CN114317816A - 一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒，包括基因膜芯片、杂交试剂和RT‑PCR反应体系；所述基因膜芯片包括尼龙膜基片和在尼龙膜基片上阵列式分布的寡核苷酸探针、对照探针及空白的点涂层；所述RT‑PCR反应试剂包括7重引物对组合。本发明将多重PCR与反向斑点杂交技术结合，利用七对特异引物对，可同时对多达七种特异基因片段进行扩增，并通过PCR产物与膜芯片上探针的杂交进一步保证检测结果的特异性与准确率，较普通定性PCR和荧光定量PCR的检测效率和准确性有较大的提高。

Description

一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试 剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因微阵列的生物芯片，尤其涉及一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒，属生物芯片和检测试剂技术领域。

背景技术

脾氨肽口服冻干粉(复可托)系自新鲜猪脾经透析提取得到的多肽及核苷酸类物质，加甘露醇作赋形剂制成的冻干品。该药品为免疫调节剂，主要用于治疗细胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊乱性疾病(反复呼吸道感染、支气管炎、肺炎、哮喘、重症带状疱疹及牛皮癣等)；用于恶性肿瘤病人放、化疗及术后生活质量，降低各种原因引起的感冒、发烧或其它感染发生率。主要受众为免疫力低下的婴幼儿、老年人及癌症患者等。复可托提取工艺一般是将新鲜猪脾脏的匀浆液装入透析袋，置冷柜中透析，收集透析液作为原液，原液再经过0.45μm粗滤和0.22μm除菌过滤两道工序，来去除可能含有的病原微生物。该产品不宜进行高温灭菌，因此必须对产品病原微生物的去除效果进行安全性综合评估。

据动物疫病对猪和人类生产和健康的危害程度，参照农业部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》和《人畜共患传染病名录》，以下六种病原微生物为常见病毒：

(1)口蹄疫

口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)为农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》一类动物疫病，且为首选品种，是世界范围内危害和造成经济损失最大的病原体之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，人也可以感染。动物临床是以口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃疡为特征，人表现为口腔黏膜、手掌、足掌和趾间发生水疱和溃疡。口蹄疫病毒属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属。病毒呈球形，直径为21～25nm，单股RNA，无囊膜。衣壳蛋白决定其抗原性。口蹄疫病毒对外界环境的抵抗力较强，病毒在组织和污染物中可存活数周至数月，但对高温、紫外线、酸碱敏感。酚、酒精、氯仿等消毒剂对口蹄疫病毒无效。

(2)乙型脑炎

乙脑(epidemic encephalitis B)为农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》二类动物疫病，属于严重危害中枢神经系统的自然源性的人猪共患急性传染病。本病重症病死率高，且易造成不同程度的神经系统后遗症，被世界卫生组织列为重点控制的传染病。

乙脑病毒属黄病毒科黄病毒属。病毒颗粒呈球型，直径为45～50nm，基因组为单股正链RNA，有传染性。20面体对称，有衣壳。

乙脑病毒在外界环境中不太稳定，56℃30min即能灭活，pH7以下或pH10以上活性迅速下降，普通消毒剂极易使之灭活。

(3)非洲猪瘟

非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。

其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，其基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。

(4)猪繁殖呼吸障碍综合症

俗称猪蓝耳病，是猪的一种繁殖障碍性疾病，是由猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(俗称猪蓝耳病病毒，PRRSV)感染引起的疾病。PRRSV为单股正链RNA，不分节段病毒，该病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。

(5)猪瘟

俗称“烂肠病”，是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。具有高度传染性和致死性。本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。该病毒为是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。

(6)猪伪狂犬病

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的猪的急性传染病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属。猪伪狂犬病，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

