JP2002514571A - ゲノムアプローチを使用して同定されるタンパク質を機能的に分類するためのハイスループット方法 - Google Patents
ゲノムアプローチを使用して同定されるタンパク質を機能的に分類するためのハイスループット方法Info
- Publication number
- JP2002514571A JP2002514571A JP2000520138A JP2000520138A JP2002514571A JP 2002514571 A JP2002514571 A JP 2002514571A JP 2000520138 A JP2000520138 A JP 2000520138A JP 2000520138 A JP2000520138 A JP 2000520138A JP 2002514571 A JP2002514571 A JP 2002514571A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- unfolding
- containers
- different molecules
- curve
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 443
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 422
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 134
- 238000013459 approach Methods 0.000 title description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 148
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 91
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 91
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 75
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 71
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 38
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 16
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 9
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 4
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims 2
- 102000018315 Parkinson Disease Associated Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010066305 Parkinson Disease Associated Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 278
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 136
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 135
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 112
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 105
- 230000006870 function Effects 0.000 description 58
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 43
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 29
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 29
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 28
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 28
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 25
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 25
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 24
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 24
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 24
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 23
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 23
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 22
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 22
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 22
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 20
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 17
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 14
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 14
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 14
- -1 etc.) Substances 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 11
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 11
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 9
- NLTUCYMLOPLUHL-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-[gamma-thio]triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O NLTUCYMLOPLUHL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 9
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 8
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 8
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 8
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 8
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 7
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 7
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 7
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 7
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 6
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- MGVRBUNKWISLAM-DQWUKECYSA-N (4s)-5-[[(2s)-1-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]-[(2s)-4-methyl-1-oxo-1-sulfooxypentan-2-yl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-[[(2s)-1-[(2s,3s)-2-[[(2s)-4-carboxy-2-[[(2s)-4-carboxy-2-[[(2s)-2-[[(2s)-3-carboxy-2-[[2-[[(2s)-2,4-diamino- Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N([C@@H](CC(C)C)C(=O)OS(O)(=O)=O)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C1=CC=CC=C1 MGVRBUNKWISLAM-DQWUKECYSA-N 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 5
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 5
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 5
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 5
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 5
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 5
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 5
- 108010059239 hirugen Proteins 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000012912 drug discovery process Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 150000007978 oxazole derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- RRPQOOFYAFVXKH-UHFFFAOYSA-N 1,3-oxazole-2-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=NC=CO1 RRPQOOFYAFVXKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KLZUFWVZNOTSEM-UHFFFAOYSA-K Aluminium flouride Chemical compound F[Al](F)F KLZUFWVZNOTSEM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 3
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 3
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KEQFTVQCIQJIQW-UHFFFAOYSA-N N-Phenyl-2-naphthylamine Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=CC=1NC1=CC=CC=C1 KEQFTVQCIQJIQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(3s)-1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)CCl)C1=CC=CC=C1 KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPPQGYCZBNURDG-UHFFFAOYSA-N 2-propionyl-6-dimethylaminonaphthalene Chemical compound C1=C(N(C)C)C=CC2=CC(C(=O)CC)=CC=C21 MPPQGYCZBNURDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTRBOZNMGVDGHY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-methylanilino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1NC1=CC=C(C=C(C=C2)S(O)(=O)=O)C2=C1 VTRBOZNMGVDGHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 101000609447 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P25 Proteins 0.000 description 2
- 101001049979 Bos taurus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 2
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 2
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- JHDGGIDITFLRJY-UHFFFAOYSA-N laurdan Chemical compound C1=C(N(C)C)C=CC2=CC(C(=O)CCCCCCCCCCC)=CC=C21 JHDGGIDITFLRJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 2
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 2
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 2
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 2
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 2
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 2
- XDIYNQZUNSSENW-NUVHGKSTSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-NUVHGKSTSA-N 0.000 description 1
- VLFYEJLWSPRLPB-NETUVYTNSA-N (4s)-4-[[(2s)-1-[(2s,3s)-2-[[(2s)-4-carboxy-2-[[(2s)-4-carboxy-2-[[(2s)-2-[[(2s)-3-carboxy-2-[[2-[[(2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]butanoyl]amino]butanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-ca Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C1=CC=CC=C1 VLFYEJLWSPRLPB-NETUVYTNSA-N 0.000 description 1
- RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L (5-hydroxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)methyl phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP([O-])([O-])=O)C(C)=C1O RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PFPNDONTABKZNK-UHFFFAOYSA-N 1,3-oxazole sulfuryl dichloride Chemical compound S(=O)(=O)(Cl)Cl.O1C=NC=C1 PFPNDONTABKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQHYICHMGNSGQH-UHFFFAOYSA-N 1,3-oxazole-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CO1 CQHYICHMGNSGQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYTTVTCLPQITSM-UHFFFAOYSA-N 1,3-oxazole-2-sulfonohydrazide Chemical compound O1C(=NC=C1)S(=O)(=O)NN GYTTVTCLPQITSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEANZWXEJRRYTD-UHFFFAOYSA-M 2-[(6-hexadecanoylnaphthalen-2-yl)-methylamino]ethyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N(C)CC[N+](C)(C)C)C=CC2=CC(C(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)=CC=C21 HEANZWXEJRRYTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OGQSKUQBPUTFHS-UHFFFAOYSA-N 2-[1-[6-(dimethylamino)naphthalen-2-yl]ethylidene]propanedinitrile Chemical compound C1=C(C(C)=C(C#N)C#N)C=CC2=CC(N(C)C)=CC=C21 OGQSKUQBPUTFHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KQLXBKWUVBMXEM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 KQLXBKWUVBMXEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCFFYALKHPIRKJ-UHFFFAOYSA-N 3-[18-(2-carboxylatoethyl)-8,13-bis(ethenyl)-3,7,12,17-tetramethyl-22,23-dihydroporphyrin-21,24-diium-2-yl]propanoate Chemical compound N1C(C=C2C(=C(C)C(=CC=3C(C)=C(CCC(O)=O)C(N=3)=C3)N2)C=C)=C(C)C(C=C)=C1C=C1C(C)=C(CCC(O)=O)C3=N1 ZCFFYALKHPIRKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZNCYFNAQLNQTDC-UHFFFAOYSA-N 6-(2-methylanilino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1NC1=CC=C(C=C(C=C2)S(O)(=O)=O)C2=C1 ZNCYFNAQLNQTDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMJIMMOCXHMQJN-UHFFFAOYSA-N 6-(3-methylanilino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC(NC=2C=C3C=CC(=CC3=CC=2)S(O)(=O)=O)=C1 VMJIMMOCXHMQJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEQXXQFTJDKYAX-UHFFFAOYSA-N 6-(cyclohexylamino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2C=C1NC1CCCCC1 LEQXXQFTJDKYAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLWGJWPCYRPPMQ-UHFFFAOYSA-N 6-(dimethylamino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=CC2=CC(N(C)C)=CC=C21 MLWGJWPCYRPPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGKOJZBNNSRXRO-UHFFFAOYSA-N 6-(n-methylanilino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C=1C=C2C=C(S(O)(=O)=O)C=CC2=CC=1N(C)C1=CC=CC=C1 MGKOJZBNNSRXRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEMRCUIXRUXGJX-UHFFFAOYSA-N 6-aminonaphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=CC2=CC(N)=CC=C21 SEMRCUIXRUXGJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTFZXNJFEIZTJR-UHFFFAOYSA-M 6-anilinonaphthalene-2-sulfonate Chemical compound C1=CC2=CC(S(=O)(=O)[O-])=CC=C2C=C1NC1=CC=CC=C1 DTFZXNJFEIZTJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DTFZXNJFEIZTJR-UHFFFAOYSA-N 6-anilinonaphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2C=C1NC1=CC=CC=C1 DTFZXNJFEIZTJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKGPJODWTZCHGF-KQYNXXCUSA-N 6-thioinosinic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(S)=C2N=C1 NKGPJODWTZCHGF-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- GWOWVPQETSDEAM-UHFFFAOYSA-N 8-anilino-5-(4-anilinonaphthalen-1-yl)-2h-naphthalene-1,1-disulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)(S(O)(=O)=O)CC=CC2=C(C=2C3=CC=CC=C3C(NC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 GWOWVPQETSDEAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVKSNHVPLWYQGJ-KQYNXXCUSA-N AMP-PNP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)NP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O PVKSNHVPLWYQGJ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 229910016569 AlF 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 102100030009 Azurocidin Human genes 0.000 description 1
