CN109239044A - 基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器，包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链包含转录因子识别序列I和三螺旋分子开关序列I；所述第二链包含转录因子识别序列II和三螺旋分子开关序列II；所述第二过渡辅助序列标记有荧光基团；所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列III，所述第三过渡辅助序列的末端标记有淬灭基团。本发明利用Ag⁺的稳定作用，构建了一种新型荧光探针‑剪刀形三螺旋分子开关，实现了在中性环境下对转录因子的快速、灵敏检测。检测过程简便，无酶参与，反应条件温和。

Description

基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器及其 应用

技术领域

本发明涉及转录因子荧光检测技术领域，具体涉及一种基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器及其在转录因子检测中的应用。

背景技术

转录因子(Transcription factors，TFs)是一类序列特异性DNA结合蛋白，通过结合基因调控区域中特异性双链DNA序列调节基因表达过程。TFs在基因复制、基因转录、细胞分裂以及DNA修复等重要生物过程中发挥重要作用。TFs的表达异常与人类多种疾病(如癌症、肿瘤等)密切相关。TFs的表达水平能够敏感地反映细胞发育阶段和疾病状态。因此，灵敏、特异地检测TFs对疾病的早期诊断和药物开发具有重要意义。

目前检测TFs的方法主要有电泳迁移率变动分析(EMSA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和电化学方法。然而，这些方法仍然存在一些不足。EMSA和ELISA分别需要放射性标记和TFs的特异性抗体，这将导致潜在的安全风险和狭窄的应用范围。电化学方法需要复杂的电极修饰过程。荧光检测策略由于其安全、简单以及灵敏度高等优势已被用于TFs的检测。目前，荧光检测方法大致分为两类：一类是基于双链DNA识别探针的构象转变，另一类是基于核酸外切酶或内切酶的保护。前者检测快速，但双链DNA识别探针需要进行特殊设计和优化，存在构型转变平衡，灵敏度较低。后者灵敏度较高，但非特异性蛋白结合会引起假阳性信号，此外，反应条件的微小变化均会对酶的活性产生影响，从而降低检测灵敏度。因此，有必要开发设计简单、无酶参与的荧光检测新方法，对TFs进行快速、灵敏检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器及其在转录因子检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器，包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；

所述第一过渡辅助序列由若干T碱基组成；

所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链包含转录因子识别序列I和三螺旋分子开关序列I；所述第二链包含转录因子识别序列II和三螺旋分子开关序列II；所述第二过渡辅助序列由若干T碱基组成，并标记有荧光基团；

所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列III，所述第三过渡辅助序列由若干碱基组成，第三过渡辅助序列的末端标记有淬灭基团。

进一步的，所述转录因子识别序列I和转录因子识别序列II互补。

优选的，所述荧光基团为FAM。

优选的，所述淬灭基团为BHQ。

本发明的第二方面，提供上述荧光传感器在检测转录因子中的应用。

本发明的第三方面，提供一种检测NF-κB p50的荧光传感器，包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；

所述第一过渡辅助序列的碱基组成为TTT；

所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链的碱基组成为GAGAGAGGGAAAGTCCC(SEQ ID NO.1)，所述第二链的碱基组成为GGGACTTTC C CTCT C TCTC(SEQ ID NO.2)，所述第二过渡辅助序列的碱基组成为TTT，第二过渡辅助序列上标记有荧光基团FAM；

所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列，所述第三过渡辅助序列的碱基组成为TTTTT，第三过渡序列的末端标记有淬灭基团BHQ；所述三螺旋分子开关序列的碱基组成为CTCTCTCTCCCTTTC(SEQ ID NO.3)。

本发明的第四方面，提供一种检测NF-κB p50的方法，包括以下步骤：

将上述检测NF-κB p50的荧光传感器和AgNO₃在PBS缓冲溶液中混合均匀，孵育，然后加入不同浓度的NF-κB p50，二次孵育，然后进行荧光检测，构建荧光强度与NF-κB p50浓度之间的线性关系，利用构建的线性关系对NF-κB p50进行检测。

优选的，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4。

优选的，所述AgNO₃的浓度为20μM。

优选的，所述孵育的条件为：37℃恒温箱中30min。

优选的，所述二次孵育的条件为：37℃恒温箱中10min。

本发明的有益效果：

本发明利用Ag⁺的稳定作用，构建了一种新型荧光探针-剪刀形三螺旋分子开关，实现了在中性环境(接近生理环境)下对转录因子(特别是NF-κB p50)的快速、灵敏检测。检测过程简便，无酶参与，反应条件温和。三螺旋分子开关设计简单，具有通用性，只要根据靶标适当改变开关中对应的识别序列，即可用于其他转录因子的检测。该传感器具有良好的选择性，并且在实际样品的临床检测中具有潜在的应用性。