目前常用的检测猪病毒性疾病的方法有镜检、分离培养与鉴定、病毒抗原抗体检测和核酸检测(主要为PCR法)等。

(一)镜检

镜检是快速检测病毒的方法之一。镜检是指在光镜或电镜下，尤其是在电镜下对病毒进行检测，电镜下观察病毒常用磷钨酸进行负染色，不仅能直接观察及检测病毒的形态与结构，也能鉴定病毒。如结合免疫标记法，可进一步提高镜下检出率。此外，观察细胞内有无包涵体的出现，也是检测病毒感染的指标之一。

(二)分离培养与鉴定

由于病毒只能在活细胞内复制增殖，所以应根据病毒的不同，选择敏感动物、鸡胚或离体组织与细胞，分别进行动物接种、鸡胚接种、组织培养或细胞培养来分离培养病毒。目前，实验室最常用的是细胞培养，常用的细胞有原代细胞、二倍体肾细胞、传代细胞等。病毒在细胞中增殖的指标有：①细胞病变效应(CPE)。多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学改变，称为细胞病变效应。常见的病变为细胞变圆、坏死、溶解和脱落，有的细胞内出现包涵体，如狂犬病毒。②红细胞吸附现象。流感病毒和副流感病毒感染的细胞膜上出现病毒基因编码的抗原，可以与红细胞结合。若向培养瓶内加入红细胞，可见红细胞吸附于细胞膜上，这种现象称为红细胞吸附现象。

(三)病毒抗原抗体检测

新分离的病毒，根据临床症状和病毒的特性(包括易感宿主动物范围、细胞病变特征与红细胞吸附现象等)，即可初步鉴定病毒的科属。进一步分型需用特异性抗体进行血清学鉴定。

(四)病毒核酸PCR检测

病毒核酸PCR检测，针对DNA病毒，先将目的DNA变性为单链模板，加入与单链DNA模板特异性互补的引物。在DNA聚合酶的催化下，单核苷酸从引物3’端开始掺入，沿模板5’-3’方向延伸，合成DNA新链。针对RNA病毒，则先将其逆转录为单链DNA，再加入引物按常规PCR方法进行检测。

现有的PCR方法能够分别检测多种猪病毒性疾病，但该方法受技术平台本身限制，存在检测通量低、检测成本高，个别技术体系还存在操作复杂等问题。

面对需要同时检测多种病毒的应用场景时，单一的PCR技术存在耗时长、效率低等局限性，而利用多重PCR结合膜芯片技术则可有效提升检测效率，可一次性检测数十种指标。从2003年至今基因膜芯片技术已经广泛应用于地中海贫血、宫颈癌、乙肝等疾病的诊断，方法简单易操作，结果稳定可靠，真正克服了传统固相芯片及液相芯片成本高、难以产业化的弊端。该技术具有准确、快速、高通量等优点，通过借助相应的显色方法，使其具有直观可视、设备要求低等特点。近年来被广泛应用于疾病及病原微生物的诊断和治疗、食品安全监测、农作物育种、环境污染检测等与国民生活息息相关的领域，该技术也为脾氨肽口服冻干粉及原料中检测猪常见六种病毒快筛方法的建立提供了新平台。

经检索，有关利用PCR产物和膜基因芯片杂交来同时检测六种常见病毒的基因芯片，至今未见报道。

本项目利用膜芯片技术平台，根据六种常见猪病毒的特异性基因/片段，建立一种快速、简便、高通量的检测方法，并使用其对常见猪病毒性疾病种类进行快速、准确的检测和甄别，从而保障复可托产品的质量安全，建立产品及其原料的该项检测标准，为该产品质量标准的完善和生物安全的控制提供新思路和新依据；进一步探讨将其应用于养殖场和市场检测的可行性，降低猪常见病毒的传播并阻断疾病传染，以期减少养殖业损失，确保市场流通猪肉的安全，满足市场监管的需要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测六种猪常见病毒的膜基因芯片。

一种同时检测复可托产品中六种猪常见病毒的试剂盒，包括基因膜芯片、杂交试剂、RT-PCR反应试剂和显色试剂；

(1)所述基因膜芯片包括尼龙膜基片和在尼龙膜基片上阵列式分布的寡核苷酸探针、对照探针及空白的点涂层；具体为六条病毒组特异性检测探针、一条内参探针、一条阳性对照探针和空白点样液阴性对照，其中，

