JP2002525073A - Ｃ．アルビカンス由来の必須遺伝子及び当該遺伝子を用いる抗真菌性物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Ｃ．アルビカンス由来の必須遺伝子及び当該遺伝子を用いる抗真菌性物質のスクリーニング方法

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JP2002525073A
JP2002525073A JP2000570365A JP2000570365A JP2002525073A JP 2002525073 A JP2002525073 A JP 2002525073A JP 2000570365 A JP2000570365 A JP 2000570365A JP 2000570365 A JP2000570365 A JP 2000570365A JP 2002525073 A JP2002525073 A JP 2002525073A
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レイウー トーマス
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ニッチェ アルムート
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｃ．アルビカンスの必須遺伝子及び、抗真菌性物質のスクリーニング方法におけるそれらの利用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、抗真菌性物質のスクリーニング方法であって、真菌類特にカンジダ
・アルビカンス (C.albicans)に由来する必須遺伝子並びに他の病原性真菌類に
由来する機能的に類似の遺伝子を標的として利用する当該スクリーニング方法に
関する。この発明は又、特定のＣ．アルビカンス遺伝子にも関係する。
【０００２】 公知のカビ感染症のスペクトルは、カビの皮膚又は爪への攻撃から潜在的に危
険な内臓へのカビ感染にまで及び；かかる感染及びその結果生じる病気は、真菌
症として知られている。
【０００３】 抗真菌性物質(静真菌性又は殺真菌性)が、真菌症の治療剤として用いられてい
る。しかしながら、今日まで、薬理効果を有することが知られている物質は、ア
ンホテリシンＢ、ナイスタチン、ピマリシン、グリセオフルビン、クロトリマゾ
ール、５−フルオロ−シトシン及びバトラフェン等比較的少数である。カビの感
染の薬物治療は、特に、宿主細胞とカビの両者が真核細胞であるために、極めて
困難である。それ故に、公知の抗真菌性物質に基づく薬物の投与は、しばしば、
望ましくない副作用を生じ、例えばアンホテリシンＢは腎毒性作用を有する。そ
れ故、免疫抑制状態の予防療法又は存在する真菌感染症の治療に適している薬物
の製造に利用することのできる薬理学的に効率のよい物質に対する強い要求があ
る。その上、これらの物質は、真菌の生育及び増殖を、治療される宿主生物に影
響を与えることなく選択的に阻止するための作用の特異的スペクトルを示すべき
である。
【０００４】 本発明の目的は、抗真菌性物質特に抗カンジダ物質の同定方法を提供すること
である。この方法の本質的特徴は、真菌類由来の必須遺伝子をスクリーニングの
ための標的として利用することである。
【０００５】 従って、本発明は、抗真菌性物質のスクリーニング方法に関係し、該方法にお
いては、真菌類由来の必須遺伝子又は他の病原性真菌類の機能的に類似の遺伝子
(又は、対応するコードされたタンパク質)を標的として利用し、必須遺伝子は、
ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ
０１２、ＣａＤＲ３２５及びＣａＪＬ０３９よりなる群から選択する。
【０００６】 この発明の方法の一具体例によれば、必須遺伝子又は機能的に類似の真菌遺伝
子を様々なレベルに発現する真菌細胞を試験すべき物質と共にインキュベートし
てその物質の生育阻止効果を測定する。
【０００７】 他の具体例によれば、前記の標的遺伝子又は対応する標的遺伝子にコードされ
たタンパク質をイン・ビトロで試験すべき物質と接触させその物質の標的に対す
る効果を測定する。
【０００８】 他の具体例によれば、スクリーニングされた物質は、必須遺伝子の機能的発現
又はコードされたタンパク質の機能的活性を部分的に又は全面的に阻害する。
【０００９】 一具体例によれば、スクリーニングされた物質は、ジヒドロプテロエートシン
ターゼ(ＤＨＰＳ)及び／又は７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン
−ピロホスホキナーゼ(ＨＰＰＫ)の活性を部分的に又は全面的に阻害する。
【００１０】 他の具体例によれば、これらの真菌種は、担子菌類、子嚢菌類及び線菌類を含
む群から選択される。
【００１１】 この発明の方法の他の具体例によれば、該機能的に類似の遺伝子は、カンジダ
種に好ましくはカンジダ・アルビカンスに由来し又はアスペルギルス種に好まし
くはアスペルギルス フミガーツスに由来する必須遺伝子である。
【００１２】 他の面によれば、本発明は、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:６、SE
Q ID NO:７、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１又はSEQ ID NO:１