附图说明

图1：Ag⁺稳定的剪刀形三螺旋分子开关快速灵敏检测转录因子原理图。

图2：NF-κB p50检测的荧光光谱表征；其中，a为50nmol/L FBM-3；b为50nmol/LFBM-3+50nmol/L NF-κB p50；c为50nmol/L FBM-3+20μmol/L Ag⁺；d为50nmol/L FBM-3+20μmol/L Ag⁺+50nmol/L NF-κB p50。

图3：三螺旋开关的熔解曲线；其中，a为1μmol/L FBM-3；b为1μmol/L FBM-1+20μmol/L Ag⁺；c为1μmol/L FBM-2+20μmol/L Ag⁺；d为1μmol/L FBM-3+20μmol/L Ag⁺；e为1μmol/L FBM-4+20μmol/L Ag⁺。

图4：三螺旋开关用于检测NF-kB p50的特异性；其中，1为人凝血酶(Humanthrombin)；2为人免疫球蛋白G(Human IgG)；3为癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen)；4为NF-κB p50；5为混合样品(Mixed samples)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，现有的转录因子荧光检测方法中，基于双链DNA识别探针的构象转变，双链DNA识别探针需要进行特殊设计和优化，存在构型转变平衡，灵敏度较低；基于核酸外切酶或内切酶的保护，非特异性蛋白结合会引起假阳性信号，此外，反应条件的微小变化均会对酶的活性产生影响，从而降低检测灵敏度。近来，三螺旋DNA(triplex DNA)在序列特异性标记、调控基因表达和构建DNA纳米结构方面已经成为最有吸引力的识别图案之一。其中，包含C-GοC和T-AοT(-代表沃森-克里克碱基配对，ο代表胡斯坦碱基配对)两种结构单元的triplex DNA应用最为广泛。但是，triplex DNA只能在弱酸性环境中形成及稳定存在，极大限制了其应用范围。本发明通过构建Ag⁺稳定的剪刀形三螺旋分子开关(Ag+-stabilized forficiform triple helix molecular switch，Ag+-FTHMS)，提出了一种设计简单、无酶参与的TFs检测新方法，对TFs进行快速、灵敏检测，获得了满意的结果。

本发明的基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器，包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；

所述第一过渡辅助序列由3-5个T碱基组成；

所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链包含转录因子识别序列I和三螺旋分子开关序列I；所述第二链包含转录因子识别序列II和三螺旋分子开关序列II；所述第二过渡辅助序列由3-5个T碱基组成，并标记有荧光基团FAM；

所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列III，所述第三过渡辅助序列由4-6个T碱基组成，第三过渡辅助序列的末端标记有淬灭基团BHQ。

所述转录因子识别序列I和转录因子识别序列II互补；所述三螺旋分子开关序列I包含部分的转录因子识别序列I；所述三螺旋分子开关序列II包含部分的转录因子识别序列II；所述三螺旋分子开关序列III与三螺旋分子开关序列II的序列相同。

本发明的荧光传感器具有通用性，只要根据靶标适当改变开关中对应的转录因子识别序列，即可用于其他转录因子的检测。

在本发明的一种优选实施方案中，给出了一种检测NF-κB p50的荧光传感器，其结构如下：

其中，双链臂中斜粗体阴影部分为目标物NF-κB p50的识别序列，三条链中下划线部分为三螺旋分子开关的组成序列，方框部分为过渡辅助序列。

本发明的荧光传感器的构建及检测NF-κB p50的原理如图1所示，荧光传感器的两条臂中的双链臂上端第二过渡辅助序列(粉红区域)上标记荧光基团(FAM)，蓝色区域为目标物NF-κB p50的识别序列，黑色区域和一部分NF-κB p50的识别区域为三螺旋开关组成序列。单链臂上端第三过渡辅助序列(粉红区域)末端标记猝灭基团(BHQ)，蓝色和黑色区域为三螺旋开关组成序列。银离子促使FBM的两条臂相互靠近，剪刀闭合，形成剪刀形三螺旋结构开关Ag⁺-FTHMS。转录因子不存在时,剪刀处于闭合，三螺旋开关“关闭”，荧光基团和猝灭基团发生荧光共振能量转移，荧光被猝灭。转录因子存在时，特异性结合包含在开关双链臂中的双链识别序列，取代单链臂，剪刀张开，三螺旋开关“打开”，猝灭基团远离荧光基团，荧光恢复。基于上述原理，本发明构建了一种设计简单、无酶参与的荧光传感器，实现对NF-κBp50的快速灵敏检测。