①所述六条病毒组特异性检测探针的基因序列为：

PRRSV探针：NH₂-C6 GGATGTACTTGCGGCCTAGCAAGCA

CSFV探针：NH₂-C6 GGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCAC

ASFV探针：NH₂-C6 TTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGA

JEV探针：NH₂-C6 CATTCTCRTCCCARGGTCCCTGGTTTTGTGTCC

FMDV探针：NH₂-C6 GGCGAGTCCTGCCACRGAGATCAACTTC

PRV探针：NH₂-C6 GTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCG

②所述一条内参探针的基因序列为：

内参探针：NH₂-C6 AGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAATAGT

③所述一条阳性对照探针的基因序列为：

PC探针：NH₂-C6 CGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCG

(2)所述RT-PCR反应试剂包括七重引物对组合，各对引物的序列从5’-3’如下：

内参：正向引物：ACGACCTCGATGTTGGATCAG

反向引物：biotin-GGTCTGAACTCAGATCACGTAGG

PRRRSV：正向引物：biotin-AATTCATCACTTCCAGATGCCG

反向引物：TGCCACCCAACACGAGGC

CSFV：正向引物：GTAGTTCGACGTGAGCAGGAG

反向引物：biotin-CAGCAGAGATTTTTATACTAGCCTGTTAG

ASFV：正向引物：biotin-GAATACCAACCCAGCGGTCA

反向引物：CAAGATCGGCCGTGGTGATA

JEV：正向引物：biotin-AAGCACAATCGGAGGGAAGG

反向引物：GCCTCTCTTGCCACAATCCT

FMDV：正向引物：biotin-CCGTGGGACCATACAGGAGA

反向引物：CGTTCACCCATCGCAGGTAA

PRV：正向引物：biotin-GGCAAGTGCGTCTCCAAG

反向引物：GGCGAAGGAGTCGTAGGG。

进一步地，所述基因膜芯片的制备方法为：将尼龙膜基片裁切至A4纸大小，用打印机打印出适合杂交卡盒大小的芯片格子，室温下放置12h以上待油墨完全晾干；室温下将膜浸泡在含10％二环己基碳二亚胺(DCCD)的亚甲氯溶液中30min，用亚甲氯溶液洗膜4次，每次5min，最后将膜放置于空气中干燥，备用；将病毒组特异性检测探针用探针点样液稀释至浓度15μM，按照点阵上规定的顺序依次点制在尼龙膜芯片上，制好探针的膜芯片放在紫外灯正下方照射10min。

进一步地，所述杂交试剂包括杂交液、杂交清洗液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2、显色液、显色清洗液以及碱性磷酸酶标记链霉亲和素。

本发明试剂盒用于检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒，包含引物和探针组合、基因膜芯片、杂交试剂和RT-PCR反应试剂；检测的具体步骤为：以待测样本总核酸(DNA和RNA)为模板，以6对特异性引物组合进行PCR扩增，各对引物的目标序列分别为动物线粒体内参基因(16S rRNA)序列，猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)ORF6基因，经典猪瘟病毒(CSFV)5’UTR，非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因，猪乙脑病毒(JEV)5’UTR序列，猪口蹄疫病毒(FMDV)3D基因，猪伪狂犬病病毒(PRV)gB基因特异靶序列，引物组合中有5’端带生物素标志(biotin)的引物。同时以多重PCR扩增产物设计检测探针，将各探针点在尼龙膜上，最后将扩增产物与探针杂交后使用显色液显色，并通过肉眼观察检测结果或直接由仪器进行芯片拍照、结果分析并出具检测报告。