- 101710154607 Azurocidin Proteins 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPFWDFCRHXHXQO-UHFFFAOYSA-N BrCC(=O)NCCS(=O)(=O)N.O1C=NC=C1 Chemical compound BrCC(=O)NCCS(=O)(=O)N.O1C=NC=C1 YPFWDFCRHXHXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001107784 Caenorhabditis elegans Deoxyribonuclease-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013830 Calcium-Sensing Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010050543 Calcium-Sensing Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101000749287 Clitocybe nebularis Clitocypin Proteins 0.000 description 1
- 101000767029 Clitocybe nebularis Clitocypin-1 Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 229940094664 Cysteine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- IELOKBJPULMYRW-NJQVLOCASA-N D-alpha-Tocopheryl Acid Succinate Chemical compound OC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C IELOKBJPULMYRW-NJQVLOCASA-N 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N D-sucrose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 229930191892 Formycin Natural products 0.000 description 1
- KBHMEHLJSZMEMI-UHFFFAOYSA-N Formycin A Natural products N1N=C2C(N)=NC=NC2=C1C1OC(CO)C(O)C1O KBHMEHLJSZMEMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 229930189936 Glyoxalase Natural products 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- XQVWYOYUZDUNRW-UHFFFAOYSA-N N-Phenyl-1-naphthylamine Chemical compound C=1C=CC2=CC=CC=C2C=1NC1=CC=CC=C1 XQVWYOYUZDUNRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SOPXTBFWNBZMJA-UHFFFAOYSA-N NCCS(=O)(=O)N.O1C=NC=C1 Chemical compound NCCS(=O)(=O)N.O1C=NC=C1 SOPXTBFWNBZMJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- OYZDQBAILDTGEW-UHFFFAOYSA-N O1CN(C=C1)S(=O)(=O)NC(C(=O)O)C Chemical compound O1CN(C=C1)S(=O)(=O)NC(C(=O)O)C OYZDQBAILDTGEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100121112 Oryza sativa subsp. indica 20ox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100121113 Oryza sativa subsp. japonica GA20OX2 gene Proteins 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- QHZLMUACJMDIAE-UHFFFAOYSA-N Palmitic acid monoglyceride Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO QHZLMUACJMDIAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101100271190 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) ATAT gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 102000013674 S-100 Human genes 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 108700021018 S100 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N Tretinoin Chemical compound OC(=O)/C=C(\C)/C=C/C=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710204001 Zinc metalloprotease Proteins 0.000 description 1
- QCBPOEYESJRYMS-BNMKEWDUSA-N [(2r,3s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-2-[[[(2r,3s,5r)-2-[[[(2r,3s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-2-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]oxola Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 QCBPOEYESJRYMS-BNMKEWDUSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940045988 antineoplastic drug protein kinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010004205 biphenyl-1,2-dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPIWFDJHCIZYMK-UHFFFAOYSA-N butane-1-sulfonamide;1,3-oxazole Chemical compound C1=COC=N1.CCCCS(N)(=O)=O UPIWFDJHCIZYMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003715 calcium chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- SKTQUNFBPUMFOT-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;dioxido-oxo-sulfanylidene-$l^{6}-sulfane Chemical compound NC([NH3+])=N.NC([NH3+])=N.[O-]S([O-])(=O)=S SKTQUNFBPUMFOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 1
- 229940082638 cardiac stimulant phosphodiesterase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001444 catalytic combustion detection Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940099418 d- alpha-tocopherol succinate Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- LROAUBRDKLVBCP-UHFFFAOYSA-N dcvj Chemical compound C1CCC2=CC(C=C(C#N)C#N)=CC3=C2N1CCC3 LROAUBRDKLVBCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- VWLWTJHKQHRTNC-UHFFFAOYSA-L dipotassium;8-anilino-5-(4-anilino-5-sulfonatonaphthalen-1-yl)naphthalene-1-sulfonate Chemical compound [K+].[K+].C=12C(S(=O)(=O)[O-])=CC=CC2=C(C=2C3=CC=CC(=C3C(NC=3C=CC=CC=3)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 VWLWTJHKQHRTNC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000198 fluorescence anisotropy Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- VEPYXRRTOARCQD-IGPDFVGCSA-N formycin Chemical compound N1=N[C]2C(N)=NC=NC2=C1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O VEPYXRRTOARCQD-IGPDFVGCSA-N 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003168 generic drug Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 108010005908 hirudin (53-64) Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- JGPMMRGNQUBGND-UHFFFAOYSA-N idebenone Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(CCCCCCCCCCO)=C(C)C1=O JGPMMRGNQUBGND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000797 iron chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229940075525 iron chelating agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 1
- 238000012804 iterative process Methods 0.000 description 1
- DZFWNZJKBJOGFQ-UHFFFAOYSA-N julolidine Chemical compound C1CCC2=CC=CC3=C2N1CCC3 DZFWNZJKBJOGFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- DMDOTRUOIVBPSF-UHFFFAOYSA-N naphthalene;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=CC2=CC=CC=C21 DMDOTRUOIVBPSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 102000028703 oxygen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009355 oxygen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical class OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003428 phospholipase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003934 phosphoprotein phosphatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N phosphorylcholine chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBWXNTAXLNYFJB-LKUDQCMESA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-LKUDQCMESA-N 0.000 description 1
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000000711 polarimetry Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003909 protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031070 response to heat Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010036927 trypsin-like serine protease Proteins 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000012036 ultra high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, e.g. Konjac gum, Locust bean gum, Guar gum
- G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials Using Thermal Means (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
ンドの能力に基づいて、タンパク質を分類する方法に関し、そこで安定性の改変
とは、リガンドとタンパク質との間の相互作用を意味する。
100,000の必須のタンパク質をコードしている(Albertsら、「M
olecular Biology of the Cell」第3版、Alb
erts,B.D.ら編(1994);Rowen,L.ら、Science
278:605(1997))。ヒトゲノムプロジェクトの研究者らは、ヒト染
色体の23対における全ての遺伝子を急速に同定しているところである。これら
の遺伝子の産物は、次の10年における医薬品の開発のための、治療学的標的の
将来のプールとして広く認識される。ヒトゲノムの配列決定は、数年の間にほぼ
完了されるが、これら遺伝子の機能の解明は、かなりの遅れを取っている。従っ
て、ヒトゲノムの機能的構成を理解し、そして「構造ゲノム」すなわち配列情報
から、「機能的ゲノム」すなわち遺伝子機能への遷移、および通常の表現型と病
理学的表現型との関連性を作り出すための、新しい技術が必要とされる(Hie
ter&Boguski、Science 278:601(1997))。
ついて、この遺伝子にコードされる約40%のタンパク質の機能が、完全に未知
であるという、最近の発見により明らかに示された(Blattnerら、Sc
ience 277:1453(1997))。実際、完全なゲノム情報が入手
可能である12の単純な生物(最大12.1メガベース(6034遺伝子)が入
手可能なS.cerevisiaeを含む)について、現在の最先端のコンピュ
ーターを利用した配列比較をもちいて、44%〜69%の遺伝子しか、同定され
ていない(Pennisi,E.、Science 277:1433(199
7))。さらに、梅毒の原因となるスピロヘータは、1,014遺伝子を有する
が、その45%の機能が未知である(Fraserら、Science 281
:375−388(1998))。その結果として、伝統的な方法論に対するチ
ャレンジを提示する機能的情報のギャップ、そして同時に、治療的処置に関する
新たな標的の発見の機会が存在する。
に基づいた機能未知のタンパク質の分類は、不正確であり、そして信頼性がない
。構造的相同性を有するタンパク質は、異なる機能を有し得る。例えば、リゾチ
ームおよびα−ラクトアルブミンは、40%の配列の相同性を有するが、機能は
相違する。リゾチームはヒドラーゼであり、そしてα−ラクトアルブミンは泌乳
哺乳動物の乳内への分泌のための、ラクトース合成に関与するカルシウム結合タ
ンパク質である(QasbaおよびKumar、Crit.Rev.Bioch
em.Mol.Biol.32:255−306(1997))。
例えば、セリンプロテアーゼであるトリプシンおよびサブチリシンは、類似の機
能を示すが、配列の相同性または構造的相同性のいずれも示さない(Tongら
、Nature Structural Biology 9:819−826
(1998))。キナーゼフォールドファミリー由来のサイクリックAMP依存
性プロテインキナーゼ、および「ATP Grasp」フォールドファミリー由
来のD−Ala:D−Alaリガーゼは、配列の相同性は有さないが、ATP認
識のための共通の構造的エレメントを共有し、そして両方ともATP依存性酵素
である(Denessioukら、Protein Science 7:17
68−1771(1998))。いくつかのタンパク質は、配列の相同性を示さ
ず、いくらかの構造的な相同性を示すが、異なる機能を有する。そのようなタン
パク質の例は、ブレオマイシン耐性タンパク質、ビフェニル1,2−ジオキシゲ
ナーゼ、およびヒトグリオキザラーゼである(Bergdollら、Prote
in Science 7:1661−1670(1998))。
、正確な、信頼できる技術が必要とされる。
パク質の安定性を改変し、従って、そのタンパク質に結合する、多数の異なる分
子における分子の能力に関する。その方法のうち3つは、タンパク質に結合する
分子が、そのタンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトするか否かの決定に関与し
ない。もう一方の異なる3つの方法は、タンパク質に結合する分子が、そのタン
パク質の熱ほどけ変性曲線をシフトするか否かの決定に関与する。
の決定に関与しない方法) 本発明は、タンパク質を機能的に分類する方法を提供し、この方法は、1以上
の多数の異なる分子を、そのタンパク質の安定性を改変するそれらの能力に関し
て、スクリーニングする工程(ここで、そのタンパク質の安定性の改変は、その
分子がそのタンパク質に結合することを示す);そのスクリーニング由来のタン
パク質に対する活性スペクトルを作製する工程(ここで、その活性スペクトルは
、そのタンパク質の安定性を改変し、それゆえそのタンパク質に結合するリガン
ドである、その多数の異なる分子由来の分子のサブセットに反映する);そのタ
ンパク質に対する活性スペクトルを、1以上の機能的な参照スペクトルリストと
比較する工程;およびそのタンパク質の安定性を改変する、多数の異なる分子中
の分子のセットに従って、そのタンパク質を分類する工程を含む。
定のクラスのタンパク質に結合することが公知の、1以上の多数の異なる分子を
、そのタンパク質の安定性を改変するそれらの能力に関して、スクリーニングす
る工程(ここで、そのタンパク質の安定性の改変は、その分子がタンパク質に結
合することを示す);そのスクリーニング由来のタンパク質に対する活性スペク
トルを作製する工程(ここで、その活性スペクトルは、そのタンパク質の安定性
を改変し、それゆえそのタンパク質に結合するリガンドである、その多数の異な
る分子由来の分子のサブセットに反映する);およびその多数の異なる分子の1
以上がそのタンパク質の安定性を改変する場合、そのクラスのタンパク質の1つ
のメンバーとしてそのタンパク質を分類する工程を含む。
のタンパク質の安定性を改変する多数の異なる分子中の分子のセットに従って、
タンパク質を分類する工程を含む。
決定に関する別の異なる方法) 本発明は、熱変化によってほどけ変性し得るタンパク質を、機能的に分類する
ための方法を提供する。この方法は、1つ以上の多数の異なる分子を、タンパク
質の熱ほどけ変性曲線をシフトするそれらの能力についてスクリーニングする工
程、ここでタンパク質の熱ほどけ変性曲線におけるシフトは、この分子がタンパ
ク質に結合することを示す;スクリーニングに由来するこのタンパク質について
の活性スペクトルを作製する工程、ここで活性スペクトルは、多数の異なる分子
に由来する1つのサブセット分子を反映し、1つのサブセット分子は、タンパク
質の熱ほどけ変性性曲線をシフトしそれ故にタンパク質に結合するリガンドであ
る;このタンパク質の活性スペクトルを、1つ以上の機能的参照スペクトルリス
トと比較する工程;および、タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトする多数の
異なる分子の分子セットに従って、このタンパク質を分類する工程、を包含する
。
るための方法を提供する。この方法は、特定のクラスのタンパク質に結合するこ
とが公知の1つ以上の多数の異なる分子を、タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシ
フトするそれらの能力についてスクリーニングする工程、ここでタンパク質の熱
ほどけ変性曲線のシフトは、この分子がこのタンパク質に結合することを示す;
スクリーニングに由来するタンパク質についての活性スペクトルを作製する工程
、ここで活性スペクトルは、多数の異なる分子に由来する1つのサブセット分子
を反映し、1つのサブセット分子は、タンパク質熱ほどけ変性曲線をシフトしそ
れ故にタンパク質に結合するリガンドである;および、1つ以上の多数の異なる
分子がタンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトする場合、タンパク質クラスのメ
ンバーとして分類する工程を包含する。
るための方法を提供する。この方法は、タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフト
する多数の異なる分子における分子のセットに基づいて、タンパク質を分類する