３に描いた配列を、好ましくはSEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:６、SE
Q ID NO:９、SEQ ID NO:１０又はSEQ ID NO:１１に描いた配列を有するポリヌク
レオチド、これらの同族体及びそれらの機能的断片に関係する。
【００１３】 他の面によれば、本発明は、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５
６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５若しくはＣａＪＬ０３９
、好ましくはＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０
２若しくはＣａＩＲ０１２である遺伝子又はそれらの機能的に類似の遺伝子若し
くは機能的断片に関係する。
【００１４】 この具体例によれば、機能的に類似の遺伝子又は相同なポリヌクレオチドは、
ヌクレオチドレベルで、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、Ｃ
ａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９とそれぞれ
少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも６０％の最も好ましくは少なくとも
７０％の配列同一性を有する。機能的断片は、出発生成物(ヌクレオチド又は遺
伝子)の機能性を保持するであろうポリヌクレオチド断片である。一例は、Ｃａ
ＯＲ１１０スプライシング変異体(これは、元の遺伝子に対してやはり約９０％
の同一性で相同である)である。
【００１５】 他の具体例によれば、機能的に類似の遺伝子は、アミノ酸レベルにおいて、Ｃ
ａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０
１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９にそれぞれコードされるタンパク質と
少なくとも４０％の、好ましくは少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくと
も６０％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【００１６】 遺伝子に関して与えたこれらの数字は、必要に応じて変更を加えて、ポリヌク
レオチドに適用する(相同性及び類似性に関して)。
【００１７】 他の面によれば、本発明は、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５
６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９遺伝
子により若しくは機能的に類似の遺伝子によりそれぞれコードされるタンパク質
又はそれらの機能的なポリペプチド性断片をカバーする。
【００１８】 他の面によれば、本発明は、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５
６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９遺伝
子又はそれらの機能的に類似の遺伝子若しくは機能的断片をそれぞれ含むプラス
ミドを提供する。
【００１９】 他の面によれば、本発明は、９８年８月１３日にＣＮＣＭ(Institut Pasteur,
Paris)に受付番号Ｉ−２０６５、Ｉ−２０６３及びＩ−２０６４(それぞれ、Ｃ
ａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２及びＣａＩＲ０１２遺伝子に対応する)にて寄託
されたプラスミド(それを含む細菌)を提供する。
【００２０】 他の面によれば、本発明は、９９年８月６日にＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung v
on Mikroorganismen und Zellkulturen, ドイツ国)に受付番号ＤＳＭ１２９７７
、ＤＳＭ１２９７６、ＤＳＭ１２９７８及びＤＳＭ１２９７９(それぞれ、Ｃａ
ＤＲ３２５、ＣａＯＲ１１０、ＣａＯＲスプライシング変異体及びＣａＭＲ２１
２に対応する)にて寄託されたプラスミド(それを含む細菌)を提供する。
【００２１】 他の面において、本発明は、真菌感染の診断のためのキットであって、ＣａＯ
Ｒ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２
、ＣａＤＲ３２５及びＣａＪＬ０３９よりなる群から選択する遺伝子、それらの
機能的に類似の遺伝子、それらの機能的断片、対応するコードされるタンパク質
又はそれらの機能的ポリペプチド断片を含む当該キットを提供する。
【００２２】 他の面によれば、本発明は、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５
６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９遺伝
子によりそれぞれ若しくは機能的に類似の遺伝子によりコードされるタンパク質
、又はそれらのポリペプチド断片に対する抗体を提供する。
