CN109706221B - 一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术定量检测突变DNA的方法 - Google Patents

一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术定量检测突变DNA的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于GQDs的共振光检测探针结合CHA技术定量检测突变DNA的方法。本发明首先合成石墨烯量子点，接着针对目标物设计了两种发夹探针H1、H2，然后将探针与GQDs通过缩合反应制备两种探针GQDs‑H1,GQDs‑H2。在PBS缓冲溶液反应体系中，当加入p53突变DNA时，会引起GQDs‑H1和GQDs‑H2的聚集，产生显著增强的共振光信号，实现对p53突变DNA的定量检测。本发明具有很高的灵敏度和选择性，线性范围为1pM到50nM，检测限为0.8pM，能有效地定量检测目标物。

Description

一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术定量检测突变 DNA的方法
技术领域
本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种基于GQDs共振光散射探针结合CHA技术定量检测突变DNA的方法。
背景技术
石墨烯量子点(GQDs)由于具有光稳定性好，水溶性好，毒性低，生物相容性好等特点，所以被广泛应用于生物医药各个领域。例如：石墨烯量子点可以作为药物递送的有效载体(Zheng,X.T.,Than,A.,Ananthanaraya,A.,Kim,D.H.,Chen,P.,Acs Nano,2013,7,6278-6286)，石墨烯量子点也具有良好的药物负载能力(Wang,J.,Liu,C.H.,Shuai,Y.,Cui.X.Y.,B.,Xia,Y.Z.,Zhang,Niel.L.,Colloids Surf.B Biointerfaces,2013,112,192-6)。除此之外，石墨烯量子点也可用于小分子检测(Lin,L.P.,Rong,M.C.,L,S.S.,Song,X.H.,Zhong,Y.X.,Yan,J.W.,Wang,Y.R.,Chen,X.,Nanoscale,2015,7,1872.)，DNA检测(Wang,G.L.,Fang,X.,Wu,X.M.,Hu,X.L.,Li,Z.J.Biosens.Bioelectron.,2016,81,214-220)，以及癌症标志物检测(Hu,T.X.,Zhang,L.,Wen,W.,Zhang,X.H.,Wang,S.F.Biosens.Bioelectron.,2016,77,451-456)。但是基于GQDs的共振光散射法用于突变DNA的检测尚未报道。共振光技术(RLS)始于20世纪90年代，因其操作简单、快速、灵敏等优点，引起了人们的广泛关注。因此，设计一种简单、免酶且灵敏的共振光散射法用于突变DNA的检测是必要的。
目前，已经设计了多种信号放大技术来实现低水平的DNA检测，然而这些方法还存在一定的缺陷。例如，聚合酶链式反应(PCR)经常被用来检测DNA，然而该方法需要复杂的聚合酶复制过程，而且很难应用于短链DNA检测(Miotke,L.,Lau,B.T.,Rumma,R.T.,Ji,H.P.,Anal.Chem.,2014,86,2618-2624)。Cheng等人开发了滚环扩增(RCA)技术结合电化学分析的方法用于检测DNA，然而该方法高度依赖酶，需要精确控制反应条件，如pH，温度和缓冲液，并且存在稳定性较差和电极修饰困难等问题，因此限制了其发展(Cheng,W.,Zhang,W.,Yan,Y.R.,Shen,B.,Zhu,D.,Lei,P.H.,Ding,S.J.,Biosens.Bioelectron.,2014,62,274-279)。Wang等人开发了一种连接酶链式反应(LCR)的表面增强拉曼散射的方法用于DNA的检测，但是该方法需要探针与金属纳米颗粒结合，合成步骤复杂，增加了检测成本(Wang,Y.L.,Wee,E.J.,Trau,M.Chem.Commun.,2015,51,10953-6)。催化发夹组装(CHA)技术相对于现有技术来说，具有设计简单，成本低，更加稳定，不需要额外的聚合酶或者其它酶，可以在温和的条件下操作等优势，所以其作为一种高灵敏度和高选择性的信号放大方法已用于生物分子检测的研究。