工程を包含する。
くつかの利点を有する。例えば、本発明の方法は、全てのリガンド/レセプター
複合体に共通の熱力学的な特性に基づくため、広範な交雑−標的(cross−
target)有用性を提供する。さらに、本発明の方法は,特異的な標的機能
の知識を必要としないため、ゲノム研究に由来したタンパク質標的の直接的な評
価を容易にする。
プターに広く適用し得ることである。新規のレセプターが試験用に入手可能にな
るごとに新しいアッセイ法を発明する必要はない。従って、化合物ライブラリー
のスクリーニングは、タンパク質標的の調製を直ちに着手する。研究中のレセプ
ターが酵素である場合、研究者は従来の動力学的方法を使用し得るよりも、より
迅速にかつより容易に一連の化合物の親和性ランク順位を決定し得る。さらに、
研究者は、活性部位、アロステリック補因子結合部位、またはレセプター・サブ
ユニット界面で結合が起こるか否かに拘わらず、酵素に結合するリガンドを検出
し得る。本発明は非酵素レセプターにも同様に適用し得る。
れたアッセイ容量(例えば、1〜5μL)を用いて実行され得ることである。こ
の方法は、16×24(384ウェル)、32×48(1536ウェル)、また
はさらに特製したアレイの高密度マイクロプレートアレイの使用を容易にする。
最終タンパク質濃度を約1〜4μMにするには、アッセイウェルあたり、わずか
約5〜40ピコモルのタンパク質が必要とされる(25kDaタンパク質につい
て0.1〜1.0μg)。従って、1.0mgのタンパク質は、縮小された形式
において、103〜104アッセイを実施するために使用され得る。
イブラリー(例えば、機能プローブライブラリー)のウルトラハイスループット
スクリーニングを容易にすることである。従って、本発明の方法は、1日間に1
つのワークステーションあたりに10,000〜30,000の化合物をスクリ
ーニングすることを可能にする。この速度で、4000の化合物の機能的プロー
ブライブラリーに対して、1日間に1つのワークステーションあたり少なくとも
2.5〜6の標的タンパク質がスクリーニングされ得る。4000の化合物の機
能的プローブライブラリーに対して、1年間に1つのワークステーションあたり
少なくとも500〜1200の治療用標的がスクリーニングされ得る。5年間で
は1つのワークステーションあたり、ヒトゲノムによってコードされるタンパク
質の約3〜7.5%をサンプリングし得る。
ダイナミックレンジが、1つのウェルアッセイが12オーダーの規模範囲(すな
わち、フェムトモル(10-15M)〜ミリモル(10-3)親和性)においてアッ
セイされ得ることである。
相互作用が、個々のリガンドについてのリガンド結合の自由エネルギーの密接相
加性を介してモニターされ得る。
,R.L.ら、Science 278:631−637(1997);ならび
に、Heiter,P.およびM.Boguski、Science 278:
601−602(1997)に報告される)により提供される情報よりも、より
正確で且つより確実な情報を提供する。
いて、同定および区別され得る。例えば、ベンゼンボロン酸誘導体(BBA)は
、細菌供給源由来のサブチリシンおよび真核生物供給源由来のα−キモトリプシ
ンのような多様なセリンプロテアーゼに可逆的に結合することが見出された(N
akatani,H.ら、J.Biochem.(Tokyo)77:905−
8(1975))。同様に、ボロアルギニン遷移状態アナログ(これは、この模
擬合成ペプチドに関してP1部位にアルギニン基を有する)は、セリンプロテア
ーゼ、トロンビン、トリプシン、およびプラスミンについてより特異的なインヒ
ビターであることが見出され(Tapparelliら、J.Biol.Che
m.268:4731−41(1993))、観察された特異性:Kd〜10n
M(トロンビン)、Kd〜1,000nM(トリプシン)、Kd〜10,000n
M(プラスミン)を有する。本発明の方法が提供する、タンパク質の分類に通ず
る配列比較アプローチに関連する重要な利点をここに説明する:ボロン酸遷移状
態アナログの結合から予想されるΔTmシフトは、配列比較のみによって提供
された情報よりも、セリンプロテアーゼのさらにより特徴的(細菌または真核生
物供給源に関係なく)であるはずである。細菌供給源および真核生物供給源由来
のセリンプロテアーゼは、収束性進化の模範例である。それ故に、このセリンプ
ロテアーゼは触媒機能を共有するという事実にもかかわらず配列相同性をほとん
ど有さない。
に記載する。
々の用語および方法論が参照される。このような公知の用語および方法論を記載
する刊行物および他の資料は、その全体が完全に示されているものとして本明細
書に参考として援用される。
トに従って、ほどけ変性し得るタンパク質の機能的分類をするための方法を提供
する。タンパク質は、変性剤(例えば、尿素、グアニジニウム塩酸塩、グアニジ
ニウムチオ硫酸塩など)、界面活性剤による処理、タンパク質を圧力で処理する
ことによって、タンパク質を加熱することによってなどで、ほどけ変性を引き起
こし得る。
む、タンパク質の機能的分類をするための方法を提供する。熱ほどけ変性曲線を
シフトする分子のみが、タンパク質に結合するリガンドであると考えられる。好
ましくは、マイクロプレート熱シフトアッセイは、タンパク質の熱ほどけ変性曲
線がシフトされるかどうかを決定するために使用される。マイクロプレート熱シ
フトアッセイは、結合について試験される分子が熱ほどけ変性曲線を結合シフト
するかどうかを決定することに関する。マイクロプレート熱シフトアッセイは、
国際特許出願番号PCT/US97/08154号(公開番号WO97/425
00号として1997年11月13日公開);米国特許出願番号第08/853
,464号、1997年5月9日出願;および米国特許出願番号第08/853
,459号、1997年5月9日出願)に記載される。
タンパク質を分類するための方法を提供する。この1つの実施態様において、標
的タンパク質は、多数のコンテナーの各々において、多数の異なる分子の1つの
分子と接触される。次いで、コンテナーはある温度範囲に渡って間隔をおいて加
熱される。好ましくは、多数のコンテナーは同時に加熱される。各加熱間隔の後
に、標的分子の熱ほどけ変性に関連する物理的変化を測定する。この方法の代替
の実施態様において、コンテナーは連続様式において加熱される。熱ほどけ変性
曲線は、各コンテナーにおいて、標的分子について温度を関数としてプロットさ
れる。好ましくは、各々の熱ほどけ変性曲線の温度中間点(Tm)を確認し、次
いでコンテナーにおいて任意の分子の非存在下で標的分子について得た熱ほどけ
変性曲線のTmと比較する。あるいは、コンピューター分析ツールを用いて、熱
ほどけ変性曲線全体を他の熱ほどけ変性曲線全体と比較し得る。
の決定に関連し、分子がタンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトするかどうかの
決定に関連しない方法(例えば、タンパク質分解感受性アッセイ、タンパク質に
よる表面結合アッセイ、タンパク質による抗体結合アッセイ、タンパク質の分子
シャペロニン結合アッセイ、固定化されたリガンドに対する示差結合アッセイ、
およびタンパク質凝集アッセイ)と区別される。このようなアッセイは、当業者
に周知である。例えば、米国特許番号第5,585,277号;および米国特許
番号第5,679,582号を参照のこと。米国特許番号第5,585,277
号および同第5,679,582号に開示されるこれらの方法は、結合について
試験される分子の存在下および非存在下において、タンパク質の折り畳み、およ
び/またはほどけ変性の程度を比較することに関連する。これらのアプローチは
、タンパク質に結合する任意の分子がタンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトす
るかどうかの決定に関連しない。
、または化学的な機能(例えば、リン酸部分を加水分解する能力(ホスファター
ゼ)、リン酸部分を付加する能力(キナーゼ)など)に基づいてタンパク質を分
類することをいう。タンパク質は1つ以上の多数の異なる機能を有する場合に分
類され得、そして、本発明の方法は、ホスファターゼ、キナーゼ、または他の型
の酵素としてタンパク質を分類することに限定されない。
くとも2個の分子、化合物またはコンテナーをいう。
セットより小さい分子セットをいう。
どけ変性し得る標的分子に結合するそれらの能力について試験することをいう。
スクリーニング過程は反復(repetitive)過程(または反復(ite
rative)過程)である。この過程では、分子は、ほどけ変性アッセイ、特
に熱シフトアッセイにおいてタンパク質への結合について試験される。例えば、
タンパク質への結合についてスクリーニングされた機能的プローブライブラリー
における分子サブセットが結合しない場合、次いで、スクリーニングは他の分子
サブセットを用いて繰り返される。ライブラリー全体がタンパク質に結合する任
意の分子を含まない場合、次いで、スクリーニングは他の機能的プローブライブ
ラリー由来の分子を用いて繰り返される。
に結合し、そして標的タンパク質の安定性を改変する機能的プローブライブラリ
ーにおける多数の異なる分子の能力の判定(例えば、アッセイ)である。
ば、熱ほどけ変性)に応答して、標的タンパク質に結合する能力、ならびにタン
パク質の安定性を改変する能力、特に熱安定性を改変する能力について試験され
る、1つ以上の異なる分子をいう。機能的プローブライブラリーの各メンバーの
存在下におけるタンパク質に対して安定性試験、好ましくはマイクロプレートシ
フトアッセイ技術を使用することによって、化合物は、標的タンパク質と共に個
々にインキュベートされ得る、ならびに/またはリガンドを決定するためのグル
ープにおいて個々にインキュベートされ得る、または密接および特異的に標的タ
ンパク質に結合する組み合わせにおいてインキュベートされ得る。
ユニットライブラリー、ペプチドライブラリー、ビタミンおよび補因子のライブ
ラリー、酵素インヒビターライブラリー、核酸ライブラリー、炭水化物ライブラ
リー、一般的な薬物ライブラリー、天然産物ライブラリー、またはコンビナトリ
アルライブラリーを含む、任意の種類の分子ライブラリーであり得る。標的タン
パク質に結合する機能的プローブライブラリーにおける分子についての生物学的
効果は、インビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて評価され得る。
いで、好ましくはDirectedDiversity(商標登録)システムを
使用してコンビナトリアルライブラリーを作成する。DirectedDive
rsity(商標登録)システムは米国特許第5,463,564号に開示され
る。
物(すなわち、リガンド)リスト、および標的タンパク質の安定性(例えば、熱
安定性)を改変する化合物リスト、ならびに標的タンパク質についてのリガンド
の各々の親和性をいう。用語「機能的プローブ結合プロフィール」および「活性
スペクトル」は同義語である。Tmの減少は、化合物または分子がタンパク質を
安定化する別の分子の結合を阻害することを示唆する。例えば、金属キレート剤
がTmを減少させる場合、タンパク質が金属に結合することを示唆する(例えば
、カルシウムとα−ラクトアルブミンとの間の相互作用)。還元剤がTmを減少
させる場合、タンパク質が1つ以上のジスルフィド結合を含んでいることを示唆
する。
れ、そして結合定数に相当する標的タンパク質クラスリスト(適した電子データ
ベースへの参照を含む)をいい、標的タンパク質の機能的分類に使用され得る。
あるいは、機能的参照スペクトルリストは、1つ以上の公知のタンパク質につい
ての1つ以上の活性スペクトルのセットであり得る。従って、所定のタンパク質
についての活性スペクトルは、そのタンパク質に属するタンパク質およびタンパ
ク質の機能クラスのための「フィンガープリント」として役立ち得る。
といった、1つ以上の共通の特徴を共有するタンパク質リストである。
ライブラリーの標的タンパク質に対する効果を観察することにより得られた活性
スペクトルを、機能的参照スペクトルと比較し得る、計算手段かまたは図解手段
かのいずれかである。例えば、活性スペクトルコンパレーターは、当業者が容易
に利用可能であるスプレッドシートソフトウェアであり得る。例えば、Micr
oSoftExcel(MicroSoft Inc.、Redmond、WA
)が使用され得る。
列相同性に由来する「機能的仮説」)を介して、試験的に割り当てられ得る。熱
シフトアッセイは、このような機能的仮説を確認するため、または配列相同性に
よって得られた可能な機能リストに由来する正確な機能を同定するために利用さ
れ得る。例えば、ATPを加水分解し、そして加水分解エネルギーを力学的エネ
ルギーに変換する、「分子モーター」として公知のタンパク質が存在する。これ
らのタンパク質には、DNAおよびRNAヘリカーゼ、キネシン、タンパク質を
再折り畳みするシャペロニン、ならびに細菌の鞭毛の基部におけるタンパク質複
合体が含まれる。これら全てのタンパク質は、ATP加水分解ドメインにおいて
配列相同性を共通するが、これらの他の機能は異なる。本発明の方法の1つの適
用において、タンパク質標的の一部分(例えば、ATPaseドメイン)につい
ての公知の配列相同性は、標的タンパク質の異なる可能な機能に指向された特異
的な機能的プローブライブラリー(例えば、シャペロニン、ヘリカーゼ、キネシ
ン、および他の分子モーターの特別な活性をプローブするための分子を含むライ
ブラリー)を使用して、熱シフトアッセイを設計するために使用され得る。ある
いは、標的タンパク質は、配列相同性を介してチロシンキナーゼとして同定され
得、次いで本発明は、多数の可能な基質リン酸化部位を含むペプチドライブラリ
ーに対して、この標的をスクリーニングするために使用され得る。これらの実施
例は、本発明が配列相同性によって示される仮説的機能を確認し、拒絶し、ある
いは加工するために使用され得るため、本発明は配列相同性を使用して機能を割
り当てる過程に高度に相補することを例示する。
る。この方法は、以下の工程を包含する;(a)特定のクラスのタンパク質に結
合することが公知の、1つ以上の多数の異なる分子を、上述のタンパク質の安定
性を改変し得る能力についてスクリーニングする工程、ここでタンパク質の安定
性の改変はこの分子がこのタンパク質に結合することを示す、(b)スクリーニ
ング工程に由来する上述のタンパク質について、活性スペクトルを作製する工程
、ここで活性スペクトルは、上述のタンパク質の安定性を改変する多数の異なる
分子に由来する分子のサブセットを反映する、および(c)1つ以上の多数の異
なる分子がタンパク質の安定性を改変する場合、上述のクラスのタンパク質のメ
ンバーとして分類する工程。
記のプロセスはまた、タンパク質の機能を評価する他の方法(例えば、タンパク
質および核酸の三次構造、mRNAの細胞発現パターンまたは標的遺伝子にコー
ドされるタンパク質の発現パターン、ならびに生物体レベルで変化する標的遺伝
子の機能を変えるための表現効果)を使用して生成された機能的仮説に適用され
得ること留意すべきである。
の1つより多い結合部位への結合を評価し得、そしてタンパク質を、タンパク質
に結合する分子サブセットに基づいて分類し得る。例えば、DNAおよびアデノ
シン三リン酸(ATP)に結合することが見出された未知の機能のタンパク質は
、DNA構造に影響するタンパク質として分類され得る。従って、多くのリガン
ドの結合に関与する情報を使用する場合、多数の可能なタンパク質分類は、ごく
少数の見込みのある分類まで狭くなり得る。
前に未知の)機能についてスクリーニングもし得る。好ましくは、マイクロプレ
ート熱シフトアッセイを使用して、そのタンパク質に対して分子の機能的プロー
ブライブラリーをスクリーニングする。
をいう。例えば、キナーゼは、タンパク質であり、そしてその機能は、リン酸基
の別のタンパク質への共有結合性の付加を触媒することである。
をいう。この用語はDNAおよびRNAのような核酸ならびにペプチドを含むが
、これらに制限されない任意の構造の化学化合物を包含する。より詳細には、用
語「分子」は、化合物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー中の化
合物を包含する。用語「分子」および「リガンド」は同義語である。
ついてスクリーニングされるべき分子と共に溶液中に入れることをいう。より狭
義は、接触とは、標的分子および結合についてスクリーニングされるべき分子の
溶液の回転、渦巻、攪拌、または振動をいう。さらに詳細には、接触とは、標的
分子と結合について試験されるべき分子との混合をいう。混合は、例えば、ピペ
ットチップへの取り込みおよび放出を反復することにより達成され得る。好まし
くは、接触とは、標的分子と結合について試験されるべき分子との間の結合の平
衡をいう。接触は容器において、または標的分子および結合について試験される
べき分子が容器に入れられる前に生じ得る。
され得る任意のうつわまたはチャンバーをいう。用語「容器」は、反応チューブ
(例えば、試験管、マイクロチューブ、バイアルなど)を包含する。好ましくは
、用語「容器」とは、マルチウェルマイクロプレートまたはマイクロタイタープ
レートのウェルをいう。
形態でのエネルギー放出、光または熱の形態でのエネルギー吸収、濁りの変化、
および光の偏光特性の変化を包含する。詳細には、この用語は蛍光発光、蛍光エ
ネルギー転移、紫外線もしくは可視光の吸収、光の偏光特性の変化、蛍光発光の
偏光特性の変化、蛍光の経時変化速度の変化(すなわち、蛍光寿命)、蛍光異方
性の変化、蛍光共鳴エネルギー移動の変化、濁りの変化、および酵素活性の変化
をいう。好ましくは、その用語は蛍光をいい、そしてより好ましくは蛍光発光を
いう。蛍光発光はタンパク質に内因性であり得るか、あるいは蛍光レポーター分
子に起因し得る。タンパク質のほどけ変性をモニターするための蛍光技術の使用
は当業者に周知である。例えば、Eftink,M.R.,Biophysic
al J.66:482〜501(1994)を参照のこと。
側鎖の結晶秩序、二次構造、三次構造、または四次構造)の欠失をいう。
化学的機能および生化学的機能を与える、タンパク質の正確なアミノ酸側鎖秩序
、二次構造、三次構造、または四次構造の獲得をいう。
次構造、または四次構造を処理して取り除いたタンパク質をいう。用語「ネイテ
ィブタンパク質」とは、完全な化学的機能および生物学的機能を有するタンパク
質を提供する程度のアミノ酸側鎖秩序、二次構造、三次構造または四次構造を有
するタンパク質をいう。ネイティブタンパク質は、加熱されていないもの、およ
びほどけ変性薬剤または尿素のような化学物質で処理されていないものである。
義語である。
質のほどけ変性に関係する物理的変化のプロットである。「変性曲線」は、温度
、変性剤濃度、圧力などの関数として、タンパク質または核酸の変性に関係する
物理的変化のプロットである。
変性に関係する物理的変化のプロットである。「熱変性曲線」は、温度の関数と
して、タンパク質または核酸の変性に関係する物理的変化のプロットである。例
えば、Davidsonら、Nature Structure Biolog
y 2:859(1995);およびClegg,R.M.ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A. 90:2994〜2998(1993
)を参照のこと。
パク質の熱ほどけ変性曲線に比較した、リガンドに結合しているタンパク質の熱
ほどけ変性曲線におけるシフトをいう。
おいて同程度の物理的変化を生じるのに要求される圧力量、熱量、界面活性剤の
濃度、または変性剤の濃度の変化に比較して、1つ以上のリガンドと結合された
標的タンパク質において所与の程度の物理的変化を生ずるのに要求される、圧力
量、熱量、界面活性剤の濃度、または変性剤の濃度の変化をいう。安定性の改変
は、安定性の増加または減少として示され得る。リガンドによるタンパク質の安
定性の改変は、そのリガンドがそのタンパク質に結合したことを示す。1を超え
るリガンドによるタンパク質の安定性の改変は、そのリガンドがそのタンパク質
に結合したことを示す。
において同程度の物理的変化を生ずるに要求される熱エネルギー量に比較して、
1つ以上のリガンドと結合した標的タンパク質において所与の程度の物理的変化
を生ずるに要求される熱エネルギーの量の変化をいう。熱安定性の改変は、安定
性の増加または減少として示し得る。リガンドによるタンパク質の熱安定性の改
変は、そのリガンドがそのタンパク質に結合したことを示す。1を超えるリガン
ドによるタンパク質の熱安定性の改変は、そのリガンドがそのタンパク質に結合
したことを示す。
業者に周知の方法を使用して容易に決定され得る。例えば、Weber,P.C
.ら、J.Am.Chem.Soc.116:2717〜2724(1994)
;ならびにClegg,R.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.90:2994〜2998(1993)を参照のこと。
化に応じて、標的分子の熱安定性に対する1つ以上の分子の効果を測定するのが
好ましい。あるいは、標的分子の熱安定性に対する1つ以上の分子の効果は、標
的タンパク質の熱ほどけ変性曲線の全体の変化に対応して測定し得る。
性したまたは変性されたレセプターと会合し得、そして規定された波長の光によ
る励起後、蛍光エネルギーを発する、蛍光分子または化合物である。用語蛍光プ
ローブ分子は、全ての発蛍光団を包含する。より具体的には、タンパク質に対し
て、この用語は、発蛍光団、例えば、チオイノシン、およびN−エテノアデノシ
ン、ホルマイシン、ダンシル、ダンシル誘導体、フルオレセイン誘導体、6−プ
ロピオニル−2−(ジメチルアミノ)ナフタレン(PRODAN)、2−アニリ
ノナフタレン、およびN−アリールアミノ−ナフタレンスルホネート誘導体、例
えば、1−アニリノナフタレン−8−スルホネート(1,8−ANS)、2−ア
ニリノナフタレン−6−スルホネート(2,6−ANS)、2−アミノナフタレ
ン−6−スルホネート、N,N−ジメチル−2−アミノナフタレン−6−スルホ
ネート、N−フェニル−2−アミノナフタレン、N−シクロヘキシル−2−アミ
ノナフタレン−6−スルホネート、N−フェニル−2−アミノナフタレン−6−
スルホネート、N−フェニル−N−メチル−2−アミノナフタレン−6−スルホ
ネート、N−(o−トルイル)−2−アミノナフタレン−6−スルホネート、N
−(m−トルイル)−2−アミノナフタレン−6−スルホネート、N−(p−ト
ルイル)−2−アミノナフタレン−6−スルホネート、2−(p−トルイジニル
)−ナフタレン−6−スルホン酸(2,6−TNS)、4−(ジシアノビニル)
ジュロリジン(DCVJ)、6−ドデカノイル−2−ジメチルアミノナフタレン
(LAURDAN)、6−ヘキサデカノイル−2−(((2−(トリメチルアン
モニウム)エチル)メチル)アミノ)ナフタレンクロライド(PATMAN)、
ナイルレッド、N−フェニル−1−ナフチルアミン、1,1−ジシアノ−2−[
6−(ジメチルアミノ)ナフタレン−2−イル]プロペン(DDNP)、4,4
’−ジアニリノ−1,1−ビナフチル−5,5−ジスルホン酸(ビスANS)、
および5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)オキ
サゾール誘導体色素(商標DAPOXYLTM(Molecular Probe
s,Inc.,Eugene,OR)で販売され、Diwu,Z.ら,Phot
ochemistry and photobiology 66(4):42
4〜431(1997)、およびBioProbes 25:8〜9頁、Mol
ecular Probes,Inc.,Eugene,OR(1997)にお
いて提供される5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニ
ル)オキサゾール色素を含む)を包含する。
ール誘導体色素の例、および対応するMolecular Probesカタロ
グ番号は、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)
オキサゾールブチルスルホンアミド(D−12801)、5−(4’’−ジメチ
ルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)オキサゾール−(2−アミノエチ
ル)スルホンアミド(D−10460)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニ
ル)−2−(4’−フェニル)オキサゾールブチルスルホンアミド(D−128
01)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)オ
