JP2000502440A

JP2000502440A - リガンドを識別するための蛍光に基づくスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2000502440A
Application number: JP9521492A
Authority: JP
Inventors: パクラ，アンドルー; ソーアー，ロバート・ティー
Original assignee: スクリプトジェン・ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2000-02-29
Also published as: EP0865502A4; EP0865502A1; WO1997020952A1; DE865502T1; CA2236339A1

Abstract

(57)【要約】薬剤学的有効性を有する可能性がある化学的化合物をスクリーニングする新規な方法が提供される。開示された方法は、標的蛋白の存在下に置き、テストリガンドの、標的蛋白を部分的に展開することを防ぐ能力を、コンホメーション感受性プローブの蛍光放出を測定して決定することにより、可能性がある治療学的テストリガンドを識別する。これは、標的蛋白の生化学的機能が知られている必要がなく、且つ標的蛋白のいずれかの知られたリガンドの存在が必要ない点において、知られた新規薬剤テスト方法と顕著に異なる。

Description

【発明の詳細な説明】リガンドを識別するための蛍光に基づくスクリーニング方法発明の分野本発明は、医薬化合物、特に疾患の病因または生理学的機能の調節に関係する蛋白に結合する医薬化合物の新規な蛍光に基づく（fluorescence-based）高処理量スクリーニングの方法に関する。発明の背景医薬は、標的（例えばレセプター）に対して誘導されるランダムスクリーニング工程によって識別（identify）される導入化合物（lead compound）から開発することができる。大規模スクリーニングの手法は多くの要因によって複雑化する。第一に多くのアッセーは、実施に骨が折れるか、または高価である。アッセーには、入手や維持が困難かまたは費用がかかる実験動物、細胞株もしくは組織培養が必要とされることがある。アッセーでは放射性物質の使用が必要な場合があり、したがって安全性および廃棄の問題を引き起こす。これらを考慮すると、無理なくスクリーニングできる化合物の数は、実際にはしばしば制限される。したがって、このようなランダムスクリーニングの方法を用いる者は、ある程度の予備知識によっておそらく有効であろうと示唆される化合物の調査をしばしば制限される。このストラテジーはテストされる化合物の範囲を制限し、多くの有用な薬剤が見落される可能性がある。さらにまた、多くの生化学アッセーの特異性によって広範囲の有用な化学物質が除外される可能性がある。なぜならば、リガンドとレセプター蛋白との間の相互反応はアッセーの視野外にあるからである。例えば、多くの蛋白は多数の機能を有するが、一方、殆どのアッセーはそのような活性のただ１つをモニターすることができるだけである。そのような特定のアッセーを用いると、多くの可能性のある医薬が検出できない可能性がある。最後に、薬剤発見のための現存するほとんどの生化学的スクリーニング手法の場合、標的蛋白の活性は明らかでなければならない。このことは、スクリーニングの開始前に問題のシステムの特性が十分に明らかにされていることを必要とする。例えば新たにクローニングされた遺伝子の場合のように蛋白配列が分かっているときですら、この蛋白の特異的機能は、その配列の解析によっても簡単には明らかにされないかもしれない。結果として、多くの標的蛋白に対する治療薬の生化学的スクリーニングは、生化学的特性の詳細な解明を待たねばならず、これは一般に広範囲の研究を必要とする。したがって、治療的または生理学的に関係を有する蛋白と結合する能力について多数の化合物をスクリーニングすることができる、迅速で経費のかからない高処理アッセーが当分野で必要とされる。さらにまた、標的蛋白の生物学的活性に依存せず、当該標的蛋白の生物学的活性ドメイン以外の領域と結合する化合物を検出するスクリーニング方法が当分野で必要とされる。発明の要約本発明は、標的蛋白と結合するリガンドを識別する蛍光に基づいた方法を提供する。本方法によれば、標的蛋白と結合することが不明の化合物がテストリガンドとして選択される。標的蛋白は、テストリガンドの各々と、個々に保温（incu bating）されテスト組み合わせが作製され、またテストリガンドの非存在下で保温されコントロール組み合わせが作製される。テスト組み合わせとコントロール組み合わせは、コンホメーション（conformati on）感受性蛍光プローブと接触させられる。コンホメーション感受性プローブとは、重畳、展開又は溶融小球状態の蛋白と優先的に結合する、又はその蛍光特性が標的蛋白の重畳状態にいずれかの態様で影響されるプローブである。組み合わせは、部分的に又は完全に展開した状態で存在する標的蛋白の検出可能な部分をもたらすよう処理される。そして、テスト及びコントロール組み合わせにおいて標的蛋白が重畳状態、展開状態、溶融小球状態、又はこれらの組み合わせとなる程度が、プローブの蛍光放出強度をモニターすることにより測定される。テスト及びコントロール組み合わせ間の蛍光強度又は他の蛍光特性の差異が、コントロール組み合わせよりもテスト組み合わせにおいて、標的蛋白がより多い又はより少ない程度に重畳状態で存在していることを示した場合、テストリガンドは標的蛋白に結合するリガンドである。好ましい実施態様において、方法の工程は、複数のテスト化合物を用い、リガンドが識別されるまで高処理量モードで繰り返される。図面の簡単な説明図１は、濃度が増加するアセタゾルアミドが存在するとき、またはアセタゾルアミドが存在しないときの蛋白分解後の炭酸脱水素酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル像を示す。図２は、カビの抽出物の存在下、非存在下における１．０ｍＭのアセタゾルアミドの存在下、非存在下での蛋白分解後の炭酸脱水素酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル像を示す。図３は、濃度が増加するエラスタチナルが存在するとき、またはエラスタチナルが存在しないときの蛋白分解後のニトロセルロースフィルターへの放射能標識ヒト好中球エラスターゼの結合の定量を表すグラフを示す。図４は、濃度が増加するＩＣ２００３５５が存在する場合の蛋白分解後のヒト好中球エラスターゼを検出するＥＬＩＳＡによる定量を表すグラフを示す。図５は、ヒト好中球エラスターゼのリガンドとして識別されたテストリガンドの分布を表すグラフを示す。図６は、ヒト好中球エラスターゼのリガンドの定量を表すグラフを示す。図７は、ヒト好中球エラスターゼの酵素活性を抑制する能力についての５種のリガンドの定量を表すグラフを示す。図８は、濃度が増加する２，３−ジホスホグリセレートが存在するとき、または存在しないときの蛋白分解後のニトロセルロースフィルターへのヒトヘモグロビンの結合の定量を表すグラフを示す。図９は、濃度が増加する２，３−ジホスホグリセレートが存在する場合の蛋白分解後のヒトヘモグロビンを検出するＥＬＩＳＡによる定量を表すグラフを示す。図１０は、ヒトヘモグロビンＳのリガンドとして識別されたテストリガンドの分布を表すグラフを示す。図１１は、ヒトヘモグロビンのリガンドの定量を表すグラフを示す。図１２は、炭酸脱水素酵素Ｉの非存在下及び存在下において測定した、ビス− １−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ビス−ＡＮＳ）の蛍光放出に対する、増加した濃度の塩酸グアニジニウム（ＧＣｌ）の効果を表すグラフを示す。図１３は、炭酸脱水素酵素Ｉ及び示された濃度の塩酸グアニジニウム（ＧＣｌ）の存在下で測定した、ビス−１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ビス−ＡＮＳ）の蛍光放出強度における時間依存的変化を表すグラフを示す。図１４は、炭酸脱水素酵素Ｉ及び２Ｍの塩酸グアニジニウムの存在下で測定した、ビス−１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートの蛍光放出強度の増強における、増加する濃度の炭酸脱水素酵素リガンド、アセタゾルアミドの効果を表すグラフを示す。発明の詳細な説明本明細書に引用される全ての特許出願、特許および参考文献は、参照により本明細書に完全な形で含まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含め本明細書の記載が優先する。定義本明細書で用いられるように、“リガンド”という用語は、標的蛋白に結合する薬剤を指す。当該薬剤は、標的蛋白が天然のコンホメーションで存在しているとき、または部分的にもしくは全体として展開もしくは変性(denatured)させられているときに該標的蛋白と結合することができる。本発明によれば、リガンドは、標的蛋白の認識されている機能領域（例えば酵素の活性部位、抗体の抗原結合部位、レセプターのホルモン結合部位、補助因子結合部位など）に結合する薬剤に限定されない。本発明を実施する場合、リガンドはまた、標的蛋白のいずれの表面もしくは内部配列または構造ドメインと結合する薬剤でもよい。したがって、本発明のリガンドは、上記の態様で標的蛋白に結合するその能力の他にそれ自体明らかな生物学的機能を持たない薬剤も含む。本明細書で用いられるように、“テストリガンド”という用語は、標的蛋白に結合することができるその能力についてテストされる化合物、分子または複合体を含む薬剤を指す。テストリガンドは、金属、ペプチド、蛋白、脂質、多糖類、核酸、小型有機分子およびそれらの組み合わせが制限なく含まれる、実質的にいかなる薬剤であってもよい。例えば天然産物の抽出物のような物質の複合混合物（１つ以上のテストリガンドを含む可能性がある）もまたテストすることができ、さらに、標的蛋白に結合する成分をその後の工程で当該混合物から精製することができる。テストリガンドとして適切な化合物は、例えば、天然物ライブラリ、発酵ライブラリ（植物及び微生物を包含する）、組み合わせライブラリ、化合物ファイル、及び合成化合物ライブラリの中に見いだすことができる。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chem ical Co．(Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex(Princeton,NJ)、Brandon Asso ciates (Merrimack, NH)、及びMicrosource (New Milford，CT)から商業的に入手可能である。稀な化学物のライブラリは、Aldrich Chemical Company，Inc.（ Milwaukee，WI）から入手可能である。また、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態の、天然化合物のライブラリは、例えば、Pan Laboratories (Bothell, WA)又はMycoSearch(NC)から入手可能であり、又は容易に製造することができる。さらに、天然及び合成的に製造されたライブラリ及び化合物は、慣用の化学的、物理的及び生化学的手段(Blondelle etal.，TibTech 14:60，1996)を通じて容易に修飾することができる。多数のテスト化合物の同時スクリーニングを可能とするよう、好ましくは自動化された装置を用いる。本明細書で用いられるように、“標的蛋白”という用語は、それに対するリガンドまたは結合相手の識別が求められているペプチド、蛋白または蛋白複合体を指す。標的蛋白には、ある疾患、状態もしくは病的生理状態の病因または生理的機能の調節に関係することが分かっているか、または関係すると信じられているペプチドまたは蛋白が制限なく含まれる。標的蛋白は、いずれの生物（例えば脊椎動物、特に哺乳類、さらにはより具体的にヒト）由来でもよい。本発明で使用するためには、該蛋白の生化学的機能が具体的に認識されている必要はない。標的蛋白には、レセプター、酵素、腫瘍遺伝子生成物、腫瘍サプレッサー遺伝子生成物、ウイルス蛋白、および転写因子が制限なく含まれ、これらは、精製形または蛋白と他の化合物との複合混合物の部分であってもよい。さらにまた標的蛋白には、野性型蛋白、また別には、変化した安定性、活性または他の異形特性をもつものを含む変異体もしくは異形蛋白、または、外来アミノ酸配列（例えば精製を促進する配列）が付加されているハイブリッド蛋白が含まれる。本明細書で用いられているように、“テスト組み合わせ”とは、テストリガンドと標的蛋白の組み合わせを指す。“コントロール組み合わせ”とは、テストリガンドを含まない標的蛋白を指す。本明細書で用いられているように、蛋白の“重畳状態”とは、蛋白がその自然の環境下でまたは分離もしくは精製した後（すなわち変性条件に曝される前）で存在している場合のような天然形または非変性形を指す。同様に、“展開状態” は、該ポリペプチドが、その“重畳状態”で存在する二次および／または三次構造の要素を失った状態を指す。ポリペプチドが完全に展開されたとき、すなわち二次および三次構造の全ての要素を失ったときを実験的に求めることが困難なことは当業者には理解されよう。したがって、本明細書で用いられているように“ 展開状態”という用語は、部分的または全体的展開を含む。本明細書で用いられているように、“検出可能部分(detectable fraction)”とは、経験的に求められ、さらに展開蛋白から重畳蛋白を区別するために用いられる方法にしたがって変動する量を指す。例えば、蛍光プローブが標的蛋白の重畳の程度をモニターするのに用いられるときは、蛍光における変化が容易に検出できる程度であるよう条件が選択される。プロテアーゼ感受性が重畳をモニターするために用いられるときは、標的蛋白の約８０％が、都合のよい保温時間内に消化されるように（たとえば温度を調節し、または変性剤を添加することによって）条件が選択される。標的蛋白の重畳または展開状態に特異的な抗体が検出方法として用いられる場合、十分量の抗体が結合し検出可能シグナルを生じるように条件が選択される。本発明は、標的蛋白に結合するリガンドを識別するための高処理量スクリーニング方法を包含する。テストリガンドが結合する標的蛋白が疾患または状態に付随するか、または原因となる場合、該リガンドは、疾患または状態の診断、予防または治療に有用かもしれない。本方法によって識別されるリガンドはまた、分離や精製方法として、例えば混合物から標的蛋白を精製または分離する方法として用いられるリガンドとすることもできる。本発明はまた、本方法によって識別されるリガンド、およびそれらの治療的使用（診断、予防または処置目的のために）、並びに精製および分離方法における使用にも関する。本発明によれば、標的蛋白に対するリガンドは、標的蛋白の重畳の程度または、重畳もしくは展開の速度に影響を与える能力によって識別される。実験条件は、標的蛋白が可逆的または不可逆的にかかわらず展開に供されるように選択される。テストリガンドがこのような条件下で標的蛋白と結合する場合、テストリガンドの存在下での重畳：展開標的蛋白の相対量、または標的蛋白の重畳もしくは展開速度は、テストリガンドの非存在下で認められるものとは異なる、すなわちより大きいか、または小さいであろう。したがって、本発明は、標的蛋白をテストリガンドの存在下および非存在下で、標的蛋白が（リガンドの非存在下で）部分的もしくは全体的に展開される条件下で保温することを含む。この後、重畳標的蛋白に対する展開標的蛋白の絶対量もしくは相対量、または標的蛋白の重畳もしくは展開速度の分析が実施される。本発明の重要な特徴は、生物学的活性または機能に緊密に関係する配列またはドメインだけでなく、標的蛋白のどのような配列またはドメインにも結合するどのような化合物も検出するということである。この結合配列、領域またはドメインは、標的蛋白が重畳状態にあるときは標的蛋白の表面に存在するかもしれないし、また蛋白の内部に埋もれているかもしれない。いくつかの結合部位は、該蛋白が部分的または全体的に展開されるときにだけ、リガンドの結合が可能になるかもしれない。本発明を実施する場合、テストリガンドは標的蛋白と組み合わされ、この混合物は適切な条件下で十分な時間維持され、テストリガンドが標的蛋白に結合することを許容する。実験条件は、各標的蛋白について経験的に決定される。複数のテストリガンドを調べる場合、殆どのリガンド：標的蛋白相互反応が完了すると考えられる保温条件が選択される。一般に、テストリガンドは、標的蛋白に対して分子過剰状態で存在する。標的蛋白は可溶形で存在してもよく、また別に固相マトリックスに結合していてもよい。マトリックスには、ビーズ、膜フィルター、プラスチック表面または他の適切な固形支持体が制限なく含まれる。各標的蛋白については、適切な実験条件（例えば温度、時間、ｐＨ、塩濃度および添加成分）が、該蛋白の検出可能部分がテストリガンドの非存在下で展開形で存在することができるように選択される。不可逆的に展開する標的蛋白については、好ましい実験条件は、都合のよい保温時間中にテストリガンドの非存在下で検出可能量の蛋白の展開を可能にする。重畳：展開蛋白比または重畳もしくは展開速度を調節または最適化するために、変性条件が要求されるかもしれない。この条件には、上昇した温度の使用や、尿素若しくはグアニジニウム若しくはグアニジウム塩（例えばグアニジニウムチオシアネート）のようなカオトロープ若しくは変性剤、界面活性剤の添加またはこれらの組み合わせが含まれる。さらにまた、野生型の蛋白と比べて安定化または脱安定化アミノ酸置換を含んでいる変異蛋白を、重畳：展開比を操作するために用いることができる。標的蛋白のリガンドへの結合のために必要な時間は、テストリガンド、標的蛋白および用いられるその他の条件にしたがって変動するであろう。ある場合には、結合は直ちに発生し（例えば、テストリガンドと標的蛋白を組み合わせるときと本質的に同時）、一方他の例では、テストリガンド一標的蛋白結合は、結合検出までもっと長時間（例えば１２−１６時間まで）維持される。多くのテストリガンドが用いられる場合、殆どの蛋白：リガンド相互反応にとって十分な保温時間が選択される。標的蛋白が非可逆的に展開する場合、テストリガンドの結合のための適切な時間を決定するのに、展開の速度もまた考慮される必要がある。テストリガンドの標的蛋白への結合は、テストリガンドの非存在下および存在下の重畳または展開標的蛋白の絶対量を比較することによって評価されるか、また別には、テストリガンドの非存在下および存在下の重畳：展開標的蛋白比または標的蛋白の重畳または展開速度を決定することによって評価される。テストリガンドが標的蛋白に結合する場合（すなわちテストリガンドが該標的蛋白に対するリガンドである場合）テストリガンドの非存在下において存在するよりも顕著に多くの重畳標的蛋白及びより少量の展開標的蛋白が存在するかもしれない（したがって展開標的蛋白に対する重畳標的蛋白の比率が高い）。また別に、テストリガンドの結合は、テストリガンドの非存在下において存在するよりも顕著に少量の重畳標的蛋白および顕著に多くの展開標的蛋白を生じるかもしれない。同様に、テストリガンドの結合は標的蛋白の重畳または展開速度の顕著な変化を引き起こすかもしれない。いずれの場合においても、重畳および展開標的蛋白の絶対量、重畳：展開比、または重畳もしくは展開速度の決定は、下記で述べるような既知の方法の１つを用いて実施できる。これらの方法には、コンホメーション特異的プローブの蛍光放出の測定、標的蛋白の蛋白分解、標的蛋白の適切な表面への結合、標的蛋白への特異抗体の結合、標的蛋白の分子シャペロンへの結合、標的蛋白の固定リガンドへの結合、および標的蛋白の凝集の測定が制限なく含まれる。他の物理化学的技術もまた、単独でまたは上記の方法と組み合わせて用いることができる。これらには、環状二色性の測定、固有紫外線および蛍光分光分析、並びに熱量分析が制限なく含まれる。好ましい実施態様では、テストリガンド非存在下及び存在下における保温に続く、標的蛋白の存在下でのコンホメーション特異的プローブの蛍光放出の比較が含まれる。典型的には、これには重畳の程度を操作するのに採用される処理（例えば温度上昇等）に先立つ、テスト及びコントロール組み合わせの、蛍光プローブとの接触が含まれる。しかしながら、各標的蛋白は、本発明の目的に対して最も適切な特定の検出方法を可能にする固有の特性を有するであろうということは当業者には理解されよう。高処理量スクリーニングの目的のためには、上記の実験条件は、スクリーニングされる全ての化合物のうちで“陽性”化合物またはリガンドとして識別されるテストリガンドの最小限比率を達成するように調節される。この最小限値（閾値）は、２つの基準にしたがって設定される。第一に、陽性化合物の数は実際的な関係で操作可能であるべきである。第二に、陽性化合物の数は、標的蛋白に対して評価可能な親和性を有するリガンドを反映しているべきである。好ましい閾値は、全テストリガンドの０．１％から１％が、与えられた標的蛋白のリガンドであることが示されたとき達成される。