【００２３】 他の面によれば、本発明は、下記のステップを含む方法により得ることのでき
るポリヌクレオチドを提供する： (ｉ)必須遺伝子をサッカロミセス・セレビシエから選択し； (ｉｉ)該遺伝子の配列をカンジダ・アルビカンスのゲノム配列と比較し； (ｉｉｉ)相同性オリゴヌクレオチド領域を演繹し； (ｉｖ)こうして得られたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅し； (ｖ)ステップ(ｉｖ)で得られたアンプリマーを用いて関心ある完全な遺伝子を
検出する： ステップ(ｉｖ)のアンプリマーを関心ある完全な遺伝子をカンジダ・アルビカ
ンスゲノムライブラリー若しくはｃＤＮＡライブラリーから検出するためのプロ
ーブとして用い；又は この完全な遺伝子を、例えばＰＣＲ法を用いることにより、アンプリマーの３
’及び５’伸長により得る。
【００２４】 この発明によれば、第１のステップは、該必須遺伝子を同定することであり、
こうして同定されたこれらの遺伝子から出発して、他の病原性真菌類由来の必須
遺伝子を同定することができる。実際的目的のためには、Ｓ．セレビシエ由来の
必須遺伝子を最初に同定し、それらから出発して、他の病原性真菌に由来する特
にカンジダに由来する必須遺伝子を得る。
【００２５】 従って、本発明は、Ｃ．アルビカンス由来の必須遺伝子の同定及び抗真菌性物
質特に抗カンジダ物質のスクリーニング法におけるそれらの利用を開示する。
【００２６】 Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を同定するためには、個々のゲノム遺伝子を相同
組換えにより除去する。もしそうして除去されたＤＮＡセグメントが必須遺伝子
に関係するものであれば、その欠失は、一倍体型のＳ．セレビシエ細胞に対して
致死性である。
【００２７】 研究されるＳ．セレビシエ遺伝子をマーカー遺伝子で置き換える方法を用いて
、Ｓ．セレビシエの対応するゲノムの欠失を生成すること及びその欠失を含むＳ
．セレビシエ細胞を決定することができる。
【００２８】 選択マーカーとして、例えば、優性選択マーカー(例えば、カナマイシン耐性
遺伝子)又は栄養要求マーカーを用いることができる。栄養要求マーカーとして
、アミノ酸合成又は核酸塩基合成のキー酵素をコードする遺伝子を利用すること
ができる。例えば、選択マーカーとして、Ｓ．セレビシエに由来する次の遺伝子
を利用することができる：ロイシン(例えば、ＬＥＵ２遺伝子)、ヒスチジン(例
えば、ＨＩＳ３遺伝子)又はトリプトファン(例えば、ＴＲＰ１遺伝子)の代謝経
路をコードする遺伝子又はウラシルの核酸塩基代謝をコードする遺伝子(例えば
、ＵＲａ３遺伝子)。
【００２９】 栄養要求性Ｓ．セレビシエ株を用いることができる。これらの栄養要求性株は
、対応するアミノ酸又はヌクレオチド塩基を含む栄養培地でのみ生育することが
できる。例えば、栄養要求マーカーを含むすべての実験室のＳ．セレビシエ株を
用いることができる。二倍体のＳ．セレビシエ株を用いる場合には、対応する選
択マーカーは、ホモ接合的に変異していなければならない。ＣＥＮ．ＰＫ２株又
はその同質遺伝子型の誘導体を用いることができる。
【００３０】 適当な栄養要求マーカーを有しない株例えば原栄養性のＳ．セレビシエ株も又
、利用することができる。その場合は、優性選択マーカー例えば耐性遺伝子例え
ばカナマイシン耐性遺伝子を用いることができる。ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏ
ｘＰカセットを、この目的のために有利に用いることができる。
【００３１】 Ｓ．セレビシエ遺伝子の全ＤＮＡ又はその部分を置換する相同組換えのために
、マーカー遺伝子が５’及び３’末端で研究するＳ．セレビシエ遺伝子の５’及
び３’末端に対して相同な配列に隣接しているＤＮＡ断片を利用する。
【００３２】 対応するＤＮＡ断片の製造のために、任意の特定のＳ．セレビシエ遺伝子の欠
失のためにも適している種々の方法を用いることができる。直鎖状ＤＮＡ断片を
、適当なＳ．セレビシエ株のトランスフォーメーションのために用いる。この断
片は、Ｓ．セレビシエゲノム中に相同組換えにより組み込まれる。これらの方法
は、下記を含む： １．欠失カセットの製造のための「慣用的方法」(Rothstein, R.J.(1983) Met
hods in Enzymology, 第101巻、202-211頁)。 ２．ＰＣＲ技術を利用する「慣用的方法」(「改変された慣用的方法」)。 ３．ＳＦＨ(短い隣接相同性)−ＰＣＲ法(Wach, A.等(1994) Yeast 10:1793-18
08；Gultner, U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524)。
【００３３】 １．Ｓ．セレビシエゲノム中の欠失カセットの製造のための「慣用的方法」に
おいて、研究すべき遺伝子は、適当なベクター中に既に存在しているか又はかか
るベクター中に組み込まれる。この方法を用いる場合には、例えばｐＢＲ−、ｐ
ＵＲ−及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)−誘導体の何れでも用いることが
できる。標的遺伝子配列の主要部をこのベクターから例えば適当な制限部位を利
用して除去するが、このベクターの内部の研究すべき遺伝子の３’及び５’領域
は保存する。選択したマーカー遺伝子を残った領域の間に組み込む。