在7重引物对组合设计上，普通的引物设计软件仅作为引物设计时参考，进行单重PCR体系设计时多数只需要设计多对引物并经过实验筛选即可获得合适的引物；但其设计的引物是无法满足多重PCR体系的，因为多对引物在同一体系内反应，难免会产生引物间的相互作用、碱基错配、引物间的竞争等问题，普通软件是无法将这些因素纳入考虑的，因此还需辅助大量技术人员体力及脑力活动进行序列的大量分析、比对并在后期实验过程中PCR扩增条件及杂交体系进行调试，最终达到体系的最适状态。本发明试剂盒的最低检测限是1.0E+02copies/μL(100copies/μL)，与目前市面上单重检测的试剂灵敏度相当。

本发明还提供了上述试剂盒在制备检测试剂中的应用。

本发明将多重PCR与反向斑点杂交技术结合，利用七对特异引物对，可同时对多达七种特异基因片段进行检测，并通过PCR产物与膜芯片上探针的杂交进一步保证检测结果的特异性与准确率，较普通定性PCR和荧光定量PCR的检测效率和准确性有所提高。膜芯片杂交中使用的反向斑点杂交技术，可使PCR产物与膜芯片上探针的杂交特异性的结合，而生物素的酶联放大作用则大大提高了体系的检测灵敏度，然后通过碱性磷酸酶与BCIP/NBT的显色作用，将检测结果直观的显示在基因膜芯片上，不需借助额外的仪器，肉眼即可判断检测结果，大大简化了检测步骤。解决了普通荧光PCR技术无法同一反应体系中同时完成三种以上常见猪病毒检测的问题。

本发明试剂盒采用多重PCR扩增方式，可同时用于复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的检测，可满足食品药品卫生监测的需要。

附图说明

图1：本发明的膜基因芯片的探针排布图。

图2a为实施例2检测结果(引物工作浓度0.2μM)，图2b为实施例2检测结果(引物工作浓度优化后)。

图3a是多重体系检测限测试结果示意图：图3b是多重体系检测限稳定性测试结果示意图。

图4：样品检测结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。

实施例1试剂盒制备流程

1、生物信息学分析及特异性引物筛选

查找不同猪病毒基因组序列，通过DNA MAN、NCBI BLAST、DNA STAR等软件进行系统的序列比对，选择保守、特异性的基因或序列作为检测对象，然后采用primer6或oligo7等软件设计多对特异引物，并在软件的引物中进行进一步比对分析，选择引物间相互作用小的引物进行合成与测试。。

2、样本制备

样本总核酸(包含DNA和RNA)提取，可采用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(或同等效力的其他提取方法或试剂盒)进行总核酸的提取，并进行浓度定量分析。

3、PCR引物特异性试验

利用不同核酸模板和对应引物分别进行扩增，检测引物特异性。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后成像，条带单一且清晰证明特异性较好，并将对应模板送生物公司进行测序，序列通过比对分析应该与目标序列一致。7重引物组合中各对引物的序列5’-3’如下：

