JP2002535989A - カンジダ・アルビカンスｓｒｂ‐７ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の一部を形成するＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７（ＣａＳＲＢ−７）をコードする核酸の単離、およびその使用に基づいている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、真菌における活性化された転写に必要とされるタンパク質、これら
のタンパク質をコードする核酸、およびこれらのタンパク質を使用する方法に関
する。

【０００２】 発明の背景 ほとんどの真菌は日和見真菌であり、易感染性個体でしか重篤な疾患を引き起
こさない。人口の高齢化と、免疫無防備状態の患者（例えば、後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）患者、ガン化学療法または免疫抑制療法（例えば、副腎皮質ホ
ルモンを用いた治療）を受けている患者、および臓器移植を受けている患者）の
数の増加の結果として、真菌感染症が急速に増加している。

【０００３】 ほとんどの感染症は、皮膚、粘膜、または呼吸上皮いずれかのコロニー化によ
り始まる。一次表面バリアーの通過は、上皮における機械的破壊により達成され
る。ほとんどの真菌は好中球により容易に死滅されるが、種のなかには、食細胞
による殺作用に耐性があり、易感染性個体の外に健康な個体に感染できるものも
ある。

【０００４】 真菌は、多くの異なる組織に寄生する。表在性真菌は、皮膚の無痛性病変を引
き起こす。皮下病原菌は、皮膚を通過して感染症を引き起こし、皮下経路または
リンパ経路により広まる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの日和見真菌は自然環境
に広く蔓延し、常在細菌叢に存在する。真菌は、主として免疫無防備状態の個体
において疾患を引き起こす。全身性真菌は最も毒性があり、免疫無防備状態の個
体の外に健康な個体において、深部内臓感染症につながる進行性疾患を引き起こ
す可能性がある（例えば、Ｓｈｅｒｒｉｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第３版，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｊ．Ｒｙａｎ編，Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａ
ｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４を参照のこと）。

【０００５】 北米で主要な真菌病原菌は、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ
、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅ
ｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ
ａｎｄｉｄａ種（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓなどがあるが、これに限定
されない）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種である（Ｍｅｄｉｃａｌｌｙ Ｉ
ｍｐｏｒｔａｎｔ Ｆｕｎｇｉ，第２版，Ｄａｖｉｓｅ Ｈ．Ｌａｒｏｎｅ編，
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、カンジタ病の最も多
い原因である。症状は、身体のあらゆる部分に関与する急性感染症から慢性感染
症までの多岐に及ぶ。

【０００６】 真菌は、微生物のなかの別個の種類であり、この大部分は独立生活をしている
。真菌は、核膜、ミトコンドリア、および小胞体を含む真核生物である。この細
胞構造として、マンナン、グルカン、およびキチンからなる堅い細胞壁と、大き
な割合のエルゴステロールを含む細胞膜が挙げられる。真菌の大きさおよび形態
は様々である。Ｃａｎｄｉｄａ属は単一形酵母であり、酵母様生物としてＣａｎ
ｄｉｄａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属が挙げられる。

【０００７】 ほんの一握りの薬剤が真菌に対して活性である。これらの真菌のいずれかによ
り引き起こされる生命を脅かす疾患に対して、アンホテリシンＢが第一選択の薬
剤である。しかしながら、この薬物は、非常に多くの重篤な副作用（例えば、発
熱、呼吸困難、および頻脈）と関連し、腎毒性のために患者の一生涯にわたる投
薬量は制限されている。同時によく用いられる薬剤は、ヌクレオシド類似体であ
るフルシトシンである。フルシトシンは、急速に耐性が現れるために他の薬剤と
独立して使用することができない。フルシトシンによる治療の不都合な効果とし
て、白血球減少、血小板減少、発疹、悪心、嘔吐、下痢、および重篤な全腸炎が
挙げられる。

【０００８】 患者の生命が脅かされていない状態では、ケトコナゾールを、ブラストミセス
症、ヒストプラスマ症、またはコクシジオイデス症の長期治療として使用するこ
とができる。フルコナゾールもまた、表在性真菌感染症の治療において重要な役
割を有する。両化合物は、同じ種類であるトリアゾールに由来し、細胞増殖を抑
制する。耐性および肝毒性の出現が、フルコナゾールおよびケトコナゾールなど
のトリアゾールの使用を制限する。最も新しいトリアゾールであるイトラコナゾ
ールは、フルコナゾールに似た薬物動力学および活性スペクトルを有する。アゾ
ールのいずれも、生命を脅かす真菌感染症または深部真菌感染症に用いることが
できない。これらは、真菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属）のコロニー化の低減と
表在性真菌症の治療に有効なだけである。

【０００９】 全ての主要な抗真菌薬が、細胞壁成分であるエルゴステロールを直接的または
間接的に攻撃する。アンホテリシンＢおよび他のポリエンマクロライドは細胞膜
中のエルゴステロールと反応し、膜透過性を増大させる孔またはチャンネルを形
成する。変異株におけるアンホテリシンＢ耐性は、細胞膜中のエルゴステロール
濃度の減少に付随する。イミダゾールおよびトリアゾールは、ミクロソームシト
クロムＰ₄₅₀依存性酵素系であるステロール１４−α−デメチラーゼを阻害する
。従って、イミダゾールおよびトリアゾールは、細胞膜用のエルゴステロールの
生合成を低下させ、ある特定の膜結合酵素系を損なう１４−α−メチルステロー
ルを蓄積する（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，
Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照のこと）。

【００１０】 真菌感染症の治療に有効な方法および組成物の開発は、製薬産業の重要な目標
である。真菌に特異的な薬物を同定するために、製薬産業はかなりの努力をして
きたが、現在まで限定的にしか成功していない。エルゴステロール以外の真菌標
的をブロックする新たなクラスの抗真菌薬を同定することは非常に重要なことで
あろう。この標的は真菌特異的であるべきであり、現在の治療に対して耐性のあ
る生物に有効な薬物の開発につながらなければならない。

【００１１】 薬物開発は、多くの場合、特定のリード化合物阻害剤を発見する前に、多数の
阻害剤となりうるものをスクリーニングすることに頼る。このようなスクリーニ
ングのために開発されたアッセイは複雑であり、標的タンパク質の生理学的活性
を模倣しなければならない。従って、標的にされたプロセスに関与するタンパク
質を明確にし、アッセイの必要な成分を精製する手段を発見していることが、こ
れらのスクリーニングの開発には重要である。さらに、これらの真菌特異的成分
の産生を容易にするために、アッセイのタンパク質成分のクローンを有している
ことは有用である。

【００１２】 従って、当該分野には、薬物介入に有用な標的、ならびに有用な抗真菌薬を識
別し、真菌感染症を治療するための方法および組成物に有用な標的として役立つ
可能性のある１または複数の真菌成分（好ましくは、ポリペプチド）を識別する
必要がある。

【００１３】 本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおける転写装置の成分に関する。ＲＮＡポ
リメラーゼＩＩホロ酵素は、（ｉ）転写段階のいくつかまたは全てに必要とされ
るが、個々のプロモーターには特異的でないＲＮＡポリメラーゼのサブユニット
、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを結合し、全てのプロモーターでの転写開始を調
節する一般転写因子（ＳＲＢと呼ぶ）を含む。さらに、特定のプロモーターにお
ける特定の配列に結合する特異的転写因子が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写活
性をさらに調節する。これらの因子の全てが抗真菌薬の標的となりうるものであ
る。

【００１４】 発明の要約 本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の一部を形成するＣａｎｄ
ｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７（ＣａＳＲＢ−７）をコードする核酸の
単離に基づいている。１つの態様では、本発明は、図２、配列番号１に示す配列
を有する単離された核酸、ならびにその配列保存変異体および機能保存変異体を
提供する。本発明はまた、これらの配列を含むベクターおよび前記ベクターを含
む細胞を提供する。（ｉ）前記細胞を培養することと、（ｉｉ）前記ポリペプチ
ドを培養物から回収することを含む、前記ポリペプチドを産生する方法もまた提
供される。