本发明在试验过程中设计了多组检测NF-κB p50的荧光传感器，其结构如表1所示。表1：

利用荧光分光光度计记录体系的荧光信号变化，如图2所示。FBM产生较强的荧光信号(a)，说明没有产生三螺旋结构开关，加入目标物NF-κB p50时，荧光信号强度几乎不变(b)。当向含有FBM的体系中加入Ag⁺后，荧光信号强度显著降低(c)，说明Ag⁺银离子促使FBM两条臂膀靠近进而形成三螺旋结构开关，此时不存在目标物，开关处于关闭状态，标记在两条臂末端的荧光基团和猝灭基团发生荧光共振能量转移，荧光被猝灭。当向含有FBM和Ag⁺的体系中加入目标物NF-κB p50时，荧光信号强度明显增强(d)，表明NF-κB p50与三螺旋结构开关中的双链识别序列结合，并将取代单链臂，开关打开，导致荧光基团远离猝灭基团，荧光恢复。

此外，利用熔解曲线进一步验证了Ag⁺对三螺旋开关稳定性的影响，如图3所示。当不存在Ag⁺时，FBM-3的Tm为35℃(a)，当Ag⁺存在时，由FBM-3组装合成的Ag⁺-FTHMS的Tm的显著升高(Tm为58℃，d)，进一步证实了Ag⁺对三螺旋开关的稳定作用。

在Ag⁺的辅助下，随着FBM的碱基数逐渐增多(由58个(FBM-1)增加至62个(FBM-3))，FBM两条臂的亲和力逐渐增强，生成的Ag⁺-FTHMS的数量逐渐增多，背景信号(F0)逐渐减小，当FBM的碱基数继续增加至64个(FBM-4)时，FBM两条臂之间逐渐增大的静电斥力削弱了它们之间的亲和力，阻碍生成Ag⁺-FTHMS，F0又会增大。由熔解曲线(图3)也可得出同样结论，当FBM的碱基数由58个(FBM-1，b)增加至62个(FBM-3，d)时，Tm逐渐升高，稳定性逐渐增强，说明生成的Ag⁺-FTHMS的数量逐渐增多，当FBM的碱基数继续增加至64个(FBM-4，e)时，Tm又逐渐降低，稳定性逐渐减弱，说明生成的Ag⁺-FTHMS的数量减少。因此，当FBM的碱基数为62个(FBM-3)时，生成的Ag⁺-FTHMS的数量最多，F0最小。由于目标物NF-κB p50对Ag⁺-FTHMS的双链臂的亲和力远大于单链臂对双链臂的亲和力，所以，当目标物存在时，发生取代反应产生的荧光信号强度几乎不受碱基数的影响，即阳性信号(F)基本保持不变，所以，当FBM碱基数为62(FBM-3)时，荧光信号强度ΔF(ΔF＝F-F0)最大，因此，FBM的最优碱基数为62(FBM-3)。

Ag⁺-FTHMS的稳定性也受Ag⁺浓度的影响，ΔF随着Ag⁺浓度的增大而增大，当Ag⁺浓度增大至20μM时，ΔF到达平台。当继续增大Ag⁺浓度时，ΔF逐渐减小，这可能是因为过量的Ag⁺易形成C-Ag-C复合物。所以Ag⁺的最优浓度为20μM。

ΔF随着pH的增加而增大，在pH为7.4时，ΔF具有最大值。当pH大于7.4时，ΔF逐渐减小，这是因为碱性环境会促使氧化银沉淀的形成，进而破坏了Ag⁺-FTHMS的稳定性。所以，最优pH为7.4。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

其中，荧光分光光度计(Cary Eclipse，安捷伦，美国)，紫外可见(UV-vis)吸收光谱仪(UV-2550，苏州贝锐仪器科技公司，中国)，干式恒温器(K30，杭州奥盛仪器有限公司，中国)，超声波清洗机(Branson-200型，中美合资必能信超有限公司，中国)，涡旋震荡器(H-101型，上海康禾光电仪器有限公司，中国)，酸度计(pHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司，中国)。

本发明实施例中所用到的DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和提纯，序列如表1所示。NF-κB p50(一种癌症标志物)购自Cayman Chemical(Ann Arbor,MI,USA)，人凝血酶、人免疫球蛋白G、癌胚抗原购于Sigma-Aldrich Co.(St Louis,MO,USA)。反应缓冲液：10mmol/L PBS(pH 7.4),100mol/L NaNO₃。海拉细胞裂解液的制备按照文献(ZhuJ,Ding Y S,Liu X T,et al.Biosens.Bioelectro.,2014,59:276)进行。其它试剂均来自上海国药集团化学试剂有限公司。实验中所用溶液均采用高纯水(>18.25MΩ)配制。

