CN113846187A - 利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒 - Google Patents
利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒。该方法包所述方法包括针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分。本发明通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒。
背景技术
随着人们在对短时间内检测多靶标的需求，比如多基因遗传位点检测、感染症侯群多感染靶标检测等，如何实现单管反应尽可能多地检测或识别不同靶序列或者同一靶序列的多位点组成信息，成为了核酸检测领域重点关注的问题。
常见的多重靶标检测技术包括基因芯片技术、高通量测序技术等，虽然具有高通量，灵敏度高等优点，但成本高，需要专业人员分析，仪器昂贵等问题仍然制约其在临床上的广泛应用。
实时PCR可以利用不同形式实现对扩增产物的荧光检测，根据荧光探针类型的不同，实时PCR可以分为荧光染料型和荧光标记探针型。其中荧光标记探针可以通过采用不同的荧光基团标记的探针进行多靶的分析。实时荧光PCR的结果判定方式分为两大类，通过扩增曲线判定与通过熔解曲线判定：通过扩增曲线判定，在一个荧光通道内只能实现单重检测，单管内只能检测4-5重；而通过熔解曲线判定，可在一个荧光通道内可实现多个Tm峰的检测，即在一个荧光通道内可实现多重检测，从而在单管内可实现20多重的检测。
目前已经有多种靶序列杂交型荧光探针用于熔解曲线分析，包括Taqman探针、分子信标及本公司已发明的熔解曲线技术(EMPA技术)等等，均可以通过标记不同的荧光基团及在qPCR结束之后的熔解曲线分析阶段与不同靶标形成带有荧光的不同Tm值的产物，实现多重靶标的检测，但Taqman探针在组合多重时容易出现非特异Tm峰或甚至不能形成有效的熔解峰，在检测SNP时，野生型与突变型两种型别的Tm值差值较低，不容易区分；分子信标的灵敏度不高的缺点也同样限制了其在临床上的应用。本公司之前发明的EMPA技术虽然在进行多重检测时可以做到高通量，但其在SNP检测时，对于野生型和突变型的区分度同样不高，在已有技术不能完全满足临床的需求的形况下，我们亟需开发出一种灵敏度高、特异性高且SNP区分更好的的多重熔解曲线检测技术。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分；所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；
步骤2：所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割探针与模板形成的DNA-RNA杂交链中的RNA碱基，同时探针的5’端在核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用下被切割，使得探针中RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与所述RNA碱基左侧的含有淬灭基团片段分离；
步骤4：所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段由于含有硫代磷酸化修饰碱基，不会被核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用切割，使得RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，仍能被保留；同时所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的3’端标记封闭基团，使其不会在核酸聚合酶的作用下延伸；
步骤5：通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。
在一种实施方式中，在所述RNA碱基右侧相隔一个碱基后连接3个连续的硫代磷酸化修饰碱基。
在一种实施方式中，所述探针中包含一个RNA碱基。
在一种实施方式中，在所述探针RNA碱基左侧片段的5’端第1个碱基与从5’端开始的2～5bp的任一个碱基上分别标记猝灭基团。经过本发明的实验验证，上述二个猝灭基团保持上述距离是合适的，一方面充分保证了对荧光基团的淬灭效果，另一方面能够提高反应中不同产物之间的Tm值差值，提高了检测的灵敏度。
在一种实施方式中，所述探针上标记的荧光基团和非末端淬灭基团的碱基之间距离为5-15bp。经过本发明的实验验证，探针上标记的荧光基团和非末端淬灭基团保持上述距离是合适的，充分保证了对荧光基团的淬灭效果，降低了反应的荧光背景，增加了反应的灵敏度。
在一种实施方式中，所述步骤4中聚合酶为具有5’—3’外切酶活性的Taq酶。
在一种实施方式中，所述耐热核糖核酸酶RNaseH包括RNaseH2。
在一种实施方式中，为使RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与靶标核酸更好的结合，RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的G+C含量为40％-60％。
在一种实施方式中，在检测多重靶标时，为使不同靶标的的Tm值有明显差别，RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的Tm值为45℃-80℃。
在一种实施方式中，提供一种利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的探针，所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述探针与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链。
在一种实施方式中，在所述探针RNA碱基右侧片段的3’末端碱基上连接封闭基团为C3 spacer。
在一种实施方式中，本发明提供一种利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括：a.探针，所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割探针与模板形成的DNA-RNA杂交链中的RNA碱基，同时探针的5’端在核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用下被切割，使得探针中RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与所述RNA碱基左侧的含有淬灭基团片段分离；和c.核酸聚合酶，所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段由于含有硫代磷酸化修饰碱基，不会被核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用切割，使得RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，仍能被保留；同时所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的3’端标记封闭基团，使其不会在核酸聚合酶的作用下延伸。