【００１５】 別の態様では、本発明は、図２、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する単離
されたポリペプチド、およびその機能保存変異体を提供する。

【００１６】 発明の詳細な説明 本明細書で引用された全ての特許出願、特許、および参考文献は、それらの全
体が参照により本明細書中に援用される。

【００１７】 定義 １．本明細書中で使用する「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、プリンお
よびピリミジンを含む任意の長さのポリマー、ポリリボヌクレオチドまたはポリ
デオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボヌクレオチド−ポリデオキシリボ
ヌクレオチドを意味する。これは、一本鎖分子および二本鎖分子、すなわち、Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドならびに塩
基とアミノ酸バックボーンとの結合により形成される「タンパク質核酸」（ＰＮ
Ａ）を含む。これはまた、修飾塩基を含む核酸を含む。

【００１８】 ２．本明細書中で使用する「単離された」核酸またはポリペプチドは、その最
初の環境（例えば、天然に生じる場合、その天然環境）から取り出された核酸ま
たはポリペプチドを意味する。単離された核酸またはポリペプチドは、最初に結
合していた細胞成分の約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは
約９０％未満を含む。

【００１９】 ３．指定された配列に「由来する」核酸配列またはポリペプチド配列は、その
指定された配列のある領域に対応する配列を意味する。核酸配列について、これ
は、配列に相同または相補的な配列、ならびに「配列保存変異体」および「機能
保存変異体」を含む。ポリペプチド配列について、これは「機能保存変異体」を
含む。配列保存変異体は、あるコドン位置の１または複数のヌクレオチドが変化
しても、その位置でコードされるアミノ酸が変化しない変異体である。機能保存
変異体は、ポリペプチドのあるアミノ酸残基が変化しているが、未変性ポリペプ
チドと、全体のコンホメーション及び機能が変化していない変異体（類似した物
理化学的特性（例えば、酸性、塩基性、疎水性など）を有するアミノ酸による、
あるアミノ酸の置換を含むが、これに限定されない）である。「機能保存」変異
体はまた、指定されたポリペプチドに特異的な抗体を誘発する能力を有する任意
のポリペプチドを含む。

【００２０】 ４．定義されたストリンジェンシー条件下で、核酸の少なくとも１本の鎖が別
の核酸鎖とアニールすることができる場合、核酸は互いに「ハイブリダイズ」す
ることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ａ
）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を行う温度、及びｂ）ハイブリダ
イゼーション溶液および洗浄溶液のイオン強度および極性（例えば、ホルムアミ
ド）、ならびに他のパラメーターによって決定される。ハイブリダイゼーション
は、２つの核酸が実質的に相補的な配列を含むことを必要とする。しかしながら
、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、ミスマッチを許容す
ることができる。核酸をハイブリダイズするのに適したストリンジェンシーは、
当該分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度によって決まる。

【００２１】 一般に、本発明の実施において用いられる核酸操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｒｅｎｔ，Ｋｉｎｇ
ｓｔｏｎ，Ｍｏｒｅ，Ｆｅｉｄｍａｎ，ＳｍｉｔｈおよびＳｔｕｈｌ編，Ｇｒｅ
ｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ
Ｙ，ＮＹ，１９９７）に開示される通りの、当該分野で周知の方法を用いる。

【００２２】 本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（ＣａＳＲＢ−７）に由来する
ＳＲＢ−７をコードするＤＮＡの単離に基づいている。ＣａＳＲＢ−７は、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の一成分であり、この酵素の転写活性を制御する。
ＣａＳＲＢ−７の発見および特徴付けと、真菌バージョンと哺乳動物バージョン
との差異の解明から、このタンパク質は、真菌感染症治療の新たな方法および組
成物の開発に重要な標的であることが分かった。以下の実施例１に示すように、
欠失分析により、ＳＲＢ−７が細胞生存能力に必須であることが証明された。従
って、ＣａＳＲＢ−７活性を選択的に妨げる薬剤は、抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ治
療薬の候補である可能性がある。本発明はまた、ＣａＳＲＢ−７活性を選択的に
妨げる化合物を識別する方法を含み、従って、有用な抗真菌薬を含み得る。

【００２３】 ＣａＳＲＢ−７をコードする遺伝子を、以下のとおりに単離した（以下の実施
例１を参照のこと）。簡単にいうと、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するゲノムラ
イブラリーを用いて、機能的ＳＲＢ−７遺伝子を欠くＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
株を形質転換した。ＳＲＢ−７欠損表現型を補うことができるＣ．ａｌｂｉｃａ
ｎｓ由来ＤＮＡフラグメントを同定および単離した。この手順で同定されたＤＮ
Ａのヌクレオチド配列決定（図２）は、１７８アミノ酸のタンパク質をコードす
る５３４ｂｐのオープンリーディングフレームを明らかにした。このタンパク質
は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒトに由来するＳＲＢ−７ポリペプチドと
顕著な相同性を示す。しかしながら、特に、この推論されたＣａＳＲＢ−７アミ
ノ酸配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒトとはかなり異なる。Ｃ．ａｌ
ｂｉｃａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、完全長タンパク質に関して４
５％同一であるが、一方、この２つの真菌種は、ヒトＳＲＢ−７と約２５％の配
列相同性を示す。

【００２４】 本発明は、ＣａＳＲＢ−７をコードする単離された核酸（例えば、図２に示す
核酸配列）を提供する。本発明はまた、それに由来する、酵素的に活性なフラグ
メントをコードする単離された核酸および関連配列を含む。本明細書中で用いる
、ある配列に「由来する」核酸は、その配列のある領域に対応する核酸配列、そ
の配列に相同または相補的な配列、配列保存変異体、および機能保存変異体を意
味する。ＣａＳＲＢ−７の重要な領域は、その遺伝子をクローニングするために
用いられた技術（すなわち、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける機能相補）を使
用することにより同定することができる。点変異および点欠失を、当業者に周知
の技術を用いてＣａＳＲＢ−７遺伝子に作成することができ、例えば、下記の実
施例１に記載のプラスミドシャッフル（ｐｌａｓｍｉｄ ｓｈｕｆｆｌｅ）技術
を用いて、これらの変異遺伝子が機能的にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＲＢ−
７の代わりとなるかどうかを決定することができる。

【００２５】 本発明はまた、前記ＣａＳＲＢ−７配列にハイブリダイズすることができる核
酸または前記ＣａＳＲＢ−７配列に由来する核酸を含む。１つの実施態様では、
本発明は、以下で定義されるハイブリダイゼーション条件下でＣａＳＲＢ−７配
列またはその相補物とハイブリダイズすることができる単離された核酸に関する
。

【００２６】 −以下の組成：４×ＳＳＣ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ
は、１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドン、１％ＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）である。１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウムからなり、ｐＨ７）を有する溶液を用いた、ＣａＳＲＢ−７をコ
ードする核酸とハイブリダイズすることができる核酸が結合している支持体（ニ
トロセルロースフィルターまたはナイロン膜）の６５℃６時間のプレハイブリダ
イゼーション処理。

【００２７】 −以下の組成：４×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、２５ｍＭ ＮａＰＯ₄、
ｐＨ７、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの超音波処理サ
ケ精子ＤＮＡ（プローブ、特に、放射性プローブとしてＣａＳＲＢ−７配列に由
来する核酸を含み、１００℃３分の処理により予め変性されている）を有する緩
衝液による、支持体と接触しているプレハイブリダイゼーション溶液の交換。

【００２８】 −６５℃１２時間のインキュベーション。

【００２９】 −以下の溶液：（ｉ）６５℃４５分の２×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０
．５％ＳＤＳによる４回の洗浄、（ｉｉ）６５℃４５分の０．２×ＳＳＣ、０．
１×ＳＳＣによる２回の洗浄、および（ｉｉｉ）６５℃４５分の０．１×ＳＳＣ
、０．１％ＳＤＳによる、連続洗浄。