实施例1：检测NF-κB p50的荧光传感器

检测NF-κB p50的荧光传感器包括：包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；

所述第一过渡辅助序列的碱基组成为TTT；

所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链的碱基组成为GAGAGAGGGAAAGTCCC(SEQ ID NO.1)，所述第二链的碱基组成为GGGACTTTCC CT CTC TCTC(SEQ ID NO.2)，所述第二过渡辅助序列的碱基组成为TTT，第二过渡辅助序列上标记有荧光基团FAM；

所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列，所述第三过渡辅助序列的碱基组成为TTTTT，第三过渡序列的末端标记有淬灭基团BHQ；所述三螺旋分子开关序列的碱基组成为CTCTCTCTCCCTTTC(SEQ ID NO.3)。

实施例2：荧光传感器的线性范围

在最优实验条件下，测定不同浓度的NF-κB p50的荧光强度。荧光强度随着NF-κBp50浓度的增加而逐渐增强。在浓度为0.5nmol/L～50nmol/L范围内，体系的荧光强度与其浓度呈良好的线性关系。线性方程为ΔF＝6.45C–3.23(C:nmol/L,R＝0.9961)，检测限达0.3nmol/L(以信噪比S/N＝3计算)，优于文献报道的灵敏度。通过平行测定8组25nmol/L来评估该生物传感器的重现性，相对标准偏差(RSD)为1.7％。

实施例3：传感器的选择性

在相同实验条件下，分别将干扰蛋白人凝血酶、人免疫球蛋白G、癌胚抗原和NF-κBp50以及混合样品进行荧光测量。如图4所示，检测体系中只有人凝血酶或人免疫球蛋白G或癌胚抗原时，荧光强度远低于体系中存在目标物NF-κB p50时的荧光强度。当体系中存在混合样品时，得到与仅有NF-κB p50时相当的荧光信号，这表明该传感器检测方法具有良好的特异性。

实施例4：回收率实验

为了验证该传感器是否具有临床应用的可能性，将25nmol/L的NF-κB p50加入到Hela细胞裂解液(1：10稀释)中，而后进行回收实验，3次测定平均回收率为101.2％，回收率标准偏差为0.3％，说明该传感器在实际样品的检测中具有潜在的应用性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器及其应用

<130> 2018

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagagaggga aagtccc 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggactttcc ctctctctc 19

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctctctctcc ctttc 15

Claims (10)

1.一种基于银离子稳定的剪刀形三螺旋分子开关的荧光传感器，其特征在于，包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；

所述第一过渡辅助序列由若干T碱基组成；

所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链包含转录因子识别序列I和三螺旋分子开关序列I；所述第二链包含转录因子识别序列II和三螺旋分子开关序列II；所述第二过渡辅助序列由若干T碱基组成，并标记有荧光基团；

所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列III，所述第三过渡辅助序列由若干碱基组成，第三过渡辅助序列的末端标记有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于，所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ。

3.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于，所述转录因子识别序列I和转录因子识别序列II互补。

4.权利要求1-3任一项所述的荧光传感器在检测转录因子中的应用。

5.一种检测NF-κB p50的荧光传感器，其特征在于，包括：通过第一过渡辅助序列连接的双链臂和单链臂；

所述第一过渡辅助序列的碱基组成为TTT；

所述双链臂包括通过第二过渡辅助序列连接的第一链和第二链；所述第一链的碱基组成为GAGAGAGGGAAAGTCCC，所述第二链的碱基组成为GGGACTTTC C CT CT C TCTC，所述第二过渡辅助序列的碱基组成为TTT，第二过渡辅助序列上标记有荧光基团FAM；

所述单链臂包括第三过渡辅助序列和三螺旋分子开关序列，所述第三过渡辅助序列的碱基组成为TTTTT，第三过渡序列的末端标记有淬灭基团BHQ；所述三螺旋分子开关序列的碱基组成为CTCTCTCTCCCTTTC。

6.一种检测NF-κB p50的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求5所述的荧光传感器和AgNO₃在PBS缓冲溶液中混合均匀，孵育，然后加入不同浓度的NF-κB p50，二次孵育，进行荧光检测，构建荧光强度与NF-κB p50浓度之间的线性关系，利用构建的线性关系对NF-κB p50进行检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述AgNO₃的浓度为20μM。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述孵育的条件为：37℃恒温箱中30min。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述二次孵育的条件为：37℃恒温箱中10min。