内参：正向引物：ACGACCTCGATGTTGGATCAG

反向引物：biotin-GGTCTGAACTCAGATCACGTAGG

PRRSV：正向引物：biotin-AATTCATCACTTCCAGATGCCG

反向引物：TGCCACCCAACACGAGGC

CSFV：正向引物：GTAGTTCGACGTGAGCAGGAG

反向引物：biotin-CAGCAGAGATTTTTATACTAGCCTGTTAG

ASFV：正向引物：biotin-GAATACCAACCCAGCGGTCA

反向引物：CAAGATCGGCCGTGGTGATA

JEV：正向引物：biotin-AAGCACAATCGGAGGGAAGG

反向引物：GCCTCTCTTGCCACAATCCT

FMDV：正向引物：biotin-CCGTGGGACCATACAGGAGA

反向引物：CGTTCACCCATCGCAGGTAA

PRV：正向引物：biotin-GGCAAGTGCGTCTCCAAG

反向引物：GGCGAAGGAGTCGTAGGG

4、猪病毒特异探针合成及筛选

4.1探针设计

通过不同基因序列比对，在上下游引物之间设计特异探针，且探针需与扩增后带5’-biotin修饰的产物链互补配对，通过合成公司进行探针的合成。

4.2芯片点制

合成探针经过稀释后，点制到经过处理的尼龙膜上。

4.3引物标记

对每对引物中其中一条引物上进行5’-Biotin修饰(带5’-Biotin修饰的产物序列需与探针序列互补配对)。反应体系中，每对引物中修饰引物与非修饰引物的摩尔浓度比为1～3，通过添加更多的修饰引物序列，可以产生更多的经过修饰的产物，更有利于后期的检测。探针通过5’-NH₂ C6基团与支持膜上的醛基基团发生反应并稳定结合，有利于探针在膜上的固定。

4.4杂交显色

实验中，将带有生物素标记的产物与探针进行杂交，利用碱基互补配对原理将扩增产物与膜芯片上的探针杂交后，通过生物素-链霉亲和素亲和系统的共价结合及多级级联放大效应提高系统检测灵敏度，最终通过化学显色(碱性磷酸酶对显色底物BCIP/NBT)直观显示检测结果，通过显色反应的优化，最终筛选斑点显色效果好的探针作为候选探针。

5、探针特异性试验

在同一PCR体系中进行多重PCR扩增，采用不同猪病毒总核酸进行PCR扩增，检测探针特异性。

PCR反应组分包括UNG酶、dNTPs、反转录酶、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR缓冲液等。

使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)移除DNA中的尿嘧啶，在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG酶敏感，所以可以在PCR扩增前对新配制的反应体系用UNG酶处理，可在一定程度上防止空气中产物气溶胶污染。dNTPs作为PCR反应的原料，应用于以原DNA为模板合成新的DNA序列；反转录酶(也可写成逆转录酶，reverse transcriptase)以RNA为模板，指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)。Taq DNA聚合酶以DNA为模板，以结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基互补配对的方式按5'→3'方向沿模板顺序合成新的DNA链；Mg²⁺作为Taq DNA聚合酶的活化剂，可以激活其聚合酶的活性；PCR反应缓冲液，使反应在一个稳定的环境中反应，避免影响反转录酶及Taq DNA聚合酶的活性，进而影响反应的进行。PCR反应缓冲液是确保反应顺利进行的基础。

膜芯片包括支持膜和依次负载于支持膜的检测探针；支持膜为尼龙膜。

将探针负载于支持膜上，探针与PCR产物杂交，然后通过探针和引物上标记的标记分子显色；通过显色反应，可直接肉眼观察实验结果或使用全自动核酸分子杂交仪配套软件自动出具检测结果图及检测报告，方法简单易行。

实验过程中，选用尼龙膜作为支持膜，经过特殊试剂及工艺的处理，可使带-NH₂修饰的探针稳定附着其上；且尼龙膜具有三维孔径结构，相比玻璃芯片的二维平面结构，单位面积上可吸附更多的探针，，有利于探针分子附着，同时提高体系的检测灵敏度。

杂交试剂包括杂交液、杂交清洗液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2、显色液、显色清洗液以及碱性磷酸酶标记链霉亲和素。

杂交液、杂交清洗液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2的主要成分为SSPE和SDS，通过一定比例的混合制作成不同的配液用于不同的用途。其中，SSPE(Saline sodiumphosphate EDTA)是一种常见的核酸杂交缓冲液；SSPE缓冲液包括NaCl、NaH₂PO₄·H₂O(或NaH₂PO₄·2H₂O)和EDTA-Na₂。

显色液为碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP；显色清洗液为蒸馏水。

通过上述的各种配液，清除杂质，排除非特异杂交的干扰，使检测结果更准确、可靠。

生物素与链霉亲和素(Streptavidin，SA)具有极高的亲和力，反应呈高度专一性。每个链霉亲和素分子具有4个生物素分子结合位点，因此，链霉亲和素可同时以多价形式结合生物素。生物素标记的引物与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素联合使用，将检测信号级联放大，最后通过显色反应或化学发光实现检测。