【００３４】 ２．この「慣用的方法」の改変型においては、ＰＣＲを利用する。この方法は
、研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子のコード配列の３’及び５’末端領域の増幅
を可能にする。この方法は、研究すべき遺伝子の両末端領域を選択的に増幅し、
それ故、各研究すべき遺伝子について２つのＰＣＲ反応(一度は、遺伝子の５’
末端を増幅し、一度は、３’末端を増幅する)を行わなければならない。増幅さ
れた末端ＤＮＡ断片の長さは、存在する制限部位に依る。研究すべき遺伝子の増
幅された末端は、一般に、５０〜５０００塩基対(ｂｐ)の長さを、好ましくは５
００〜１０００ｂｐの長さを有する。
【００３５】 ＰＣＲ反応のテンプレートとして、Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡ又は野生型
遺伝子を用いることができる。これらのプライマー対(それぞれ、センス及びア
ンチセンスプライマー)は、それらが研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子の３’末
端及び５’末端配列に対応するように構築する。特に、このプライマーは、その
組込みを適当な制限部位により可能にするように選択する。
【００３６】 ベクターとして、ｐＢＲ−、ｐＵＣ−及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(登録商標)
−誘導体を用いることができる。特に、選択マーカーをコードする遺伝子を既に
含んでいる特定のベクターは、適当である。特に、選択マーカーＨＩＳ３、ＬＥ
Ｕ２、ＴＲＰ１又はＵＲＡ３の遺伝子を含むベクターを用いることができる。
【００３７】 ＰＣＲにより得られた研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子のＤＮＡセグメントを
、ベクター中に、選択マーカーの両側に、その後、「慣用的方法」におけるよう
に、その選択マーカーが両端において研究すべき遺伝子に相同なＤＮＡ配列に隣
接するように組み込む。
【００３８】 ３．Ｓ．セレビシエにおける相同組換えは、非常に効率的に且つ正確な様式で
起き、選択マーカー遺伝子に隣接している研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子に相
同なＤＮＡ配列の長さは、実際、「慣用的方法」を用いたときよりかなり短くて
よい。研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子に相同なこれらのフランキング末端は、
約２０〜６０ｂｐ好ましくは３０〜４５ｂｐだけの長さがあればよい。このＳＦ
Ｈ−ＰＣＲ法は、骨の折れるクローニングステップを回避することができるので
、特に有利である。
【００３９】 用いるべき選択マーカーの遺伝子を含むＤＮＡテンプレート上でＰＣＲ反応を
行い、該反応では、プライマーを、センスプライマーのＤＮＡ配列が選択マーカ
ー配列の５’末端と相同になるようにし且つそのプライマーがその５’末端に好
ましくは４０ヌクレオチドの領域を付加的に与えるように構築する(該領域は、
研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子の５’末端配列に対応する)。アンチセンスプ
ライマーを類似の仕方で構築する(即ち、それは、選択マーカーの遺伝子配列の
３’末端に相補的であり、このプライマーは、その５’末端に好ましくはやはり
４０ヌクレオチドの研究すべき遺伝子の３’末端コード配列の相補鎖に対応する
領域を含む)。
【００４０】 研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子のＳＦＨ−ＰＣＲ法による増幅のためには、
栄養要求マーカー又は選択マーカーの遺伝子を含むベクターを用いることができ
る。特に、プラスミドｐＵＧ６がテンプレートとして用いられる。このプラスミ
ドは、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセット(Gultner等(1996) Nucleic Aci
ds Research 24:2519-2524)を含む。換言すれば、カナマイシン耐性遺伝子が、
両端でｌｏｘＰ配列と隣接している(ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセット)
。このカセットは、研究すべきＳ．セレビシエ遺伝子中へのｌｏｘＰ−ＫａｎＭ
Ｘ−ｌｏｘＰカセットの組込みの後でカナマイシン耐性遺伝子が最終的にＳ．セ
レビシエゲノムから除去され得るという点で有利である。バクテリオファージＰ
１のＣｒｅレコンビナーゼをこの目的のために用いることができる。Ｃｒｅレコ
ンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列を認識して２つのｌｏｘＰ配列の間に位置するＤＮ
Ａの相同組換えプロセスによる除去を誘導する。結果として、１つのｌｏｘＰ配
列のみが残り、いわゆるマーカー再生が起きる(即ち、このＳ．セレビシエ株は
、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを用いて再度トランスフォームする
ことができる)。これは、致死的表現型を得るために少なくとも２つの機能的に