【００３０】 本発明はまた、前記の条件下で（しかし４０℃では、４５℃１５分の２×ＳＳ
Ｃによる連続洗浄を含む）、前記ＣａＳＲＢ−７をコードするＤＮＡと特異的に
ハイブリダイズする性質を示す任意の核酸を含む。

【００３１】 前記で定義されたハイブリダイゼーション条件は好ましいハイブリダイゼーシ
ョン条件を構成するが、決して制限するものでなく、前記のプローブおよび核酸
の認識およびハイブリダイゼーションの特性に決して影響を及ぼすことなく変更
することができることが理解されよう。

【００３２】 ハイブリダイゼーションおよび膜洗浄の間の塩条件および温度は、ハイブリダ
イゼーションの検出に影響を及ぼすことなく、より大きなまたは小さなストリン
ジェンシーという意味で変更することができる。例えば、ハイブリダイゼーショ
ン間の温度を下げるために、ホルムアミドを添加することができる。

【００３３】 本発明はまた、ＣａＳＲＢ−７をコードする配列を含むベクター、前記ベクタ
ーを含む細胞、および前記細胞を培養することを含むＣａＳＲＢ−７を産生する
方法を含む。

【００３４】 様々な真核生物宿主および原核生物宿主における発現用のプラスミドおよび真
菌ベクターを含む多数のベクターが述べられている。便利なことに、ベクターは
また、ＣａＳＲＢ−７コード部分に操作可能に連結されるプロモーターを含んで
もよい。コードされているＣａＳＲＢ−７を、本明細書中に開示または引用され
た方法、あるいは他に関連分野の当業者に周知の方法を用いて、任意の適切なベ
クターおよび宿主細胞を用いることにより発現することができる。ベクター／宿
主を個々に選択することは、本発明に重要ではない。

【００３５】 ベクターは、しばしば、クローニングまたは発現のための１または複数の複製
系、宿主における選択のための１または複数のマーカー、例えば、抗生物質耐性
、および１または複数の発現カセットを含む。挿入されるＣａＳＲＢ−７コード
配列は、合成してもよいし、天然供給源から単離してもよいし、ハイブリッドと
して調製などしてもよい。周知の方法により、コード配列を転写調節配列にライ
ゲーションすることができる。適切な宿主細胞を、エレクトロポレーション、Ｃ
ａＣｌ₂により媒介されるＤＮＡ取り込み、真菌感染、マイクロインジェクショ
ン、マイクロプロジェクタイル、または他の確立した方法を含む任意の適切な方
法により形質転換／トランスフェクト／感染することができる。

【００３６】 適切な宿主細胞として、細菌、古細菌、真菌特に、酵母、ならびに植物細胞お
よび動物細胞特に哺乳動物細胞、が挙げられた。特に関心が持たれるのは、Ｅ．
ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳＦ９細胞、Ｃ
１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、
ＨｅＬａ細胞、不死化された哺乳動物骨髄細胞株およびリンパ細胞株である。好
ましい複製系として、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、λ、
アデノウイルスなどが挙げられる。多数の転写開始調節領域および転写終結調節
領域が単離され、様々な宿主における異種タンパク質の転写および翻訳に効果的
であることが示されている。これらの領域、単離方法、操作方法などの例は当該
分野で周知である。適切な発現条件下で、宿主細胞を、組換えにより産生される
ＣａＳＲＢ−７の供給源として使用することができる。

【００３７】 野生型または変異体ＣａＳＲＢ−７ポリペプチドをコードする核酸はまた、組
換え事象により細胞に導入することもできる。例えば、このような配列を細胞に
導入し、それにより、内因遺伝子またはこの遺伝子と実質的同一性を有する配列
の部位で相同組換えをもたらすことができる。他の組換えに基づく方法、例えば
、非相同組換え、または相同組換えによる内因遺伝子の欠失も使用してよい。

【００３８】 本発明はまた、単離および精製されたＣａＳＲＢ−７ポリペプチド、例えば、
図２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにこのポリペプチドの機
能保存変異体（前記のように転写調節活性を保持するフラグメントを含む）を含
む。

【００３９】 機能保存変異体を含む、本発明によるＣａＳＲＢ−７由来ポリペプチドは、野
生型または変異体Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞から、あるいはＣａＳＲＢ−７由来
タンパク質をコードする配列が導入および発現されている異種生物または細胞（
細菌、真菌、昆虫、植物、哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない
）から単離することができる。さらに、前記ポリペプチドは、組換え融合タンパ
ク質の一部でもよい。あるいは、排他的固相合成、部分的固相合成、フラグメン
ト縮合、または古典的溶液合成を含むがこれらに限定されない市販の自動化手順
により、ポリペプチドを化学合成してもよい。

【００４０】 「精製された」ＣａＳＲＢ−７ポリペプチドを、従来技術を用いることにより
得ることができる。調製ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆
相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラ
フィー、ならびに向流分配を含むがこれらに限定されないポリペプチド精製法は
、当該分野で周知である。目的によっては、組換え系においてポリペプチドを産
生することが好ましい。ここで、タンパク質は、精製を容易にする付加配列タグ
（例えば、ポリヒスチジン配列であるが、これに限定されない）を含んでいる。
次いで、ポリペプチドを、適切な固相マトリクスでのクロマトグラフィーにより
宿主細胞の粗溶解物から精製することができる。あるいは、ＣａＳＲＢ−７また
はそれに由来するペプチドに対して産生された抗体を、精製試薬として使用する
ことができる。他の精製法が可能である。

【００４１】 単離されたポリペプチドを、例えば、リン酸化、硫酸化、アシル化、または他
のタンパク質修飾により修飾することができる。単離されたポリペプチドを、検
出可能なシグナルを生じることができる標識（放射性同位体および蛍光化合物が
挙げられるが、これらに限定されない）で直接的または間接的に修飾してもよい
。

【００４２】 本発明は、ＣａＳＲＢ−７または前記の通り同定されるフラグメントに特異的
な抗体を含む。本明細書において、ＣａＳＲＢ−７に「特異的な」抗体としては
、ＣａＳＲＢ−７を他の核タンパク質と区別する抗体、ＣａＳＲＢ−７を異なる
種と区別する抗体、関連ドメインまたは他の機能ドメインを同定する抗体などが
挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、ポリクローナルでもモノクロー
ナルでもよい。抗体を、ＣａＳＲＢ−７またはそれに由来するフラグメントによ
る免疫化により動物宿主において誘発してもよいし、免疫細胞のｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ免疫化により形成してもよい。抗体を誘発するのに用いる免疫原を、Ｃ．ａｌ
ｂｉｃａｎｓ細胞から単離してもよいし、組換え系において産生してもよい。抗
体をまた、適切な抗体をコードするＤＮＡが組み込まれた組換え系において産生
してもよい。あるいは、抗体を、精製された重鎖および軽鎖の生化学的再構築に
より構築してもよい。抗体としては、ハイブリッド抗体（すなわち、２組の重鎖
／軽鎖の組み合わせを含む。重鎖／軽鎖の組み合わせのそれぞれが異なる抗原を
認識する）、キメラ抗体（すなわち、重鎖、軽鎖、またはその両方のいずれかが
融合タンパク質である）、および１価抗体（すなわち、第２の重鎖の定常領域に
結合した重鎖／軽鎖複合体からなる）が挙げられる。抗体のＦａｂ’およびＦ（
ａｂ）₂フラグメントを含むＦａｂフラグメントもまた含まれる。