发明内容
为了改善已有的分析技术在DNA检测时检测过程复杂、检测成本高、检测时间长等问题，本发明的目的是在于提供一种低成本、高灵敏度、高选择性的检测方法来实现DNA的检测。
根据共振光散射理论，粒子体积的增大和强静电结合及大结合数所导致的高度的电子离域共轭，都会产生强烈的共振光散射现象。本发明中，p53突变DNA与H1中的部分序列互补配对，从而将H1打开，形成DNA双链，裸露出的DNA序列打开H2，形成H1/H2复合物，目标物被竞争下来进入下一轮循环，如此循环，形成越来越多的H1/H2复合物。H1和H2缀合到石墨烯量子点上会形成越来越多的石墨烯量子点聚集体，石墨烯量子点体积增大，导致该体系产生与p53突变DNA浓度相对应的共振光信号，据此可以实现对p53突变DNA的定量检测。
技术方案包括如下步骤：
(一)石墨烯量子点的制备
将2g柠檬酸置于圆底烧瓶中，在200℃下用加热套加热30分钟，柠檬酸逐渐溶化,其颜色从无色变为橙色。然后，在剧烈搅拌下将100mL 10mg mL-1NaOH溶液逐滴加入到反应混合物,并搅拌30分钟，得到的GQDs溶液调节至中性并储存在冰箱中。
(二)一种发夹型DNA探针的设计，具有：
茎环结构H1：NH2C6-GAC TCC GGT TCA TGC ATA TAG GAG TCC GAG CAT GAA CCG
其中内嵌有p53突变DNA完全互补的碱基序列GAC TCC GGT TCA TGC；
发夹H2：NH2C6-TCA TGC TCG GAC TCC TAT ATG CAT GAA CCG GAG TCC GAG
其中的碱基序列TCA TGC TCG GAC TCC TAT ATG CAT GAA CCG GAG TC与H1中的碱基序列GAC TCC GGT TCA TGC ATA TAG GAG TCC GAG CAT GA互补。
进一步的，发夹H1的5’端GAC TCC GGT TCA TGC序列因为与目标p53突变DNA完全互补配对，所以当加入目标物后，H1可以被打开；
设计H2中的TCA TGC TCG GAC TCC TAT ATG CAT GAACCG GAG TC因为与H1中的碱基序列GAC TCC GGT TCA TGC ATA TAG GAG TCC GAG CAT GA完全互补，所以可以将与H1杂交的目标物给替换下来，从而进行目标物的循环。
(三)石墨烯量子点和氨基修饰的发夹探针的缀合
取10mL的离心管，加入0.1mg mL-1的石墨烯量子点溶液，超声15min。然后，再加入50mM EDC和10mM NHS，在室温下搅拌30min，以使石墨烯量子点上的羧基活化。将GQDs溶液分成两份相等的体积。分别加入两份体积相同的氨基修饰的发夹探针H1、H2,在室温下进行缩合反应,持续反应一夜，得到GQDs-H1,GQDs-H2缀合物
(四)样品的检测
步骤一：在PBS缓冲体系中，将GQDs-H1、GQDs-H2缀合物溶液与不同浓度的p53突变DNA在37℃下反应1h；
步骤二：将溶液置于荧光分光光度计上，激发和发射狭缝宽度设置为3.0nm，以相同的激发和发射波长，在220到700nm的范围内进行共振光散射扫描，得到共振光散射光谱以对p53突变DNA进行定量检测。
进一步的，样品检测中所用的PBS缓冲溶液pH值为7.4。
