CN114262734A - 一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶p450家族基因突变位点的检测方法 - Google Patents
一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶p450家族基因突变位点的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，PCR产物经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延技术，通过双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列。本发明通过检测替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19‑1、CYP2C19‑2、CYP2C19‑3、CYP3A4、CYP2C9片段中的突变位点可以评估被检样本对于替格瑞洛的相关性，可以用于对应药物的用药指导，具有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及DNA测序应用技术领域，特别是涉及一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法。
背景技术
肝脏的细胞色素酶P450家族在药物的代谢中起着重要作用，它将药物由疏水型转化为更易排泄的亲水型。生物转化反应一般可分为细胞色素P450依赖的I相和II相结合反应。已清楚药物的肝外代谢对体内药物总的降解起一定的作用。胃肠道内的生物转化是非常重要的，因为它可降低口服药物的生物利用度。遗传多态性、酶抑制、酶诱导及生理因素均可引起细胞色素酶P450活性的改变。这有一定的临床含意，因为这会引起药物药代动力学的改变，导致药物效能改变，因代谢减少或毒性代谢物生成增多而增加药物毒性，以及导致药物的相互作用。有证据表明CYP2C19等细胞色素酶P450家族基因的多态性与药物的个体差异密切相关，通过检测患者CYP2C19等细胞色素酶P450家族的基因型，判断患者代谢速率类型，合理调整用药剂量，是提高相关疾病治愈率,减少毒副作用的有效途径，尤其像氯吡格、雷伏立康唑、抗抑郁类药物、抗癫痫药物等。
替格瑞洛的商品名为倍林达，是一种血小板聚集抑制剂，其临床疗效和安全性已得到血小板抑制和患者后果结局研究(PLATO研究)及其多项亚组研究的验证和支持。药物基因组学研究表明，替格瑞洛在体内的代谢水平与细胞色素酶P450家族的CYP2C19等基因的表型密切相关。FDA在该药的说明也提出了这一点。因此，用药前检测相关基因的变异情况，能有效辅助替格瑞洛的临床用药，对患者有重要的指导意义。目前市场上的相关核酸质谱检测技术均是采用单向单碱基延伸技术来进行的，而单向单碱基延伸难以对变异位点进行精确确定，给替格瑞洛的治疗应用带来了一定消极影响。
发明内容
基于此，有必要针对上述现有技术中的不足，提供一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法。
一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，PCR产物经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延技术，通过双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列。
上述替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，通过双向单碱基延伸的技术，对人类替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因进行精确的变异检查，从而为个体临床用药提供安全指导。
在其中一个实施例中，所述目标位点特异性引物包括：
用于扩增替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：31，反向引物为SEQ ID Nos：32；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ IDNos：33，反向引物为SEQ ID Nos：34；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的特异性引物，正向引物为：SEQ IDNos：35，反向引物为SEQ ID Nos：36；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：37，反向引物为SEQ ID Nos：38；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C9片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：39，反向引物为SEQ ID Nos：40。
用于扩增替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1片段的特异性正向引物SEQ ID Nos：31的序列为：ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC，
用于扩增替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1片段的特异性反向引物SEQ ID Nos：32的序列为：ACGTTGGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTC，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的特异性正向引物SEQ ID Nos：33的序列为：ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的特异性反向引物SEQ ID Nos：34的序列为：ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的特异性正向引物SEQ ID Nos：35的序列为：ACGTTGGATGCAAATTTGTGTCTTCTGTTC；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的特异性反向引物SEQ ID Nos：36的序列为：ACGTTGGATGGGATTTGAGCTGAGGTCTTC；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的特异性正向引物SEQ ID Nos：37的序列为：ACGTTGGATGTCTGGTTACCTTTGTGGGAC；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的特异性反向引物SEQ ID Nos：38的序列为：ACGTTGGATGTCTAGCACCGAGTGGATTTC；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的特异性正向引物SEQ ID Nos：39的序列为：ACGTTGGATGATGCAAGACAGGAGCCACAT；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的特异性反向引物SEQ ID Nos：40的序列为：ACGTTGGATGTGTCACAGGTCACTGCATGG。
在其中一个实施例中，所述单碱基延伸技术所用的引物包括：
用于扩增替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：101和SEQ ID Nos：102；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ IDNos：SEQ ID Nos：103和SEQ ID Nos：104；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ IDNos：105和SEQ ID Nos：106；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：107和SEQ ID Nos：108；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C9片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：109和SEQ ID Nos：110。