在各特异靶序列引物中间设计对应的探针，每个探针的5’端带NH₂-C6标记，经杂交检测后筛选得到的探针其碱基序列如下：

内参探针：NH₂-C6 AGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAATAGT

PRRSV探针：NH₂-C6 GGATGTACTTGCGGCCTAGCAAGCA

CSFV探针：NH₂-C6 GGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCAC

ASFV探针：NH₂-C6 TTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGA

JEV探针：NH₂-C6 CATTCTCRTCCCARGGTCCCTGGTTTTGTGTCC

FMDV探针：NH₂-C6 GGCGAGTCCTGCCACRGAGATCAACTTC

PRV探针：NH₂-C6 GTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCG

6、膜芯片的制备及杂交质控点设置

从生物公司购买尼龙膜，将芯片裁切至A4纸大小，并用打印机打印出适合杂交卡盒大小的芯片格子，室温下放置12h以上待油墨完全晾干。室温下将膜浸泡在含10％二环己基碳二亚胺(DCCD)的亚甲氯溶液中30min，用亚甲氯溶液洗膜4次，每次5min，最后将膜放置于空气中干燥，备用；

将稀释处理的靶标探针按照点阵上规定的顺序依次点制在尼龙膜芯片上，制好探针的膜芯片放在紫外灯正下方照射10min备用(点制并处理后未及时使用的膜芯片需置于密封干燥箱中保存)。

点制前，靶标探针用探针点样液稀释至浓度15μM。

膜芯片的探针点制模式图如图1所示，内参代表动物线粒体16s rRNA基因，PRRSV、CSFV、ASFV、JEV、FMDV和PRV分别表示不同的检测靶标，PC表示阳性对照(Positivecontrol)；NC表示阴性对照(Negative control)，即点样时只加入点样液。PC探针序列如下：

PC探针：NH₂-C6 CGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCG。

反应结果有效前提：PC显色，NC不显色。

判读标准：

猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(猪蓝耳病毒)：内参、PRRSV显色；

经典猪瘟病毒：内参、CSFV显色；

非洲猪瘟病毒：内参、ASFV显色；

猪乙脑病毒：内参、JEV显色；

口蹄疫病毒：内参、FMDV显色；

猪伪狂犬病毒：内参、PRV显色。

实施例2

按照天根生化科技(北京)有限公司病毒DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP315)说明书分别提取6种猪病毒标准样品总核酸。提取后的总核酸用超微量分光光度计(NanoDrop2000)测定浓度及质量后分别进行PCR加样，测试各引物扩增效率及特异性。

PCR扩增的反应体系如下所示：

2×RT-Multiplex PCR Master Mix：10μL；

各靶标备选引物上引(10μM)：0.5μL

各靶标备选引物下引(10μM)：0.5μL

提取的样品总核酸：2～5μL；

ddH₂O：补足至总体积20μL；

扩增结束后进行凝胶电泳，检测扩增目的条带。选择特异性好、扩增效率高(即扩增条带单一、产物量大)的引物作为备选，并在此基础上设计、筛选探针。

实施例3

多重反应体系的配制：使用第1-7引物对配制多重RT-PCR引物Mix，各引物终浓度为10μM。每20μL反应体系中加入0.4μL配制好的引物Mix，故而反应体系中各引物工作终浓度均为0.2μM。

核酸提取：按照天根生化科技(北京)有限公司病毒DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP315)说明书分别提取培养的6种猪病毒标准样品总核酸。提取后的总核酸用超微量分光光度计(NanoDrop2000)测定浓度，并用无酶水将上述核酸梯度稀释至中间浓度(约1.0E+04copies/μL)进行PCR加样。

PCR扩增的反应体系如下所示：

2×RT-Multiplex PCR Mix(含引物Mix)：10.4μL；

提取的样品总核酸:2～5μL；

ddH₂O:补足至总体积20μL；

使用上述配制好的反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由UNG酶消化，反转录酶、Taq DNA聚合酶反应，经过预变性、变性、退火和延伸，条件分别为：