キサゾール−3−スルホンアミドフェニル(phyenyl)ホウ酸(D−10
402)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)
オキサゾールスルホン酸、ナトリウム塩(D−12800)、5−(4’’−ジ
メチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)オキサゾールスルホニルヒド
ラジン(D−10430)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(
4’−フェニル)オキサゾール−(2−ブロモアセトアミドエチル)スルホンア
ミド(D−10300)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4
’−フェニル)オキサゾール−2−(3−(2−ピリジルジチオ)プロピオンア
ミドエチル)スルホンアミド(D−10301)、5−(4’’−ジメチルアミ
ノフェニル)−2−(4’−フェニル)オキサゾールスルホニルクロライド(D
−10160)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェ
ニル)オキサゾール−3−スルホンアミドプロピオン酸、スクシンイミジルエス
テル(D−10162)、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4
’−フェニル)オキサゾールカルボン酸、スクシンイミジルエステル(D−10
161)を含む。
TNS、および5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニ
ル)オキサゾール誘導体色素(商標DAPOXYLTMで販売され、例えば、Di
wu,Z.ら,Photochemistry and photobiolo
gy 66(4):424〜431(1997)において提供されるもの)をい
う。なおより好ましくは、この用語は、5−(4’’−ジメチルアミノフェニル
)−2−(4’−フェニル)オキサゾール誘導体色素(商標DAPOXYLTMで
販売され、例えば、Diwu,Z.ら,Photochemistry and
photobiology 66(4):424〜431(1997)におい
て提供されるもの)をいう。最も好ましくは、この用語は、5−(4’’−ジメ
チルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)オキサゾールスルホン酸、ナト
リウム塩(D−12800)をいう。
形状のプラットフォームまたは他の物体を包含する。キャリアは、ガラス、プラ
スチック、または金属を含むがこれらに限定されない任意の物質から作製され得
る。好ましくは、このキャリアはマルチウェルマイクロプレートである。この用
語マイクロプレートおよびマイクロタイタープレートは同義語である。キャリア
は、加熱エレメントから取り外され得る。本発明において、複数のキャリアが使
用される。各キャリアは複数の容器を保持する。
収の変化を測定することをいう。濁り度測定、可視光吸収測定、および紫外線吸
収測定は、スペクトル測定の例である。標的タンパク質の内因性蛍光の測定、お
よび標的タンパク質と複合体化されているまたは結合している、外因性蛍光体の
蛍光もまた、スペクトル測定および分光光度測定の例である 用語「旋光測定」とは、光および蛍光発光の旋光特性の変化を測定することに
関する。円二色性および旋光は、旋光分析で測定され得る、光の旋光特性の例で
ある。円二色性および旋光の測定は、分光偏光計を使用して行われる。「非旋光
」測定とは、分光偏光計を使用して得られない測定である。
て価値のある財産と成り得る。ここでそれは、薬の機能に対する治療学的仮説の
詳細な理解の展開、薬物設計に対して特異的なストラテジーの設計、および潜在
的薬物副作用の解明において有用であり得る。
し、そしてより多くが、ゲノム配列決定研究を通して絶えず発見されている。こ
れらのタンパク質および細胞レセプターは、生体系において特定の機能を有する
。これは、それらが特異的相互作用を形成する分子リガンドにより実際的に限定
される。機能的有意性を有する代表的相互作用は、基質または基質アナログのよ
うな分子リガンド、補助因子、アダプタードメイン、核酸などと酵素との相互作
用を含み、そして特異的リガンド、他のレセプター、細胞表面構造構成成分、核
酸、多糖類などとのレセプターの相互作用を含む。
ることが広く可能である一方、多くの場合において、薬物の発見プロセスの次の
段階を援助し得るタンパク質についての機能的知識ベースはない。しかし、かな
り大部分の公知のタンパク質分子は、酵素補因子、酵素基質または基質アナログ
などを含む、特定のタイプの分子リガンドと結合するそれらの能力を含む重要な
特性を共有する機構のクラスに分類される。したがって、単独または組み合わせ
のいずれかで、種々の種類のリガンドに特異的に結合するそれらの能力によって
、そうでなければ未知の機能の多くのタンパク質を分類することが可能である。
リガンドの結合していない状態に関連する安定性を反映する、タンパク質の物理
的状態に対する効果がある。したがって、以前は機能が未知のタンパク質を、生
物学的リガンドおよび補因子のプローブパネル(機能的プローブライブラリー)
とそのタンパク質とをインキュベートすること、およびどのリガンドがそのタン
パク質の安定性に対する効果を有するかを測定することにより、機能的に分類し
得る。あるいは、以前は機能が未知のタンパク質の以前は未知の機能を、生物学
的リガンドおよび補因子のプローブパネル(機能的プローブライブラリー)とそ
のタンパク質とをインキュベートすること、およびどのリガンドがそのタンパク
質の安定性に対する効果を有するかを測定することにより、決定し得る。
つの分子が会合して、有利かつ特異的な相互作用複合体の形成する場合、結合相
互作用は、複合体の総自由エネルギーの減少、およびリガンドの結合していない
タンパク質に比較してタンパク質−リガンド複合体の正味の安定と関連する。実
際には、これは、酵素またはレセプターが、その特異的補因子(または補因子の
アナログ)と相互作用する場合、その酵素またはレセプターは、その相互作用に
より安定化することを意味する。しかし、リガンド結合が標的タンパク質を不安
定化し得る、特殊な状況が存在し得ることがあり得る。例えば、いくつかのタン
パク質は、1を超えるリガンドが結合し得る1つ以上のドメインまたはアロステ
リック部位を含む。
てその機能的特徴づけが、薬物の発見プロセスにおいて有用であり得るタンパク
質である。治療的介入のための潜在的な標的である多くの遺伝子は、疾患状態と
遺伝子欠損とを関連づける現象学的相関関係を通して(例えば、遺伝性疾患が、
特定の酵素およびレセプターの遺伝子欠損と相関付けられる場合)、または罹病
組織対正常組織におけるタンパク質発現パターンの違いを通して同定される。
性を通して、遺伝子産物のいくつかの「機能」を決定することが可能である。し
かし、かなりの場合において、配列相同性は、機能的関連性の確立するには十分
でないかもしれず、そして代替の手段が、ある意味で薬物発見プロセスを直接容
易にし得る方法で機能を確立するために必要とされる。
ンパク質を得る必要がある。潜在的な新しい治療標的であり、そして/または機
能的特徴づけを要求するタンパク質は、種々の確立された生化学的単離手順を用
いて天然の供給源から直接単離され得る。
して同定されたタンパク質標的のクローニングおよび発現を容易にする。例えば
、公知の標的DNA配列を使用して、多くのそのようなcDNAクローンの代表
的ライブラリーから、目的の遺伝子をコードするcDNA全体を含む完全長cD
NAクローンを選択するための、オリゴヌクレオチドプローブを設計し得る。別
の例において、公知の標的DNA配列を使用して、ゲノム総DNAから目的の遺
伝子の選択的増幅およびクローニングのためのPCRプライマーを設計し得る。
高処理量クローニングおよび発現のためのこれらのおよび他の方法は、当業者に
周知である。従って、完全長遺伝子配列データは、任意の分子に基づく高処理量
の機能的スクリーニングストラテジーに必要な第1工程である、タンパク質標的
の高処理量並行産生のための直接的手段を自動的に提供する。 (C.熱安定性スクリーニング) 標的タンパク質のマイクロプレート熱シフトアッセイを行うためには、アッセ
イの実行に最適化したアッセイ条件の決定が必要である。タンパク質は、安定な
、高度に組織化された三次元構造へと自然に折り畳まれるアミノ酸の直鎖ポリマ
ーである。標的タンパク質の生物学的活性および機能(タンパク質を特徴付ける
全ての特異的結合および触媒作用特性を実質的に含む)は、その三次元構造に依
存する。
された擬一次相転移で融解した。すなわち、実験の溶媒条件でのタンパク質三次
元構造の安定化の自由エネルギーを反映する、十分に規定された融解温度(Tm
)で、部分的に乱れた有機液体様の状態へと融解した有機結晶として熱的に挙動
する。マイクロプレート熱シフトアッセイ技術は、熱ほどけ変性プロセスの鋭敏
な検出のため、および溶媒環境の摂動またはタンパク質へのリガンド結合を通し
て起こるタンパク質安定性に対する効果の直接的な観測のため、環境感受性の蛍
光色素を使用する。
乱される。1つの方法は、そのタンパク質分子が初めに組織化されていないポリ
マーから三次元的に組織化された状態へと初めに折り畳む水性溶媒の環境を変化
させることである。タンパク質の周囲のバルク溶媒の特性を変化することにより
、折り畳み状態の安定性は、ほどけ変性状態の安定性に関連して変化し得る。こ
れは、リガンド結合測定に最適な条件を見つけるための有用なストラテジーを提
供し得、そして安定性スクリーニングの背景となる原理である。
ための最適条件を決定するための標的タンパク質とともに用いられた一組の溶媒
条件および蛍光色素である。そのタンパク質は、タンパク質の挙動および/また
はアッセイ値を評価するための、様々な溶液条件および/または蛍光色素の影響
を受ける。
対的安定性を変化する可能性を有する、有機溶媒の添加、pH、塩などの変化を
含み得る。色素の変数の例は、測定の精度、小型化または特異的アッセイ条件下
のシグナル対ノイズの最適化において利点を提供する、電荷、極性、励起波長、
発光波長、バックグラウンドシグナル強度、または他の特性におけるそれらの相
異を含み得る。安定性スクリーニングを容易にする条件の最適化は、経験的プロ
セスであり、そして当業者により容易に行われ得る。
特性を共有する機構的クラスに分類される。例えば、多くの酵素は、エネルギー
性の補因子としてATPを使い、他の酵素は、ピリジンヌクレオチドを補因子と
して使い、いくつかの酵素は、両方を補因子として使う、など。
アナログ、補因子、アダプタータンパク質ドメイン、核酸アナログ、多糖類、脂
肪酸、核酸、エフェクターペプチド、または規定されたクラスのタンパク質分子
と特異的に結合することが決定されているか、または機能的な意義が、機能的に
公知のクラスの分子への強固な結合に関連付けられている、他の分子のセットに
編集することが可能である。
ンパク質と結合するそれらの能力について試験され、そして熱ほどけ変性に対応
するタンパク質の熱安定性を改変する1つ以上の異なった分子をいう。機能的プ
ローブライブラリーの各メンバーの存在下でそのタンパク質の熱安定性試験(好
ましくは、マイクロプレート熱シフトアッセイ技術を用いることにより)を行う
ことにより、化合物を、標的タンパク質とインキュベートして、どのリガンドが
個々にまたは組み合わせで、その標的タンパク質と強固にかつ特異的に結合する
かを個々および/またはグループで決定し得る。
定されない。
、アセチル−CoA、ビオチン、S−アデノシル−メチオニン、チアミンピロリ
ン酸(TPP)、硫酸化オリゴサッカライド、ヘパリン様多糖類、GTP、GT
P−γ−S、ガンマS、ピリドキサール−5−リン酸、フラビンモノヌクレオチ
ド(FMN)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、葉酸、テトラヒド
ロ葉酸、メトトレキサート、ビタミンK1、ビタミンEコハク酸塩、ビタミンD3 、ビタミンD3−25−ヒドロキシ、ビタミンD3−1−α−25−ジヒドロキシ
、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンB6、補酵素A、補酵素A−n−ブチリ
ル、トランスレチノイン酸、およびヘム。
ドメインなど 生理活性ペプチド レクチン。
、MOから市販されている)。
オリゴヌクレオチド)に対するタンパク質をスクリーニングして、核酸結合タン
パク質の異なったクラスをプローブするために使用し得る。例えば、特定のクラ
スのDNA配列に結合する能力により同定され得る多くのDNA結合タンパク質
が存在する。多くの異なった核酸配列(例えば、4096の異なる可能性のある
合成8量体)を含む大きなライブラリーは、購入または合成され得る。高濃度で
、部位特異的核酸結合タンパク質の同族の結合部位の全部または一部が検出され
得る。タンパク質がいくつかの異なった配列に結合すると思われる場合、結合部
位は、核酸配列の種々の組み合わせを合成することにより再構築され得、次いで
マイクロプレート熱シフトアッセイ、または他のアッセイが、結合親和性を測定
するために使用され得る。
くのDNA結合タンパク質が存在する。例えば、いくつかの転写因子が、G/C
リッチ配列よりはむしろ種々のA/Tリッチ配列に結合することは、周知である
。テロメラーゼが、G/Cリッチ配列を認識することは公知である。ヘリカーゼ
が、低い特異性で一本鎖DNAの短いフラグメントに結合することは公知である
。より小さく、より一般的なライブラリーは、これらおよび他のDNA結合タン
パク質を検出するために、以下の成分を含み得る: −AT−リッチトラクト: d(T)32/d(A)32 d(ATAT)8/d(TATA)8 d(AAAT)8/d(TTTA)8 d(AAATT)6/d(TTTAA)6 d(AAATTT)6/d(TTTAAA)6 d(AAAATTTT)4/d(TTTTAAAA)4 −GC−リッチトラクト: d(C)32/d(G)32 d(GCGC)8/d(CGCG)8 d(GGGCCC)6/d(CCCGGG)6 d(GGGGCCCC)4/d(CCCCGGGG)4 −他 d(CA)32/d(GT)32 d(CT)32/d(GA)32 d(AG)32/d(TC)32 −上記二本鎖配列の一本鎖成分 −d(T)40/d(A)40(一本鎖および二本鎖DNAの両方を含むフラグメ
ントの例) −せん断されたヒト染色体DNA −異なったヒト染色体に適用された「全ゲノム増幅」 −せん断されたサケ精子DNA −せん断された微生物DNA −スーパーコイルのプラスミドDNA −特定の染色体領域(例えば、テロメアおよびセントロメア)からのPCR増
幅産物 −転写、RNAプロセッシング、転位に対する他の公知の認識部位。
ouis、MO) PMSF ロイペプチン ペプスタチンA ベスタチン ペプチドアルデヒドシステイン(システインプロテアーゼインヒビター) タンパク質チロシンキナーゼインヒビター(Calbiochem、San D
iego、CA) タンパク質ホスファターゼインヒビター(Calbiochem、San Di
ego、CA) タンパク質キナーゼインヒビター(Calbiochem、San Diego
、CA) タンパク質キナーゼアクティベーター(Calbiochem、San Die
go、CA) ホスホジエステラーゼインヒビター(Calbiochem、San Dieg
o、CA) ホスホリパーゼインヒビター 遷移状態アナログ。
ルボキシペプチドは、(a)EDTAまたはオルトフェナントロリン(Zn2+キ
レート化)による不安定化により、および(b)Zn2+触媒化ペプチド結合加水
分解のための遷移状態を模倣するヒドロキサメートおよびホスホラミデートの存
在下での安定化により同定可能である。
アルカロイド化合物を含み得る。
あるいは、機能的プローブライブラリーは、天然産物ライブラリーであり得る。
例えば、Encyclopedia of Common Natural I
ngredients Used in Foods,Drugs and C
osmetics、第2版、LeungおよびFoster編、Wiley I
nterscience(1996)を参照のこと。
パク質の安定性に影響を与える別の方法は、折り畳まれていない状態のタンパク
質、または折りたたまれた状態のタンパク質のいずれかへ分子を特異的に結合さ
せることである。実質的に全ての生物学的に活性なタンパク質が、構成された3
次元構造で折り畳まれるので、ほとんどの関心は、タンパク質の折り畳まれた状
態に結合し、そしてそれを安定化するリガンド分子に置かれる。
、標的タンパク質へ結合し、そして標的タンパク質の安定性を改変する機能的プ
ローブライブラリーにおける多数の異なった分子の能力のアッセイである。この
技術を用いて、タンパク質のほどけ変性中間点温度Tm(または熱ほどけ変性プ
ロフィール)への影響を通して、標的タンパク質への小さなまたは大きな分子リ
ガンドの結合親和性を直接測定し得る。生物学的に興味のあるほとんどのリガン
ドを含む、タンパク質の折り畳まれた状態に結合する分子について、リガンド結
合の親和性と、リガンドが結合した状態のタンパク質のTmの、リガンドが結合
していない状態のタンパク質のTmに比較してシフトされる程度との間に定量的
な関係がある。
子リガンドのいずれかに結合する能力により反映される機能を有する。多くのタ
ンパク質は、触媒機構の限定されたセットを用いて、特異的補因子に結合するか
、または特異的反応を触媒する機能的クラス(例えば、キナーゼ、ホスファター
ゼ、ピリジンヌクレオチド依存性オキシドレダクターゼなど)に属する。従って
、補因子としてATPを使用する所定の機能的クラス様キナーゼにおける分子は
、一般に、非加水分解性のATP補因子アナログ様AMPPNPに結合する(こ
れは、本発明の方法を用いて検出可能である性質である)。
物学的アダプタードメインとの多数のセットの相互作用を形成する。これらの相
互作用が独立である程度まで、それらは、リガンドの結合していない形態のタン
パク質の安定性に対して付加的な摂動(perturbation)を生成する
。
ンパク質のそのクラスに結合することが公知の化合物または分子のライブラリー
を用いて、そのタンパク質を再スクリーニングし得る。
ク質の熱安定性試験(好ましくは、マイクロプレート熱シフトアッセイ技術を用
いることによって)を行なった後、どのリガンドが標的タンパク質に強固におよ
び特異的に結合し、そして標的タンパク質の熱安定性を改変するのかを決定し得
る。標的タンパク質に結合し、そして標的タンパク質の熱安定性を改変する化合
物(すなわち、リガンド)のリスト、およびそのリガンドそれぞれの標的タンパ
ク質に対する親和性は、その標的タンパク質の活性スペクトルを含む。
的に分類するために使用され得る標的タンパク質クラス(適切な電子データベー
スへの参照を含む)、関連リガンド、および対応する結合定数のリストである。
あるいは、機能的参照スペクトルのリストは、1つ以上の公知のタンパク質につ
いての一つ以上の活性スペクトルのセットであり得る。
または通常の活性を示すなどの1つ以上の共通の特徴を共有するタンパク質のリ
ストである。機能的参照のリストの例を表1に示す。表1に列挙されるタンパク
質により共有される特徴は、それらが、NADに結合し、そしてデヒドロゲナー
ゼ活性を示すことである。表1におけるタンパク質のリストは、どのようにタン
パク質の機能的に関連したクラスが、リガンドの異なったセットに結合する能力
に従って識別され得るかを例示する。例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド(NAD)、NADPH、またはNADH、およびリンゴ酸に結合するタ
ンパク質は、そのタンパク質の熱安定性を改変するこれらの化合物の能力により
示される場合、リンゴ酸デヒドロゲナーゼとして分類され得る。別の例として、
熱安定性がエタノールおよびNADにより改変されるタンパク質は、アルコール
デヒドロゲナーゼとして分類され得る。
手段または図解的な手段のいずれかであって、それによって機能的参照スペクト
ルのリストと、標的タンパク質に対する機能的なプローブライブラリーの効果を
観察することによって得られた活性スペクトルとを比較し得る手段である。例え
ば、活性スペクトルコンパレーターは、当業者にとって容易に入手可能である表
計算ソフトであり得る。例えば、MicroSoft Excel(Micro
Soft Inc.、Redmond、WA)を使用し得る。
パターンにより示される。活性スペクトルコンパレーターを使用して、機能的参
照スペクトルのリストと観察された標的活性スペクトルとを比較することにより
、標的タンパク質は、公知のタンパク質に関して得られた関連データに従って機
能的に分類され得る。例えば、タンパク質は、熱ほどけ変性に対してタンパク質
を安定化するリガンドのセットに従って分類され得る。
する(そしてそれゆえ、そのタンパク質に結合する)程度のプロットと、同じ分
子が公知のタンパク質の熱安定性を改変する(そしてそれゆえ、そのタンパク質
に結合する)程度のプロットとを比較することにより、タンパク質が属するタン
パク質クラスを推定し得る。
標的タンパク質の活性スペクトルを比較することにより分類され得る。例えば、
PDRオンライン、Medline、SciFinder、STNExpres
s、in−house データベース、NAPRALERT Online、E
ncyclopedia of Common Natural Ingred
ients Used in Foods,Drugs and Cosmet
ics、第2版、LeungおよびFoster編、Wiley Inters
cience(1996)、およびHandbook of Enzyme I
nhibitors、パートAおよびB、第2版、Ellner編、ECH(1
990)のようなデータベースを調べ得る。
得るかを決定するために、プローブリガンドのパネルの存在下でタンパク質をイ
ンキュベートする効果を測定する任意の手段は、タンパク質を機能的に分類する
手段として十分である。好ましくは、マイクロプレート熱シフトアッセイは、標
的タンパク質の熱安定性に対する1つ以上の分子またはリガンドの効果を決定す
るために使用される。マイクロプレート熱シフトアッセイは、標的タンパク質の
熱安定性に対する、1つ以上の分子の効果をアッセイするための直接的かつ定量
的な技術である。
性曲線のリガンド依存性変化に基づく。ある範囲の温度にわたって加熱される場
合、レセプターはほどけ変性する。温度の関数としてのほどけ変性の程度をプロ
ットすることにより、レセプターに関する熱ほどけ変性曲線を得る。熱ほどけ変
性曲線における参照の有用な点は、レセプター分子の半分が変成した温度である
温度中間点(Tm)である。
の関数のカップリングのために、リガンド結合親和性Kdに関連する実験的に観
察可能なものとして、リガンド−レセプター複合体(複合体形成されていないレ
セプターに比較して)についての、熱的に誘導されたほどけ変性曲線の中間点の
リガンド依存性変化ΔTmに基づいている(Schellman,J.A.、B
iopolymers 15:999〜1000(1976);Brandts
,J.F.、Biochemistry 29:6927〜6940(1990
))。この熱的物理学的スクリーニングストラテジーは、リガンド−レセプター
相互作用についての結合親和性のインディケーターとしてリガンド−レセプター
混合物の熱安定性を利用する。これらのアッセイは、伝統的にタンパク質が、熱
誘導性ほどけ変性転移を起こすときに、熱容量の変化をモニターする示差走査熱
量測定器(DSC)において、1度に行なわれてきた(Brandtsら、Bi
ochemistry 29:6927〜6940(1990);およびWeb
er,P.ら、J.Am.Chem.Soc.116:2717〜2724(1
994))。あるいは、熱シフトアッセイは、タンパク質の熱的に誘導されたほ
どけ変性転移に対して生じる吸光度変化(Chavan,A.J.ら、Bioc
hemistry 33:7193〜7202(1994));蛍光変化(Ch
avan,A.J.ら、Biochemistry 33:7193〜7202
(1994));または円二色性変化(Bouvier,M.ら、Scienc
e 265:398〜402(1994);Morton,A.ら、Bioch
emistry 34:8564〜8575(1995))をモニタリングする
温度制御光学機器を使用することにより、同様に、1度に実行され得る。
識化合物だけでなく、蛍光または他の発色団による標識を必要としないので、熱
シフトアッセイを使用する多くの利点がある。アッセイは、多くの(もし全部で