在一种实施方式中，提供一种实现单管检测新型冠状病毒、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和乙型流感的试剂盒，所述试剂盒利用利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线检测上述常见性病病原体，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计的特异性上、下游引物和探针；所述上、下游引物和探针分别如下：
本发明具有的优点和积极效果是：(1)本发明通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。因此，本发明检测通量相对于使用扩增曲线判定结果的传统实时荧光PCR技术提高了数倍，同时还保证了相同的检测灵敏度。
(2)由于能够单管同时平行检测多种靶序列，大大减少了检测技术的操作量和检测成本。
(3)在检测SNP时，需要野生型与突变型的靶标序列所产生的Tm值有差别，根据Tm值差别进行野生型与突变型靶标的鉴定，由于所述探针被RNaseH切割后保留的RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段较短，导致探针与野生型和突变型靶标形成的熔解曲线Tm值差别较大，且该片段上较多的修饰基团，加大了寡脱氧核糖核苷酸一级和二级结构对荧光变化的影响，因此野生型与突变型靶标的Tm值差值可达3-10℃。因此，本发明可以通过野生型与突变型的靶标序列所产生的Tm值差别，检测到核酸序列中的SNP，且该技术形成的Tm值差值为3-10℃，大部分会集中在5-10℃，Tm值差别明显，两种型别的区分更容易。
(4)在本发明中RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，才可以实现本发明对多种靶序列检测，如果RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧只标记一个猝灭基团，实验结果显示本发明方法不能够实现本发明对多种靶序列检测。
(5)在本发明RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，本发明中发现如果只有1个硫代磷酸化修饰碱基，阻止不了核酸聚合酶的5’－3’外切酶对碱基的切割，RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，不能保留；本发明经过优选发现右侧相隔至少一个碱基后连接3个连续的硫代磷酸化修饰碱基的效果最佳。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明方法的原理图。
图2表示单猝灭标记探针检测HCoV-229E的熔解曲线图；
图3表示双猝灭标记探针检测HCoV-229E的熔解曲线图；
图4表示单管6重反应体系的熔解曲线图；
图5表示新型冠状病毒的熔解曲线图；
图6表示HCoV-OC43的熔解曲线图；
图7表示HCoV-229E的熔解曲线图；
图8表示乙型流感(IFB)的熔解曲线图；
图9表示本发明中方法对2019新型冠状病毒Of1a基因SNP检测的熔解曲线图；
图10表示本发明中方法对结核杆菌rpob基因SNP检测的熔解曲线图；
图11表示Taqman探针对2019新型冠状病毒Of1a基因SNP检测的熔解曲线图；
图12表示Taqman探针对结核杆菌rpob基因SNP检测的熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。标准质粒的提取试剂盒与病毒RNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。
实施例一本发明方法的基本原理
如图1所示，如图1所示，本发明利用荧光定量PCR扩增中探针RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与产物结合的熔点Tm值，实现单管检测多个待测目标核酸序列和/或序列中的SNP检测：
步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分；所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值。如果待测目标核酸是DNA，则直接设计相应的引物和探针，如果待测目标核酸是RNA，则反转录成为cDNA，然后进行相应的引物和探针的设计。所述探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离根据淬灭基团对荧光基团的淬灭效果进行选择，淬灭效果好，本底背景就低，一般为5-15bp，这时试剂自身荧光背景最低，实验效果最好。
步骤2：所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割探针与模板形成的DNA-RNA杂交链中的RNA碱基，同时探针的5’端在核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用下被切割，使得探针中RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与所述RNA碱基左侧的含有淬灭基团片段分离；
步骤4：所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段由于含有硫代磷酸化修饰碱基，不会被核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用切割，使得RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，仍能被保留；同时所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的3’端标记封闭基团，使其不会在核酸聚合酶的作用下延伸；
步骤5：通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。
实施例二：标记单/双淬灭基团探针的对比实验