類似の遺伝子を削除すべき場合に特に有利である。
【００４１】 ＰＣＲ法を用いる場合、ＰＣＲ反応用のプライマーは、その３’末端が、好ま
しくは２０ヌクレオチド長の配列であって、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰカ
セットの左及び／又は右に位置された配列に相同であり、５’末端が、好ましく
は４０ヌクレオチド長の配列であって、研究すべき遺伝子の両端と相同である。
【００４２】 これらの３つの方法を用いて、研究すべき遺伝子の相同配列と両側で隣接して
いる選択マーカーをコードする遺伝子を含む直鎖状欠失カセットを得る。これら
の欠失カセットは、二倍体のＳ．セレビシエ株のトランスフォーメーションのた
めに用いられる。例えば、二倍体株のＳ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ２(Scientifi
c Research & Development有限会社、Oberursel)をこの目的のために用いること
ができる。
【００４３】 [ＣＥＮ．ＰＫ２ Ｍａｔａ／ＭＡＴα ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２
ｌｅｕ２−３、１１２／ｌｅｕ２−３、１１２ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１ ｔ
ｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９ ＭＡＬ２−８ｃ／ＭＡＬ２−８ｃ ＳＵＣ
２／ＳＵＣ２]
【００４４】 このＣＥＮ．ＰＫ２株を準備して公知の方法を用いて培養する(Gietz,R.D.等(
1992) Nucleic Acids Research 8:1425；Guldener,U.等(1996) Nucleic Acids R
esearch 24:2519-2524)。
【００４５】 これらの用いられたＳ．セレビシエ株の細胞は、適当なＤＮＡ量の直鎖状欠失
カセットを用いる公知の方法によりトランスフォームされる(例えば、Sambrook
等、1989)。その後、これらの細胞が培養されている培地を新しい培地{いわゆる
、選択培地、これは、対応するアミノ酸(例えば、ヒスチジン、ロイシン又はト
リプトファン)又は核酸塩基(例えば、ウラシル)を含んでいない}と交換し、又は
カナマイシン耐性遺伝子を含む欠失カセットを用いる場合には、ゲネチシン(Ｇ
４１８、登録商標)を含む培地{例えば、ゲネチシンを含む完全培地(ＹＥＰＤ)}
と交換する。或は、トランスフォームされた細胞を、対応する培地を用いて調製
した寒天プレート上にプレートすることができる。それにより、相同組換えが起
きたトランスフォームされた細胞が選択される(それらの細胞しか、これらの改
変条件下で生育できないから)。
【００４６】 しかしながら、殆どの場合には、この二倍体のＳ．セレビシエ株の２本の染色
体のセット中の遺伝子の２つのコピーの内の１つだけが、トランスフォーメーシ
ョンにおいて欠失カセットのＤＮＡにより置換されて、ヘテロ接合二倍体Ｓ．セ
レビシエ変異株を生じ、該変異株では、研究すべき遺伝子の１コピーは選択マー
カーにより置換されているが、その遺伝子の他のコピーはゲノム中に保持されて
いる。これは、必須遺伝子の欠失の場合には、その必須遺伝子の第２のコピーの
存在のために変異型Ｓ．セレビシエ株が依然として生存できるという利点を与え
る。
【００４７】 この欠失カセットＤＮＡの予め決めた染色体遺伝子座(研究すべき遺伝子の遺
伝子座)における適当な組込みは、サザーンブロット分析(Southern,E.M.(1975)
J.Mol.Biol.98:503-517)により又は特異的プライマーを用いる診断用ＰＣＲ分析
(Guldener,U.等(1996) Nucleic Acids Research 24:2519-2524)によりチェック
することができる。
【００４８】 個々の二倍体細胞の遺伝的分離は、四分子分析によりモニターすることができ
る。この目的のためには、公知の方法例えば酢酸カリウムプレート上での窒素欠
乏(Sherman,F.等(1986) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, N.Y.；Guthrie,C.及びFink,G.R.(1991) Methods in Enzymology, 第194
巻、Academic Press, San Diego, 3-21；Ausubel,F.M.等(1987) Current Protoc
ol in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc.,第13章)を用いて、二倍
体細胞特にヘテロ接合変異株に還元分裂(減数分裂)を誘導する。減数分裂は、４
つの子嚢胞子を有する子嚢(分離されている)を生じるだけであり、それは、マイ
クロマニピュレーター(例えば、SINGER)により、ザイモリアーゼによる子嚢胞子
壁の部分的酵素消化の後に個別化することができる(Ausubel等(1987))。例えば
、四分子分析を二本の染色体セット中に存在する必須遺伝子が一方の染色体にお
いて相同組換えにより置換されているヘテロ接合二倍体変異株について行う場合
には、分離された２つの子嚢胞子 (即ち、必須遺伝子を有するもの) のみが生存