ある蛋白への結合は、その蛋白の作用を直接修飾することを意図されている医薬にとって不可欠である。したがって、本方法の使用を介して、テストリガンドが、ある状態の病因を反映するかまたは影響を与える蛋白に結合することが示されるならば、それは、蛋白の機能を変化させ、有効な医薬またはそのような医薬を作り上げるための導入化合物となる当該テストリガンドの潜在的能力を示すことができるであろう。また別に、このリガンドは、蛋白の機能を変化させる潜在的能力を有する付加的成分を含むハイブリッド化合物の構築のための基礎として役立つかもしれない。この場合、標的蛋白へのリガンドの結合は、その医薬的有効性を発揮させるために付加された成分の固着又は方向付けに役立つ。例えば、関連する酵素類の活性を抑制する既知の化合物は、既知化合物によって認識される部位と異なる部位で該酵素類の１つと特異的に結合する、本発明の方法によって識別されたリガンドに該既知化合物を共役させることによって当該酵素類の１つに特異的にさせることができる。本方法は、殆どの蛋白に共通の物理化学的特性に基づいているという事実は、当該方法に広範囲の応用性を与える。本発明は、何千ものテストリガンドの経費効率のよいスクリーニングを可能にする系統だった大規模な高処理量工程に利用できる。本発明の方法によって一旦リガンドが識別されると、さらに、用いた特定の標的蛋白に特異的な既知の方法を用いてさらに詳細に分析できる。例えば、リガンドは、標的蛋白への結合について直接、例えば非標識標的蛋白と放射能標識リガンドとを保温し、続いて蛋白結合および非結合リガンドを分離することによって調べることができる。さらに、このリガンドを、該標的蛋白の既知の生物学的活性に正の方向または負の方向のいずれかで影響を与える能力について調べることができる。本発明の好ましい実施態様では、標的蛋白へのテストリガンドの結合は、蛍光放出特性が標的蛋白のコンホメーションに感受性の分子プローブの使用によって検出される。特定の蛍光化合物は、水溶液中に遊離状態であるときには弱い蛍光放出しか示さない(Semisotnov，et al.，Biopolymers 31:119，1991)が、組織化された疎水表面に結合したときにはずっと強力に蛍光する。十分に重畳した小球蛋白へのこれらの化合物の結合は、疎水性残基が主として蛋白の内部に埋もれていることに起因し、典型的には弱い。さらに、（十分展開され又は編成されたポリペプチドに見いだされるような）ランダムコイルコンホメーションへのこれらの化合物の結合もまた強くない。それは、これらのコンホメーション中では、疎水残基が、露出していても、プローブの高親和性結合を支持するのに十分に組織化されていないからである。しかしながらプローブは、典型的にはコンパクトな展開蛋白コンホメーションと高い親和性及び化学量論性(stoichiometry) で結合する。これはしばしば「溶融小球(molten globule)」と呼ばれ、ランダムコイルの展開状態と比較した際のコンパクトさ、実質的な２次構造の存在、及び固有の全体的なコンホメーションの欠如等を特徴とする。溶融小球状態は最初は、低いｐＨ、中程度の変性剤濃度、及び熱等の特別な条件下において、様々な蛋白質について安定して起こるコンパクトな展開状態として識別された(Ptitsyn e t al.，Mol.Biol．17:569，1983)。溶融小球は、蛋白重畳の過程における共通の中間状態として識別されている(Ptitsyn et al.，FEBS Letts.262:20，1990)。理論に拘束されることは好まないが、溶融小球状態は、有用な蛍光プローブとの μＭの範囲の親和性での結合を支持する、十分組織化された疎水表面を示していると考えられる。本発明を実施するのに有用な蛍光分子（以下「プローブ」と称する）は、特に限定されないが、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）、ビス −１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ビス−ＡＮＳ）及び６−プロピオニル−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミノナフタレン（プロダン）（分子プローブ、ユージーン、ＯＲ）を含む。蛋白との結合の際に蛍光特性が実質的に変化し、特定の標的蛋白の溶融小球又は他の展開型と優先的に結合するものであれば、いずれの蛍光化合物をも用いることができることが理解される。ただ、相対的な結合親和性及びプローブの結合の化学量論性が、天然と溶融小球状態との間のコンホメーションの変化に際し観察される蛍光の変化が容易に検出されることを保証する程度でなくてはならないということのみが限定となる。好ましくは、本発明を実施するのに使用されるプローブの濃度は、重畳型の不安定化を実質的に避けるのに十分に低い。例えば、天然のＤｎａＫ蛋白は、ビス −ＡＮＳに、１：１の化学量論性で、且つ解離定数７．０ｐＭで結合し；一方溶融小球状態のＤｎａＫはビス−ＡＮＳと３：１の化学量論性で、且つ２．０、５．１、及び３９μＭの解離定数で結合する(Shi et al.，Biochemistry 33:7536 ，1994)。１μＭのＤｎａＫ蛋白を６０μＭのビス−ＡＮＳに曝すと、天然から溶融小球コンホメーションへの変換と一致して、ＤｎａＫにおけるコンホメーションの変化がもたらされる。しかしながら、本発明によれば、より低いビス−ＡＮＳの濃度を、コンホメーション変化の指標(indicator)として使用することができる。例えば、１μＭのビス−ＡＮＳに１μＭのＤｎａＫを添加すると、溶融小球状態ＤｎａＫへの結合の結果、ビス−ＡＮＳの蛍光が３０倍近くに増強される。混合物ヘリガンド、ＡＴＰを添加すると、蛍光の増強が約５分の１に減少する。この実施態様において、標的蛋白は、標的蛋白の少なくとも一部が部分的に展開している条件下において、プローブと、テスト化合物の存在下及び非存在下で（即ちテスト及びコントロール組み合わせにおいて）接触される。適切な保温の期間（通常１から１０分間）の後、テスト及びコントロール組み合わせは、適切な波長の光で照射され、プローブが励起さ．れ、プローブの蛍光放出が、特定のプローブに適切な波長にて測定される。テスト化合物が標的蛋白のリガンドである場合、溶融小球（又は重畳中間）状態の蛋白の量は、テスト化合物の存在により減少するはずであり、プローブの結合、及び対応する蛍光放出の強度の減少に反映されるはずである。もう１つの実施態様において、テストリガンドの標的蛋白への結合は蛋白分解の使用により検出される。このアッセーは、展開された変性ポリペプチドのプロテアーゼ消化に対する感受性は重畳蛋白のそれと比較して高まることに基づいている。この場合、テストリガンド−標的蛋白組み合わせおよびテストリガンドを欠くコントロール組み合わせが、展開標的蛋白に優先的に作用する１つまたは２つ以上のプロテアーゼで処理される。適切な保温時間の後、無傷(intact)、すなわち蛋白分解されていない標的蛋白レベルが、下記の方法（例えばゲル電気泳動および／または免疫アッセー）の１つを用いて評価される。テストリガンドが標的蛋白に結合したことを示す２通りの結果が考えられる。顕著に高くなるかまたは顕著に低くなる無傷または分解蛋白の絶対量が、リガンド非存在下よりもリガンド存在下で観察されるであろう。本発明を実施するために有用なプロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、テルモリシン、およびズブチリシン（これらすべてはシグマケミカル（Si gma Chemical Co.，セントルイス、ミズーリー）から入手可能）が制限なく含まれる。本発明を実施するために用いられるプロテアーゼの選択で最も重要な基準は、これらプロテアーゼは、選択された保温条件下で特定の標的蛋白を消化でき、さらにこの活性は該蛋白の展開形を優先的に指向することが必要である。プロテアーゼを直接抑制するテストリガンドに生じる“偽陽性”結果を避けるために、２つ以上のプロテアーゼ、特に異なる酵素的作用メカニズムを有するプロテアーゼを同時にまたは平行したアッセーで用いることができる。さらに、プロテアーゼの活性のために要求される補助因子を過剰に提供し、これらの因子を引き離す可能性を有するテストリガンドによる偽陽性結果を避ける。典型的には、先ず５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸カルシウム及び０．０３４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む緩衝液中に、精製標的蛋白を最終濃度２−１００ｐｇ／ｍｌで採る。続いて、明瞭な作用メカニズムを有するプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ及びテルモリシンを、２−１０μｇ／ｍｌの最終濃度で加える。続いて、並行した保温を５分間から１時間の範囲の異なる時間、２０゜Ｃから６５゜Ｃの範囲の温度で実施する。反応は、塩化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）を最終濃度１ｍＭ、及びエチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）を最終濃度２０ｍＭ添加することによって停止させる。保温時間終了時の反応混合物に残存する無傷の蛋白量を続いて以下の方法のいずれかによって評価する：ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡまたはニトロセルロースフィルターへの結合。上記のプロトコルは、標的蛋白の約８０％の消化（これは、顕著な程度の展開が起こったことを示す）をもたらす適切な条件の選択を可能にする。もし、標的蛋白に対する既知のリガンドが利用できる場合、このリガンドは、２０−２００ μＭの濃度で反応混合物に含まれ、この実験は反復される。典型的には、標的蛋白の消化の程度で少なくとも２倍増加または減少が認められるが、これは、既知リガンドの結合が重畳：展開標的蛋白比および／または重畳もしくは展開速度を変化させることを示唆している。上記のように高処理量スクリーニングのための条件が一旦確立されたら、２０から２００μＭの濃度で多数のテストリガンドを用いてこのプロトコルを同時に反復する。無傷の蛋白の量における少なくとも２倍の増加または減少が認められたら、“ヒット”化合物、すなわち標的蛋白に結合するリガンドのしるしである。好ましい条件は、この方法を用いてテストリガンドの０．１％から１％がヒット化合物と識別されるような条件である。