【００４３】 前記タイプの抗体および誘導体の全てを産生する方法は当該分野で周知であり
、以下でさらに詳細に議論される。例えば、ポリクローナル抗血清を産生および
処理する技術は、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）に開示さ
れている。このような抗体は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に開示される方法および組成物、
ならびに当業者に知られた免疫学的技術およびハイブリドーマ技術を用いて都合
よく作成される。天然または合成のＣａＳＲＢ−７由来ペプチドを用いて、Ｃａ
ＳＲＢ−７特異的免疫反応を誘導する場合、このペプチドを、ＫＬＨなどの適切
な担体に都合よく結合し、フロイントなどの適切なアジュバントに溶解して投与
してもよい。実質的にＴａｍ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８５：５４０９，１９８８）の方法に従って、選択されたペプチドをリジンコ
ア担体に結合することが好ましい。

【００４４】 １つの実施態様では、当該分野で標準的な技術に従って、精製された組換えＣ
ａＳＲＢ−７を用いてマウスを免疫化し、この後、マウスの脾臓を取り出し、脾
臓細胞を用いてミエローマ細胞との細胞ハイブリッドを形成し、抗体分泌細胞の
クローンを得る。結果として生じるモノクローナル抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏア
ッセイ、例えば、ＣａＳＲＢ−７への結合、またはＣａＳＲＢ−７のＲＮＡホロ
酵素ＩＩ型への結合の阻害について前記に記載されたアッセイを用いてスクリー
ニングする。

【００４５】 イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡなどがあるが、これに限定されない）を用いてＣ
ａＳＲＢ−７を定量するために、抗ＣａＳＲＢ−７抗体を用いることができる。
ＣａＳＲＢ−７サブユニット間の複合体または集合されたＲＮＡポリメラーゼＩ
Ｉ複合体と他の転写成分との間の複合体の形成を阻害することにより、あるいは
細胞抽出物またはＣａＳＲＢ−７の転写反応物を免疫枯渇することにより、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩの転写機能をブロックするために、抗ＣａＳＲＢ−７抗体を
用いてもよい。さらに、これらの抗体を用いて、異なる供給源からＣａＳＲＢ−
７を同定、単離、および精製することができ、細胞下および組織化学的局在研究
を行うことができる。

【００４６】 転写を改変する方法 本発明は、ＣａＳＲＢ−７タンパク質またはＣａＳＲＢ−７タンパク質をコー
ドするＤＮＡ／ＲＮＡに結合するか、またはそれらと相互作用する物質により遺
伝子転写を改変する方法を提供する。これらの物質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ
または遺伝子転写に必須の他の転写因子に対するＣａＳＲＢ−７タンパク質の影
響を変える。ＣａＳＲＢ−７タンパク質またはＣａＳＲＢ−７タンパク質をコー
ドするＤＮＡ／ＲＮＡに結合するか、またはそれらと相互作用する物質は、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を妨害または増強することができ、従
って、遺伝子転写を阻害または増強することができる。例えば、ＣａＳＲＢ−７
ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし、それらの転写または翻訳を完全に阻
害または減少するアンチセンスまたはナンセンスヌクレオチド配列は、ホロ酵素
複合体の形成を妨害し、遺伝子転写を阻害することができる。あるいは、ホロ酵
素複合体が形成されても、ＣａＳＲＢ−７タンパク質に結合できるか、またはそ
れと相互作用することができる物質は、転写プロセスにおける複合体の機能を妨
害または増強することができる。これらの物質として、ＣａＳＲＢ−７タンパク
質と反応するか、またはそれに結合する抗体が挙げられる。

【００４７】 ハイスループット薬物スクリーニング 本発明は、真菌遺伝子転写、特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるＣａＳＲＢ
−７依存的様式の遺伝子転写の調節に有用な薬剤を識別することを含む。好まし
い実施態様では、ＣａＳＲＢ−７依存性プロセスを妨げる能力について多数の試
験化合物を調べるために、ハイスループットスクリーニングプロトコールが用い
られる。

【００４８】 試験阻害化合物を、合成化合物または天然化合物の大きなライブラリーからス
クリーニングする。糖類、ペプチド、および核酸に基づく化合物のランダム合成
および制御された合成のために、現在、非常に多くの手段が用いされている。合
成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔ
ｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃ
ｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃ
ｋ，ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）
から市販されている。レアケミカルライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および
動物抽出物の形での天然化合物ライブラリーは、例えば、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）か
ら入手可能であるか、あるいは容易に生産することができる。さらに、天然のお
よび合成により生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的
、および生化学的手段により容易に改変される。

【００４９】 ＣａＳＲＢ−７をコードする核酸を使用するアッセイを用いて、有用な阻害剤
を識別することができる。例として、タンパク質結合アッセイ、核酸結合アッセ
イ、およびゲルシフトアッセイが有用なアプローチである。好ましくは、ＣａＳ
ＲＢ−７のみを用いた、あるいはＣａＳＲＢ−７ならびに他の一般転写因子（例
えば、ＳＲＢ−２、４、５、６、８、９、１０、１１など）の組み合わせまたは
サブコンビネーションを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて、ＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩ複合体またはサブユニット（Ｋｉｍら，１９９４;Ｈｅｎｇａ
ｒｔｎｅｒら，１９９５）を用いてもよい。

【００５０】 例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体またはサブユニットを、当該分野で標
準的な方法を用いてマイクロタイターディッシュ上に固定してもよい。次いで、
このプレートを、候補化合物の非存在下または存在下で放射性標識ＣａＳＲＢ−
７（例えば、³²Ｐ−ＣａＳＲＢ−７）に暴露する。逆に、ＣａＳＲＢ−７を固定
化し、候補化合物の非存在下または存在下で放射性標識ＲＮＡポリメラーゼＩＩ
と共にインキュベートしてもよい。ＣａＳＲＢ−７標的配列を含むオリゴヌクレ
オチドを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと共に用いてもよい。ポジティブな「ヒット
」化合物は、ＣａＳＲＢ−７／ＲＮＡポリメラーゼＩＩ相互作用を阻害する化合
物である。これらの場合、インキュベーション、洗浄、および放射能検出のステ
ップを自動化することができる。これにより、多数の化合物、好ましくは、１週
間あたり少なくとも約１０００個の化合物をスクリーニングすることができる。

【００５１】 ＣａＳＲＢ−７タンパク質を結合するリガンドを識別するために、米国特許第
５，５８５，２７７号および同第５，６７９，５８２号、米国特許出願番号０８
／５４７，８８９（現在、米国特許 号）、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ
９６／１９６９８に記載のハイスループットスクリーニング方法を用いてもよい
。これらの方法によれば、ＣａＳＲＢ−７標的タンパク質の１または複数のリガ
ンドが、標的タンパク質のフォールディングの程度あるいはフォールディングま
たはアンフォールディングの割合に影響を及ぼす能力により識別される。標的タ
ンパク質が（可逆的でも不可逆的でも）アンフォールディングされるように、実
験条件を選択する。これらの条件下で試験リガンドが標的タンパク質に結合する
場合、試験リガンド存在下での、フォールディングされた標的タンパク質：アン
フォールディングされた標的タンパク質の相対量、あるいは標的タンパク質のフ
ォールディングまたはアンフォールディングの速度は、試験リガンドの非存在下
で観察されたものとは異なる、すなわち、試験リガンドの非存在下で観察された
ものより大きい、または小さい。従って、本方法は、（リガンドの非存在下では
）ＣａＳＲＢ−７タンパク質が部分的または完全にアンフォールディングする条
件下で、１または複数のリガンドの存在下または非存在下でＣａＳＲＢ−７をイ
ンキュベートすることを含む。この後に、フォールディングされた標的タンパク
質対アンフォールディングされた標的タンパク質の絶対量または相対量、あるい
は標的タンパク質のフォールディングまたはアンフォールディングの速度を分析
する。

【００５２】 この方法の重要な特徴は、生物学的活性または機能に密接に関与する配列また
はドメインだけでなく、ＣａＳＲＢ−７の任意の配列またはドメインに結合する
任意の化合物を検出することである。結合する配列、領域、またはドメインは、
フォールディングされた状態にある時にＣａＳＲＢ−７の表面上に存在してもよ
く、タンパク質の内部に埋められていてもよい。結合部位のなかには、タンパク
質が部分的または完全にアンフォールディングされた時にだけ、リガンドが結合
できるようになるものもある。