以呼吸道病毒病原体HCoV-229E的检测为例，用本发明的方法但使用分别标记单/双淬灭基团探针对假病毒提取的RNA进行定性检测，具体方法包括如下步骤：
一、假病毒RNA提取
用天根生化科技(北京)有限公司的病毒RNA提取试剂盒按照说明书提取假病毒样本中病毒RNA。
二、引物、探针的设计
根据待测核酸序列保守区域设计上下游引物和带一个RNA碱基的探针，其中P1为标记单猝灭探针，P2为标记双猝灭探针，引物探针的序列信息如下表所示。
注：*为硫代磷酸化修饰，小写字母碱基为RNA碱基，探针3’做C3 spacer，加粗碱基标记荧光基团，斜体碱基连接猝灭基团。
三、PCR反应及熔解曲线分析
RNA反应体系：1×PCR buffer，1×solutionⅠ，0.2mM dNTPs、0.03μM上游引物(或下游引物)，0.3μM下游引物(或上游引物)，0.15μM探针，20mU RNaseH，3U聚合酶，90U SuperM-MuLV Reverse，12U RNase Inhibitor。30μL反应体系，其中模板RNA加入5μL。
荧光PCR反应程序：50℃反转录20分钟，95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，58℃退火延伸，同时退火时收集荧光，重复45个循环；40℃降温1分钟，50℃降温2分钟，50-95℃熔解曲线分析，每隔0.04℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟。
四、检测结果
HCoV-229E病原体两种探针形成的产物熔解曲线结果如图2、3所示，数据的统计分析如下表所示，从以上结果及可看出，将探针标记为单猝灭时，在检测靶标时形成的熔解峰的Tm值离散程度较大(mean±2*SD＝62.72±1.77)，且不同浓度的靶标的Tm值呈现出不稳定的状态(5copies mean±2*SD＝63.9±0.72，10copies mean±2*SD＝62.25±0.18，100copies mean±2*SD＝62±0.2)，不具备良好的特异性，当进行多重靶标检测或SNP检测时不能进行有效区分，甚至判读出假阳性或假阴性的结果。将探针标记为双猝灭时，检测靶标形成的熔解峰的Tm值足够稳定(mean±2*SD＝62.67±0.56)，在检测不同浓度的靶标时Tm值的差别不大，(5copies mean±2*SD＝63.05±0.16,10copies mean±2*SD＝62.52±0.06,100copies mean±2*SD＝62.45±0.1)，以上数据表明标记双猝灭基团的探针特异性更好，更容易进行结果判读，因此在本发明中使用双猝灭修饰的探针比单猝灭修饰探针表现更佳。在通常的荧光定量PCR反应中，通常一个荧光基团对应一个淬灭基团，但是在本发明中研究中为了实现本发明的技术效果，需要使用双猝灭修饰的探针，单猝灭修饰探针不能够实现本发明的技术效果。
实施例三：呼吸道病毒病原体六重检测试剂盒的建立
以呼吸道病毒病原体：新型冠状病毒，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和乙型流感(IFB)检测为例，用本发明的方法对各病原体假病毒提取的RNA进行定性检测，及对2019新型冠状病毒，HCoV-229E、HCoV-OC43和乙型流感(IFB)四种病原体的临床阳性样本的RNA进行定性检测。具体方法包括如下步骤：
一、假病毒与临床样本RNA提取
用天根生化科技(北京)有限公司的病毒RNA提取试剂盒按照说明书提取假病毒与临床样本中病毒RNA。
二、引物、探针的设计
根据各待测核酸序列保守区域设计上下游引物和带一个RNA碱基的探针，引物探针的序列信息如下表所示。
注：*为硫代磷酸化修饰，小写字母碱基为RNA碱基，探针3’做C3 spacer，加粗碱基标记荧光基团，斜体碱基连接猝灭基团。
三、PCR反应及熔解曲线分析
本发明中方法RNA反应体系及熔解曲线反应条件：同实施例2。
四、检测结果
呼吸道病原6重体系各荧光通道的产物熔解曲线结果如图4所示，其中，A1-A6依次代表：新型冠状病毒(Tm值：57.8℃)、HCoV-229E(Tm值：64℃)、HCoV-OC43(Tm值：66.3℃)、HCoV-NL63(Tm值：76.1℃)、HCoV-HKU1(Tm值：78℃)和乙型流感(IFB)(Tm值：79.5℃)；该体系检测单个病原体临床样本的各荧光通道的产物熔解曲线结果如图5-8所示。从以上检测结果可看出，该6重体系检测6种目标序列的假病毒提取的RNA的等比例混合模板和分别检测单种目标序列的临床样本RNA(新型冠状病毒(Tm值：57.5℃)、HCoV-229E(Tm值：64.2℃)、HCoV-OC43(Tm值：66℃)、乙型流感(IFB)(Tm值：79.4℃)时，每种病原体均有对应的特征熔解峰，说明建立的常见呼吸道病毒病原体检测体系能够准确检测对应病原体。
实施例四：单管检测目标核酸序列中的SNP
以病原体新型冠状病毒Of1a基因和结核杆菌rpoB基因的SNP检测为例，用本发明的方法对两种病原体野生型和突变型假病毒样本提取的假病毒RNA或重组质粒进行定性检测，同时使用Taqman探针法对两种病原的SNP进行检测。具体方法包括如下步骤：
一、假病毒RNA与阳性重组质粒DNA的提取
用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒和病毒RNA提取试剂盒按照说明书提取新型冠状病毒假病毒样本中病毒RNA和结核杆菌的重组质粒。
二、引物、探针的设计
根据2019新型冠状病毒Of1a基因和结核杆菌rpoB基因的野生型序列的保守区域设计上下游引物和带一个RNA碱基的探针，新型冠状病毒与结核杆菌引物探针的序列信息见下表。并同时采用相同序列的Taqman探针(如下表中的P1所示)进行对比检测。
注：*为硫代磷酸化修饰，小写字母碱基为RNA碱基，探针3’做C3 spacer，加粗碱基标记荧光基团，斜体碱基连接猝灭基团，P1表示Taqman探针，5’标记荧光报告基团，3’标记猝灭接团。
三、PCR反应及熔解曲线分析
本发明中方法DNA反应体系：1×PCR buffer，1×solution Ⅰ，0.2mM dNTPs、0.03μM上游引物(或下游引物)，0.3μM下游引物(或上游引物)，0.15μM探针，20mU RNaseH，3U聚合酶。30μL反应体系，其中模板DNA加入5μL。
Taqman探针DNA反应体系：1×PCR buffer，1×solution Ⅰ，0.2mM dNTPs、0.03μM上游引物(或下游引物)，0.3μM下游引物(或上游引物)，0.15μM探针，3U聚合酶。30μL反应体系，其中模板DNA加入5μL。
本发明中方法RNA反应体系：同实施例2中体系。
Taqman探针RNA反应体系：1×PCR buffer，1×solution Ⅰ，0.2mM dNTPs、0.03μM上游引物(或下游引物)，0.3μM下游引物(或上游引物)，0.15μM探针，3U聚合酶，90U SuperM-MuLV Reverse，12U RNase Inhibitor。30μL反应体系，其中模板RNA加入5μL。