別の実施態様では、テストリガンドの存在下、非存在下で重畳および展開標的蛋白の相対量が、適切な表面に結合する標的蛋白の相対量を測定することによって評価される。この方法は、展開蛋白は表面に粘着し易いということを利用する。これは、展開によって生じる表面積の増加と疎水性残基の保護の減少よるものである。テストリガンドが標的蛋白に結合すると（すなわち、標的蛋白のリガンドであると）、このリガンドは標的蛋白の重畳形を安定化させ、固体表面への標的蛋白の結合を低下させるであろう。また別に、リガンドはこの蛋白の展開形を安定化させ、固体表面へのその結合を増加させるかもしれない。この実施態様では、標的蛋白、テストリガンド、および優先的に展開蛋白を結合させる表面が組み合わされ、標的蛋白のリガンドへの結合と展開標的蛋白の表面への結合に適した条件下で維持される。また別に、結合させるために該表面の非存在下で標的蛋白とテストリガンドとを予備保温してもよい。この目的に適した表面には、種々の処理または未処理プラスチックで構築されたマイクロタイタープレート、組織培養用もしくは高蛋白結合用に処理されたプレート、ニトロセルロースフィルターおよびＰＶＤＦフィルターが制限なく含まれる。表面結合標的蛋白量または溶液中に残存する標的蛋白量の決定は、当該技術分野で既知の標準的方法、例えば放射能活性または免疫アッセーによる決定を用いて実施できる。テストリガンド非存在下よりテストリガンド存在下で顕著に増加または減少した標的蛋白が表面に結合している場合は、このテストリガンドはこの標的蛋白のリガンドである。同様に、テストリガンドがこの標的蛋白のリガンドである場合は、表面結合標的蛋白：可溶性標的蛋白比は、テストリガンドが存在しないときよりテストリガンドが存在するときに顕著に増加または減少するであろう。別の実施態様では、テスト組合せ中に重畳および展開標的蛋白が存在する程度が、この蛋白の展開状態または重畳状態のいずれかに特異的な抗体（すなわちそれぞれ変性型特異的（“ＤＳ”）または天然型特異的（“ＮＳ”））を用いて評価される（Breyer，1989，J．Biol．Che m.，264(5):13348-13354）。特定の標的蛋白に特異的な多クローン性および単クローン性ＤＳおよびＮＳ抗体は、当分野で周知の方法によって調製できる（E．Har1ow & D．Lane, 抗体：実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manua1)、コールドスプリングハーバー研究所、1988；Zola，単クローン性抗体：技術入門(Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques), CRCPress，Inc.，Boca Raton,フロリダ、1987）。ＤＳ抗体については、当該蛋白が天然の状態にあるときに該蛋白の内部に埋め込まれている蛋白領域に由来するペプチドで動物を免役することができる。当該蛋白の三次元構造が不明の場合は、いくつかのペプチドに対して抗体を調製し、続いて変性状態への優先的な結合についてスクリーニングする。ＮＳ抗体については、無傷の変性されていない蛋白をを免疫源として使用し、得られる抗体を、天然の蛋白への優先的結合についてスクリーニングし、さらに本発明に使用するために精製する。ＤＳまたはＮＳ抗体を用いて、重畳標的蛋白レベル、展開標的蛋白レベル、重畳：展開比または重畳もしくは展開速度におけるリガンド誘発変化を検出することができる。ある手法では、ＤＳ抗体、標的蛋白およびテストリガンドを含むテスト組み合わせが、標的蛋白とリガンドとの結合およびＤＳ抗体の展開標的蛋白への結合に適した条件下で固形支持体（例えば変性標的蛋白またはそのペプチドフラグメントで被覆したマイクロタイタープレート）に曝される。テストリガンドを含まない点を除いてテスト組み合わせと同様であるコントロール組合せは、このテスト溶液と同じ態様で処理される。プレートに結合した抗体量またはテスト組合せとコントロール組合せの溶液中に残存する量を比較することによって、標的蛋白の重畳における相違を検出する。プレートに結合し、または溶液中に残存する抗体量は下記のように測定できる。第二の手法では、ＤＳ抗体、テストリガンドおよび標的蛋白を含むテスト組合せを第二の抗体で被覆した固形支持体に曝す。この抗体被覆固形支持体を固相抗体と呼ぶが、これはＤＳ抗体と同時に標的蛋白と結合することができない。さらに、標的蛋白に特異的であるが、重畳状態に特異的であるか（ＮＳ抗体）または天然と変性状態とを識別できない（“非識別”または“ＮＤ”抗体）かのいずれかである。得られたテスト組み合わせまたは溶液を、標的蛋白と標的蛋白のリガンドとの結合および抗体が認識する蛋白へのそれら抗体の結合に適した条件下で維持する。テストリガンドを含まない点を除きテスト溶液と同じコントロール組合せをテスト溶液と同じ態様で処理する。両方の組み合わせで、変性（展開）標的蛋白はＤＳ抗体に結合し、固相抗体に結合することが抑制される。標的蛋白に結合するテストリガンドの能力は、テスト溶液中の固相抗体に結合する標的蛋白量を決定し、これを標的蛋白がテストリガンドの非存在下で固相抗体と結合する程度（これは重畳状態の標的蛋白量を反映する）と比較することによって測定することができる。第二の抗体を介してプレートに結合した標的蛋白量、または溶液中に残存している標的蛋白量は下記の方法によって検出できる。この手法は、可溶性抗体としてＮＳ抗体を用い、さらに固相にＤＳもしくはＮＤ抗体を用いて類似の態様で使用できる。第三の手法では、ＤＳまたはＮＳ抗体で被覆した固形支持体（例えばマイクロタイタープレート）に標的蛋白およびテストリガンドを含むテスト溶液を曝し、標的蛋白とリガンドの結合および抗体と標的蛋白の結合に適した条件下で維持する。また別には、この抗体はビーズの表面に存在させてもよい。テストリガンドの標的蛋白への結合能力は、標的蛋白が溶液中（抗体に未結合）または固形表面（抗体に結合）に残存している程度を決定するか、またはテストリガンドの存在下および非存在下でのこれら２種の比を決定することによって測定される。また別には、この抗体は溶液中にあって、標的蛋白を固相（例えばプレート表面またはビーズ表面）に付着させてもよい。また別の実施例では、分子シャペロンを用いて、テスト組合せ中の重畳および展開蛋白の相対レベルを評価する。シャペロンには、それらの通常の生理学的機能の一部分として展開蛋白に結合する既知の蛋白が包含される。一般に、それらはオリゴマー蛋白の組み立て、ある種の蛋白の正確な重畳、蛋白の適性配置の促進および生理的ストレス時の蛋白様凝集形成の防止に関与する(Hardy，1991，Sc ience，251:439-44 3)。これらの蛋白は、限定された配列モチーフを特異的に認識することなく多くの展開蛋白、または部分的に変性した蛋白と相互反応する能力を有する。大腸菌(E．Co1i)で見出された分子シャペロンはＳｅｃＢとして知られた蛋白である。ＳｅｃＢは、他の点では無関係の蛋白のサブセットの輸出に明瞭に関与している。競合実験によって、ＳｅｃＢは調べられた全ての展開蛋白（その特定の輸出サブセット以外の蛋白を含む）と固く結合することが示されたが、重畳蛋白と相互反応はしないようである。本発明での使用に適した他のシャペロンには、熱ショック蛋白７０ｓ、熱ショック蛋白９０ｓ、ＧｒｏＥＩおよびＧｒｏＥＳが制限なく含まれる(Gethingら、Nature 355:33，1992)。この実施例では、テストリガンドおよび標的を含むテスト組合せは、標的蛋白とそのリガンドとの結合および分子シャペロンと展開標的蛋白との結合に適した条件下で、分子シャペロンで被覆した固形支持体（例えばマイクロタイタープレートまたは他の適切な表面）に曝される。溶液中の展開標的蛋白は、リガンド安定化重畳標的蛋白に較べて分子シャペロン被覆表面により結合し易い。したがって、標的蛋白に結合するテストリガンドの能力は、未結合の標的蛋白量またはシャペロン被覆表面に結合した量を決定することによって求めることができる。また別に、分子シャペロンとの結合に関する競合アッセーも利用できる。精製標的蛋白、テストリガンドおよび分子シャペロンを含むテスト組み合わせを、標的蛋白とそのリガンドとの結合および分子シャペロンと展開標的蛋白との結合に適した条件下で、固形支持体（例えば変性（展開）標的蛋白で被覆したマイクロタイターのくぼみ（ウェル））に曝すことができる。リガンドを含まないという点を除いてテスト組み合わせと同じコントロール組み合わせを同じ態様で処理する。溶液中の変性標的蛋白はシャペロンに結合し、したがって、支持体に結合させた変性標的蛋白とシャペロンの結合が抑制される。テストリガンドと標的蛋白の結合は展開標的蛋白量の違いをもたらし、したがって、テストリガンドの結合がない場合よりも、もっと多くのまたはもっと少ないシャペロンが固相変性標的蛋白に結合することができるであろう。したがって、テストリガンドの結合は、テスト組合せおよびコントロール組合せの表面に結合したシャペロンまたは溶液中のシャペロンを評価し、それらの結果を比較することによって求めることができる。このアッセーでは、結合の競合が測定できるように一般にシャペロンは過剰に提供されない。また別に、標的蛋白、テストリガンドおよび分子シャペロンを含むテスト組合せを、重畳標的蛋白に特異的（ＮＳ抗体）であるが、シャペロンに結合した標的蛋白には結合できない抗血清または単クローン性抗体で被覆した固形支持体（例えばマイクロタイターウェル）に曝すことができる。展開標的蛋白は溶液中のシャペロンに結合し、したがって固相抗体との結合が抑制されるであろう。溶液中またはウェルの壁に結合した標的蛋白を検出し、適切なコントロール（テストリガンドを含まない同じ組み合わせ）中の一方または両方の程度を比較することによって、標的蛋白と結合するテストリガンドの能力が求められる。テストリガンドが標的蛋白のリガンドである場合、コントロール組み合わせよりもテスト組み合わせの容器表面に結合させた抗血清または単クローン性抗体にもっと多くの、またはもっと少ない標的蛋白が結合するであろう。さらにそれに対応して、コントロール組み合わせにおいてよりももっと多いまたはもっと少ない標的蛋白が、テスト組み合わせにおいて未結合の状態で（溶液中に）存在するであろう。また別の実施例では、標的蛋白の既知のリガンド、補助因子、基質またはその類似体が、重畳標的蛋白の存在についてのアッセーに用いられる。重畳形蛋白部分が多ければ多いほど、重畳状態にもっぱら結合するリガンドと結合するために利用される蛋白量が多くなる。結果として、蛋白が既知のリガンドを有する場合、この蛋白の別の部位で結合するテストリガンドを添加することによって、この蛋白の既知のリガンドへの結合を増加、または減少させることが可能である。