なければ)薬物標的生体分子にとって内在性の一般的な物理化学的プロセスであ
る、生体分子の熱ほどけ変性を利用する。一般的な適用性が、このアッセイの重
要な局面である。なぜなら、新規の治療用レセプタータンパク質が市販されるた
びに、新規のアッセイを発明する必要性を未然に防ぐからである。分光光度法ア
ッセイが通常可能でない場合、このアッセイは、非酵素標的へのリガンドの結合
(例えば、成長因子/レセプター相互作用)を測定するために特によく適してい
る。しかし、従来行われているように、熱シフト法の単一のアッセイ構成は、特
に化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに対してこの技術の有
用性を限定してきた。
ド化合物を同定し、そして順位付けする96穴プレート(またはより高密度)型
における、一般に適用可能なハイスループットリガンド−レセプタースクリーニ
ングストラテジーを開発することにより、タンパク質/リガンドスクリーニング
プロセスを非常に加速し得た。
opolymers 14:999〜1018(1975))。結合の程度およ
び相互作用の自由エネルギーは、リガンド濃度の関数としての平行な過程に従う
(Schellman,J.、Biophysical Chemistry
45:273〜279(1993);Barcelo,F.ら、Chem.Bi
ol.Interactions 74:315〜324(1990))。リガ
ンドによる安定化の結果として、より多くのエネルギー(熱)が、レセプターを
ほどけ変性させるために必要とされる。従って、リガンド結合は、熱ほどけ変性
曲線をシフトする。すなわち、リガンド結合は、タンパク質の熱安定性を増加す
る。この性質は、リガンドがレセプターに結合するか否かを決定するために利用
され得る:熱ほどけ変性曲線における、従って、Tmにおける変化または「シフ
ト」は、リガンドがレセプターに結合することを示唆する。
Biopolymers 15:999〜1000(1976))により記載さ
れ、そしてまた、Brandtsら(Biochemistry 29:692
0〜6940(1990))により記載されている。Brandtsら(Bio
chemistry 29:6927〜6940(1990))による示差走査
熱量測定研究は、1つのほどけ変性転移のある1:1の化学量論の強固な結合の
系について、以下の数式からTmでの結合親和性を見積もり得ることを示してい
る:
ゼンリガンドの構造に基づく設計のために有用であることが見出された(Web
er,P.ら、J.Am.Chem.Soc.116:2717〜2724(1
994))。これらの測定値は、混合または等温性の滴定熱量測定実験を行うこ
とによりさらに調べられ、DSCにより決定された結合親和性と一致する結合親
和定数を得た。リガンド結合親和性を見積もるためにタンパク質熱ほどけ変性を
用いることの容易さおよび再現性は、さらなる一般的な薬物発見ツールになるこ
とに対するこのアプローチをさらに広げる可能性を、本発明者らに印象付けた。
れぞれのタンパク質に対して特異的である。熱量計が代表的に0.1℃ごとにほ
どけ変性データを収集するので、ΔHuおよびΔCpuの熱量測定は、これらのパ
ラメーターの最も正確な見積もりである。しかし、パラメーターΔHuおよびΔ
Cpuはまた、マイクロプレート熱シフトアッセイにおいて見積もられ得、この場
合、ΔHuは、熱量エンタルピーでなく、最近のプロトコルを用いて、2.0℃
ごとで収集されたほどけ変性データに基づく比較可能van’t Hoffエン
タルピーである。さらに、ΔHuおよびΔCpuについての最適データの不在下で
さえ、これらのパラメーターは、化合物スクリーニングに関与するタンパク質に
特異的な定数であり、そのために、ウエルからウエルへ変化しておらず、結合親
和性(すなわちTmでのKI)の相対値の計算に影響を与えない。
は、以下の等式を使用するそれぞれのウエルについてのほどけ変性データの非線
型最小二乗法コンピューターフィットの使用を通して達成される:
ーターを使用し、ここで、yfおよびyuは、それぞれ遷移前および遷移後の蛍光
レベルである。コンピューターフィットは、Levenberg−Marqua
rdtアルゴリズムを使用することにより、残差平方和の最小値に達するために
、これらのパラメーターを浮動することにより決定される。T0値は、リガンド
を添加していないウエルについて得られ、そして参照としてセットされる。市販
の曲線フィッティングソフトウエアは、当業者にとって容易に入手できる。例え
ば、Kaleidograph3.0(Synergy、Reading、PA
)を使用し得る。
リガンド結合の際の熱容量の変化であるΔCpLが、公知である場合、等式3を用
いて、任意の温度でのリガンド会合平衡定数であるTでのKL、Tmでのリガンド
会合平衡定数を計算することもまた可能である(BrandtsおよびLin、
1990)。
の指数関数項がちょうど使用されてTにおけるKLの近似値が得られ得る。そし
て方程式3は、方程式4に変形される。
熱量測定装置を使用する等温滴定熱量測定法を使用して測定され得る。熱量測定
のデータが利用できない場合、
タルピーである(Wisemanら、Anal.Biochem.179:13
1−137(1989))。
この蛍光方法体系は、吸着方法体系よりも感度が高い。蛍光分光測定実験におけ
る固有タンパク質蛍光および蛍光プローブ分子の使用は、当業者に周知である。
例えば、Bashford,C.L.ら,Spectrophotomery
and Spctrofluorometry:A Practical Ap
proach,IRL Press Ltd.,出版,91−114頁(198
7);Bell,J.E.,Spectroscopy in Biochem
istry,第I巻,CRC Press,出版,155−194(1981)
;Brandts,L.ら,Ann.Rev.Biochem.41:843(
1972)を参照のこと。
た米国特許出願番号第08/853,464号、および国際特許出願番号PCT
/US97/08154(公開番号WO97/42500として1997年11
月13日に公開)に記載され、これらは本明細書中においてそれら全体を参考と
して援用する。
サンプルにおいて同時に行われ得る。あるいは、読み込みは、少なくとも2つの
グループにおけるサンプルにおいて一度に行われ得る。
分子またはレセプターの熱ほどけ変性をモニターするために使用され得る。蛍光
イメージングシステムは、当業者に周知である。例えば、ALPHAIMAGE
RTM ゲルドキュメンテーションおよび解析システム(Alpha Innot
ech,San Leandro,CA)では、768×494ピクセルの解像
度を有する高性能電荷結合素子(CCD)カメラを使用する。電荷結合素子カメ
ラはコンピューターで調整され、そして画像はImage analysis
softwareTMで解析される。CHEMIMAGERTM(Alpha In
notech)は、ALPHAIMAGERTMの全ての機能を実行し、さらに化
学発光サンプルおよび他の低い強度のサンプルの画像を取り込む冷却電荷結合素
子である。CHEMIMAGERTM電荷結合素子は、ペンティアムプロセッサー
(1.2Gbハードドライブ、16Mb RAM)、AlphaEaseTM解析
ソフトウェア、軽くしっかりとしたキャビネット、ならびにUVおよび白光トラ
ンス−イルミネーターを備える。例えば、MRC−1024 UV/可視レーザ
ー共焦イメージングシステム(BioRad,Richmond,CA)は、広
い範囲の照度波長(350nm〜700nm)の全域での1つより多い発蛍光団
の同時イメージングを容易にする。Gel Doc1000蛍光ゲルドキュメン
テーションシステム(BioRad,Richmond,CA)は、20×20
cmの大きさ、または5×4cmの小ささのサンプル面積を明瞭に提示し得る。
少なくとも2つの96ウェルマイクロプレートが、20×20cm面積に適し得
る。このGel Doc1000システムはまた、時間ベースの実験の実行を容
易にする。
イクロプレート熱シフトアッセイにおいてレセプターほどけ変性をモニターする
ために使用され得る。この実施態様において、複数のサンプルが25℃〜110
℃の間で同時に加熱される。蛍光発光読み込みは、複数のサンプルのそれぞれで
同時に行われる。例えば、96ウェルまたは384ウェルマイクロプレートの各
ウェルでの蛍光は、同時にモニターされ得る。あるいは、蛍光読み込みは、各サ
ンプルに対して継続的におよび同時に行われ得る。より低い温度では、サンプル
は全て低レベルの蛍光を提示する。温度が上昇するにつれて、各サンプルの蛍光
は増加する。高い親和性で標的分子と結合するリガンドを含むウェルは、熱ほど
け変性曲線を高温側へシフトする。この結果、任意のリガンドの非存在下におい
て標的分子のTmより高い所定の温度で、高い親和性を有する標的分子と結合す
るリガンドを含むウェルは、高い親和性リガンドを含まないウェルより蛍光が減
少する。サンプルが増加段階で加熱される場合、全ての複数のサンプルの蛍光は
、各加熱段階で同時に画像化される。サンプルが継続的に加熱される場合、複数
のサンプルの全ての蛍光発光は、加熱中同時に画像化される。
理由のため、熱シフトアッセイは1〜10μLの容量で実施するのが好ましい。
第一に、およそ10〜100倍少ないタンパク質が、小型化アッセイのために要
求される。このように、たった約4〜40ピコモルのタンパク質(25kDaの
タンパク質では0.1μg〜1.0μg)がアッセイのために要求される(すな
わち、約1μM〜約4μMの標的分子の濃度を有する1μL〜10μLの使用量
)。このように、1mgのタンパク質が、小型化形式において1,000〜10
,000アッセイを行うために使用され得る。これは、標的分子が微量で利用可
能な場合、特に有利である。
求される。この利点は、ライブラリー化合物が微量で合成される有価コンビナト
リアルライブラリーをスクリーニングする場合、研究者にとって非常に重要であ
る。ヒトα−トロンビンの場合、理想のリガンド濃度は約50μMであり、これ
は、小型化形式におけるアッセイ当たり25ピコモル〜250ピコモルのリガン
ド、または10ng〜100ngのリガンド(500Daの分子量と仮定)と解
釈される。
し得るため、アッセイのより大きなアレイを使用可能にする。例えば、384ウ
ェル(16×24アレイ)または864ウェル(24×36アレイ)プレートは
、96ウェルプレート(8.5×12.5cm)と同じ寸法を有する。この38
4ウェルプレートおよび864ウェルプレートは、使用者が多くのアッセイとし
てそれぞれ4回または9回と、96ウェルプレートを使用して実行し得るのと同
じくらい多くのアッセイを実行することを可能にする。あるいは、より多くのウ
ェルを有するプレート(例えば、1536ウェルプレート(32×48アレイ;
Matrix Technologies Corp.)のような)が使用され
得る。1536ウェルプレートは、96ウェルプレートにより提供される処理量
の16倍を容易にする。
用してアッセイが実行され得る速さと比較して、アッセイの速さが約16倍増加
し得る。8×12アッセイアレイの配置(96ウェルプレート)は、96アッセ
イ/時、または約2300アッセイ/24時間の実行を容易にする。32×48
アレイアッセイ配置は、約1536アッセイ/時の実行を容易にし、または約3
7,000アッセイ/24時間が、32×48アッセイアレイ配置を使用して、
実行され得る。
〜50μLである。より好ましくは、アッセイ容量は1〜25μLである。さら
により好ましくは、アッセイ容量は1〜10μLである。さらにより好ましくは
、アッセイ容量は1〜5μLである。さらにより好ましくは、アッセイ容量は5
μLである。最も好ましくは、アッセイ容量は1μLまたは2μLである。
ピレンプレートまたは小さいくぼみのプレートにおいて実行される。小さいくぼ
みのプレートは、全容量15μLを保持する複数の丸底ウェルを含むプレートで
ある。
ンテナにおける多数の異なる分子の1つ以上と接触させる工程;(b)工程(a
)からの多数のコンテナを、好ましくは同時に、加熱する工程;(c)各コンテ
ナ中で、加熱から生じる標的分子の熱ほどけ変性と関連した物理的変化を測定す
る工程;(d)各コンテナについての温度の関数として標的分子についての熱ほ
どけ変性曲線を作成する工程;および(e)工程(d)における各ほどけ変性曲
線と(1)他の各熱ほどけ変性曲線および(2)多数の異なる分子のいずれかの
非存在下におけるタンパク質について得られた熱ほどけ変性曲線とを比較する工
程;ならびに(f)多数の異なる分子のいずれかが、このタンパク質の熱安定性
を改変するかどうかを決定する工程であって、ここで熱安定性における改変は、
熱ほどけ変性曲線におけるシフトにより示される、工程により実行される。
程を包含し得る。工程(e)はさらに、工程(d)における各熱ほどけ変性曲線
のTmと(1)他の各熱ほどけ変性曲線のTmおよび(2)異なる分子のいずれか
の非存在下における標的タンパク質について得られた熱ほどけ変性曲線のTmと
を比較する工程を包含し得る。
、工程(a)は、標的タンパク質を、多数の各コンテナに存在する蛍光プローブ
分子と接触させる工程を包含し、そして工程(c)は、(c1):多数の各コン
テナにおいて、光により蛍光プローブ分子を励起する工程;および(c2)多数
の各コンテナからの蛍光を測定する工程を包含する。蛍光(例えば、蛍光発光)
は、多数の各コンテナで一度に1つのコンテナから、同時に多数のコンテナのサ
ブセットから、または同時に多数の各コンテナから測定され得る。
質を安定させる程度に従って分類される。分子が分類された後、機能プローブラ
イブラリー中の分子に対する標的タンパク質の活性スペクトルは、1つ以上の機
能的参照スペクトルリストと比較される。
、ROBOCYCLER(登録商標)勾配温度サイクラー(Stratagen
e,La Jolla,CA)(米国特許第5,525,300号参照のこと)
が、使用され得る。あるいは、温度勾配加熱ブロックが使用され得る(米国特許
第5,255,976号参照のこと)。蛍光は、任意の適切な蛍光分光デバイス
を使用して読み込まれ得る。例えば、CytoFluorII装置(PerSe
ptive Biosystems,Framingham,MA)が、使用さ
れ得る。
を加熱し得るいずれかの要素であり得る。本発明において、複数のサンプルが同
時に加熱される。複数のサンプルは、単一の加熱要素で加熱され得る。あるいは
、複数のサンプルは、1つの加熱要素で所定の温度に加熱され得、次いで別の温
度に加熱するために別の加熱要素へ移動され得る。加熱は、規則的あるいは不規
則的な間隔で達成され得る。滑らかなほどけ変性曲線を生ずるには、サンプルは
、1℃または2℃の間隔で均一に加熱されるべきである。サンプルが加熱され得
る温度範囲は、4℃〜110℃である。スペクトルの読み込み、および特に蛍光
の読み込みは、各加熱段階後に行われる。サンプルは加熱され得、そしてスペク
トルデバイス(例えば、蛍光イメージングカメラ)により継続的様式において読
み込まれ得る。あるいは、各加熱段階後、サンプルは、スペクトルの読み込みを
行う前に、より低い温度に冷却され得る。好ましくは、サンプルは継続的に加熱
され、そしてサンプルが加熱されている間にスペクトルの読み込みが行われる。
おいて同時に行われ得る。あるいは、読み込みは、一度に少なくとも2つの群の
サンプルにおいて行われ得る。最終的には、この読み込みは、一度に1つのサン
プルにおいて行われ得る。
器具は、スキャナーおよび制御ソフトウェアシステムから成る。蛍光(例えば、
蛍光発光)は、光を通さない検出チャンバーにおける光電子倍増管により検出さ
れ得る。このソフトウェアは、パーソナルコンピューターで使用し、そしてスキ
ャナーの作動はこのソフトウェアを通じて制御される。
光を定量するために、敏感なファイバー光プローブを用いてマイクロプレートを
スキャンする。このマイクロプレートおよびサンプルは、サンプルの各列のスキ
ャン中、静止したままであり得、次いでこのファイバー光プローブが、次の列へ
移動され得る。あるいは、マイクロプレートおよびサンプルが、ファイバー光プ
ローブ下においてサンプルの新しい列に位置するように移動され得る。このスキ
ャンシステムは、1分間に96サンプルをスキャンし得る。このスキャナーは、
最も共通の発蛍光団を測定するために複数の励起フィルターおよび複数の発光フ
ィルターを保持し得る。このように、蛍光発光の読み込みは、一度に1つのサン
プルにおいて、またはサンプルのサブセットにおいて同時に行われ得る。
速におよび再生的に加熱し得る任意の要素であり得る。複数のサンプルが、単一
の加熱要素において加熱され得る。あるいは、複数のサンプルが、ある加熱要素
上で所定の温度に加熱され得、そして次いで別の温度へ加熱するために別の加熱
要素へ移動され得る。加熱は規則的な間隔または不規則的な間隔で成し遂げられ
得る。滑らかなほどけ変性曲線を生ずるために、このサンプルは、1℃または2
℃の間隔で均一に加熱されるべきである。このサンプルが加熱され得る温度範囲
は、4℃〜110℃である。
おいて別々の温度間隔において加熱される場合、スペクトルの読み込みは各加熱
段階後に行われる。あるいは、各加熱段階後、サンプルは、スペクトルの読み込
みが行われる前により低い温度に冷却され得る。あるいは、サンプルは、継続様
式で加熱され得、そしてスペクトルの読み込みは加熱中に行われる。
いは、このアッセイ装置は、可動プラットホーム上に複数の熱伝導ブロックを含
むように、配置され得る。このプラットホームは、例えばサーボ駆動リニアース
ライドデバイスによって直動され得る直動可能なプラットホームであり得る。例
証的なリニアースライドデバイスは、モデルSAA5M400(IAI Ame
rica,Torrance,CA)である。本実施態様において、センサーは
、所定の熱伝導ブロックにおいて各サンプルからのスペクトル発光を受容する。
次いで、このプラットフォームは、加熱ブロックにおける各サンプルからのスペ
クトル発光を受容するために、センサー下に別の熱伝導ブロックおよびそれに付
随するサンプルを置くように直動される。このプラットフォームは、スペクトル
発光が全ての熱伝導ブロックにおけるサンプルから受容されるまで、直動する。
2に示されるような、回転プラットフォームであり得る。後者の実施態様におい
て、センサーは、所定の熱伝導ブロックにおける各サンプルからのスペクトル発
光を受容する。次いでこのプラットホームは、加熱ブロックにおける各サンプル
からのスペクトル発光を受容するために、センサー下に別の熱伝導ブロックおよ
びそれに付随するサンプルを置くように回転される。このプラットホームは、全
ての熱伝導ブロックにおけるサンプルからスペクトル発光を受容するまで、回転
する。
を含む複数の熱伝導ブロック204は、回転プラットフォームまたはカルーセル
206上に装備される。プラットホームまたはカルーセル206は、熱伝導ブロ
ック204が構成される物質のような熱伝導物質で構成され得る。軸208は、
基部202に回転可能に連結される。回転プラットホーム206は、軸208の
周囲を回転するように軸方向に装備される。軸208の回転は、サーボコントロ
ーラー210によって制御される。サーボコントローラー210は、当業者に周
知の様式において、コンピューターコントローラー250によって制御される。
コンピューターコントローラー250は、サーボコントローラー210に軸20
8を回転させ、それにより、回転プラットフォーム206を回転させる。この様
式において、熱伝導ブロック204は、ファイバー光プローブ212下で連続し
て置換される。
て制御され得る。このように、1番目の熱伝導ブロック204の温度は、2番目
の熱伝導ブロック204の温度より高く、または低くなり得る。同様に、3番目
の熱伝導ブロック204は、1番目または2番目の熱伝導ブロック204のいず
れかの温度より高く、または低くなり得る。
04へ連結される。温度コントローラー214の作動下において、熱伝導ブロッ
ク204の温度は、上昇、低下、または一定に保たれ得る。温度コントローラー
214は、回転プラットホーム206の温度を調節するように配置され得る。こ
のような配置では、回転プラットホーム206が加熱される場合、熱伝導ブロッ
ク204もまた、加熱される。あるいは、各熱伝導ブロック204の温度は、上
記に示したような循環水システムによって制御され得る。特に、熱伝導ブロック
204の温度は、予め決められた温度プロフィールに従って温度コントローラー
214により、変更され得る。好ましくは、温度コンピューターコントローラー
214は、コンピューターシステムを使用して実行される。
う。用語「温度プロフィール」は、温度における継続的な上方変化または下方変
化、直線的および非直線的な変化を共に含む。この用語はまた、段階的な温度変
化プロトコルを含み、これは、温度上昇または低下が温度が一定に維持される期
間によって中断される間の、温度における増分的な増加または減少によって特徴
付けられるプロトコルを含む。図2に示される装置において、この温度プロフィ
ールは、温度コンピューターコントローラー214をプログラミングすることに
よって予め決定され得る。例えば、温度プロフィールは、温度コントローラー2
14の記憶デバイスに保存され得るか、または操作者によって温度コントローラ
ー214へインプットされ得る。
源218からの励起光は、励起光によりサンプル216を励起する。任意の適切
な光源が、使用され得る。励起光は、サンプル216からのスペクトル発光を生
じる。このスペクトル発光は、電磁スペクトルにおける任意の波長の電磁放射で
あり得る。好ましくは、このスペクトル発光は蛍光、紫外光、または可視光であ
る。最も好ましくは、このスペクトル発光は、蛍光発光である。
いる。例証的なセンサーは、ファイバー光プローブ212である。ファイバー光
プローブ212は、励起光をサンプル216に伝達し得るファイバー光ケーブル
、およびサンプル216からのスペクトル発光を受容し得るファイバー光ケーブ
ルを備える。電磁放射は、励起光インプットファイバー光ケーブル228により
、励起光源218からファイバー光プローブ212へ伝達される。
孔径を制御する。励起光源218および励起光フィルターサーボコントローラー
258は、励起光コンピューターコントローラー254に、伝達可能におよび作
動可能に連結される。コンピューターコントローラー254は、励起光フィルタ
ーサーボコントローラー258を制御することによってサンプル216へ伝達さ
れる励起光の波長を制御する。励起光は、サンプル216への伝達のために、励
起光インプットファイバー光ケーブル228を通じてファイバー光プローブ21
2へ伝達される。
て受容され、アウトプットファイバー光ケーブル250によりスペクトル発光フ
ィルター238へ伝達される。スペクトル発光サーボコントローラー240は、
スペクトル発光フィルターの孔径238を制御し、それにより、光電子倍増管2
20へ伝達されるスペクトル発光の波長を制御する。スペクトル発光サーボコン
トローラー240は、コンピューターコントローラー242によって制御される
。
電気アウトプット244は、光電子倍増管220を電気連結224へ連結する。
電気連結224は、電気アウトプット244をコンピューター222に連結する
。適切なソフトウェアにより駆動されて、コンピューター222はサンプル21
6からのスペクトル発光シグナルを処理する。例証的なソフトウェアは、サンプ
ル216から得られた蛍光データを自動的に解析するグラフィカルインターフェ
イスである。このようなソフトウェアは、当業者に周知である。例えば、Cyt
oFluorTMII蛍光マルチウェルプレートリーダー(PerSeptive
Biosystems,Framingham,MA)は、Cytocalc TM データ解析システム(PerSeptive Biosystems,Fra
mingham,MA)を利用する。他の適切なソフトウェアは、MicroS
oft Excelまたは匹敵する任意のソフトウェアを含む。
機子226を移動させる。2番目の相対移動手段232は、サンプル216から
のスペクトル発光を検出するためにファイバー光プローブ212が移動され得る
ように、方向246および248にセンサー電機子226を移動させる。
手段またはセンサーは、光電子増倍管を含み得る。あるいは、スペクトルの受信
手段またはセンサーは、電荷結合デバイス(CCD)を含み得る。なお別の代替
物において、スペクトルの受信手段またはセンサーは、ダイオードアレイを含み
得る。CCDは、半伝導シリコンから作製される。光子があたった場合、自由電
子が放出される。
得る。高解像度のCCDカメラは、電磁エネルギーが、遠い星(distanc
e star)から生じようとも、結晶により回折されようとも、発蛍光団によ