できる。残りの２つの分離された子嚢胞子は、必須遺伝子を欠くので生存できな
い。
【００４９】 この方法により調べた遺伝子が本当に必須であるかをチェックし又は相同組換
えが研究すべき遺伝子の遺伝子座に隣接する必須遺伝子の変化を生じるかをチェ
ックするために、ヘテロ接合二倍体Ｓ．セレビシエ変異株を、該研究すべき遺伝
子を含むセントロメアプラスミドを用いてトランスフォームする。
【００５０】 トランスフォーマントについて四分子分析を行う。２つでなくて４つの生存で
きる分離胞子(segregate)が得られる場合には、セントロメアプラスミドに含ま
れる研究すべき遺伝子は、２つの生存可能でない一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／変
異株の欠陥を補完することができ、これは、その研究すべきＳ．セレビシエ遺伝
子が必須であることを示している。
【００５１】 好ましくは、低コピー数(例えば、細胞当たり１又は２コピー)で存在するプラ
スミドをセントロメアプラスミドとして用いる。例えば、プラスミドｐＲＳ３１
３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５及びｐＲＳ３１６(Sijkorski,R.S.及びHieter,
P.(1989) Genetics 122:19-27)又は類似のプラスミドをこの目的のために用いる
ことができる。好ましくは、研究すべき遺伝子を該プラスミド(３’及び５’末
端非コード領域を含む)に組み込む。
【００５２】 個々のＳ．セレビシエ遺伝子(それらの配列は、完全に又は部分的に公知であ
る)を上記の方法を用いて研究することができる。Ｓ．セレビシエの完全なゲノ
ム配列は、１９９６年４月２４日に、ＷＷＷ(World Wide Web)により公衆が利用
できるものとなった。
【００５３】 ＷＷＷによりＳ．セレビシエのゲノムＤＮＡ配列にアクセスするための種々の
可能性が存在する。
【００５４】 ＭＩＰＳ(Munich information Centre of Protein Sequence)アドレス http:
//speedy.mips.biochem.mpg.de/mips /yeast/ ＳＧＤ(Saccharmyces Genome Database, Stanford) アドレス http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces ＹＰＤ(Yeast Protein Database, Cold Spring Harbor) アドレス http://www.proteome.com/YPDhome.html
【００５５】 完全なＳ．セレビシエＤＮＡ配列は、欧州のＦＴＰ(file transfer protocol)
を介して(例えば、アドレス：ftp.mips.embnet.org)、米国(アドレス：genome-f
tp.Stanford.edu)又は日本(アドレス：ftp.nig.ac.jp)においてもアクセスする
ことができる。
【００５６】 ７つの必須のゲノムのＳ．セレビシエの遺伝子が、この方法により同定された
：ＹＤＲ３２５ｗ、ＹＪＬ０３９ｃ、ＹＯＲ１１０ｗ、ＹＮＬ２５６ｗ、ＹＢＲ
１０２ｃ、ＹＩＲ０１２ｗ及びＹＭＲ２１２ｃ。
【００５７】 次いで、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を用いて、他の真菌類の対応する機能的
に類似の遺伝子を同定する。
【００５８】 他の真菌種の機能的に類似の遺伝子とは、Ｓ．セレビシエの同定された必須遺
伝子と類似の又は同じ機能を有する遺伝子を意味する。他の真菌類の機能的に類
似の遺伝子は、配列において、対応する必須のＳ．セレビシエ遺伝子と相同であ
ってよいがそうである必要はない。他の真菌類の機能的に類似の遺伝子は、ヌク
レオチドレベルで、対応する必須のＳ．セレビシエ遺伝子に対して中位の配列相
同性だけを示すことができる。中位の配列相同性とは、本発明においては、ヌク
レオチドレベルで、少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０％の、
最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する遺伝子を意味する。
【００５９】 加えて、他の真菌類の機能的に類似の遺伝子は、必須のＳ．セレビシエ遺伝子
によりコードされるタンパク質に配列において相同なタンパク質をコードするこ
とができるが、コードしなくてもよい。他の真菌類の機能的に類似のタンパク質
は、必須のＳ．セレビシエ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する中位の
タンパク質配列相同性を示してよい。
【００６０】 中位のタンパク質配列相同性とは、本発明においては、アミノ酸レベルで、少
なくとも４０％の、好ましくは少なくとも５０％の、一層好ましくは少なくとも
６０％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパク質を
意味する。
【００６１】 配列において相同な遺伝子は、公知の方法によって例えば相同スクリーニング
(Sambrook,J.等(1989) Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, N.Y.)により又は特異的プライマーを用いるＰＣＲ技術によって対応する真