UNG酶消化+反转录酶反应：温度45℃，时间30min；

预变性：温度95℃，时间10min；PCR循环：35个循环组成

变性：温度95℃，时间30s；退火：温度55℃，时间30s；

延伸：温度72℃，时间30s；后延伸：温度72℃，时间5min；保存：温度4℃/12℃。

膜芯片杂交：将PCR产物放入PCR仪，95℃热变性5min后立即置于冰上冷却，备用。

杂交液中预先加入含1μmol/mL的寡核苷酸序列(Pos-oligo)，用于质控杂交过程，Pos-oligo序列：bio-CGCAACGTGTGGTGACAATCGCGCATTAACCCG，然后将杂交液分装为200μL/样分别加入各杂交管中。

取冷却后的PCR产物20μL加入200μL已分装好杂交液的杂交管中，在全自动基因膜芯片检测工作站(MFS-24)中进行膜芯片杂交检测反应，杂交检测流程包括杂交、杂交清洗、酶标、酶标清洗、显色、显色清洗等步骤，如表1所示。

表1全自动基因膜芯片检测工作站杂交检测流程

实验完成后，根据杂交点显色情况参照图1进行结果判读，结果如图2所示，分别为猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪乙脑病毒(JEV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)。

实施结果显示，多重体系下个别靶标，如PRRSV，CSFV，显色极弱；FMDV显色相对其他靶标比较弱，因此需要对多重体系进行如引物配比、扩增循环数、杂交程序的调试。经调试后引物配比如下表2所示。

表2调整后多重引物体系中各引物工作浓度

PCR体系加样及杂交程序参照上述进行，PCR扩增程序调整为如下：

UNG酶消化+反转录酶反应：温度45℃，时间30min；

预变性：温度95℃，时间2min；PCR循环：38个循环组成

变性：温度95℃，时间30s；

退火：温度55℃，时间45s；

延伸：温度68℃，时间30s；后延伸：温度68℃，时间5min；保存：温度4℃/12℃。

实验结果如图2b所示，调整后检测体系效果优于调整前。

实施例4

将实施例3中提取的各阳性靶标核酸测定浓度后使用无DNase/RNase酶水分别进行梯度稀释，然后选择浓度为1.0E+04copies/μL、1.0E+03copies/μL、1.0E+02copies/μL的模板进行检测限测试，检测结果如图3a所示。

测试结果显示，体系灵敏度可达1.0E+02copies/μL，与预期目标一致。为测试体系在检测限浓度的稳定性，使用1.0E+02copies/μL各阳性核酸进行体系检测限稳定性测试，每个样本重复3次，PCR加样及杂交程序参照实施例3，扩增程序参照实施例3中调整后的扩增程序。测试结果如图3b所示。检测结果显示，多重体系可稳定检出检测限浓度核酸，具有良好的稳定性。

实施例5

收集脾氨肽冻干粉等相关药品及其原料、市场上和养殖场猪肉、猪脾脏等共计10个样本，按照天根生化科技(北京)有限公司病毒DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP315)说明书中的操作步骤进行核酸提取。使用实施例3中调试过的多重体系进行检测，PCR加样、扩增及杂交均参照实施例3进行。检测结果如图4所示。

检测结果显示，仅9号样本中检出非洲猪瘟，与预期一致(9号样本为往猪生肉中加入一定量的非洲猪瘟核酸后取样提取的样本)，与预期一致。其余样本均经过普通PCR筛检同步对比后的结果。检测结果显示试剂盒可应用性强。