り放射されようとも、非常に少量の電磁エネルギーを検出し得る。電子画像装置
として、CCDカメラは、非常にかすかな物体を検出し得、広範囲のスペクトル
領域にわたって感度良く検出し得、低レベルの電磁的ノイズを与え、そして広い
ダイナミックレンジにわたるシグナルを検出し得る(すなわち、電荷結合デバイ
スは、明るい物体およびかすかな物体を同時に検出し得る)ことから、特に蛍光
放射画像化に適している。さらに、出力は、集められた電気の量が、光子受信数
と直接比例するように、直線である。これは、画像の明るさが、物体の実際の明
るさ(例えば、写真乳剤によって与えられない特性)の尺度であることを意味す
る。適切なCCDカメラは、Alpha−Innotech(San Lean
dro、CA)、Stratagene(La Jolla、CA)、およびB
ioRad(Richmond、CA)より入手可能である。
本明細書中に参考として援用される、1997年5月9日に出願された、米国特
許出願番号第08/853,459号および国際特許出願番号PCT/US97
/08154(1997年11月13日に、公開番号WO97/42500とし
て公開された)にさらに記載される。
るが、他に特定しない限り、限定することを意図しない、以下の具体例を参照す
ることにより容易に理解される。
アッセイにおいて試験されており、そして表2に列挙される。それらは、インビ
ボでの機能の広い多様性を有する種々の異なるタンパク質を含む。種々のセリン
プロテアーゼ、DNA結合タンパク質(lacリプレッサー)、2つの増殖因子
(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および酸性線維芽細胞増殖因子(aF
GF))、および増殖因子レセプター(線維芽細胞増殖因子レセプター1のドメ
インII(D(II)FGFR1)、がこれらに含まれる。
。平均的に、10μLのアッセイ容量を使用して、1.0mgのタンパク質あた
り1322アッセイを行なうことが可能であった。実行され得るアッセイの数は
、もし、5μLアッセイ形式がとり行なわれる場合、2倍にされ得る。
ルプレート中で、タンパク質/リガンド混合物の熱ほどけ変性転移をモニタリン
グするための蛍光プローブとして、200μMの1,8−ANSを用いて行なっ
た。460nmでの蛍光放射の変化は、CytoFluorII(PerSep
tive Biosystems)蛍光プレートリーダー(360nmにおいて
励起)でモニタリングし、そして温度は、RoboCycler(登録商標)G
radient Temperature Cycler(Stratagen
e、La Jolla、CA)を用いて、2℃の増加分で上昇させた。
クロプレート熱シフトアッセイを用いてアッセイした:セリンプロテアーゼ(ト
ロンビン、Xa因子、D因子、ウロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、サ
ブチリシン);細胞表面レセプター(FGFレセプター1、MHC Class
II、GLP1レセプター、β−2アドレナリン作動性レセプター、フィブロネ
クチンレセプター(IibIIIa));増殖因子(aFGF、bFGF);D
NA結合タンパク質(lacリプレッサー、NF−k−B、ヘリカーゼ);モー
タータンパク質(ミオシン、ヘリカーゼ);オキシド−レダクターゼ(西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、シトクロムc、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクトペルオキシ
ダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセルア
ルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ);カーボハイドレート改変体(セルラーゼ、
α−アミラーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ);
免疫グロブリン(IgG Fab、IgG Fc);DNAse(DNase
I、DNase II)RNAse(RNase A);細胞内カルシウムレセ
プター(カルモジュリン、S100タンパク質);神経伝達物質ヒドラーゼ(ア
セチルコリンエステラーゼ);フリーラジカル捕捉剤(スーパーオキシドジスム
ターゼ);ビオチン結合タンパク質(ストレプトアビジン);酸素結合タンパク
質(ミオグロビン);およびプロテアーゼインヒビター(トリプシンインヒビタ
ー)。
ンパク質分子内で多数回生じる複数リガンド結合の相互作用について例示される
。アッセイを再構成することなしに、単一タンパク質への多くの異なった種類の
リガンドの結合を評価し得る能力は、この技術にとって大きな利点であり、そし
て一次配列以外に知られていることのないタンパク質の機能決定の課題に容易に
それらを用いる。異なったリガンドの結合のための知識は、ゲノム情報から得た
サンプルのタンパク質の機能の評価を補助する。
ク質への1つの部位への結合についてリガンドをスクリーニングするために用い
られ得る。しかし、リガンド結合およびタンパク質のほどけ変性の自由エネルギ
ーのおよその加算性に基づいて、マイクロプレート熱シフトアッセイを、標的タ
ンパク質に対する複数リガンド結合相互作用の分析のために用いることもまた可
能である。原則として、同じタンパク質に結合する異なるリガンドの結合の自由
エネルギーが、ほぼ加算性である場合、非共作同性または共作同性(陽性または
陰性)のいずれかの複数リガンド結合系を分析し得る。
のアッセイの有用性試験のための理想的なシステムである。なぜなら、ヒトトロ
ンビンは、少なくとも4つの異なる結合部位を有している:(1)触媒の結合部
位;(2)フィブリン結合部位(エキソサイトI(exosite I));(
3)ヘパリン結合部位(エキソサイトII);(4)触媒部位から約15Åの位
置にある、Na+結合部位。
(Hirugen)(ヒルジン53−64)(Sigma)、およびヘパリン5
000(CalBiochem)が、それぞれトロンビンの触媒部位、フィブリ
ン結合部位、およびヘパリン結合部位と結合する。
NaCl、1mM CaCl2、および100μM 1,8−ANS中1μM
まで希釈した。それぞれのトロンビンリガンドは、単一にそして異なる組み合わ
せで、200μMであるヘパリン5000を除いて、それぞれ50μMの終濃度
の1μMトロンビン溶液まで含む。100μLのトロンビンまたはトロンビン/
リガンド溶液を、96ウェルV底ポリカーボネートマイクロタイタープレートの
ウェルに分注した。内容物を、100μLピペットチップで、吸い上げおよび排
出を繰り返して混合した。最後に、1滴の鉱油(Sigma、St.Lois、
MO)を、温度の上昇したサンプルからの蒸発を減少させるために、それぞれの
反応ウェルの上部に加えた。プレートは、RoboCycler(登録商標)G
radient Temperature Cycler(Stratagen
e、La Jolla、CA)熱ブロック中で、3分間加熱して、それによって
マイクロプレート内での熱勾配を作製し、続いて、30秒間25℃で冷却し、そ
して次いで蛍光プレートリーダーで読み取った。データは、非線形最小角適合に
より分析した。
、それぞれのTm(等式(1)を参照のこと)でのリガンド結合について、それ
ぞれ15nM、185nMおよび3434nMのKdに対応して、3DP−46
60>ヒルゲン>ヘパリン5000である。
図4の結果より、全てを加算して予測したものよりもわずかに小さい熱ほどけ変
性シフトを示す。例えば、ヒルゲン単独では、5.8℃のΔTmが得られ、3D
P−4660単独では、7.7℃のΔTmが得られるが、それらを一緒にすると
、もし、結合エネルギーが十分に加算性である場合、予想されたシフトである1
3.5℃ではなく12.2℃のΔTmを示した。この結果は、両方のリガンドが
トロンビンと結合する場合、1つまたは両方のリガンドの結合親和性が、減少す
ることを意味し得、そしてフィブリン結合部位と触媒結合部位との間の陰性の共
作同性の例である。そのような結果は、種々の色素生産性基質の加水分解の動力
学が、エキソサイトIと結合するリガンドに依存することを見出した、トロンビ
ンの文献と一致する。実際に、ヒルゲンが存在する場合、D−フェニルアラニル
ピペコリルアルギニル−p−ニトロアニリドの加水分解におけるKmで、60%
の減少が観察された(Dennisら、Eur.J.Biochem.188:
61−66(1990))。さらに、触媒部位とエキソサイトIとの間の共作同
性の構造的な証拠もまたある。PPACK結合トロンビン(PPACKは、トロ
ンビン触媒部位インヒビターである)およびヒルゲン結合トロンビンの同形構造
の比較により、エキソサイトIでのヒルゲン結合の結果として、活性部位で生じ
る、構造変化が明らかとなった(Vijayalakshmiら、Protei
n Science 3:2254−2271(1994))。従って、触媒作
用の中心とエキソサイトIとの間で、観察された明らかな共作同性は、文献にお
ける機能および構造のデータと一致する。
7℃のΔTmが見られると予想した。しかし、3つの全てのリガンドが同時に存
在する場合、ΔTmは、12.9℃であった。この結果は、3つの全てのタンパ
ク質の結合部位でのリガンド結合を含む陰性の共作同性をさらに意味する。この
仮定と一致する文献中のいくつかの証拠が存在する。例えば、ヘパリンおよびフ
ィブリンモノマーと3つ組みの複合体を形成するトロンビンは、トリペプチド色
素生産性基質およびプロトロンビンの活性を減少させ(HoggおよびJack
son、J.Biol.Chem.265:248−255(1990))、そ
してアンチトロンビンとの反応性を著しく減少させた(HoggおよびJack
son、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3619−3
623(1989))。また、最近のHotchkissらの観察(Blood
84:498−503)によると、3つ組みの複合体はまた、血漿中で形成し
、そしてヘパリン抗凝固活性を著しく損なうことが示される。
びに表3の結果から、以下の結論が得られた。第1に、ヘパリン5000の存在
下で、ヒルジン53−65は、ヘパリン非存在下の結合よりも約21分の1の強
さでトロンビンに結合し;そしてヘパリン5000の存在下で、3DP−466
0は、ヘパリン非存在下での結合よりも約10分の1の強さでトロンビンと結合
した。
非存在下での結合よりも約18分の1の強さでトロンビンに結合し;そして、ヒ
ルジン53−65の存在下で、3DP−4660は、ヒルジン53−65の非存
在下での結合よりも約3分の1の強さでトロンビンに結合した。
在下での結合と比べて約25%の強さでトロンビンと結合し;そして、3DP−
4660の存在下で、ヒルジンは、3DP−4660の非存在下での結合と比べ
て、約2.3分の1の強さでトロンビンに結合した。
ける複数リガンドの結合相互作用の分析のために多くの利益を提供する。例えば
、同じアッセイは、標的タンパク質上の複数の結合部位に結合する、異なる種類
のリガンドの結合を同時に検出し得る。同定されたそれぞれのリガンドの結合相
互作用は、使用者のタンパク質の機能の割り当てを助ける。機能が要約されてい
る場合、タンパク質の特定のクラスに特徴的である応答曲線が得られる。
パク質について知られていることをそのときに忘れている場合、ヘパリン結合の
データが、ヘパリンおよび他の硫酸化オリゴ糖が、高等生物の組織の細胞外マト
リクスの重要な構成成分であることから、このタンパク質の細胞外での役割を示
唆し得る。触媒結合部位のリガンドである3DP−4660は、トリプシン様セ
リンプロテアーゼの基質およびインヒビターの特徴である、P1部位にアルギニ
ル側鎖を有するペプチドの非ペプチド模倣物である。同様に、この合成ペプチド
模倣物についてのP1部位にアルギニン基を有する、ボロアルギニン(boro
arginine)転移状態アナログが、観察された特異性:Kd 約10nM
(トロンビン)、Kd 約1,000nM(トリプシン)、Kd 約10,000
nM(プラスミン)を有するセリンプロテアーゼ、トロンビン、トリプシン、お
よびプラスミンについての特異的インヒビターであることが見出された(Tap
parelliら、J.Biol.Chem.268:4734−4741(1
993))。従って、ボロアルギニン転移状態アナログとの結合が観察された、
ヘパリン結合の重ね合わせた知識は、任意のほかの情報が存在しない場合に、細
胞外タンパク質分解機能へのこのタンパク質の割り当てに急速に焦点を当てる。
結合の共作同性を検出するために用い得る。リガンド結合共作同性に関する情報
を、従来の方法を用いてタンパク質機能の分類を行なう場合に必要とされるよう
な数ヶ月以上にわたるのではなく、非常に速く、数時間で収集および分析し得る
。
ート1)は94の化合物(および2つのコントロールウェル)を含み、そしてタ
ンパク質のリガンド結合の優先度、およびそこから予測されるタンパク質の機能
に関する情報を提供するために有用であると考えられる多くの化合物を含む。例
えば、NADおよびATPのような補因子は、それぞれウェルA4およびウェル
A5において見出される。この特定プレートはまた、金属イオン補因子に対する
標的タンパク質をプローブするのを援助するため、非常に多くの金属イオン結合
条件を含んだ。
レート1の化合物と共にインキュベートし、次いでマイクロプレート熱シフトア
ッセイを使用してアッセイした。例えば、第Xa因子(Enzyme Rese
arch Labs)に対して得られた活性スペクトルは、図6に示される。
end,IN)から購入した。反応物を、96ウェルポリカーボネートV底ウェ
ルマイクロタイタープレート中で調製した。第Xa因子の最終濃度は、200m
M Tris−HCl(pH8)の中で1.4μM(55ng/mL)とした。
1,8−ANSの最終濃度は100μMとした。結合に関して試験された各分子
の最終濃度は、図6に示される。内容物を、100μLのピペットチップ内で吸
入および排出を繰り返すことにより混合した。最後に、温度上昇におけるサンプ
ルからの蒸発を減少するために、1滴のミネラルオイル(Sigma,St.L
ois,MO)を各反応ウェルの上に添加した。
dient Temperature Cycler(Stratagene,
La Jolla, CA)を使用して、40℃〜70℃までの2℃増分で加
熱した。各加熱工程の後、蛍光スキャニングの前に、サンプルを25℃に冷却し
た。蛍光を、CytoFluor II蛍光マイクロプレートリーダー(Per
Septive Biosystems,Framingham, MA)を用
いて測定した。1,8−ANSを波長360nmの光で励起した。蛍光発光を、
460nmで測定した。
が見出された:(1)0.5M (NH4)2SO4、(2)0.5M MgSO4 、(3)0.5M Li2SO4、(4)0.5M KCl、(5)0.1Mトリ
ポリリン酸塩、および(6)0.1M CaCl2。最後の2つの条件はおそら
く最も重要である。なぜなら、トリポリリン酸塩は、ヘパリンおよび他の硫酸化
オリゴ糖を模擬する高分子電解質であり、そしてそのタンパク質への結合は、第
Xa因子に対して周知のものである、ヘパリン結合部位の存在を示唆する。類似
して、Ca2+は、第Xa因子のGlaドメインに結合することが公知であり、こ
れは0.1M CaCl2に対して見られる安定効果と一致する。
見出された。例えば、[Co(NH3)6]Cl3、BaCl2、CdCl2、YC
l2、およびNiSO4は、6℃〜17℃で第Xa因子を不安定化することが観察
された。この不安定効果の理由は知られていない。これらの金属イオンは、非折
りたたみ形態(unfolded form)の第Xa因子に選択的に結合する
ことが可能である。蛍光プローブでのいくつかの干渉もまた可能である。
FR1に対する活性スペクトルを生成するために使用された。D(II)FGF
R1をクローン化して、そしてE.coli中で発現させた。組換えD(II)
FGFR1を、ヘキサヒスチジンタグがNi2+キレートカラムでアフィニティー
クロマトグラフィーによる回収を容易にするためにN末端に含まれることを除い
て(Janknecht,R.ら、Natl.Acad.Sci.USA 88
:8972−8976(1991))、本質的に記載されたように(Wetmo
re、D.R.ら、Proc.Soc.Mtg.,San Diego,CA(
1994))、封入体から再生した。D(II)FGFR1をヘパリンセファロ
ースカラム(Kan,M.ら、Science 259:1918−1921(
1993);Pantoliano、M.W.ら、Biochemistry
33:10229−10248(1994))でさらに精製した。純度は、SD
S−PAGEで評価した場合、>95%であった。D(II)FGFR1タンパ
ク質を12mg/mL(約1mM)に濃縮し、そして4℃で保存した。
中で調製した。D(II)FGFR1の最終濃度は、96ウェルポリカーボネー
トマイクロタイタープレートの各ウェルにおいて、200mM Tris−HC
l(pH8)中に50μMとした。1,8−ANSの最終濃度は100μMとし
た。結合に関して試験された各分子の最終濃度は、図7に示される。内容物を、
100μLのピペットチップ内での吸入および排出を繰り返すことにより混合し
た。最後に、温度上昇におけるサンプルからの蒸発を減少するために、1滴のミ
ネラルオイル(Sigma,St.Lois,MO)を各反応ウェルの上に添加
した。
dient Temperature Cycler(Stratagene,
La Jolla,CA)を使用して、25℃〜60℃まで2℃増分で加熱した
。各加熱工程の後、蛍光スキャニングの前に、サンプルを25℃に冷却した。蛍
光を、CytoFluor II蛍光マイクロプレートリーダー(PerSep
tive Biosystems,Framingham,MA)を用いて測定
した。1,8−ANSを波長360nmの光で励起した。蛍光発光を、460n
mで測定した。
)FGFR1を安定化することが見出された。例えば、糖類の全て、D(+)−
グルコース、D(+)−スクロース、キシリトール、およびソルビトールは、全
てD(II)FGFR1に対し安定化する(そして、おそらく結合する)ことが
見出された。この結果は、このタンパク質の公知のヘパリン結合特性に一致し得
る。トリポリリン酸塩(公知の高分子電解質ヘパリン模擬体)は、最も大きいシ
フト(約11℃)を生じた。この結果は、このタンパク質のヘパリン結合特性と
一致する(Pantoliano,M.W.ら、Biochemistry 3
3:10229−10248(1994)。
ては(新しい遺伝子がクローン化され、そしてそのコードされたタンパク質の機
能が未知である場合に代表的であるように)、プレート1においてただこの化合
物をスクリーニングしたことにより得られる情報は、使用者にD(II)FGF
R1は、ヘパリン結合タンパク質として分類され得るといういくつかの証拠を提
供したと考えられた。
かし、このタンパク質はダイマー状態においてDNAに結合することが示された
。Lewisらは、そのコグネイトDNAリガンドに結合するLacリプレッサ
ーの結晶構造を解明した(Lewisら、1996、Science 271:
1247−1254)。遺伝学的に改変された二量体(四量体を形成し得ない二
量体)、および合成21マーオリゴヌクレオチド(天然lacオペレーターのパ
リンドローム配列)を、ペンシルバニア大学でDr.Mitch Lewisか
ら得た。合成lacオペレーターの変異体lacリプレッサーへの結合を、マイ
クロプレート熱シフトアッセイを使用してアッセイした。
中で60μMとした。反応物は、96ウェルポリカーボネートV底ウェルマイク
ロタイタープレート中で調製した。1,8−ANSの最終濃度は100μMとし
た。結合に関して試験された各分子の最終濃度は、図7に示される。内容物を、
100μLのピペットチップ内で吸入および排出を繰り返すことにより混合した
。最後に、温度上昇におけるサンプルからの蒸発を減少するために、1滴のミネ
ラルオイル(Sigma,St.Lois,MO)を各反応ウェルの上に添加し
た。
dient Temperature Cycler(Stratagene,
La Jolla,CA)を使用して、25℃〜75℃まで2℃増分で加熱した
。各加熱工程の後、蛍光スキャニングの前に、サンプルを25℃に冷却した。蛍
光を、CytoFluor II蛍光マイクロプレートリーダー(PerSep
tive Biosystems,Framingham,MA)を用いて測定
した。ANSを波長360nmの光で励起した。蛍光発光を、460nmで測定
した。
折りたたみ遷移のためのTmは、5.6℃シフトされた(図8)。計算されるTm でのKdは、6μMである。ΔHL(−10.0kcal/mol)に関する知識
に基づいた推測を使用すると、計算される25℃でのKdは1.2μM、および
生理的温度(37℃)での計算されるKdは3.4μMである。蛍光プローブ、
1,8−ANSは、単独のDNAには結合しなかった(すなわち、lacリプレ
ッサーが全く含まれないコントロール反応に対して、蛍光シグナルは全く存在し
ない)。
互作用をアッセイするために使用され得ることを示す。
ト熱シフトアッセイを使用してアッセイされ得る。ウシ筋肉ミオシン(Sigm
a)、ウシ心臓3’−5’cAMP−依存プロテインキナーゼ(Sigma)お
よびニワトリ筋肉ピルビン酸キナーゼ(Sigma)を、最終濃度2mg/mL
でストック溶液を作成するために、それぞれ緩衝液Aに溶解した。塩化マグネシ
ウム(MgCl2)、アデノシン三リン酸、アデノシン三リン酸−γ−S(AT
P−γ−S)、三フッ化アルミニウム(AlF3)、およびフッ化ナトリウム(
NaF)を、緩衝液A(50mM HEPES、pH7.5、100mM Na
Cl)中で、各実験で使用されるストック濃度に溶解した。DapoxylTM1
2800溶液を、ジメチルスルホキシド中の20mM DapoxylTM128
00(5−(4’’−ジメチルアミノフェニル)−2−(4’−フェニル)オキ
サゾールスルホン酸、ナトリウム塩、Molecular Probes,In
c.)のストックを、緩衝液A中で適切な濃度にまで希釈することにより調製し
た。
溶液(2mg/mL)を12μL、ATPまたはATP−γ−S(50mM)の
いずれかを9.6μL、MgCl2(100mM)を4.8μLおよび、緩衝液
A中の222μM dapoxyl 12800溶液を21.6μLを含有した
。ATP、三フッ化アルミニウム、およびフッ化ナトリウムの反応において、各
サンプルはタンパク質ストック溶液(2mg/mL)を12μL、ATP(50
mM)を9.6μL、三フッ化アルミニウム(50mM)+フッ化ナトリウム(
50mM)を9.6mL、100mM MgCl2を4.8μL、および緩衝液
A中の400μM Dapoxyl 12800溶液を12μL含有した。
トを、MJリサーチ384−ウェルサーモサイクラープレートの異なる4象限に
配置された4つのウェル内に分配した。次いで、蒸発を避けるため、各4つのウ
ェルに10μLのミネラルオイルを添加した。示される各データポイントは、こ
のプレートを3分間示された温度に加熱することにより、収集された。例えば、
プレートを所定の温度に加熱し、1分間25℃まで冷却して、次いでUVイルミ
ネーションおよびデータ収集を可能にした。次いで、このプレートを次の高温な
どに加熱した。UVイルミネーションを200〜420nmでの長波長イルミネ
ーション(365nmにピークを有する)を使用して実施した。蛍光を、550
nmを中心点としたバンドパスフィルタを有するCCDカメラを使用して画像化
した。
イの結果を示す。このデータは、温度の関数として蛍光強度に対してプロットさ
れる。コントロールの熱ほどけ変性曲線(ATPなし)のTmは、49.3℃で
あった(マイクロプレートウェルK2)。ATPに結合したウシ筋肉ミオシンに
ついての熱ほどけ変性曲線((+)ATP)のTmは、51.4℃であった(マ
イクロプレートウェルK16)。従って、ATP結合についてのΔTmは、2.
1℃であった。Kdは、440μMであった。
対するマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。このデータは、温度の
関数として蛍光強度に対してプロットされる。コントロールの熱ほどけ変性曲線
(ATP−γ−Sなし)のTmは、46.2℃であった(マイクロプレートウェ
ルE14)。ATP−γ−Sに結合した3’,5’−cAMP依存プロテインキ
ナーゼについての熱ほどけ変性曲線((+)ATP−γ−S)のTmは、51.