【００５３】 簡単に言うと、この方法を行うためには、１または複数の試験リガンドをＣａ
ＳＲＢ−７と組み合わせ、試験リガンドを結合させるのに適切な条件でかつ十分
な時間で、混合物を維持する。経験に基づいて実験条件を決定する。複数の試験
リガンドを試験する場合、ほとんどのリガンドとＣａＳＲＢ−７タンパク質の相
互作用が完了するまで進行すると期待されるように、インキュベーション条件を
選択する。試験リガンドは、ＣａＳＲＢ−７と比較してモル過剰に存在する。標
的タンパク質は可溶性形態でもよく、あるいは固相マトリクスに結合していても
よい。マトリクスは、ビーズ、膜フィルター、プラスチック表面、または他の適
切な固体支持体を含んでもよいが、それらに限定されない。

【００５４】 好ましい実施態様では、１または複数の試験リガンドのＣａＳＲＢ−７への結
合を、タンパク質分解を用いることにより検出する。このアッセイは、フォール
ディングされたタンパク質と比較して、アンフォールディングされた変性ポリペ
プチドのプロテアーゼ消化に対する感受性が増加することに基づいている。この
場合、試験リガンド−ＣａＳＲＢ−７タンパク質の組み合わせと、試験リガンド
を欠く対照組み合わせを、アンフォールディングされた標的タンパク質に選択的
に作用する１または複数のプロテアーゼで処理する。適切な期間のインキュベー
ションの後、未変性、すなわち、タンパク質分解されていない標的タンパク質の
レベルを、下記の例えばゲル電気泳動および／またはイムノアッセイの方法の１
つを用いて評価する。

【００５５】 試験リガンドが標的タンパク質を結合したことを示す２つの可能な結果がある
。リガンドの存在下では、リガンドの非存在下より１）有意に多い、または２）
有意に少ない未変性タンパク質または分解タンパク質の絶対量を観察することが
できる。

【００５６】 本発明の実施に有用なプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、
Ｖ８プロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ
、サーモリシン、パパイン、およびズブチリシンが挙げられるが、これらに限定
されない（これらの全てが、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）。本発明の実施において使用するための１
または複数のプロテアーゼの選択に最も重要な基準は、この１または複数のプロ
テアーゼが、選択したインキュベーション条件下でＣａＳＲＢ−７タンパク質を
消化できなければならないことと、この活性が、ＣａＳＲＢ−７タンパク質のア
ンフォールディング形態に選択的に向けられることである。プロテアーゼを直接
阻害する試験リガンドにより引き起こされる「偽陽性」結果を避けるために、１
を超えるプロテアーゼ、特に、異なる酵素作用機構を有する複数のプロテアーゼ
を、同時に、または並列アッセイにおいて用いることができる。さらに、補因子
を隔離する可能性のある試験リガンドによる偽陽性結果を避けるために、１また
は複数のプロテアーゼの活性に必要とされる補因子を過剰に供給する。

【００５７】 この方法の代表的な実施態様では、最初に、精製されたＣａＳＲＢ−７タンパ
ク質を、１〜１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．５、１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、およ
び１．０ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液に溶解する。次いで、例えば、プロテイナー
ゼＫまたはサーモリシン（異なる作用機構を有するプロテアーゼ）などのプロテ
アーゼを、０．２〜１０．０μｇ／ｍｌの最終濃度まで個々に添加する。４℃、
１５℃、２５℃、および３５℃で、５分〜１時間の異なる期間（好ましくは３０
分間）、並列インキュベーションを行う。適切なプロテアーゼ阻害剤を添加する
ことにより、例えば、（セリンプロテアーゼについては）塩化フェニルメチルス
ルホニル（ＰＭＳＦ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することにより、（メタロプ
ロテアーゼについては）エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）を２０ｍＭの最終
濃度まで添加することにより、または（システインプロテアーゼについては）ヨ
ードアセトアミドを添加することにより、反応を終結させる。次いで、インキュ
ベーション期間の終わりに反応混合物に残っている未変性タンパク質の量を、任
意の方法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、またはニトロセルロ
ースフィルターへの結合が挙げられるが、これらに限定されない）により評価す
ることができる。適切な条件を確立するために、さらに狭い範囲の温度を用いた
追加実験を行うことができることが理解されよう。このプロトコールを用いると
、３０分のインキュベーション期間内に標的タンパク質の約７０％を消化する（
有意な程度のアンフォールディングが起こったことを示す）、適切な条件（例え
ば、プロテアーゼ濃度および消化温度）を選択することができる。

【００５８】 別の実施態様では、試験リガンドの存在下および非存在下での、フォールディ
ングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質とアンフォールディングされたＣａＳＲＢ
−７タンパク質の相対量を、適切な表面に結合するタンパク質の相対量を測定す
ることにより評価する。この方法は、表面積の増加によるアンフォールディング
されたタンパク質の表面接着性の増加傾向と、アンフォールディングから生じる
疎水性残基のマスキングの減少とを利用している。試験リガンドがＣａＳＲＢ−
７を結合する（すなわちリガンドである）場合、標的タンパク質のフォールディ
ング形態を安定化し、固体表面への結合を減少させる可能性がある。あるいは、
リガンドは、タンパク質のアンフォールディング形態を安定化し、固体表面への
結合を増加させる可能性がある。

【００５９】 この目的に適した表面として、様々な処理または未処理プラスチックから作成
されたマイクロタイタープレート、組織培養用または高タンパク質結合用に処理
されたプレート、ニトロセルロースフィルターおよびＰＶＤＦフィルターが挙げ
られるが、これらに限定されない。

【００６０】 別の実施態様では、フォールディングされた標的タンパク質とアンフォールデ
ィングされた標的タンパク質が試験組み合わせに存在する程度を、アンフォール
ディング状態またはフォールディング状態の標的タンパク質に特異的な抗体（す
なわち、それぞれ、変性特異的（ＤＳ）抗体または未変性特異的（ＮＳ）抗体）
を用いることにより評価する（Ｂｒｅｙｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６４:（５）１３３４８−１３３５４）。ポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体を前記のように調製する。結果として生じる抗体を、変性状態
にあるＣａＳＲＢ−７タンパク質への選択的な結合についてスクリーニングする
。これらの抗体を用いて、これらの相互作用の阻害剤をスクリーニングする。

【００６１】 別の実施態様では、分子シャペロンを用いて、試験組み合わせにおけるフォー
ルディングされたタンパク質とアンフォールディングされたタンパク質の相対レ
ベルを評価する。シャペロンは、その正常な生理学的機能の一部として、アンフ
ォールディングされたタンパク質を結合する既知のタンパク質を含む。この実施
態様では、試験リガンドとＣａＳＲＢ−７を含む試験組み合わせを、ＣａＳＲＢ
−７とそのリガンドとの結合と、分子シャペロンとアンフォールディングされた
標的タンパク質との結合に適した条件下で、分子シャペロンでコートされた固体
支持体（例えば、マイクロタイタープレートまたは他の適切な表面）に暴露する
。リガンドで安定化されたフォールディングされた標的タンパク質と比較して、
溶液中のアンフォールディングされた標的タンパク質は、分子シャペロンで覆わ
れた表面に結合する傾向がより大きい。従って、結合していない標的タンパク質
の量、すなわちシャペロンでコートされた表面に結合した量を決定することによ
り、標的タンパク質を結合する試験リガンドの能力を決定することができる。あ
るいは、分子シャペロンへの結合についての競合アッセイを利用することができ
る。