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素のメトトレキセート（葉酸類似体）への結合は、この酵素の重畳レベルを評価するために用いることができる。この手法では、標的蛋白に結合することが分かっているリガンド、補助因子、基質またはその類似体が固形土台に固定される。標的蛋白とテストリガンドを含む溶液を続いて添加する。テストリガンドが存在しない同一のアッセーと比較した場合の固定化合物に結合する標的蛋白量の増加または減少は、テストリガンドが標的蛋白に結合することを示唆する。固形土台に結合した標的蛋白量は、この固形土台をサンプリングするかまたはこの溶液をサンプリングすることによって調べることができる。別の実施例では、テスト組み合わせ中の展開標的蛋白量が蛋白凝集を測定することによって評価される。不可逆的に展開する蛋白の場合、展開蛋白はしばしば不溶性の凝集物を形成する。蛋白凝集の程度は、当分野で既知の技術によって測定できるが、これらの技術には光散乱、遠心沈澱およびろ過が制限なく含まれる。この手法では、標的蛋白とテストリガンドが保温され、蛋白凝集量が経時的にまたは一定の保温時間後に測定される。テスト混合物中の蛋白凝集の程度が、テストリガンドの存在しないコントロールアッセーでの同じ測定と比較される。テストリガンドが標的蛋白と結合する場合、標的蛋白の展開速度は、テストリガンドが存在しないときよりももっと遅いかまたはもっと速いであろう。経時的測定については、テストリガンドが標的蛋白のリガンドである場合は、そうでない場合より凝集蛋白の出現速度はもっと遅いかまたはもっと速いであろう。一定時間での測定については、テストリガンドが標的蛋白のリガンドである場合は、そうでない場合よりもっと多いまたはもっと少ない展開蛋白が存在し、それに対応して、もっと少ないまたはもっと多い凝集蛋白が存在するであろう。したがって、標的蛋白と結合するテストリガンドの能力は、テストリガンドの存在下および非存在下での蛋白凝集の程度を評価することによって決定される。上記の実施態様を以下の表に要約する。蛋白検出方法上記の実施態様は、テストリガンドに曝した後の重畳および展開標的蛋白の相対量を定量するために、標的蛋白もしくはその消化生成物、または抗体のレベルを検出および／または定量する最終工程を必要とする。本発明を実施する場合、当分野で既知の方法を用いて、蛋白、小型ペプチドまたは遊離アミノ酸の有無を検出する。使用方法は、検出すべき生成物（蛋白、ペプチド、遊離アミノ酸）によって決まるであろう。例えば、蛋白サイズを検出する技術（例えばゲル電気泳動、毛細管電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど）を用いて標的蛋白の蛋白分解の程度を決定することができる。放射能活性、蛍光、または酵素活性の測定によって、溶液中または固形支持体上の生成物の有無を検出できる。例えばＥＬＩＳＡおよび放射能免疫アッセーを含む免疫学的方法によって、溶液中または土台上の既知標的蛋白の有無を検出できる。上記の方法は例えば以下の文献に記載されている。E．Harlow & D．Lane, 抗体：実験室マニュアル(Antibodies: A laboratory Manual)、コールドスプリングハーバー研究所、1988：S.F.Y．Li, 毛細管電気泳動(Capillary Electrophoresis) 、Elsevier Press,1993; Bidlingmeyer、ＨＰＬＣの実際的方法と応用(Practica l HPLC Methodology and Applications)、John Wiley and Sons，Inc.，1992; C .R.Cantor & P.R．Schimmel、生物物理化学(Biophysical Chemistry)、WH Freem an & Co.，1980。好ましい実施例では、ゲル電気泳動を用いて蛋白の有無が検出され、さらに蛋白のサイズを検出するためにも用いることができる。この後者の方法は蛋白分解と組み合わせた場合特に有用である。テスト組み合わせではコントロール組み合わせよりもっと多いまたはもっと少ない量の未消化標的蛋白が存在していることが、テストリガンドが標的蛋白に結合したことを示すからである。以下の実施例は、本発明を制限するためではなく本発明を詳述することを目的とするものである。実施例１：メトトレキセートの結合はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をプロテイナーゼＫによる蛋白分解性消化から保護する以下のものを組み合わせ５４゜Ｃで５分間保温した：ＤＨＦＲ（１００ｐｇ／ｍｌ）、プロテイナーゼＫ（８０μｇ／ｍｌ）、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および１０^-10１０^-4のメトトレキセート。サンプルを取り出し、未消化ＤＨＦＲをＥＬＩＳＡで以下のように定量した：（ａ）プロテアーゼ保温物をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で５０倍に希釈した；（ｂ）希釈サンプル５０ｐｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、室温で６０分保温した；（ｃ）プレートのウェルを０．１％トゥイーン−２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で十分に洗浄した；（ｄ）５％無脂肪ドライミルクを含むＴＢＳＴで２５０倍に希釈した５０μｌの抗ＤＨＦＲウサギ血清を各ウェルに添加し、室温で３０分保温した；（ｅ）上記（ｃ）のようにプレートのウェルを洗浄した；（ｆ）５％ミルク含有ＴＢＳＴで５００倍に希釈した５０μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ共役物を各ウェルに加え、室温で３０分保温した；（ｇ）（ｃ）のようにプレートのウェルを洗浄した；さらに（ｈ）０．１％ジエタノールアミン中の１．０ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート０．１ｍｌを加えた。発色は、結合したアルカリフォスファターゼ抗体共役物に比例する。このＥＬＩＳＡ分析によって、メトトレキヤートは１０^-8Ｍ以上の濃度でＤＨＦＲを消化から保護することが示された。同じ方法によって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）と１０^-5上の濃度のジヒドロ葉酸塩は、別個の実験でＤＨＦＲの蛋白分解を抑制することが示された。実施例２：メトトレキセート、ＮＡＤＰＨおよびジヒドロ葉酸塩結合は、アミノ酸混合物の存在下でプロテイナーゼＫによる蛋白分解性消化からジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を保護する以下のものを組み合わせ、５４゜Ｃで５分間保温した：ＤＨＦＲ（２．１μｇ／ｍｌ）、プロテイナーゼＫ（８０μｇ／ｍｌ）、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２０種全ての通常アミノ酸１０^-5Ｍおよび０もしくは１０^-5Ｍのリガンド。用いたリガンドは抑制物質メトトレキセート並びに基質ジヒドロ葉酸塩およびＮＡＤＰＨであった。サンプルを取り出し、未消化ＤＨＦＲをＥＬＩＳＡで以下のように定量した：（ａ）プロテアーゼ保温物をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で５０倍に希釈した；（ｂ）希釈サンプル５０μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、室温で６０分保温した；（ｃ）プレートのウェルを０．１％トウイーン−２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で十分に洗浄した；（ｄ）５％無脂肪ドライミルクを含むＴＢＳＴで２５０倍に希釈した５０μｌの抗ＤＨＦＲウサギ血清を各ウェルに添加し、室温で３０分保温した；（ｅ）上記（ｃ）のようにプレートのウェルを洗浄した；（ｆ）５％ミルク含有ＴＢＳＴで５００倍に希釈した５０ｐｌのヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ共役物を各ウェルに加え、室温で３０分保温した；（ｇ）（ｃ）のようにプレートのウェルを洗浄した；さらに（ｈ）０．１％ジエタノールアミン中の１．０ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート０．１ｍｌを加えた。発色は、結合したアルカリフォスファターゼ抗体共役物に比例する。このＥＬＩＳＡ分析によって、メトトレキセートおよび基質は、ＤＨＦＲに結合するリガンドが存在しないことに対応する消化からＤＨＦＲを保護することが示された。したがって、特異的な結合は、標的蛋白に結合しない化合物の複合混合物の存在下で検出できる。実施例３：メトトレキセート結合はＤＨＦＲのマイクロタイタープレートへの結合を抑制する以下のものを６０μｌの容量中に加え、ファルコン３０７２“組織培養用処理済み”マイクロタイタープレートで２０または４７゜Ｃで保温した：１００ｍｇＤＨＦＲ、５０ＭＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）および１０^-10− １０^-4Ｍのメトトレキセート。各サンプル５０μｌをその後ＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、溶液中に残存するＤＨＦＲを以下のようにＥＬＩＳＡによって定量した：（ａ）５０μｌのサンプルを室温で６０分保温した；（ｂ）プレートのウェルを０．１％トゥーン−２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で十分に洗浄した；（ｃ）５％無脂肪ドライミルクを含むＴＢＳＴで２５０倍に希釈した５０μｌの抗ＤＨＦＲウサギ血清を各ウェルに添加し、室温で３０分保温した；（ｄ）上記（ｃ）のようにプレートのウェルを洗浄した；（ｅ）５％ミルク含有ＴＢＳＴで５００倍に希釈した５０μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ共役物を各ウェルに加え、室温で３０分保温した；（ｆ）（ｂ）のようにプレートのウェルを洗浄した；さらに（ｇ）０．１％ジエタノールアミン中の１．０ｍｇ／ｍｌＤ−ニトロフェニルホスフェート０．