8℃であった(マイクロプレートウェルM15)。従って、ATP−γ−S結合
についてのΔTmは、5.6℃であった。Kdは、200μMであった。ピルビン
酸キナーゼに対する結果を含むこの結果は表4に要約される。
。ウシ肝臓ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR、Sigma)、ニワトリ肝臓ジヒ
ドロ葉酸還元酵素(DHFR、Sigma)、ハト肝臓アリールアミンアセチル
トランスフェラーゼ(ArAcT、Sigma)、およびブタ肝臓ホルムイミノ
グルタミン酸トランスフェラーゼ(FGT、Sigma)を最終濃度2mg/m
Lでストック溶液を作成するために、緩衝液A(50mM HEPES、pH7
.5、100mM NaCl)にそれぞれ溶解した。ジヒドロ葉酸(FAH2)
、メトトレキサート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP
)を、使用直前に緩衝液A中に固形材料を溶解することによって調製した。Da
poxylTM12800溶液を、緩衝液A中で、ジメチルスルホキシド中の20
mM DapoxylTM12800のストックを適切な濃度にまで希釈すること
により調製した。
、ジヒドロ葉酸(FAH2)またはメトトレキサートストック溶液(1mM)の
いずれかを4.8μL、および緩衝液A中の154μM DapoxylTM 1
2800溶液を31.2μLを含有した。各サンプルはタンパク質ストック溶液
(2mg/mL)12μL、NADPストック溶液(50mM)を4.8μL、
および緩衝液A中の154μM DapoxylTM 12800溶液を31.2
μLを含有した。
、MJリサーチ384−ウェルサーモサイクラープレートの異なる4象限に配置
された4つのウェル内に分配した。次いで、蒸発を避けるため、各4つのウェル
に10μLのミネラルオイルを添加した。示される各データポイントを、このプ
レートを3分間示された温度に加熱し、次いで25℃で1分間インキュベーショ
ンし、次いでUVイルミネーションおよびデータ収集により、収集した。この結
果を表5に示す。
別々におよび同時にのどちらも)は、複数リガンド結合の相互作用を測定するこ
とにおける本発明の有用性に関する別の実施例である。この場合、2つのリガン
ドの結合部位は隣接しており、この2つのリガンドの結合には正の協同性が存在
する。これは、各リガンドが別々に結合すること対するシフトの合計よりも、両
リガンドが同時に結合することに対する熱シフトは、2〜4℃高いという事実に
より示される(図6)。
シフトアッセイを使用してアッセイされ得る。ウシ肝臓ジヒドロ葉酸還元酵素(
DHFR、Sigma)およびニワトリ肝臓ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR、
Sigma)を、最終濃度2mg/mLでストック溶液を作成するために、緩衝
液A(50mM HEPES、pH7.5、100mM NaCl)にそれぞれ
溶解した。リガンドの全てのストック溶液を、使用直前に緩衝液A中に固形材料
を溶解することによって調製した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸還元形態(NADPH、100mM)、NADP(100mM)、およびメト
トレキサート(1mM)のストック溶液を、緩衝液Aで最終アッセイ濃度の2倍
(2×ストック):(メトトレキサート(200μM)、NADP(20mM)
、NADPH(20mM)、メトトレキサート+NADP(200μM+20m
M)、メトトレキサート+NADPH(200μM+20mM))にさらに希釈
した。DapoxylTM12800溶液を、ジメチルスルホキシド中の20mM
DapoxylTM12800のストックを、緩衝液A中で適切な濃度にまで希
釈することにより調製した。各タンパク質ストック溶液の5μLを、緩衝液A中
の250μM DapoxylTM12800溶液20μLで混合された2×リガ
ンドストック溶液25μLに添加した。
00μM MTXとした。
、MJリサーチ384−ウェルサーモサイクラープレートの異なる4象限に配置
された4つのウェル内に分配した。次いで、蒸発を避けるため、各4つのウェル
に10μLのミネラルオイルを添加した。示される各データポイントを、このプ
レートを3分間示された温度に加熱し、次いで25℃で1分間インキュベーショ
ンし、次いでUVイルミネーションおよびデータ収集により、収集した。
ト熱シフトアッセイの結果を示す。このデータは、温度の関数として蛍光強度に
対してプロットされる。コントロールの熱ほどけ変性曲線(MTXなし)のTm
は、47.2℃であった(マイクロプレートウェルM1)。メトトレキサートに
結合したDHFRについての熱ほどけ変性曲線((+)MTX)のTmは、56
.4℃であった(マイクロプレートウェルG6)。従って、メトトレキサート結
合についてのΔTmは、9.2℃であった。Kdは、24nMであった。
フトアッセイの結果を示す。このデータは、温度の関数として蛍光強度に対して
プロットされる。コントロールの熱ほどけ変性曲線(NADPHなし)のTmは
、50.8℃であった(マイクロプレートウェルG8)。NADPHに結合した
DHFRについての熱ほどけ変性曲線((+)NADPH)のTmは、53.8
℃であった(マイクロプレートウェルB20)。従って、NADPH結合につい
てのΔTmは、3.℃であった。Kdは、0.7μMであった。
キサートは、DHFRに結合する葉酸アナログである。本発明の方法が信頼性の
あるものであることの証拠として、この方法がDHFRに対する葉酸の結合を検
出するために使用され得ることが示される。ウシ肝臓DHFRを、タンパク質の
機能についてスクリーニングするために80の化合物と組み合わせ、そして多く
の他の化合物に対してではなく、メトトレキサートに対しての結合を検出した。
ェルは、ジメチルスルホキシド中で濃度が10mMである80の異なる化合物の
うちの1つを含有した。各化合物溶液を、384ウェルポリスチレンプレート中
の独立ウェル内で、緩衝液A(50mM HEPES、pH7.5、100mM
NaCl)に、最終濃度200μMにまで希釈した。各ウェル内に含まれる5
μL溶液を、ウシ肝臓DHFR(0.5mg/mL濃度)およびDapoxyl TM 12800色素(200μM濃度)を5μL含むMJリサーチポリプロピレン
プレートに移した。これは、各ウェルの10μL容量中に、100μMリガンド
、0.25mg/mL DHFR、および100μM dapoxylの最終濃
度を生じる。
で、熱ほどけ変性プロフィールを、25℃〜70℃まで、1℃増分で分離される
各温度でのデータポイントを収集することにより、各ウェルに対して測定した。
各データポイントを、このプレートを3分間示された温度に加熱し、次いで25
℃で1分間インキュベーションし、次いで長波長UVイルミネーションおよびC
CDカメラを利用するデータの収集により、収集された。
収集された。4象限は、以下のウェルからなる:ウェルA2からウェルH11ま
で(第1象限)、ウェルA14からウェルH23まで(第2象限)、ウェルI2
からウェルP11まで(第3象限)、およびウェルI14からウェルI23まで
(第4象限)。カラム1、12、13、および24は、単独のDHFRおよびジ
メチルスルホキシドを含む基準ウェルからなる。
は、ソフトウェアによりフィッティング赤色ウェルとして示された。メトトレキ
サートは、5.13±0.19℃(4象限の平均)までTmをシフトし、そして
プレート上の他の化合物は、ほとんどまたは全く効果を有しなかった(白色に近
いウェルとして示される)。これらの結果は、DHFRは、メトトレキサートを
結合することを示した。
参考として援用される。
が、形態および詳細についての種々の変化が本発明および添付された請求項の真
の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、この開示を読むことから当業者
により認識される。
発明の方法を例示する別のフローダイヤグラムを示す。
ッセイ装置の平面図を図示する概略図である。
1つのリガンド結合相互作用のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す
。
プレート熱シフトアッセイの結果を示す。
て作製された、Xa因子についての活性スペクトルを示す。
て作製された線維芽細胞増殖因子1(FGFR1)についての活性スペクトルを
示す。
組換え二量体lacリプレッサーのマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を
示す。
ロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。
するウシ心臓3’,5’−cAMP−依存性プロテインキナーゼのマイクロプレ
ート熱シフトアッセイの結果を示す。
)のマイクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。
イクロプレート熱シフトアッセイの結果を示す。
Claims (30)
- 【請求項1】 タンパク質を機能的に分類するための方法であって、該方法
は、以下の工程: (a)1以上の多数の異なる分子を、該タンパク質の安定性を改変するそれらの
能力に関してスクリーニングする工程であって、ここで、該タンパク質の安定性
の改変は、該分子が該タンパク質に結合することを示す、工程; (b)工程(a)の該スクリーニング由来の該タンパク質についての活性スペク
トルを作製する工程であって、ここで、該活性スペクトルは、該タンパク質の安
定性を改変し、それゆえ該タンパク質に結合するリガンドである、該多数の異な
る分子由来の分子のサブセットを反映する、工程; (c)該タンパク質についての該活性スペクトルを、1以上の機能的な参照スペ
クトルリストと比較する工程;および (d)該タンパク質の安定性を改変する、該多数の異なる分子中の分子のセット
に従って該タンパク質を分類する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニン
グ工程(a)が、以下の工程: (a1)前記タンパク質を、1以上の前記多数の異なる分子と、多数のコンテナ
の各々の中で接触させる工程; (a2)該タンパク質を、各々の該多数のコンテナ内で、該タンパク質にほどけ
変性を引き起こすように処理する工程; (a3)各々の該コンテナ内で、該標的分子のほどけ変性に関連する物理的変化
を測定する工程; (a4)各々の該コンテナに対する、該標的分子についてのほどけ変性曲線を作
製する工程;および、 (a5)工程(d)の各々の該ほどけ変性曲線を、(1)各々の該他のほどけ変
性曲線、および(2)任意の該多数の異なる分子の非存在下で該タンパク質につ
いて得られるほどけ変性曲線と比較する工程;ならびに、 (a6)任意の該多数の異なる分子が、該タンパク質の安定性を改変するか否か
を決定する工程であって、ここで、安定性における改変が、該ほどけ変性曲線に
おける変化により示される、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項3】 タンパク質を機能的に分類するための方法であって、該方法
が、以下の工程: (a)特定のクラスのタンパク質に結合することが公知の1以上の多数の異なる
分子を、該タンパク質の安定性を改変するそれらの能力に関してスクリーニング
する工程であって、ここで、該タンパク質の安定性の改変が、該分子が該タンパ
ク質に結合することを示す、工程; (b)工程(a)の該スクリーニング由来の該タンパク質についての活性スペク
トルを作製する工程であって、ここで、該活性スペクトルは、該タンパク質の安
定性を改変し、それゆえ該タンパク質に結合するリガンドである、該多数の異な
る分子由来の分子のサブセットを反映する、工程;および、 (c)該1以上の該多数の異なる分子が、該タンパク質の安定性を改変する場合
、該クラスのタンパク質のメンバーとして該タンパク質を分類する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項4】 請求項3に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニン
グ工程(a)が、以下の工程: (a1)前記タンパク質を、1以上の前記多数の異なる分子と、多数のコンテナ
の各々の中で接触させる工程; (a2)該タンパク質を、各々の該多数のコンテナ内で、該タンパク質にほどけ
変性を引き起こすように処理する工程; (a3)各々の該コンテナ内で、該標的分子のほどけ変性に関連する物理的変化
を測定する工程; (a4)各々の該コンテナに対する、該標的分子についてのほどけ変性曲線を作
製する工程;および、 (a5)工程(d)の各々の該ほどけ変性曲線を、(1)各々の該他のほどけ変
性曲線、および(2)任意の該多数の異なる分子の非存在下で、該タンパク質に
ついて得られるほどけ変性曲線と比較する工程;ならびに、 (a6)任意の該多数の異なる分子が、該タンパク質の安定性を改変するか否か
を決定する工程であって、ここで、安定性における改変が、該ほどけ変性曲線に
おける変化により示される、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項5】 タンパク質を機能的に分類するための方法であって、該方法
が、以下の工程: 該タンパク質の安定性を改変する、多数の異なる分子中の分子のセットに従っ
て、該タンパク質を分類する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項6】 熱変化によってほどけ変性し得るタンパク質を、機能的に分
類するための方法であって、該方法が、以下の工程: (a)1以上の多数の異なる分子を、該タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフト
するそれらの能力に関してスクリーニングする工程であって、ここで、該タンパ
ク質の熱ほどけ変性曲線におけるシフトは、該分子が該タンパク質に結合するこ
とを示す、工程; (b)工程(a)の該スクリーニング由来の該タンパク質についての活性スペク
トルを作製する工程であって、ここで、該活性スペクトルは、該タンパク質の熱
ほどけ変性曲線をシフトし、従って、該タンパク質に結合するリガンドである、
該多数の異なる分子由来の分子のサブセットを反映する、工程; (c)該タンパク質に対する該活性スペクトルを、1以上の機能的な参照スペク
トルリストと比較する工程;および (d)該タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトする、該多数の異なる分子中の
分子のセットに従ってタンパク質を分類する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項7】 請求項6に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニン
グ工程(a)が、以下の工程: (a1)前記タンパク質を、1以上の前記多数の異なる分子と、多数のコンテナ
の各々の中で接触させる工程; (a2)工程(a1)由来の該多数のコンテナを加熱する工程; (a3)各々の該コンテナ内で、該加熱より生じる該標的分子の熱ほどけ変性に
関連する物理的変化を測定する工程; (a4)各々の該コンテナに対する温度の関数として、該標的分子についての熱
ほどけ変性曲線を作製する工程;および (a5)工程(a4)の各々の該ほどけ変性曲線を、(1)各々の該他の熱ほど
け変性曲線、および(2)任意の該多数の異なる分子の非存在下で、前記タンパ
ク質について得られる熱ほどけ変性曲線と比較する工程;および、 (a6)任意の該多数の異なる分子が、該タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフ
トするか否かを決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項8】 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記比較する工程
(a5)は、各々の前記多数の異なる分子の、前記タンパク質の熱ほどけ変性曲
線をシフトする能力に従って、該タンパク質に対する該多数の異なる分子におけ
る該分子をランク付けする工程を包含する、方法。 - 【請求項9】 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記加熱する工程
(a2)において、前記多数のコンテナが同時に加熱される、方法 - 【請求項10】 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記工程(a4
)はさらに、前記熱ほどけ変性曲線から中間点温度(Tm)を決定する工程を包
含し;そして ここで、前記工程(a5)はさらに、工程(a4)における各々の該熱ほどけ
変性曲線のTmを、(1)各々の前記他の熱ほどけ変性曲線のTm、および(2)
任意の前記異なる分子の非存在下で前記標的タンパク質に対して得られる熱ほど
け変性曲線のTmと比較する工程を包含する、方法。 - 【請求項11】 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記工程(a3
)は、各々の前記コンテナの前記内容物による光の吸収を測定する工程を包含す
る、方法。 - 【請求項12】 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記工程(a1
)は、前記タンパク質を、各々の前記多数のコンテナに存在する蛍光プローブ分
子と接触する工程を包含し、かつここで、前記工程(a3)は、以下の工程: (i)各々の該多数のコンテナにおいて、該蛍光プローブ分子を光で励起する工
程;および、 (ii)各々の該多数のコンテナからの蛍光を測定する工程 を包含する、方法。 - 【請求項13】 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)(ii)はさらに、各々の前記多数のコンテナからの蛍光を、一度に1コン
テナずつ測定する工程を包含する、方法。 - 【請求項14】 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)(ii)はさらに、前記多数のコンテナのサブセットからの蛍光を同時に測
定する工程を包含する、方法。 - 【請求項15】 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)(ii)はさらに、各々の前記多数のコンテナからの蛍光を同時に測定する
工程を包含する、方法。 - 【請求項16】 請求項7に記載の方法であって、ここで前記工程(a3)
は、以下の工程: (i)各々の前記多数のコンテナにおいて、前記タンパク質のトリプトファン残
基を光で励起する工程;および、 (ii)各々の該多数のコンテナからの蛍光を測定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項17】 請求項7に記載の方法であって、ここで、工程(a1)に
おける前記多数のコンテナは、マイクロプレート中に多数のウェルを含む、方法
。 - 【請求項18】 熱変化によってほどけ変性し得るタンパク質を、機能的に
分類するための方法であって、前記方法が、以下の工程: (a)特定のクラスのタンパク質に結合することが公知の1以上の多数の異なる
分子を、該タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトする能力に関してスクリーニ
ングする工程であって、ここで、該タンパク質の熱ほどけ変性曲線におけるシフ
トが、該分子が該タンパク質に結合することを示す、工程; (b)工程(a)の該スクリーニング由来の該タンパク質の活性スペクトルを作
製する工程であって、ここで、該活性スペクトルは、該タンパク質の熱ほどけ変
性曲線をシフトし、それゆえ該タンパク質に結合するリガンドである、該多数の
異なる分子由来の分子のサブセットを反映する、工程; (c)該1以上の該多数の異なる分子が、前記タンパク質の熱ほどけ変性曲線を
シフトする場合、該クラスのタンパク質のメンバーとして該タンパク質を分類す
る工程、 を包含する、方法。 - 【請求項19】 請求項18に記載の方法であって、ここで、前記スクリー
ニング工程(a)が、以下の工程: (a1)前記タンパク質を、1以上の前記多数の異なる分子と、多数のコンテナ
の各々の中で接触させる工程; (a2)工程(a1)由来の該多数のコンテナを加熱する工程; (a3)各々の該コンテナ内で、該加熱より生じる前記標的分子の熱ほどけ変性
に関連する物理的変化を測定する工程; (a4)各々の該コンテナに対する温度の関数として、該標的分子についての熱
ほどけ変性曲線を作製する工程;ならびに (a5)工程(a4)の各々の該ほどけ変性曲線を、(1)各々の該他の熱ほど
け変性曲線、および(2)任意の該多数の異なる分子の非存在下で、該タンパク
質について得られる熱ほどけ変性曲線と比較する工程;ならびに (a6)任意の該多数の異なる分子が、該タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフ
トするか否かを決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項20】 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記比較する
工程(a5)は、前記タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトする、各々の前記
多数の異なる分子の能力に従って、該タンパク質に対する該多数の異なる分子に
おける該分子をランク付けする工程を包含する、方法。 - 【請求項21】 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記加熱する
工程(a2)において、前記多数のコンテナが同時に加熱される、方法。 - 【請求項22】 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
4)はさらに、前記熱ほどけ変性曲線から中間点温度(Tm)を決定する工程を
包含し;そして ここで、前記工程(a5)はさらに、工程(a4)における各々の前記熱ほど
け変性曲線のTmを、(1)各々の前記他の熱ほどけ変性曲線のTm、および(2
)任意の前記異なる分子の非存在下で前記標的タンパク質に対して得られる熱ほ
どけ変性曲線のTmと比較する工程を包含する、方法。 - 【請求項23】 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)は、各々の前記コンテナの前記内容物による光の吸収を測定する工程を包含
する、方法。 - 【請求項24】 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
1)は、前記タンパク質を、各々の前記多数のコンテナに存在する蛍光プローブ
分子と接触する工程を包含し、そしてここで、前記工程(a3)は、以下の工程
: (i)各々の該多数のコンテナにおいて、該蛍光プローブ分子を光で励起する工
程;および、 (ii)各々の該多数のコンテナからの蛍光を測定する工程 を包含する、方法。 - 【請求項25】 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)(ii)はさらに、各々の前記多数のコンテナからの蛍光を、一度に1コン
テナずつ測定する工程を包含する、方法。 - 【請求項26】 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)(ii)はさらに、前記多数のコンテナのサブセットからの蛍光を同時に測
定する工程を包含する、方法。 - 【請求項27】 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記工程(a
3)(ii)はさらに、各々の前記多数のコンテナからの蛍光を同時に測定する
工程を包含する、方法。 - 【請求項28】 請求項19に記載の方法であって、ここで前記工程(a3
)は、以下の工程: (i)各々の前記多数のコンテナにおいて、前記タンパク質のトリプトファン残
基を光で励起する工程;および、 (ii)各々の該多数のコンテナからの蛍光を測定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項29】 請求項18に記載の方法であって、ここで、工程(a1)
における前記多数のコンテナは、マイクロプレート中に多数のウェルを含む、方
法。 - 【請求項30】 熱変化によってほどけ変性し得るタンパク質を機能的に分
類するための方法であって、該方法が、以下の工程: 該タンパク質の熱ほどけ変性曲線をシフトする、多数の異なる分子中の分子の
セットに従って、該タンパク質を分類する工程、 を包含する、方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US6512997P | 1997-11-12 | 1997-11-12 | |
US60/065,129 | 1997-11-12 | ||
PCT/US1998/024035 WO1999024050A1 (en) | 1997-11-12 | 1998-11-12 | High throughput method for functionally classifying proteins identified using a genomics approach |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002514571A true JP2002514571A (ja) | 2002-05-21 |
Family
ID=22060528
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000520138A Pending JP2002514571A (ja) | 1997-11-12 | 1998-11-12 | ゲノムアプローチを使用して同定されるタンパク質を機能的に分類するためのハイスループット方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20010003648A1 (ja) |
EP (1) | EP1030678B1 (ja) |
JP (1) | JP2002514571A (ja) |
KR (2) | KR20030040425A (ja) |
AT (1) | ATE335498T1 (ja) |
AU (1) | AU750501B2 (ja) |
CA (1) | CA2309345C (ja) |
DE (1) | DE69835531T2 (ja) |
DK (1) | DK1030678T3 (ja) |
ES (1) | ES2273442T3 (ja) |
HU (1) | HU225767B1 (ja) |
IL (1) | IL136046A0 (ja) |
NZ (1) | NZ504483A (ja) |
PL (1) | PL194483B1 (ja) |
WO (1) | WO1999024050A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4750783B2 (ja) * | 2004-04-02 | 2011-08-17 | エルヴェーテーハー・アーヘン | 攪拌されている複数のマイクロリアクターにおける反応液のプロセスパラメータを検出するための方法及び装置 |
JP2014529748A (ja) * | 2011-09-06 | 2014-11-13 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | 生体高分子複合体を分析するための方法およびその使用 |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2203832A1 (en) * | 1995-09-08 | 1997-03-13 | Jaime E. Arenas | Screen for compounds with affinity for rna |
IL136046A0 (en) | 1997-11-12 | 2001-05-20 | Dimensional Pharm Inc | Methods for classifying proteins |
US6569631B1 (en) * | 1998-11-12 | 2003-05-27 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Microplate thermal shift assay for ligand development using 5-(4″dimethylaminophenyl)-2-(4′-phenyl)oxazole derivative fluorescent dyes |
EP1409982A4 (en) * | 2001-06-14 | 2006-05-24 | Anadys Pharmaceuticals Inc | PROCESS FOR SCREENING ON LIGANDS OF TARGET MOLECULES |
CA2460819A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and apparatuses for purification |
AU2002325030A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-04-01 | Energetic Geonomics Corporation | A high throughput energy array |
GB0125436D0 (en) * | 2001-10-23 | 2001-12-12 | Deltadot Ltd | Analysis of temperature-dependent molecular configurations |
AU2003209272A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Zyomyx, Inc. | Engineered binding proteins |
EP1470241A2 (en) * | 2002-01-24 | 2004-10-27 | Ecopia Biosciences Inc. | Method, system and knowledge repository for identifying a secondary metabolite from a microorganism |
AU2003247276A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and apparatuses for characterizing stability of biological molecules |
US20050079526A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-04-14 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and apparatuses for characterizing refolding and aggregation of biological molecules |
WO2003087834A2 (en) * | 2002-04-08 | 2003-10-23 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | High throughput analysis of recombinant proteins in multi-well plates |
US20040121445A1 (en) * | 2002-07-31 | 2004-06-24 | Fabien Marino | Cell cultures |