【００６２】 前記のようにハイスループットスクリーニングの条件が確立したら、このプロ
トコールを、２０〜２００μＭの濃度の多数の試験リガンドを用いて同時に繰り
返す。標的タンパク質の消化程度の少なくとも２倍の増加または１／２の減少を
観察することが、「ヒット」化合物、すなわち、標的タンパク質を結合するリガ
ンドを意味している。好ましい条件は、この手順を用いて試験リガンドの０．１
％〜１％が「ヒット」化合物として識別される条件である。

【００６３】 さらに別の実施態様では、前記の試験組み合わせと対照組み合わせを、コンホ
メーション感受性蛍光プローブ、すなわち、フォールディングされた状態、アン
フォールディングされた状態、またはモルテングロビュール状態のＣａＳＲＢ−
７に選択的に結合するプローブ、あるいは蛍光特性がＣａＳＲＢ−７タンパク質
のフォールディング状態により何かの方法で影響されるプローブと接触させるこ
とができる。

【００６４】 特定の試験化合物が前記の通り識別されたら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写アッセイ
を用いて、試験化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応物に添加し、ＣａＳＲＢ−７
により媒介される活性化転写に対するその影響を測定することにより、その活性
を確認する。例えば、目的のＤＮＡ（すなわち、転写しようとするＤＮＡ）を、
（ｉ）精製されたＤＮＡポリメラーゼＩＩ、（ｉｉ）ＳＲＢタンパク質、（ｉｉ
ｉ）転写因子ｂ，ｅ，ｇ，またはａ（ＫｏｌｅｓｋｅおよびＹｏｕｎｇ，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３６８:４６６−４６９，１９９４）、（ｉｖ）ＣａＳＲＢ−７、（ｖ
）試験しようとする物質と混合することができる。混合物を、転写が起こるのに
十分な条件下で維持する。結果として生じる組み合わせを試験混合物と呼ぶ。産
生されるｍＲＮＡの量を決定することにより、ＤＮＡ転写を評価することができ
る。試験物質の存在下での転写を測定し、同一条件下で起こる試験物質の非存在
下（例えば、対照混合物）でのＤＮＡ転写と比較する。試験混合物における（す
なわち、評価する物質の存在下での）転写が、対照混合物より少ない程度で起こ
った場合、その物質は、転写を阻害する様式で、１または複数のＳＲＢタンパク
質、好ましくはＣａＳＲＢ−７と相互作用している。試験混合物における転写が
、対照混合物より大きな程度で起こった場合、その物質は、転写を刺激する様式
で、１または複数のＳＲＢタンパク質、好ましくはＣａＳＲＢ−７と相互作用し
ている。

【００６５】 ＣａＳＲＢ−７タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写またはｍＲＮＡ配列
の翻訳を阻害するか、または減少させて、ＣａＳＲＢ−７の産生を減少させるか
、ＣａＳＲＢ−７を完全に無くすこともできる。ＣａＳＲＢ−７遺伝子の転写を
阻害するか、ＣａＳＲＢ−７遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する
有効量の物質を細胞に導入することにより、遺伝子転写を改変することができる
。例えば、ＣａＳＲＢ−７タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズし、
その遺伝子の転写を阻害するアンチセンスヌクレオチド配列を、細胞に導入する
ことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏ
ｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ，１９９７を参照の
こと）。あるいは、ＣａＳＲＢ−７タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を妨
げるアンチセンス配列を細胞に導入することができる。

【００６６】 さらに、前記のように識別された試験化合物を、２つの性質：１）真菌増殖を
阻害する能力と；２）哺乳動物転写に影響を及ぼさないことについて試験する。
真菌増殖を、当該分野で周知の任意の方法（例えば、液体培養物の光学密度また
は寒天上でのコロニー形成）により測定する。Ｃｈａｏら，１９９６と同様に、
酵母成分を類似するヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系に置き換えることにより、試験
化合物が哺乳動物ＳＲＢ−７−ＲＮＡポリメラーゼＩＩ相互作用に影響を及ぼさ
ないことを試験する。

【００６７】 試験化合物の識別に有用な、さらなる転写アッセイがＰＣＴ公報番号ＷＯ９７
／０９３０１に開示されている。

【００６８】 以下の実施例は、本発明の非限定例示として意図される。

【００６９】 実施例１:Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７をコードするＤＮＡ
の単離および配列決定 ＳＲＢ−７をコードするＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＤＮＡを同定するた
めに、以下の実験を行った。

【００７０】 ＤＮＡ法および遺伝子操作 酵母株、プラスミド、およびオリゴヌクレオチドを、それぞれ表１、２、およ
び３に列挙する。全てのＤＮＡ操作を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従っ
て行った。酵母培地を、記載（ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ，１９９１）のよ
うに調製した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換
を、酢酸リチウム法を用いて行った（ＳｃｈｉｅｓｔｌおよびＧｉｅｔｚ，１９
８９）。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの形質転換を、記載（Ｅｌｂｌｅ，
１９９２）の通りに行った。プラスミドシャッフル技術を、記載（Ｂｏｅｋｅら
，１９８７）の通りに、ＵＲＡ３プラスミドに対する選択剤として５−フルオロ
−オロチン酸（５−ＦＯＡ）を用いて行った。

【００７１】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムライブラリーをＳＣ５３１４株から調製した（Ｆ
ｏｎｚｉおよびＩｒｗｉｎ，１９９３）。Ｐｈｉｌｌｉｐｐｓｅｎら（１９９１
）に記載のように、ゲノムＤＮＡを単離し、部分的にＳａｕ３Ａで消化し、０．
７％アガロースゲルで分離し、４〜８ｋｂフラグメントをＧｅｎｅＣｌｅａｎ（
ＢＩＯ１０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）により精製し、末端を、Ｋｌｅｎｏｗ
を用いてｄ（ＡＧ）ＴＰで部分的にフィルインした。ＬＥＵ２ ２μプラスミド
（ｐＣＴ５３８）をＸｈｏＩで消化し、その末端をＳａｕ３Ａ消化ゲノムＤＮＡ
の末端と適合するように、ｄ（ＣＴ）ＴＰで部分的にフィルインした。ライゲー
ション後、ＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を
エレクトロポレーションにより形質転換した。９０％の挿入効率および５ｋｂの
平均挿入物サイズで、約２５，０００個の個々のクローンを得た。

【００７２】 ＤＮＡ配列決定反応を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびサーモサイクラー
を用いて行い、ＡＢＩシークエンシングゲルにおいて行った。配列アラインメン
トを、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ
ソフトウェアパッケージを用いて行った。

【００７３】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７のクローニングおよび配列分析 完全長Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７ホモログを、プラスミ
ドシャッフル技術を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＲＢ−７欠失変異体
（Ｚ７０４）の機能相補により単離した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＬＥＵ２
２マイクロンプラスミド（ｐＣＴ５３８）中に構築されたＣ．ａｌｂｉｃａｎ
ｓ ＳＣ５３１４ゲノムＤＮＡライブラリーを用いて、Ｚ７０４（Ｃｈａｏら，
１９９６）細胞を形質転換した。ＳｃＳＲＢ−７ ＵＲＡ３プラスミドの損失を
可能にするように、ロイシンを欠く液体培地中で形質転換細胞を１２時間培養し
、次いで、ロイシンを欠き、５−ＦＯＡを含む寒天培地上に置いた。重複する制
限酵素フラグメントを有する１０個のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムクローンを、
５−ＦＯＡの存在下で増殖することができるＬｅｕ＋形質転換体から単離した。
最も小さなゲノムＤＮＡ挿入物を有するクローン（ｐＣＴ５６８）を、さらなる
分析のために選択した。