菌類のゲノムライブラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリーから単離することが
できる。
【００６２】 一具体例によれば、配列において相同な遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーから
単離される。他の真菌類において機能的に類似の遺伝子を発見するためには、公
知の方法(Sambrook等、1989)により研究すべき真菌種からｍＲＮＡを単離して、
ｃＤＮＡを公知の方法(Sambrook等、1989；又はｃＤＮＡ合成キット、例えばStr
atagene社製)によって合成する。
【００６３】 調製したｃＤＮＡを、指向的に、適当な発現ベクター中に組み込む。
【００６４】 例えば、第一のｃＤＮＡ鎖の合成を、発現ベクターのプロモーターに関して適
当な向きで後続のクローニングを可能にするために、適当な制限部位を有するプ
ライマーの存在下で実施することができる。制限部位としては、任意の公知の制
限部位を用いることができる。プライマーとしては、例えば、下記の５０ヌクレ
オチド長のプライマーを用いることができる：
【化１】
【００６５】 配列(X)６は、適当な制限部位(例えば、ＸｈｏＩ部位)を表している。
【００６６】 二本鎖合成後に、二本鎖ｃＤＮＡの粘着性末端を埋め(鈍端)、それから、この
ｃＤＮＡの両端を適当なＤＮＡアダプター配列を用いて連結する。このＤＮＡア
ダプター配列は、第一のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマーにおいて用いられ
る制限部位と異なる制限部位を含むべきである。このＤＮＡアダプターは、例え
ば、両端が制限部位の粘着性末端を表す相補的９量体又は１３量体オリゴヌクレ
オチドを含んでよい。これらの末端は、例えば下記のＥｃｏＲＩ部位であってよ
い：
【化２】
【００６７】 このアダプター配列中の一本鎖のXは、制限部位の粘着性末端を表している。
【００６８】 対応するアダプター配列を与えられたｃＤＮＡを、次いで、制限エンドヌクレ
アーゼを用いて開裂させる(該制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、第一のｃ
ＤＮＡ鎖の合成のためのプライマーにおいて用いられたもの例えばＸｈｏＩであ
る)。こうして得られたｃＤＮＡは、この例によれば、３’ＸｈｏＩ及び５’Ｅ
ｃｏＲＩ突出末端を有し、それ故、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで開裂させた発現ベ
クター中に指向的に組み込むことができる。
【００６９】 発現ベクターとしては、他の内で、大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクター
即ち大腸菌並びにＳ．セレビシエにおいて使用可能なベクターが適当である。か
かるベクターを、次いで、例えば大腸菌中で増幅させることができる。発現ベク
ターとしては、Ｓ．セレビシエ細胞中で高いコピー数で存在するもの並びに低い
コピー数で存在するものを用いることができる。この目的のためには、例えば、
ｐＲＳ４２３−ｐＲＳ４２６(ｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐ
ＲＳ４２６)及び／又はｐＲＳ３１３−ｐＲＳ３１６(ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１
４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６)よりなる群において選択されるベクター(Siko
rki,R.S.及びHieter,P.(1989) Genetics 122:19-27；Christianson T.W.等(1992
) Gene 110:119-122)が適当である。
【００７０】 発現ベクターは、適当なＳ．セレビシエプロモーター及びターミネーターを含
むべきである。それらがこれらのエレメントを有しない場合には、対応するプロ
モーター及びターミネーターを、生成されたｃＤＮＡの後続の組込みが可能なま
まであるような仕方で挿入する。特に適当なのは、Ｓ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ
２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のプロモーターであ
る。非改変型の野生型遺伝子のプロモーター並びにある種のアクチベーター配列
及び／又はリプレッサー配列が除去されるような仕方で改変されたプロモーター
を用いることができる。ターミネーターとしては、例えば、Ｓ．セレビシエ遺伝
子ＭＥＴ２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のターミネ
ーターが適当である。
【００７１】 他の具体例によれば、配列において相同な遺伝子は、ゲノムライブラリーから
単離される。真菌類に由来するゲノムＤＮＡライブラリーは、公知の手順に従っ
て(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,
Incに記載されたようにして)調製することができる。例えば、真菌類由来のゲノ
ムＤＮＡは、酵母細胞溶解及びゲノムＤＮＡの単離のための公知の方法(例えば