与现有技术相比，本发明基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术定量检测突变DNA的方法，具有特异性强、所需检测设备简单、试剂易得、易于操作、检测时间短、线性范围较宽、灵敏度较高等特点，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为一种基于GQDs与CHA技术的共振光散射探针检测突变DNA的原理图。
图2为本实验中的探针序列和目标p53突变DNA序列及不同错配碱基的DNA序列。
图3为GQDs与氨基修饰的发夹探针结合的紫外吸收图。
图4为加入目标p53突变DNA后，GQDs聚集的荧光光谱图。
图5为不同情况下发夹H(H1或H2)修饰的GQDs反应体系的共振光散射强度对比关系图。
图6为琼脂糖凝胶电泳验证CHA技术的可行性。
图7为不同GQDs和发夹H(H1或H2)的浓度的比例对共振光散射强度的优化关系图
图8为温度对共振光散射强度影响的关系图。
图9为时间与共振光散射强度变化的关系图。
图10为不同浓度p53突变DNA的共振光光谱图及线性关系曲线图。
图11为对不同错配碱基序列DNA的特异性检测图。
图12为共振光散射探针应用于血清检测中的加标回收实验表。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1
一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术在定量检测突变DNA中的可行性验证
(1)p53突变DNA的共振光检测
将GQDs-H1和GQDs-H2(GQDs:90ng/mL；H1、H2:120nM)加入到10mM PBS中,加入不同浓度的目标物，在37℃下反应1h。最后，通过用RF-5301PC荧光分光光度计(岛津，日本)将激发和发射单色仪(λex＝λem)从220.0nm同步扫描到700.0nm获得所得反应溶液的共振光光谱。激发和发射狭缝宽度设置为3.0nm。
(2)吸收光谱测定
用UV-2450分光光度计(岛津，日本)检测氨基修饰的发夹H和石墨烯量子点的结合。在具有1.0mm路径长度的石英比色皿中，在200-600nm的波长范围内获得吸收光谱。氨基修饰的发夹探针H(10μM)在缓冲液(10.0mM PBS，pH 7.4)中进行测量。石墨烯量子点溶液(2μM)在pH 7.4缓冲液中测量。石墨烯量子点溶液在含有氨基修饰的发夹DNA，石墨烯量子点溶液(2μM)在pH 7.4下缓冲并进行吸收光谱分析。如图3a所示，发夹DNA显示出最大值为260nm的特征吸收曲线。如图3b所示，石墨烯量子点显示出在360nm的特征吸收光谱。如图3c所示，在GQD-H中观察到260nm处的吸收峰，表明DNA有效地共价连接至GQDs表面。
(3)荧光光谱测定
通过用RF-5301PC荧光分光光度计(岛津，日本)来验证由目标物加入后导致发夹修饰的石墨烯量子点的聚集。将GQDs-H1和GQDs-H2(GQDs:90ng/mL；H1、H2:120nM)加入到10mM PBS(pH 7.4)中,加入不同浓度的目标物，在37℃下反应1h。如图4所示，与在460nm处具有荧光发射的裸GQDs相比,GQDs-H聚集，GQD有明显的荧光猝灭。
(4)共振光光谱测定
由图5所示，从曲线a到e，其共振光曲线形状几乎保持一致。因此在460nm处的共振光峰可用作体系的特征吸收峰。对于仅含有GQDs-H1的溶液(图5中的曲线a)，共振光信号在469nm处最小。在GQDs-H1中添加p53突变DNA后，GQDs-H1的共振光散射强度几乎没有发生变化(图5中的曲线b)。然而，在系统中存在GQDs-H1和GQDs-H2时，由于H1与H2杂交(曲线c)引起的GQDs聚集，共振光强度稍微改变。此外，在包含GQDs-H1和GQDs-H2的溶液中引入靶突变体p53基因导致共振光信号显着增加(图5中的曲线d)。这种现象说明GQDs-H形成聚集体。
(5)凝胶电泳实验