【００７４】 ｐＣＴ５６８が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＲＢ−７の代わりとなること
を確認するために、Ｚ７０４を、ぞれぞれ、ｐＣＴ５３８（ベクターのみ）、ｐ
ＣＨ５０（ＳｃＳＲＢ−７）、およびｐＣＴ５６８（ＣａＳＲＢ−７）を用いて
形質転換した。細胞をロイシンを欠く寒天培地上に置き、５−ＦＯＡの非存在下
（図１Ａ）または存在下（図１Ｂ）での形質転換ＬＥＵ２標識プラスミドについ
て選択した。３つ全ての細胞型は、５−ＦＯＡの非存在下で等しく良好に増殖し
た。５−ＦＯＡの存在によりＵＲＡ３ ＳｃＳＲＢ−７を含むプラスミドを選択
した場合、ＬＥＵ２プラスミド上のＳｃＳＲＢ−７またはＣａＳＲＢ−７により
形質転換された細胞は等しく良好に増殖したが、ベクターのみで形質転換された
細胞は増殖しなかった。この実験により、ｐＣＴ５６８は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＳＲＢ−７欠失を相補するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子を含むことが確
認された。

【００７５】 ｐＣＴ５６８の４．３ｋｂゲノム挿入物を完全に配列決定し、５３４ｂｐオー
プンリーディングフレームを同定した。このオープンリーディングフレームから
、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒトＳＲＢ−７と顕著な配列同一性を有する
（図３）、１７８アミノ酸のタンパク質が推定される（図２）。Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＲＢ−７は、完全長タンパク質に関
しては４５％同一であるが、この２つの真菌種は、ヒトＳＲＢ−７と約２５％の
配列同一性を示す。

【００７６】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７の欠失分析 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７の欠失分析を用いて、ＣａＳＲＢ−７が細
胞生存能力に必須であることを証明した。プラスミドｐＣＴ５７８（Δｃａｓｒ
ｂ７）を、２ステップＰＣＲにより作成した。１回目の合成では、オリゴＣａＳ
ＲＢ−７ｐ１５（フォワード方向、ＡＴＧの約５７０ヌクレオチド上流）とＣａ
ＳＲＢ−７ｐ２０（リバース方向、ＡＴＧのすぐ上流）を用いて、５'末端およ
び３’末端に、それぞれＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ部位を含むＣａＳＲＢ−７ ５
'隣接領域を含むフラグメントを作成した。オリゴＣａＳＲＢ−７ｐ２１（フォ
ワード方向、ＯＲＦのすぐ３’側）とＣａＳＲＢ−７ｐ１９（リバース方向、Ｓ
ＲＢ−７停止コドンの５００ヌクレオチド下流）を用いて、５'末端および３’
末端で、それぞれＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位により枠決めされた３'隣接領域
を作成した。この２つの生成物を、プライマーＣａＳＲＢ−７ｐ１５およびＣａ
ＳＲＢ−７ｐ１９と組み合わせて、１．１Ｋｂ ＣａＳＲＢ−７フラグメントを
増幅し、これをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＢＳＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に挿入した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ欠失体の相補により単離したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７クローン
であるｐＣＴ５６８を、ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。

【００７７】 プラスミドｐＣＴ５８０（Δｃａｓｒｂ７：：ＣａＵＲＡ３）を、ｐＣＴ５７
０からの１．４Ｋｂ ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ ＣａＵＲＡ３フラグメントを、ｐＣ
Ｔ５７８のＳａｌＩ−ＳｐｅＩに挿入することにより作成した。プラスミドｐＣ
Ｔ５７０を、ｐＤＢＶ５１（Ｂｒｏｗｎら，１９９６）からのＣａＵＲＡ３を含
む１．４Ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＳＩＩＳＫ（
＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）の ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｍＨＩに挿入することにより作成した。

【００７８】 最初に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＣ５３１４株（ＦｏｎｚｉおよびＩｒｗｉ
ｎ，１９９３）に由来するゲノムＤＮＡからの２．２Ｋｂ ＣａＡＤＥ２フラグ
メントをＰＣＲ増幅することにより、プラスミドｐＳＨ２０９（ＣａＡＤＥ２）
を作成した。使用したプライマーｐＣａＡＤＥ２ｆおよびｐＣａＡＤＥ２ｂには
、それぞれＰｓｔＩおよびＢａｌＩＩ部位が含まれていた。ＰＣＲ産物をＰｓｔ
ＩおよびＢａｌＩＩで消化し、ｐＲＳ３１５（ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＨｉｅｔ
ｅｒ，１９８９）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩに挿入した。ｐＳＨ２０９の２．２Ｋ
ｂ ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ ＣａＡＤＥ２フラグメントをｐＣＴ５７８のＳａｌＩ
−ＳｐｅＩに挿入することにより、プラスミドｐＳＨ２１０（Δｃａｓｒｂ７：
：ＡＤＥ２）を作成した。

【００７９】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＣＡ１８株（ＦｏｎｚｉおよびＩｒｗｉｎ，１９９３
）においてＳＲＢ−７を単一破壊するために、細胞を、ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消
化されているプラスミドｐＳＨ２１０（Δｃａｓｒｂ７：：ＡＤＥ２）を用いて
形質転換し、ＡＤＥ＋原栄養体を選択した。ＳＲＢ−７におけるΔｃａｓｒｂ７
：：ＡＤＥ２カセットの組み込みを、ＣａＳＲＢ−７ ５'隣接領域を含むプロ
ーブを用いたサザンにより確認した。４つのＡｄｅ＋形質転換体のうち４つが、
２．６Ｋｂの破壊されていない野生型バンドに加えて、期待された４．２Ｋｂの
ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩΔｃａｓｒｂ７：：ＡＤＥ２バンドを示した（データ示さ
ず）。これらの単一破壊された株の１つ（ＳＨＣ１）を、さらなる分析のために
選択した。

【００８０】 次いで、第２のＳＲＢ−７対立遺伝子を欠失しようという試みを行った。Ｎｏ
ｔＩ／ＸｈｏＩで消化されているｐＣＴ５８０（Δｃａｓｒｂ７：：ＵＲＡ３）
を用いて、単一破壊されているＳＨＣ１株（ＳＲＢ−７／Δｃａｓｒｂ７：：Ａ
ＤＥ２）を形質転換し、Ａｄｅ＋Ｕｒａ＋形質転換体を選択した。Ｕｒａ＋Ａｄ
ｅ＋形質転換体を、前記ＳＲＢ−７ ５'プローブを用いたサザンブロットによ
りスクリーニングした。ＳＲＢ−７の第２のコピーの欠失は、新たな３．５Ｋｂ
ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩΔｃａｓｒｂ７：：ＵＲＡ３フラグメントをもたらし、
２．６ｋｂ野生型バンドを消失させるはずである。しかしながら、２０の形質転
換体のうち２０で、２．６Ｋｂ野生型バンドはまだ存在していた。このことは、
第２の遺伝子座を欠失することは不可能であり、ＳＲＢ−７は細胞生存能力に必
須であることを強く示唆している。図４は、２０の形質転換体のうち５つについ
ての、こののサザンブロット分析の結果を示す。対照として、ＮｏｔＩ／Ｘｈｏ
Ｉで消化したｐＣＴ５８０（Δｃａｓｒｂ７：：ＵＲＡ３）を用いてＣＡ１８を
形質転換し、Ｕｒａ＋形質転換体を選択した。これらの形質転換体のうちの１つ
（ＳＣＨ２）の分析を図４に示す。