DNA模板熔解曲线反应条件：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，58℃退火延伸，同时退火时收集荧光，重复45个循环；40℃降温1分钟，50℃降温2分钟，50-95℃熔解曲线分析，每隔0.04℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟。
RNA模板熔解曲线反应条件：同实施例2中体系。
四、检测结果
2019新型冠状病毒Of1a基因和结核杆菌rpob基因使用本发明中方法检测SNP熔解曲线结果分别如图9、10所示，使用Taqman探针检测SNP熔解曲线结果分别如图11、12所示，从以上检测结果可看出，使用本发明中方法分别检测2019新型冠状病毒Of1a基因的野生型(Tm值：56.1℃)、突变型(突变位点位于探针第23位G>T，Tm值：53℃)的假病毒RNA和结核杆菌rpob基因的野生型(Tm值：71.3℃)、突变型(突变位点位于rpoB核心区密码子526CAC→CGC，Tm值：63.6℃，526CAC→GAC，Tm值：66℃)的重组质粒时，野生型和不同突变型均有对应的特征熔解峰，且野生型与不同突变型间的Tm差值均在3℃以上，使用Taqman探针检测SNP时，野生型与不同突变型间的Tm差值均在3℃以内:2019新型冠状病毒Of1a基因的野生型(Tm值：48℃)、突变型(探针第23位G>T，Tm值：47.2℃)；结核杆菌rpob基因的野生型(Tm值：60.6℃)、突变型(526CAC→CGC，Tm值：59.6℃，526CAC→GAC，Tm值：60.2℃)，相比于Taqman探针，本发明中的方法对于检测核酸序列中的SNP更容易区分，判读更加简便。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京宏微特斯生物科技有限公司
江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actacaaatg ggatgaacac tagtcact 28
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accactctca acagcaaata catttt 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgcaacggc tgtgttggtc attca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgcaacggc tgtgttggtc attca 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaagagcaa gaagaagatt ggtta 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caattgtttg aatagtagtt gtctg 25
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcctcactgc cgtcttgttg acca 24
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actacaaatg ggatgaacac tagtcact 28
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accactctca acagcaaata catttt 26
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgcaacggc tgtgttggtc attca 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacgatggta tttttactat ctggg 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggggtattg acatcagcct 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgctaaagac cagtatggca ccga 24
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggaccttaa attcagacaa cgttct 26
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gattacgttt gcgattacca agact 25
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggtgttgtt tgggttgcta aggaaggtgc t 31
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaaacccaa cctaaattca ctgt 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gggtactccg aaagcaatgg 20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcccacatt attcctggtt ctccg 25
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagtcttggc tttgatgtct ctc 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggctgargcc attcgattta 20
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccctctgtct gccattgctc ttccta 26
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggaggcgatc acaccgcaga cgtt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acctccagcc cggcacgctc acgt 24
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaacaacccg ctgtcggggt tgacccacaa gcg 33