用2.5％的琼脂糖凝胶电泳实验来验证催化发夹自组装扩增反应的可行性。样品1,2和3分别为目标DNA，H1和H2。样品4为H1和目标DNA。样品5是H1和H2的混合物。样品6是H1，H2和目标DNA。所有样品都在37℃孵育1h。在1×TAE缓冲液(88mM Tris-乙酸和2mMEDTA，pH 8.0)中的2.5％琼脂糖凝胶用于解析CHA反应序列和产物，然后通过80V的恒定电压驱动凝胶电泳分离80分钟。最后，通过Bio-Rad Laboratories(USA)凝胶成像系统拍摄凝胶。
如图6所示，泳道1、泳道2和泳道3分别显示目标带H1和H2。目标DNA因为是最小的分子，所以它显示出最高的迁移率。H1和H2迁移率相同，低于目标DNA。当目标DNA加入到H1中时，泳道4显示在两个发夹DNA之间形成的H1、靶DNA和未反应的H1。泳道5中的合并带仅显示可以形成少量的H1：H2双链体，说明H1，H2共同存在时很稳定。然而，当加入目标物时，产物的条带更明显(泳道6)，表明目标DNA成功的进行了组装。
实施例3
一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术在定量检测突变DNA的优化
该方法的检测效率受石墨烯量子点(GQDs)浓度和发夹H浓度以及反应时间和工作温度等因素的影响。通过优化，得出了最佳的实验条件为：石墨烯量子点(GQDs)的浓度为90ng/mL,发夹H浓度为120nM；反应时间为60分钟；最佳反应温度37℃。
实施例4
一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术在定量检测突变DNA中的灵敏性测定
将一系列不同浓度的p53突变DNA与探针一起加入，并在最佳条件下获得信号。如图10A所示，在460nm处观察到最强的RLS带，并且共振光光谱随着随着p53突变DNA浓度的增加逐渐增加。如图10B和10C所示，在两个线性范围内，ΔIRLS的值随着目标浓度从1pM到50nM而增加。在1pM-1.5nM的范围曲线的相关方程为ΔIRLS＝0.2123C+37.39(R2＝0.9962)，在1.5nM-50nM的范围内ΔIRLS＝163.8logC-173.4(R2＝0.9951)(ΔI＝I-I0,I，I0分别为加入p53突变DNA和不加p53突变DNA的共振光强度)。检测限为0.8pM(3σ)。
实施例5
一种基于GQDs的共振光散射探针结合CHA技术在定量检测突变DNA中的特异性分析
如图11所示，与空白样品相比，在添加单碱基错配、双碱基错配、三碱基错配、四碱基错配、完全不匹配的DNA序列时，样品中几乎观察不到明显的RLS信号强度变化。实验结果表明，由于目标物与其发夹探针之间的特异性结合，所提出的策略对检测p53突变DNA具有良好的选择性。
实施例5
本发明方法用于血清中样品的测定
将不同种浓度的p53突变DNA加入到人血清样品的稀释液中，并使用共振光散射技术检测。如图12所示，所提出的方法具有良好的回收率，表明该方法在临床诊断方面具有很大的潜力。

Claims (1)

1.一种基于GQDs和CHA技术定量检测突变DNA的共振光散射探针，共振光散射探针包含：
茎环结构H1：GQD-NH2C6-GAC TCC GGT TCA TGC ATATAG GAG TCC GAG CAT GAA CCG
发夹H2：GQD-NHC6-TCATGC TCG GAC TCC TATATG CAT GAACCG GAG TCC GAG其特征在于：
茎环结构H1，由GQD和DNA链缀合，内嵌有与p53突变DNA完全互补的碱基序列GAC TCCGGT TCATGC，当加入目标物后，H1可以被打开；
发夹H2，由GQD和DNA链缀合，其中的碱基序列TCATGC TCG GAC TCC TATATG CATGAACCG GAG TC与H1中的碱基序列GAC TCC GGT TCATGC ATATAG GAG TCC GAG CAT GA互补，可以将与H1杂交的目标物给替换下来，从而进行目标物的循环。
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