US8180572B2 (en) * | 2007-10-25 | 2012-05-15 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | High-resolution melting analysis |
US8993714B2 (en) * | 2007-10-26 | 2015-03-31 | Imiplex Llc | Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof |
US9102526B2 (en) | 2008-08-12 | 2015-08-11 | Imiplex Llc | Node polypeptides for nanostructure assembly |
WO2010109204A1 (en) * | 2009-03-26 | 2010-09-30 | Ucb Pharma S.A. | Thermofluor method |
US9285363B2 (en) | 2009-05-11 | 2016-03-15 | Imiplex Llc | Method of protein nanostructure fabrication |
US9523693B2 (en) | 2011-04-18 | 2016-12-20 | Biotarget Engagement Interest Group Ab | Methods for determining ligand binding to a target protein using a thermal shift assay |
GB201106548D0 (en) | 2011-04-18 | 2011-06-01 | Evitraproteoma Ab | A method for determining ligand binding to a target protein using a thermal shift assahy |
WO2013112956A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for protein melt analysis using dipyrrometheneboron difluoride compounds |
WO2014144360A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Life Technologies Corporation | Methods for dye selection for protein melt temperature determinations |
GB2524519B (en) * | 2014-03-25 | 2019-11-06 | Pelago Bioscience AB | Methods for identifying a biomarker indicative of a reduced drug response using a thermal shift assay |
US11027273B2 (en) * | 2015-03-01 | 2021-06-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Apparatuses and methods for pathogen detection using microfluidic biochips |
WO2017053567A1 (en) * | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Delta Tm Technologies | Designing customized protein-specific buffer systems |
US11466309B2 (en) | 2018-10-12 | 2022-10-11 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Mechanically-strained oligonucleotide constructs and methods of using the same |
Family Cites Families (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4626684A (en) | 1983-07-13 | 1986-12-02 | Landa Isaac J | Rapid and automatic fluorescence immunoassay analyzer for multiple micro-samples |
US4580895A (en) | 1983-10-28 | 1986-04-08 | Dynatech Laboratories, Incorporated | Sample-scanning photometer |
US4628026A (en) | 1983-11-15 | 1986-12-09 | Dietlind Gardell | Method and apparatus for automated double fluorochromization analysis in lymphocytotoxicity testing |
US5096807A (en) | 1985-03-06 | 1992-03-17 | Murex Corporation | Imaging immunoassay detection system with background compensation and its use |
JPS61241639A (ja) | 1985-04-19 | 1986-10-27 | Hitachi Ltd | 反応試料分析装置 |
DE3683573D1 (de) | 1985-06-26 | 1992-03-05 | Japan Tectron Instr Corp | Automatischer analysenapparat. |
US4859609A (en) | 1986-04-30 | 1989-08-22 | Genentech, Inc. | Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists |
US5260207A (en) * | 1987-04-06 | 1993-11-09 | Enzon Labs Inc. | Engineering of electrostatic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins |
US4880750A (en) * | 1987-07-09 | 1989-11-14 | Miragen, Inc. | Individual-specific antibody identification methods |
US5217869A (en) | 1987-10-13 | 1993-06-08 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to produce immunodiagnostic reagents |
US5338659A (en) | 1991-04-02 | 1994-08-16 | Terrapin Technologies, Inc. | Method for determining analyte concentration by cross-reactivity profiling |
US5300425A (en) | 1987-10-13 | 1994-04-05 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to produce immunodiagnostic reagents |
US4963263A (en) | 1988-03-24 | 1990-10-16 | Terrapin Technologies, Inc. | Method of identity analyte-binding peptides |
US5133866A (en) | 1988-03-24 | 1992-07-28 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to identify analyte-bending ligands |
US5340474A (en) | 1988-03-24 | 1994-08-23 | Terrapin Technologies, Inc. | Panels of analyte-binding ligands |
US5409611A (en) | 1988-03-24 | 1995-04-25 | Terrapin Technoogies, Inc. | Method to identify analyte-binding ligands |
JP2656564B2 (ja) | 1988-08-26 | 1997-09-24 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析方法 |
US5325295A (en) | 1989-05-04 | 1994-06-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Adaptation of microtiter plate technology to measurement of platelet aggregation |
HUT69771A (en) | 1990-08-17 | 1995-09-28 | Univ Boston | Proteases causing abnormal degradation of amyloid beta-proteine precursors |
US5506097A (en) | 1990-08-24 | 1996-04-09 | President And Fellows Of Harvard College | Method for inhibiting β-protein enzymatic activity |
US5200504A (en) | 1990-10-02 | 1993-04-06 | The Scripps Research Institute | Metallopeptides having stabilized secondary structures |
US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
DE4123817C2 (de) | 1991-07-18 | 1994-06-09 | Berthold Lab Prof Dr | Strahlungsmeßgerät, insbesondere zur Messung der Lumineszenz |
WO1993014781A1 (en) | 1992-01-24 | 1993-08-05 | The Regents Of The University Of California | Novel peptides and method for altering the activity of allosteric proteins |
WO1993018182A1 (en) | 1992-03-09 | 1993-09-16 | Difco Laboratories | Diagnostic microbiological testing apparatus and method |
CA2093481A1 (en) | 1992-04-30 | 1993-10-31 | Gottlieb Schacher | Processing station for carrying out fluorescence polarization measurements in an analyzer |
US5255976A (en) | 1992-07-10 | 1993-10-26 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Temperature gradient calorimeter |
US5314825A (en) | 1992-07-16 | 1994-05-24 | Schiapparelli Biosystems, Inc. | Chemical analyzer |
US5585275A (en) | 1992-09-02 | 1996-12-17 | Arris Pharmaceutical Corporation | Pilot apparatus for peptide synthesis and screening |
US5355215A (en) | 1992-09-30 | 1994-10-11 | Environmental Research Institute Of Michigan | Method and apparatus for quantitative fluorescence measurements |
CA2115900A1 (en) | 1993-02-22 | 1994-08-23 | Gerald W. Becker | Pharmaceutical screens and antibodies |
US5383023A (en) | 1993-03-01 | 1995-01-17 | Walleczek; Jan | Method and apparatus for performing dual-beam dual-wavelength fluorescence spectrophotometric evaluation of a biological specimen |
US5356784A (en) | 1993-03-30 | 1994-10-18 | Terrapin Technologies, Inc. | Determination of concentration by affinity titration |
US5679582A (en) | 1993-06-21 | 1997-10-21 | Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. | Screening method for identifying ligands for target proteins |
US5585277A (en) * | 1993-06-21 | 1996-12-17 | Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. | Screening method for identifying ligands for target proteins |
JP3598123B2 (ja) | 1993-07-15 | 2004-12-08 | 浜松ホトニクス株式会社 | 核酸の変性検出装置 |
US5436718A (en) | 1993-07-30 | 1995-07-25 | Biolumin Corporation | Mutli-functional photometer with movable linkage for routing optical fibers |
CA2129787A1 (en) | 1993-08-27 | 1995-02-28 | Russell G. Higuchi | Monitoring multiple amplification reactions simultaneously and analyzing same |
US5525300A (en) | 1993-10-20 | 1996-06-11 | Stratagene | Thermal cycler including a temperature gradient block |
US5415839A (en) | 1993-10-21 | 1995-05-16 | Abbott Laboratories | Apparatus and method for amplifying and detecting target nucleic acids |
PT738390E (pt) | 1994-01-06 | 2003-07-31 | Telik Inc | Substitutos para alvos e paineis de referencia melhorados |
US5587293A (en) | 1994-01-06 | 1996-12-24 | Terrapin Technologies, Inc. | Method to identify binding partners |
US5935803A (en) | 1994-02-01 | 1999-08-10 | Terrapin Technologies, Inc. | Methods to identify immunomodulators using cognate interaction of PKC-theta |
US5631734A (en) | 1994-02-10 | 1997-05-20 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials |
US5557398A (en) | 1994-04-15 | 1996-09-17 | Molecular Devices Corporation | Photometric device |
US5463564A (en) | 1994-09-16 | 1995-10-31 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties |
US5589351A (en) | 1994-12-06 | 1996-12-31 | Nps Pharmaceuticals, Inc. | Fluorescence detection apparatus |
AU5132096A (en) | 1995-01-30 | 1996-08-21 | Terrapin Technologies, Inc. | Glubodies - multiplicities of proteins capable of binding a variety of small molecules |
CA2203832A1 (en) | 1995-09-08 | 1997-03-13 | Jaime E. Arenas | Screen for compounds with affinity for rna |
US5633762A (en) * | 1995-10-23 | 1997-05-27 | Motorola | Dual image manifestation apparatus with integrated electro-optical package |
CA2184195C (en) | 1995-10-25 | 2002-04-16 | Andrew Pakula | Screening method for identifying ligands for target proteins |
JP2000502440A (ja) * | 1995-12-07 | 2000-02-29 | スクリプトジェン・ファーマスーティカルズ,インコーポレイテッド | リガンドを識別するための蛍光に基づくスクリーニング方法 |
AU741049B2 (en) | 1996-05-09 | 2001-11-22 | Life Technologies Corporation | Microplate thermal shift assay and apparatus for ligand development and multi-variable protein chemistry optimization |
WO1998015813A1 (en) | 1996-10-09 | 1998-04-16 | Symyx Technologies | Infrared spectroscopy and imaging of libraries |
CA2282418A1 (en) | 1997-03-05 | 1998-09-11 | Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. | Screen employing fluorescence anisotropy to identify compounds with affinity for nucleic acids |
IL136046A0 (en) | 1997-11-12 | 2001-05-20 | Dimensional Pharm Inc | Methods for classifying proteins |
US6376180B1 (en) | 1999-12-09 | 2002-04-23 | Pharmacia & Upjohn Company | Methods of identifying compounds that bind to target species under isothermal denaturing conditions |
-
1998
- 1998-11-12 IL IL13604698A patent/IL136046A0/xx unknown
- 1998-11-12 AT AT98957812T patent/ATE335498T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-12 EP EP98957812A patent/EP1030678B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-12 AU AU13980/99A patent/AU750501B2/en not_active Expired
- 1998-11-12 US US09/190,128 patent/US20010003648A1/en not_active Abandoned
- 1998-11-12 NZ NZ504483A patent/NZ504483A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-11-12 CA CA002309345A patent/CA2309345C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-12 KR KR10-2003-7002857A patent/KR20030040425A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-11-12 DK DK98957812T patent/DK1030678T3/da active
- 1998-11-12 ES ES98957812T patent/ES2273442T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-12 JP JP2000520138A patent/JP2002514571A/ja active Pending
- 1998-11-12 HU HU0100037A patent/HU225767B1/hu unknown
- 1998-11-12 KR KR10-2000-7005169A patent/KR100406310B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-11-12 WO PCT/US1998/024035 patent/WO1999024050A1/en active IP Right Grant
- 1998-11-12 PL PL98340449A patent/PL194483B1/pl unknown
- 1998-11-12 DE DE69835531T patent/DE69835531T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-01-29 US US10/057,940 patent/US7122321B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4750783B2 (ja) * | 2004-04-02 | 2011-08-17 | エルヴェーテーハー・アーヘン | 攪拌されている複数のマイクロリアクターにおける反応液のプロセスパラメータを検出するための方法及び装置 |
KR101117064B1 (ko) * | 2004-04-02 | 2012-02-22 | 알더블유티에이치 아헨 | 각각의 교반되는 마이크로반응기 내의 반응 유체의 공정변수를 기록하기 위한 장치 및 그 방법 |
US8268632B2 (en) | 2004-04-02 | 2012-09-18 | Rwth Aachen | Method and device for recording process paramaters of reaction fluids in several agitated microreactors |
JP2014529748A (ja) * | 2011-09-06 | 2014-11-13 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | 生体高分子複合体を分析するための方法およびその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7122321B2 (en) | 2006-10-17 |
EP1030678A1 (en) | 2000-08-30 |
KR20030040425A (ko) | 2003-05-22 |
DE69835531D1 (de) | 2006-09-21 |
WO1999024050A1 (en) | 1999-05-20 |
HUP0100037A2 (hu) | 2001-05-28 |
EP1030678B1 (en) | 2006-08-09 |
HU225767B1 (en) | 2007-08-28 |
KR100406310B1 (ko) | 2003-11-19 |
NZ504483A (en) | 2002-11-26 |
US20010003648A1 (en) | 2001-06-14 |
ES2273442T3 (es) | 2007-05-01 |
EP1030678A4 (en) | 2002-10-09 |
CA2309345C (en) | 2007-01-23 |
DE69835531T2 (de) | 2007-04-05 |
WO1999024050A9 (en) | 1999-08-12 |
AU750501B2 (en) | 2002-07-18 |
US20020168686A1 (en) | 2002-11-14 |
DK1030678T3 (da) | 2006-12-11 |
KR20010032048A (ko) | 2001-04-16 |
HUP0100037A3 (en) | 2003-08-28 |
PL194483B1 (pl) | 2007-06-29 |
PL340449A1 (en) | 2001-02-12 |
CA2309345A1 (en) | 1999-05-20 |
ATE335498T1 (de) | 2006-09-15 |
IL136046A0 (en) | 2001-05-20 |
AU1398099A (en) | 1999-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1030678B1 (en) | High throughput method for functionally classifying proteins identified using a genomics approach | |
US6291192B1 (en) | Method for identifying conditions that facilitate recombinant protein folding | |
US6569631B1 (en) | Microplate thermal shift assay for ligand development using 5-(4″dimethylaminophenyl)-2-(4′-phenyl)oxazole derivative fluorescent dyes | |
JP6038759B2 (ja) | 検出可能な核酸タグ | |
Maneiro et al. | PROTACs, molecular glues and bifunctionals from bench to bedside: Unlocking the clinical potential of catalytic drugs | |
Galletto et al. | Global conformation of the Escherichia coli replication factor DnaC protein in absence and presence of nucleotide cofactors | |
NZ521789A (en) | Functional probe library and apparatus for identifying the previously unidentified biological function of target proteins | |
CZ20001776A3 (cs) | Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu | |
MXPA00004638A (en) | High throughput method for functionally classifying proteins identified using a genomics approach | |
US20020006671A1 (en) | Luminescence polarization assays | |
Bogomolovas et al. | Production and analysis of titin kinase: Exploiting active/inactive kinase homologs in pseudokinase validation | |
Lindberg et al. | Inhibitor screening of proprotein convertases using positional scanning libraries | |
US20040234942A1 (en) | Methods of identifying non-specific inhibitors of biomolecules | |
LOBANOV et al. | General Strategy for Drug Discovery” | |
MXPA98009291A (en) | Proof of thermal change in microplates and apparatus for developing ligands and chemical optimization multivariable protei |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040114 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040322 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040426 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040824 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20040930 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20050204 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20070316 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070511 |