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-1片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：101的序列为：GTCCACTATCATTGATTATTTCCC，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-1片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：102的序列为：AAGAGTAAAGGAGTAGATTTTT，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：103的序列为：TTGGCCTTACCTGGAT，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：104的序列为：TTGCTGGACATGTCAA，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：105的序列为：TGTGTCTTCTGTTCTCAAAG，
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：106的序列为：AGCACTGCCAGACTGAGAGGCAACG；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：107的序列为：TTTCTTTTGAATTCTGAGAGT；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：108的序列为：AGAAGACTTCAAAGACACTT；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C9片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：109的序列为：CTTTCACGAGGTCCAGAGATAC；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C9片段的单碱基延伸引物SEQ ID Nos：110的序列为：TCTCGTCTTTCTCCACCCTGG。
在其中一个实施例中，在所述单碱基延伸引物的5`端均加入10nt的固定序列ACGTTGGATG。
在其中一个实施例中，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟，95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保温。
在其中一个实施例中，所述限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
在其中一个实施例中，所述限制性内切酶消化处理的条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。
在其中一个实施例中，所述双向延伸反应的程序为：94℃30秒；95℃5秒，52℃5秒，80℃，5秒，5个循环，40个循环；72℃3分钟，4℃保温。
在其中一个实施例中，所述核酸质谱分析的具体步骤为：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干3-8分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充41ul ddH2O，用封口膜密封，3000rpm，瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000rpm，瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转30分钟，在3000rpm，离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
在其中一个实施例中，所述替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因为人类替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延技术，通过双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列。本发明所述的检测基因突变的方法与传统的SNP位点检测技术相比，可以在一个反应中实现多个SNP位点的检测，同时应用双向单碱基延伸技术使检测的精确度得到大幅度的提高，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1的核酸质谱分析图；
图2为本发明实施例替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-2的核酸质谱分析图；
图3为本发明实施例替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-3的核酸质谱分析图；
图4为本发明实施例替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP3A4的核酸质谱分析图；
图5为本发明实施例替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C9的核酸质谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例：一种人类替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法
1.提取血液样本DNA，
(1)将离心管中的500ul血液样品10000rpm离心2min，去除上清液，留沉淀备用。
(2)向上述离心管中加入350μl Buffer MCL和20μl Proteinase K，震荡混匀，65℃水浴20min，间或混匀。
(3)水浴完成之后向离心管中加入350μl Buffer MA和25μl SanMag Beads，振荡或者颠倒混匀，室温静置3min，间或混匀。
(4)将离心管置于磁力架上30s，待SanMag Beads完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
(5)向离心管中加入700μl 70％乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30s，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
(6)重复步骤(5)一次，室温开盖干燥10min至管内无液体残留。
(7)向离心管中加入50μl TE Buffer(pH8.0)，间或混匀。
(8)取出离心管并置于磁力架上30s，待SanMag Beads完全吸至管壁上之后，小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。
2.设计出特异性引物，
NCBI网站上查询并下载人类替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1、CYP2C19-2、CYP2C19-3、CYP3A4、CYP2C9的序列信息，在待测的位点的上下游选取20nt的特异性序列作为扩增引物。设计原则为：包含待测位点的DNA片段长度100bp-300bp均可，避免发夹结构和重复序列。设计完成以后，在引物5'端加入一段固定序列ACGTTGGATG。所设计的PCR引物序列如表1所示：
表1
3.设计出单碱基延伸引物，
单碱基延伸引物的设计同样是在该基因序列上设计，选择待测碱基位点上游和下游紧临的碱基，并根据质谱检测范围(4000道尔顿～9000道尔顿)，设计引物长度，设计原则引物扩增的第一个碱基即为待测碱基，而且避免发夹结构和重复序列。所设计的单碱基延伸引物序列如表2所示：
表2
4.核酸质谱分析
利用单管多重PCR技术扩增出包含CYP2C19-1、CYP2C19-2、CYP2C19-3、CYP3A4、CYP2C9基因的目的片段。
(1)配制1μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含CYP2C19-1、CYP2C19-2、CYP2C19-3、CYP3A4、CYP2C9多个SNP位点的正向引物和反向引物。