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctgtcggggt tgacccacaa gcg 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agaagagcaa gaagaagatt ggtta 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caattgtttg aatagtagtt gtctg 25
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcctcactgc cgtcttgttg acca 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcctcactgc cgtcttgttg acca 24
Claims (14)
1.利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分；所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；
步骤2：所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割探针与模板形成的DNA-RNA杂交链中的RNA碱基，同时探针的5’端在核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用下被切割，使得探针中RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与所述RNA碱基左侧的含有淬灭基团片段分离；
步骤4：所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段由于含有硫代磷酸化修饰碱基，不会被核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用切割，使得RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，仍能被保留；同时所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的3’端标记封闭基团，使其不会在核酸聚合酶的作用下延伸；
步骤5：通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述RNA碱基右侧相隔一个碱基后连接3个连续的硫代磷酸化修饰碱基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针中包含一个RNA碱基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述探针RNA碱基左侧片段的5’端第1个碱基与从5’端开始的2～5bp的任一个碱基上分别标记猝灭基团。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针上标记的荧光基团和非末端淬灭基团的碱基之间距离为5-15bp。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中聚合酶为具有5’—3’外切酶活性的Taq酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐热核糖核酸酶RNaseH包括RNaseH2。
8.利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的探针，其特征在于，所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；
所述探针与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链。
9.根据权利要求8所述的探针，其特征在于，在所述RNA碱基右侧相隔一个碱基后连接3个连续的硫代磷酸化修饰碱基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述探针RNA碱基左侧片段的5’端第1个碱基与从5’端开始的2～5bp的任一个碱基上分别标记猝灭基团。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述探针上标记的荧光基团和非末端淬灭基团的碱基之间距离为5-15bp。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述探针RNA碱基右侧片段的3’末端碱基上连接封闭基团为C3 spacer。
13.利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
a.探针，所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；
b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割探针与模板形成的DNA-RNA杂交链中的RNA碱基，同时探针的5’端在核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用下被切割，使得探针中RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与所述RNA碱基左侧的含有淬灭基团片段分离；和
c.核酸聚合酶，所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段由于含有硫代磷酸化修饰碱基，不会被核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用切割，使得RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，仍能被保留；同时所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的3’端标记封闭基团，使其不会在核酸聚合酶的作用下延伸。
14.实现单管检测新型冠状病毒、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和乙型流感的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线检测上述常见性病病原体，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计的特异性上、下游引物和探针；所述上、下游引物和探针分别如下：
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