１ｍｌを加えた。発色は、結合したアルカリフォスファターゼ抗体共役物に比例する。ＥＬＩＳＡ分析は、メトトレキセートが、１０^-7Ｍ以上の濃度で、ＤＨＦＲがファルコン３０７２プレートに結合するのを抑制することを明らかにした。実施例４：展開特異抗体の結合抑制または強化（１）ＥＬＩＳＡプレートを以下の混合物で６０分保温することによって被覆する：トリス緩衝食塩水（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．２ＭＮａＣｌ；ＴＢＳ）中の不可逆的に変性させた４μｇ／ｍｌの標的蛋白またはそのペプチドフラグメント。（２）プレートを０．１％トゥイーン−２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄する。（３）以下の混合物（全容量５０μｌ）をマイクロタイタープレートの被覆ウェルで６０分保温する：（ａ）最大結合の５０％（競合標的蛋白の非存在下で）を生じるために十分な濃度の標的蛋白の展開状態に特異的な抗体。（ｂ）プレートへの抗体結合の９０％抑制を達成するために十分な濃度の標的蛋白。適切な標的蛋白濃度は各標的蛋白で異なる。この濃度は、一部には標的蛋白の重畳形の安定性に依存する。幾つかの場合には、高温、蛋白変性性化学物質の添加または、標的蛋白への脱安定化アミノ酸置換の導入によって標的蛋白の安定性を減少させることが望ましい。（ｃ）１０^-9−１０^-5Ｍのテストリガンド。（ｄ）ＴＢＳＴ中の５％の無脂肪ドライミルク。（４）このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。（５）適切な希釈のヤギ抗ＩｇＧアルカリフォスファターゼ共役物５０μｌを５％の無脂肪ドライミルク含有ＴＢＳＴに加え、室温で３０分保温する。（６）ＴＢＳＴでプレートを３回洗浄する。（７）０．１％ジエタノーノレアミン中の１．０ｍｇ／ｍｌＤ−ニトロフェニルホスフェート０．１ｍｌを加え、ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置によって発色量を記録する。ＥＬＩＳＡ分析は、テストリガンド−標的蛋白結合が首尾よく生じたとき、そのような結合が生じない場合よりもっと多くの、またはもっと少ない抗体がプレートに結合することを示す。実施例５：シャペロン結合の抑制または強化（１）ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳ中の４μｇ／ｍｌのシャペロンで数時間保温することによって被覆する。（２）プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。（３）続いて、以下の混合物（全容量５０μｌ）をマイクロタイタープレート１０の被覆ウェルで６０分保温する：（ａ）シャペロン蛋白上に存在する利用可能な結合部位の約５０％を飽和するために十分な濃度の標的蛋白。変性条件を、そうしなければ標的蛋白の重畳形があまりに安定でシャペロンとの適切な結合が許容されない場合には用いてもよい。（ｂ）ＴＢＳＴ中の１０^-9−１０^-5Ｍのテストリガンド。（４）ウェルの溶液の適量を新しいＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、室温で６０分保温する。（５）このプレートのウェルをＴＢＳＴで３回洗浄する。（６）標的蛋白に特異的な、５％無脂肪ドライミルク含有ＴＢＳＴで適切に希釈した５０μｌの抗体を各ウェルに加え、室温で３０分保温する。（７）ＴＢＳＴでこのプレートのウェルを３回洗浄する。（８）５％無脂肪ドライミルク含有ＴＢＳＴで適切に希釈した５０μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ共役物を各ウェルに加え、室温で３０分保温する。（９）このプレートのウェルをＴＢＳＴで３回洗浄する。（１０）０．１％ジエタノーノレアミン中の１．０ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート０．１ｍｌを加える。発色（結合したアルカリフォスファターゼ抗体共役物に比例）は、ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置によってモニターする。ＥＬＩＳＡ分析は、テストリガンド−標的蛋白結合が生じたとき、そのような結合が生じない場合より溶液中の標的蛋白はもっと高濃度、またはもっと低濃度であることを示すであろう。実施例６：既知リガンドへの結合強化または抑制（１）以下の混合物（全容量５０μｌ）をマイクロタイタープレートの被覆ウェルで６０分保温する：（ａ）標的蛋白に結合することが分かっているリガンドを、例えばセファデックスのような固形ビーズに共有結合的に付着させたもの。このリガンドは小型分子でも巨大分子でもよい。（ｂ）リガンドの飽和より十分に低く、わずか１０％の蛋白がリガンド部位に結合するような濃度の標的蛋白。溶液の条件は、標的蛋白のほとんどが変性状態で存在するような条件である。（ｃ）１０^-9−１０^-5Ｍのテストリガンド。（ｄ）必要な変性剤（例えば尿素）を含むＴＢＳＴ。（２）ウェルの上清（ビーズを含まない）の適量を新しいＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、室温で６０分保温する。（３）このプレートのウェルをＴＢＳＴで３回洗浄する。（４）標的蛋白に特異的な、５％無脂肪ドライミルク含有ＴＢＳＴで適切に希釈した５０μの抗体を各ウェルに加え、室温で３０分保温する。（５）ＴＢＳＴでこのプレートのウェルを３回洗浄する。（６）５％無脂肪ドライミルク含有ＴＢＳＴで適切に希釈した５０ｐｌのヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ共役物を各ウェルに加え、室温で３０分保温する。（７）ＴＢＳＴでこのプレートのウェルを３回洗浄する。（８）０．１％ジエタノールアミン中の１．０ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート０．１ｍｌを加える。発色（結合したアルカリフォスファターゼ抗体共役物に比例）は、ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置によってモニターする。ＥＬＩＳＡ分析は、テストリガンド−標的蛋白結合が首尾よく生じたとき、溶液中の標的蛋白はもっと高濃度、またはもっと低濃度であることを示すであろう。実施例７：炭酸脱水素酵素リガンドのための低処理量アッセ標的蛋白重畳のプローブとして蛋白分解を用いて、炭酸脱水素酵素Ｉ（シグマ）へのリガンド結合を調べ、さらにプロテアーゼによる消化後に残存する無傷の蛋白の検出のための方法として変性ゲル電気泳動を用いた。このアッセーの有効性を確認するために、アセタゾルアミド（炭酸脱水素酵素の既知リガンド）を調べた。アセタゾルアミドは炭酸脱水素酵素活性の既知抑制物質であるが、これらの実験はこの特性を利用しないし、この蛋白の酵素活性を測定しない。さらに、天然生成物の抽出物による干渉に対するこの方法の感受性が調べられた。反応混合物は、１３．３μｇ／ｍｌの炭酸脱水素酵素、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１Ｍ酢酸カルシウム、２．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、１０％ＤＭＳＯおよび０．０から１．０ｍＭの範囲の濃度のアセタゾルアミド（シグマ）を含んでいた。反応物を５４゜Ｃで１５分保温し、続いて氷上で冷却した。続いて、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）をエタノール中の２０ｍＭ保存溶液から最終濃度１ｍＭで加え、さらにＥＤＴＡを０．５Ｍの保存溶液から最終濃度２０ｍＭで加えた。０．０１ｍｌのＳＤＳ負荷用緩衝液（１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍジチオスレイトール、０．４Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、５０％グリセロール）を添加し、サンプルを９５゜Ｃ３分加熱した。４−１５％ポリアクリルアミド（BioRad）勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサンプルを解析し、これをその後クーマシーブルー染料で染色した。図１に示したように、炭酸脱水素酵素への、既知リガンドであるアセタゾルアミドの結合は、プロテイナーゼＫによる蛋白分解に対して１×１０^-5Ｍアセタゾルアミドで炭酸脱水素酵素の安定化をもたらした。この相互反応の解離定数は２．６×１０^-6Ｍであると報告されている（K．Matsumotoら、Chem．Pharm．Bull. ，37:1913-1915，1989）。カビのメタノール抽出物を、上記に述べたものと他の点では全く同一な反応物に、添加された小分子の最終濃度がもとの培地でのその濃度と等しくなるように含ませた。抽出物の存在は、偽のシグナルを誘発せず、また１．０ｍＭのアセタゾルアミドに対する反応も減少させなかった（図２）。実施例８：ＨＩＶＲｅｖ蛋白のための低処理量アッセー反応混合物（全容量０．０３ｍｌ）は、大腸菌で産生させた３０μｇ／ｍｌのＨＩＶＲｅｖ蛋白、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１Ｍ酢酸カルシウム、２．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０％ＤＭＳＯおよび既知リガンドとして種々の量のｔＲＮＡを含んでいた。反応物を氷上で１５分保温した。上記実施例７に述べたようにＰＭＳＦおよびＥＤＴＡを添加した後、サンプルをゲル電気泳動用に調製し、実施例７で述べたように分析した。結果は、ｔＲＮＡの非存在下ではこのような条件の下でＲｅｖ蛋白はプロテイナーゼＫによってほぼ完全に消化されることを示した。しかしながら、ｔＲＮＡの存在下では、この蛋白の低分子量フラグメントは蛋白分解に対して安定化された。したがって、ＨＩＶＲｅｖ蛋白への既知リガンドの結合は、本発明の方法を用いて検出可能である。実施例９：ヒト好中球エラスターゼに対するリガンドの高処理量スクリーニング本発明の実施に際して、多数の化合物についてこの結合アッセーを実施できることは、潜在的な医薬としての有用性をもつ化合物を発見するという有用性にとって決定的に重要である。