序列表

<110> 台州市药品检验研究院

<120> 一种同时检测复可托产品中六种猪常见病毒的试剂盒

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 1

ggatgtactt gcggcctagc aagca 25

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 2

ggtacgacct gatagggtgc tgcagaggcc cac 33

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 3

ttctcttgct ctggatacgt taatatga 28

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 4

cattctcrtc ccarggtccc tggttttgtg tcc 33

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 5

ggcgagtcct gccacrgaga tcaacttc 28

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 6

gtcaccttgt ggttgttgcg cacgtactcg 30

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 7

agggttcgtt tgttcaacga ttaatagt 28

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 8

cgggttaatg cgcgattgtc accacacgtt gcg 33

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 9

acgacctcga tgttggatca g 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 10

ggtctgaact cagatcacgt agg 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 11

aattcatcac ttccagatgc cg 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 12

tgccacccaa cacgaggc 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 13

gtagttcgac gtgagcagga g 21

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 14

cagcagagat ttttatacta gcctgttag 29

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 15

gaataccaac ccagcggtca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 16

caagatcggc cgtggtgata 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 17

aagcacaatc ggagggaagg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 18

gcctctcttg ccacaatcct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 19

ccgtgggacc atacaggaga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 20

cgttcaccca tcgcaggtaa 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 21

ggcaagtgcg tctccaag 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 22

ggcgaaggag tcgtaggg 18

Claims (3)

1.一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒，包括基因膜芯片、杂交试剂和RT-PCR反应试剂；

(1)所述基因膜芯片包括尼龙膜基片和在尼龙膜基片上阵列式分布的寡核苷酸探针、对照探针及空白的点涂层；具体为六条病毒组特异性检测探针、一条内参探针、一条阳性对照探针和空白点样液阴性对照，其中，

①所述六条病毒组特异性检测探针的基因序列为：

PRRSV探针：NH₂-C6 GGATGTACTTGCGGCCTAGCAAGCA

CSFV探针：NH₂-C6 GGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCAC

ASFV探针：NH₂-C6 TTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGA

JEV探针：NH₂-C6 CATTCTCRTCCCARGGTCCCTGGTTTTGTGTCC

FMDV探针：NH₂-C6 GGCGAGTCCTGCCACRGAGATCAACTTC

PRV探针：NH₂-C6 GTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCG

②所述一条内参探针的基因序列为：

内参探针：NH₂-C6 AGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAATAGT

③所述一条阳性对照探针的基因序列为：

PC探针：NH₂-C6 CGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCG

(2)所述RT-PCR反应试剂包括七重引物对组合，各对引物的序列从5’-3’如下：

内参：正向引物：ACGACCTCGATGTTGGATCAG

反向引物：biotin-GGTCTGAACTCAGATCACGTAGG

PRRRSV：正向引物：biotin-AATTCATCACTTCCAGATGCCG

反向引物：TGCCACCCAACACGAGGC

CSFV：正向引物：GTAGTTCGACGTGAGCAGGAG

反向引物：biotin-CAGCAGAGATTTTTATACTAGCCTGTTAG

ASFV：正向引物：biotin-GAATACCAACCCAGCGGTCA

反向引物：CAAGATCGGCCGTGGTGATA

JEV：正向引物：biotin-AAGCACAATCGGAGGGAAGG

反向引物：GCCTCTCTTGCCACAATCCT

FMDV：正向引物：biotin-CCGTGGGACCATACAGGAGA

反向引物：CGTTCACCCATCGCAGGTAA

PRV：正向引物：biotin-GGCAAGTGCGTCTCCAAG

反向引物：GGCGAAGGAGTCGTAGGG。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述基因膜芯片的制备方法为：将尼龙膜基片裁切至A4纸大小，用打印机打印出适合杂交卡盒大小的芯片格子，室温下放置12h以上待油墨完全晾干；室温下将膜浸泡在含10％二环己基碳二亚胺(DCCD)的亚甲氯溶液中30min，用亚甲氯溶液洗膜4次，每次5min，最后将膜放置于室温下悬挂晾干，备用；

将病毒组特异性检测探针用探针点样液稀释至浓度15μM，按照点阵上规定的顺序依次点制在尼龙膜芯片上，点制好探针的膜芯片放在紫外灯正下方照射10min，常温干燥保存，备用。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交试剂包括杂交液、杂交清洗液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2、显色液、显色清洗液以及碱性磷酸酶标记链霉亲和素。

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