(2)根据说明书配制PCR反应液，每个PCR反应中分别加入DNA样本和对照样本。
(3)加入DNA样本后，96孔反应板于漩涡振荡器混匀，贴上封口膜。
(4)将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：95℃2分钟，；95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，45个循环；72℃5分钟，4℃保温。
(5)向PCR产物中加入0.75U的虾碱性磷酸酶，用0*Tris-Buffer调节缓冲液浓度，每个反应加入10*Tris-Buffer 0.5ul，然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟，然后85℃加热变性5分钟，最后冰浴10分钟。
(6)将各个位点的延伸引物稀释到10μM，计算在体系中的比例，然后配制iPLEX延伸引物反应液。
(7)在1.5mL管中配制iPLEX延伸反应液。
(8)每一个反应孔中加入2μl iPLEX延伸反应液，混匀。
(9)把板用膜封好，涡旋震荡和然后离心4000rpm 5秒。
(10)将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：
(11)反应结束后，向96孔板的每一个反应孔中加入41μl水，然后瞬时离心。
(12)将96孔板放入质谱仪，打开点样程序，进行自动点样操作。
(13)打开飞行质谱软件，设置好参数，进行检测。
(14)检测介绍后，在软件中自动生成结果，导出即可。
替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1、CYP2C19-2、CYP2C19-3、CYP3A4、CYP2C9的核酸质谱分析结果具体见图1-5。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 苏州华谦科技有限公司
<120> 一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法
<130> 2021.11.11
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
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<211> 30
<212> DNA
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<211> 30
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 14
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 20
tctcgtcttt ctccaccctg g 21
Claims (10)
1.一种替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，PCR产物经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延技术，通过双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列。
2.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述目标位点特异性引物包括：
用于扩增替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：31，反向引物为SEQ ID Nos：32；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：33，反向引物为SEQ ID Nos：34；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：35，反向引物为SEQ ID Nos：36；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：37，反向引物为SEQ ID Nos：38；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C9片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：39，反向引物为SEQ ID Nos：40。
3.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单碱基延伸技术所用的引物包括：
用于扩增替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因CYP2C19-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：101和SEQ ID Nos：102；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：SEQ ID Nos：103和SEQ ID Nos：104；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C19-3片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：105和SEQ ID Nos：106；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP3A4片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：107和SEQ ID Nos：108；
用于扩增替格瑞洛用药相关CYP2C9片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：109和SEQ ID Nos：110。
4.根据权利要求3所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，在所述单碱基延伸引物的5`端均加入10nt的固定序列ACGTTGGATG。
5.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟，95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保温。
6.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。
7.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶消化处理的条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。
8.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述双向延伸反应的程序为：94℃30秒；95℃5秒，52℃5秒，80℃，5秒，5个循环，40个循环；72℃3分钟，4℃保温。
9.根据权利要求1所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述核酸质谱分析的具体步骤为：
(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干3-8分钟；
(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充41ul ddH2O，用封口膜密封，3000rpm，瞬时离心；
(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000rpm，瞬时离心；
(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转30分钟，在3000rpm，离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。
10.根据权利要求1～9任一项所述的替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因为人类替格瑞洛用药相关细胞色素酶P450家族基因。
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2021
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