２つの異なる手法が、高処理量スクリーニングモードに提供され成功し、その各々が２つの標的蛋白、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）およびヒトヘモグロビン（ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）およびヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の両方）に応用された（下記実施例１０で詳述）。特に、これら標的蛋白は多くの重要な点で互いに異なっている。すなわち、ＨｂＳは、その機能にとって重要な補欠分子族(prosthetic group)を含む細胞内の四量体蛋白である。異なる構造的機能的特性をもつ２種のコンホメーションで存在することが知られている。対照的に、ＨＮＥは単量体で、補欠分子族を欠き、分泌される。ＨＮＥは酵素活性を有し（蛋白分解）、いかなる全体的コンホメーション変化も受けないようである。これら標的蛋白の両方についての高処理量スクリーニングのため、蛋白分解が標的蛋白重畳のプローブとして用いられる。この２つの高処理量モードは、蛋白分解後の残存する標的蛋白の検出に用いられる方法が異なっている。この２つの検出方法は、１）放射能標識蛋白のニトロセルロースフィルターへの捕捉とその後の結合放射能の定量、および２）酵素連結免疫吸着アッセー（ＥＬＩＳＡ）による蛋白の測定である。これらの方法の各々は、ヘモグロビンおよびＨＮＥの両方について都合よく用いられた。Ａ）放射能標識ＨＮＥのニトロセルロース結合：０．１ｍｇのＨＮＥ（Elastin Products）を、製造元のプロトコル（Pierce）にしたがいヨードゲン（Pierce）の存在下で¹²⁵Ｉ−沃化ナトリウム（アマーシャム）で反応させて標識した。反応混合物は、放射能標識ＨＮＥ（２００００ｃｐｍ、約１０μｇに相当）、０．０２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸カルシウム、２．５μｇ／ｍｌテルモリシン（べーリンガーマンハイム）、２．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（メルク）、１０％ＤＭＳＯおよび２００μＭの濃度のテスト化合物を含む０．０５ｍｌの最終容量で調製された。コントロール混合物は、テスト化合物が省略されていることを除き同一であった。この混合物を２００Ｃ１５分保温し、続いて６５゜Ｃで３０分保温し、その後氷上に静置した。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．１２ｍｌを続いて各混合物に加えた。氷上でさらに１５分保温した後、シュレイヒャーアンドシュエルミニフォールド(Schleiche r and Schuell Minifold)を用いてニトロセルロース膜シートでサンプルをろ過した。その後、装置の各ウェルを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．２ｍｌで１回、２．０％ＳＤＳおよび１．０％トリトン−Ｘ１００を含む５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ５．５）０．５ｍｌで２回洗浄した。フィルターを乾燥させた後、ワラックマイクロベータ（Wallac MicroBeta）装置を用いてシンチレーション計測によって結合放射能を決定した。このアッセーの有効性を確認するために、ＨＮＥの既知のリガンド、エラスタチナル(elastatinal)を１−５ｍＭの範囲の濃度でこのアッセーに含めた。図３に示したように、エラスタチナルの存在は、ニトロセルロースフィルターへの標識ＨＮＥの保持を増加させた。このことは、これが蛋白分解からＨＮＥを保護したことを示している。Ｂ）ＨＮＥのＥＬＩＳＡ定量：最終容量０．０５ｍｌの反応混合物は、２μｇ／ｍｌＨＮＥ、０．０２０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸カルシウム、７．５μｇ／ｍｌテルモリシン（ベーリンガーマンハイム）、７．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（メルク）、１０％ＤＭＳＯおよび２０または２００ｐＭの濃度のテスト化合物を含んでいた。コントロール混合物は、テスト化合物が省略されていることを除いて同一であった。混合物は２０゜Ｃで１５分、続いて６３゜Ｃで３０分保温され、その後氷上に静置された。５％無脂肪ドライミルク（カーネーション）含有ＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス− ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン−２０）中で１：１００００に希釈した０．１ｍｌのウサギ抗ＨＮＥ抗体（Calbiochem）が、続いて各反応に加えられた。室温で１０分保温後、混合物を９６ウェルのイムロン−４プレート（Dynatech）に移された。このプレートは、ウェル当たり０．１ｍｌの、０．２μｇ／ｍｌＨＮＥの５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）及び３ｍＭナトリウムアジド溶液で一晩保温し、さらにＴＢＳＴで十分に洗浄することによってＨＮＥで被覆されていたものである。このプレートを続いて室温で１時間保温し、その後ＴＢＳＴで十分に洗浄した。５％無脂肪ドライミルク含有ＴＢＳＴで１：１０００に希釈した０．１ｍｌのアルカリフォスファターゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Calbiochem）を各ウェルに加え、プレートを１−２時間室温で保温した。続いてプレートをＴＢＳＴで十分に洗浄し、最後にトゥイーンを含まないＴＢＳＴで洗浄した。１Ｘジエタノールアミン基質緩衝液（Pierce）中のｐ−ニトロフェニルフォスフェート（０．５ｍｇ／ｍｌ）をｍｌにつき０．１ｍｌ各ウェルに加えた。発色するまでプレートを室温で保温し、その後、バイオラド３５５０−ＵＶマイクロプレート読み取り装置を用いて各ウェルの４０５ｎｍでの吸収を測定した。このアッセーの有効性を確認するために、ＨＮＥの既知のリガンド、ＩＣＩ２００３５５を０．０１−１０μＭの範囲の濃度でこのアッセーに含めた。図４に示したように、リガンドの存在はプレートへの抗体結合の抑制をもたらした。これは反応混合物中の免疫反応性ＨＮＥレベルの増加を示している。Ｃ）高処理量スクリーニングの結果：上記のように蛋白分解およびＥＬＩＳＡによる検出を用いて、ＨＮＥとの相互反応について３６００の化合物がスクリーニングされた（図５）。これらのうち、２４種が、２０μＭ濃度でアッセーしたとき５０％またはそれより高い程度でプロテイナーゼＫによるＨＮＥの蛋白分解を抑制した（陽性ヒット化合物）。さらに別の６化合物が、２０ｐＭでテストしたとき少なくとも２倍蛋白分解の程度を高めることが分かった（陰性ヒット化合物）。ヒット化合物の効果の濃度依存性が測定された。ヒット化合物は、８μＭの低さの濃度で最大の半分の効果を示した。１例が図６に示されている。最大抑制は通常（いつもではないが）ほぼ１００％である。このヒット化合物をＨＮＥの酵素活性を抑制する能力についてアッセーした。この結合アッセーで認識された化合物は蛋白表面のどの場所にでも結合できるので、きわめて僅かな部分のみがＨＮＥの酵素活性を抑制するであろうと予想される。色素形成合成基質であるＳｕｃ−（Ａｌａ）₃−ｐＮＡ（Elastin Products ）の蛋白分解抑制物質として、文献の方法(J.Bieth,B.Spiess & C.G.Wermuth,Bi ochemical Me dicine 11:350-357(1974))にしたがってこの化合物を調べた。２つの陽性ヒット化合物と１つの陰性ヒット化合物が、このアッセーでＨＮＥの蛋白分解活性を顕著に抑制した（図７）。実施例１０：ヒトヘモグロビンのリガンドの高処理量スクリーニングＡ）放射能標識ヘモグロビンのニトロセルロース結合０．２ｍｇのＨｂＳまたはＨｂＡ（シグマ）は、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中の¹²⁵Ｉ−ボルトンーハンター試薬１ｍＣｉ（アマーシャム）と氷上で１時間反応させて放射能標識した。標識は２００ｍＭグリシンを含むホウ酸緩衝液を加えて停止させた。続いて混合物を、０．２５％のゼラチンを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）でエクセセルロースＧＦ −５カラム（Pierce）を用いてサイズによって分画した。結合アッセーのために、最終容量０．０５ｍｌの反応混合物は放射能標識ヘモグロビン（２００００ＣＰＭ）、０．０６３ｍｇ／ｍｌ未標識ヘモグロビン、０．０３４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸カルシウム、２．５μｇ／ｍｌテルモリシン（ベーリンガーマンハイム）、２．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（メルク）、１０％ＤＭＳＯおよびテスト化合物を含んでいた。コントロール混合物は、テスト化合物が省略されていることを除き同一であった。混合物は２００Ｃで１５分、続いて４０゜Ｃで３０分保温し、さらに氷上に静置した。０．１２ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を続いて各混合物に添加した。氷上でさらに１５分保温したあと、シュレイヒャーアンドシュエルミニフォールドを用いてニトロセルロース膜シートでサンプルをろ過した。続いて装置の各ウェルを０．２ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で１回、２．０％ＳＤＳと１．０％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）０．５ｍｌで２回洗浄した。フィルターを乾燥後、ウォラックマイクロベータ装置を用いてシンチレーション計測によって結合した放射能を求めた。このアッセーの有効性を確認するために、ヘモグロビンの既知のリガンドである２，３−ジホスホグリヤレートを１０^-5から１０^-1Ｍの範囲の濃度で反応混合物に含めた。図８に示したように、２，３−ジホスホグリセレートは、ヘモグロビンのフィルター保持を著しく高めた。Ｂ）へモグロビンのＥＬＩＳＡ定量最終容量０．０５ｍｌの反応混合物は、０．０６３ｍｇ／ｍｌのへモグロビン、０．