【００８１】

【表１】

【００８２】

【表２】

【００８３】

【表３】

【００８４】 参考文献の例 Bjorklund, S., and Kim, Y.-J. (1996). Mediator of transcriptional regula
tion. Trends Biochem.Sci.21, 335-337. Boeke, J., Truehart, J., Natsoulis, B., and Fink, G.R. (1987). 5-Flouro-
orotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Meth. Enzy
mol. 154, 164-175. Brown, D.H., Slobodkin, I.V., and Kumamoto, C.A. (1996). Stable transfor
mation and regulated expression of an inducible reporter construct in Ca
ndida albicans using restriction enzyme-mediated integration. Mol. Gen.
Genet. 251, 75-80. Chao, D.M., Gadbois, E.L., Murray, PJ., Anderson, S.F., Sonu, M.S., Parv
in, J.D., and Young, R.A. (1996). A mammalian SRB protein associated wit
h an RNA polymerase II holoenzyme. Nature 380, 82-85. Elble R. (1992). A
simple and efficient procedure for transformation of yeasts. Biotechniq
ues 13, 18-20. Farrell, S., Simkovich, N., Wu, Y., Barberis, A., and Ptashne, M. (1996)
. Gene activation by recruitment of the RNA polymerase II holoenzyme. Ge
nes Dev. 10,2359-2367. Fonzi, W.A., and Irwin, M.Y. (1993). Isogenic strain construction and ge
ne mapping in Candida albicans. Genetics 134, 717-728. Guthrie, C., and Fink, G.R. eds.(1991). Guide to Yeast Genetics and Mole
cular Biology. Academic Press, New York. Hengartner, C.J., Thompson, C.M., Zhang, J., Chao, D.M., Liao, S.-M., Ko
leske, A.J., Okamura, S., and Young, R.A. (1995). Association of an acti
vator with an RNA polymerase II holoenzyme. Genes Dev. 9, 897-910. Kim, Y.-J., Bjorklund, S., Li, Y., Sayre, M.H., and Komberg, R.D. (1994)
. A multiprotein mediator of transcriptional activation and its interaction with the C-te
rminal repeat domain of RNA polymerase II. Cell 77, 599-608. Koleske, A.J., Buratowski, S., Nonet, M., and Young, R.A. (1992). A nove
l transcription factor reveals a functional link between the'RNA polymer
ase II CTD and TFIID. Cell 69, 883-894. Koleske, A.J., and Young, R.A. (1994). An RNA polymerase II holoenzyme r
esponsive to activators. Nature 368, 466-469. Koleske, A.J., and Young,
R.A. (1995). The RNA polymerase II holenzyme and its implications for ge
ne regulation. Trends Biochem. Sci. 20, 113-116. Liao, S.-M., Zhang, J., Jeffery, D.A., Koleske, A.J., Thompson, C.M., Ch
ao, D.M., Viljoen, M., van Vuuren, H.J.J., and Young, R.A. (1995). A kin
ase-cyclin pair in the RNA polymerase II holoenzyme. Nature 374, 193-196
. Maldonado, E., Shiekhattar, R., Sheldon, M., Cho, H., Drapkin, R., Ricke
rt, P., Lees, E., Anderson, C.W., Linn, S., and Reinberg, D. (1996). A h
uman RNA polymerase II complex associated with SRB and DNA-repair protei
ns. Nature 381, 86-89. Myers, L.C., Gustafsson, C.M., Bushnell, D.A., Lui, M., Erdjument-Bromag
e, H., Tempst, P., and Komberg, R.D. (1998) The med proteins of yeast an
d their function through the RNA polymerase II carboxy-terminal domain.
Genes Dev. 12, 45-54. Nonet, M.L., and Young, R.A. (1989). Intragenic an
d extragenic suppressors of mutations in the heptapeptide repeat domain
of Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II. Genetics 123,715-724. Philippsen, P., Stotz, A., and Scherf, C. (1991). DNA ofSaccharomyces ce
revisiae. Meth. Enzymol. 194, 169-182. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor, New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press). Schiestl, R.H. and Gietz, R.D. (1989). High efficiency transformation of
intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Cu
rr. Gent. 16, 339-346. Scully, R., Anderson, S.F., Chao, D.M., Wei, W., Ye, L., Young, R.A., Li
vingston, D.M., and Parvin, J.D. (1997). BRCA1 is a component of the RNA
polymerase II holoenzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5605-5610. Sikorski, R.S., and Hieter, P. (1989). A system of shuttle vectors and y
east host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccarom
yces cerevisiae. Genetics 122, 19-27. Thompson, C.M., Koleske, A.J., Cha
o, D.M., and Young, R.A. (1993). A multisubunit complex associated with
the RNA polymerase II CTD and TATA-binding protein in yeast. Cell 73, 13
61-1375. Thompson, C.M., and Young, R.A. (1995). General requirement for RNA poly
merase II holoenzymes in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4587-4590.

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＵＲＡ３プラスミドに対する選択剤として５−フルオロ−オロチ
ン酸（５−ＦＯＡ）を用いるプラスミドシャッフル技術の結果を示す。ＳＲＢ−
７欠失を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、ロイシンを欠く寒天培地に置き、
５−ＦＯＡの非存在下（図１Ａ）または存在下（図１Ｂ）で、形質転換されたＬ
ＥＵ２標識プラスミドについて選択した。

【図２】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＲＢ−７のＤＮＡ配列およびタンパク
質配列を示す。

【図３】 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびヒト
のＳＲＢ−７タンパク質配列間の配列同一性を示す。

【図４】 ＳＲＢ−７が細胞生存能力に必須であることを示す、サザンブロ
ット分析の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB50 CB21 FB02 FB08 4B024 AA01 AA13 BA10 CA03 DA12 HA14 4B065 AA73Y AA80X AB01 CA24 CA29 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA15 DA75 DA89 EA29 EA52 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図２、配列番号１に示す配列を有する単離された核酸。
2. 【請求項２】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求
   項１に記載の核酸にハイブリダイズする単離された核酸。
3. 【請求項３】 転写調節エレメントに操作可能に連結された請求項１に記載
   の核酸を含む核酸ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを含む細胞。
5. 【請求項５】 前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動
   物細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の細胞。
6. 【請求項６】 ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法は、 （ｉ）ＣａＳＲＢ−７ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項５に記載の
   細胞を培養すること；及び （ｉｉ）前記培養物から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
7. 【請求項７】 図２、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する単離されたポ
   リペプチド。
8. 【請求項８】 ＣａＳＲＢ−７ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
9. 【請求項９】 フォールディングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質に結合す
   るリガンドを、フォールディングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質を結合するこ
   とが知られていない複数の試験リガンドから識別するための迅速な大規模スクリ
   ーニング方法であって、前記ＣａＳＲＢ−７タンパク質は、複数の試験リガンド
   の存在下および非存在下でインキュベートされ、その後、アンフォールディング
   条件にかけられており、前記方法は、 フォールディングされた状態のＣａＳＲＢ−７タンパク質の量の増加または減
   少を検出することを含み、前記増加または減少により前記ＣａＳＲＢ−７タンパ
   ク質に結合する試験リガンドが識別される方法。
10. 【請求項１０】 フォールディングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質に結合
    するリガンドを、前記フォールディングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質に結合
    することが知られていない複数の試験リガンドから識別するための迅速な大規模
    スクリーニング方法であって、前記ＣａＳＲＢ−７タンパク質は、複数の試験リ
    ガンドの存在下および非存在下でインキュベートされており、前記方法は、 前記ＣａＳＲＢ−７タンパク質をアンフォールディング条件にかけること；及
    び フォールディングされた状態のＣａＳＲＢ−７タンパク質の量の増加または減
    少を検出することを含み、前記増加または減少により前記ＣａＳＲＢ−７タンパ
    ク質に結合する試験リガンドが識別される、方法。
11. 【請求項１１】 フォールディングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質に結合
    するリガンドを、フォールディングされたＣａＳＲＢ−７タンパク質に結合する
    ことが知られていない複数の試験リガンドから識別するための迅速な大規模スク
    リーニング方法であって、前記方法は、 前記ＣａＳＲＢ−７タンパク質を複数の試験リガンドの存在下および非存在下
    でインキュベートすること； 前記ＣａＳＲＢタンパク質をアンフォールディング条件にかけること；及び フォールディングされた状態のＣａＳＲＢ−７タンパク質の量の増加または減
    少を検出することを含み、前記増加または減少により前記ＣａＳＲＢ−７タンパ
    ク質に結合する試験リガンドが識別される、方法。