０３４ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸カルシウム、７．５μｇ／ｍｌのテルモリシン（ベーリンガーマンハイム）、７．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（メルク）、１０％ＤＭＳＯ、および２０または２００μＭの濃度のテスト化合物を含んでいた。コントロール反応は、テスト化合物が省略されていることを除いて同一であった。混合物を２０゜Ｃで１５分、続いて４４゜Ｃで３０分保温し、その後氷上に静置した。続いて、２０ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＰＭＳＦを含む０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液０．０５ｍｌを各混合物に加えた。氷上で１０分維持した後、被覆されていない９６ウェルのイムロン−４プレート（Dynatech）に混合物を移した。続いてプレートを４゜Ｃで一晩維持し、蛋白をプレートに結合させた。プレートをＴＢＳＴで十分に洗浄し、０．１ｍｌのウサギ抗ヒトヘモグロビン抗体（Calbiochem）０．１ｍｌ（１：５００希釈）を各ウェルに加えた。プレートは室温で１時間保温し、その後十分にＴＢＳＴで洗浄した。次に、５％無脂肪ドライミルクを含むＴＢＳＴで１：１０００に希釈したアルカリフォスファターゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Calbio chem）を各ウェルに加え、さらにプレートを室温で１−２時間保温した。その後、プレートをＴＢＳＴで十分に洗浄し、最後にトゥイーンを含まないＴＢＳＴで洗浄した。１Ｘジエタノールアミン基質緩衝液（Pierce）中のｐ−ニトロフェニルフォスフェート（０．５ｍｇ／ｍｌ）をｍｌにつき０．１ｍｌ各ウェルに加えた。発色するまでプレートを室温で保温し、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸収を、バイオラド３５５０−ＵＶミクロプレート読み取り装置を用いて測定した。このアッセーの有効性を確認するために、ヘモグロビンの既知リガンドである２，３−ジホスホグリセレートをこの反応に含めた。図９に示したように、この化合物は免疫反応性ヘモグロビン検出を高めた。Ｃ）高処理量スクリーニングの結果上記のように蛋白分解とＥＬＩＳＡによる検出を用いて、４０００種の化合物がＨｂＳとの相互反応についてスクリーニングされた（図１０）。これらのうち、２３種が２０μＭの濃度で調べたとき、２０％またはそれ以上の程度まで蛋白分解を抑制することが分かった（陽性ヒット化合物）。ヒット化合物の作用の濃度依存性を測定した。ヒット化合物は、２．０μＭの範囲の低濃度で最大効果の半分を示した（例えば図１１参照）。実施例１１：炭酸脱水素酵素リガンドのための蛍光に基づいた低処理量アッセー炭酸脱水素酵素Ｉへのリガンド結合を、コンホメーション特異的蛍光プローブを標的蛋白重畳の指標として用いて調べた。最終容量０．１ｍｌの反応混合物は、２μＭのヒト炭酸脱水素酵素(Sigma)、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．６、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．０ｐＭのビス−１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ビス−ＡＮＳ）(Molecular Probes,Inc.，Eugene,0R)を含んでいた。ビス−ＡＮＳの蛍光放出を、３６５ｎｍで励起後４５０ｎｍで測定した。測定は、ダイナテック蛍光マイクロプレートリーダ(Dynatech fluorescence micro plate reader)を用いて行った。まず、塩酸グアニジニウム（ＧＣｌ）の濃度の増加の、ビス−ＡＮＳにおける効果を試験した。図１２は、ＧＣｌ添加３分後に測定したビス−ＡＮＳの蛍光強度（任意の単位）を示す。炭酸脱水素酵素を欠いた混合物においてビス−ＡＮＳの蛍光収率は低く、ＧＣｌの存在によって影響されなかった（図１２、中黒の四角）。これに対して、炭酸脱水素酵素は、ビス−ＡＮＳの蛍光放出を、ＧＣｌの濃度に感受性な態様で増強した。ＧＣｌの非存在下では、炭酸脱水素酵素により蛍光が５倍に増強された。０．５Ｍから２ＭのＧＣｌの添加は、蛍光を比例的に増加させ、２ＭＧＣｌにおいて最大１５倍の増強があった。さらなるＧＣｌの添加は蛍光を減少させた。図１３は、上記混合物中のＧＣｌ誘導蛍光増強の時間依存性を示す。これらのデータは、ビス−ＡＮＳの蛍光放出強度が、炭酸脱水素酵素の重畳状態に影響されることを示している。このアッセーの炭酸脱水素酵素リガンドのスクリーニングにおける使用の有効性を確認するために、炭酸脱水素酵素の既知リガンドであるアセタゾルアミドについての、上記混合物中のビス−ＡＮＳの蛍光放出に影響する能力を試験した。図１４は、炭酸脱水素酵素を２ＭＧＣｌに曝して１分後のビス−ＡＮＳの放出を、アセタゾルアミドの濃度を増加させて調べた結果を示す。蛍光放出は、アセタゾルアミドにより、濃度依存的な様式で減少した。これらのデータは、アセタゾルアミドの炭酸脱水素酵素への結合が、ＧＣｌにより誘導される蛋白の重畳型から溶融小球重畳中間体への変換を妨げ、この効果はリガンド結合の指標として使用できることを示している。実施例１２：蛍光に基づいたリガンドの高処理量アッセーコンホメーション選択的蛍光プローブを、本発明によるリガンド結合の測定の高処理量スクリーニングフォーマットに使用する。蛍光プローブ、標的蛋白、及びテスト化合物（及び並行した、テスト化合物を欠いた対照のウェル）を、９６ウエルマイクロタイタープレートのそれぞれのウエルに提供する。適切な保温期間の後、それぞれのウエルの蛍光を、蛍光プレートリーダー（例えばDynatech，Chantilly，VA等）を用いて決定する。テスト化合物を欠いたコントロールウエルと比較したウエル内の蛍光強度の増加又は減少は、テスト化合物がそれぞれ標的蛋白の重畳又は展開状態と結合を起こしたことを示す。それぞれの標的蛋白の条件は、条件が安定化したものから不安定化したものまで様々であるので、プローブ蛍光の変化を組織的にモニタリングすることにより決定される。リガンドによる重畳状態の安定化に際して蛍光の測定可能な変化がもたらされるように、観察される蛍光強度の実質的な部分は、プローブの、標的蛋白の溶融小球状態との相互作用によるものでなければならない。必要であれば、上昇した温度又は尿素、グアニジン若しくは有機溶媒の添加等の変性条件が、溶融小球状態で存在する標的蛋白の割合を増加させるために使用される。必要であれば、溶融小球状態の存在は、ＮＭＲ、粘度測定、固有蛍光(intrinsic fluor escence)及びゲル濾過クロマトグラフィーを含む生物物理学的な測定により確認される。適切な条件下で、標的蛋白が天然から溶融小球状態へ変換されるのに伴い、増加した蛍光が観察され、一方、溶融小球状態からランダムコイルへの変換に伴い蛍光の減少が観察される。いくつかの標的蛋白の場合、溶融小球状態は、「安定」条件（即ち上に列挙した変性条件がない状態）においてさえ支配的であることもある。このような場合、標的蛋白によるプローブ蛍光の比較的高い増強が安定化条件下においてさえ観察され、条件がより不安定化されるにつれ、蛍光の減少が観察される。溶融小球状態の存在は、上記の通りに確認することができる。天然から溶融小球状へのコンホメーション変化の可逆性もまた特徴づけることができる。移行が可逆的である場合、アッセーは、平衡条件下で確立することができる。この場合、保温時間は、プローブの、（テスト化合物不在下における）標的蛋白の溶融小球状態への結合が平衡に達するのを許容するのに十分長い時間が選択される。移行が可逆的でない場合保温時間は、蛍光増強の測定可能であるが完全ではない変化が起こるよう選択され、このような条件は可逆的コンホメーション変化の場合においても用いることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１．所定の標的蛋白に結合するリガンドを識別するための、蛍光に基づくスクリーニング方法であって：（ａ）標的蛋白に結合することが不明の複数の化合物をテストリガンドとして選択し、（ｂ）標的蛋白を当該テストリガンドの各々と保温してテスト組み合わせを作製し、またテストリガンドの非存在下において保温してコントロール組み合わせを作製し、（ｃ）前記テスト及びコントロール組み合わせをコンホメーション感受性蛍光プローブと接触させ、（ｄ）前記テストおよびコントロール組み合わせを、標的蛋白が適切な程度に展開する条件下で処理し、（ｅ）前記テスト組み合わせおよびコントロール組み合わせにおいて前記コンホメーション感受性蛍光プローブの蛍光放出を測定し、（ｆ）テスト組み合わせおよびコントロール組み合わせの間で工程（ｄ）で得られた測定を比較し、このとき、コントロール組み合わせよりもテスト組み合わせで、前記プローブの蛍光放出の強度がより高い又は低い場合、テストリガンドは標的蛋白に結合するリガンドである工程を含む方法。２．標的蛋白に結合するリガンドが識別されるまで、複数の前記テストリガンドについて工程（ｂ）−（ｆ）を繰り返すことをさらに含む請求項１記載の方法。３．前記蛍光プローブが重畳、展開又は溶融小球状態の蛋白と優先的に結合する請求項１記載の方法。４．前記プローブが、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）、ビス−１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ビス−ＡＮＳ）及び６−プロピオニル−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−アミノナフタレン（プロダン）からなる群より選択される請求項３記載の方法。５．前記蛍光プローブがビス−ＡＮＳである請求項４記載の方法。６．前記処理が、前記テスト及びコントロール組み合わせが曝される温度を上昇させること、前記テスト及びコントロール組合せを蛋白変性剤と接触させること、又はこれらの組み合わせを含む請求項１記載の方法。７．前記標的蛋白が、前記蛋白の野生型のものに比べて安定化又は不安定化した変異体を含む請求項１記載の方法。８．前記テストリガンドが、金属、ペプチド、蛋白、脂質、多糖類、核酸、小型有機分子、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１記載の方法。