、Bio101, Incから市販されているキット)を用いて調製することができる。この
ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ等の制限酵素を用いて部分消化し、その断片をアガ
ロースゲル電気泳動によってサイズで選択することができる。次いで、例えば、
５〜１０ｋｂのサイズを有するＤＮＡ断片を古典的方法(例えば、Bio101のＧｅ
ｎｅ Ｃｌｅａｎキット)により精製して、適合性の末端を与える制限酵素(例え
ば、Ｓａｕ３ＡＩ切断ゲノムＤＮＡのためのＢａｍＨＩ)で切った大腸菌／酵母
シャトルベクター例えばＹＥＰ２４中に挿入する(例えば、Sanglard D., Kuchle
r K., Ischer F., Pagani J-L., Monod M. 及びBille J., Antimicrobial Agent
s and Chemotherapy, (1995) Vol.39 No11,p2378-2386に記載されている)。その
結果生成した発現ライブラリーは、大腸菌中で増幅させることができる。しかし
ながら、ゲノムライブラリーの調製に適した如何なる公知の方法でも本発明にお
いて用いることができる。
【００７２】 研究中の真菌種においてＳ．セレビシエの必須遺伝子と機能的に類似する遺伝
子を見出すためには、Ｓ．セレビシエの必須遺伝子を、組込み遺伝子(１)又は染
色体外遺伝子(２)として、調節されたプロモーターの制御下に置く。
【００７３】 １．調節されたプロモーターのＳ．セレビシエゲノム中への組込みのためには
、選択した必須遺伝子の天然のプロモーターを調節されたプロモーターにより、
例えばＰＣＲによる相同組換え(Guldener等(1996)によって置換する。ＰＣＲに
よる相同組換えは、例えば、二倍体Ｓ．セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ２において実
施することができる。一方の染色体への上首尾の組込みは、四分子分析後に、一
倍体細胞においてチェックすることができる。
【００７４】 四分子分析を用いて、４つの生存可能な子嚢胞子を得る(２つの一倍体分離胞
子においては選択した必須遺伝子が天然のプロモーターの制御下に置かれている
が、残りの２つの分離胞子中の必須遺伝子は調節されたプロモーターの制御下に
置かれている)。
【００７５】 最後に挙げた一倍体分離胞子を、組換えベクター中に存在するｃＤＮＡ又はゲ
ノムＤＮＡによるトランスフォーメーションに用いる。
【００７６】 ２．染色体外変異体を用いて、選択した必須のＳ．セレビシエ遺伝子を先ず適
当な発現ベクター例えば大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクターに挿入する。
この目的のために、必須遺伝子を、ＰＣＲによりＳ．セレビシエゲノムＤＮＡ(
ＡＴＧ開始コドンから始まり終始コドンまで)から増幅することができる。この
目的のために用いるプライマーは、それらが適当な制限酵素のための認識部位を
含んで、後続の発現ベクター中の調節されたプロモーターの制御下への挿入を容
易にするような仕方で構築することができる。
【００７７】 次いで、調節されたプロモーターの制御下の必須のＳ．セレビシエ遺伝子のプ
ラスミドコピーを有する組換え発現ベクターを、対応する変異型対立遺伝子のト
ランス補完のために用いる。この対応する変異型対立遺伝子は、上記の必須の真
菌遺伝子を相同組換えにより部分的に又は完全に除去することにより調製したヘ
テロ接合二倍体変異株から選択することができる。
【００７８】 選択した必須のＳ．セレビシエ遺伝子を有する発現ベクターを、この選択した
必須のＳ．セレビシエ遺伝子の代わりに選択マーカー遺伝子を有する対応するヘ
テロ接合二倍体変異株にトランスフォームする。トランスフォーマントを、用い
た発現ベクターに含まれる栄養要求マーカーに基づく選択により単離する。こう
してトランスフォームされたヘテロ接合二倍体変異株を四分子分析にかける。４
つの生存可能な分離胞子が得られる。変異型対立遺伝子及び発現ベクターの対応
するマーカーを遡って調べることにより、トランスフォームされた野生型分離胞
子を必須遺伝子のゲノムコピーを含まない分離胞子から区別することができる。
選択した必須遺伝子のゲノムコピーを含まない分離胞子は、トランス補完される
一倍体変異株として示される。それらは、その後、適当なベクター中に存在する
他の真菌種由来のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーによるト
ランスフォーメーションに用いられる。
【００７９】 調節されたプロモーターとしては、誘導可能プロモーター又は抑制可能プロモ
ーターを用いることができる。これらのプロモーターは、自然に及び／又は人為
的に配置されたプロモーター配列よりなってよい。
【００８０】 調節されたプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ遺伝子のプロモーター及び
対応するプロモーター誘導体、例えばその異なるＵＡＳ(upstream activation s
equence)エレメントが除去されているプロモーター(GALS, GALL; Mumberg, J.等
(1994) Nucleic Acids Research 22:5767-5768)を用いることができる。調節さ
れたプロモーターとしては、糖新生遺伝子のプロモーター例えばＦＢＰ１、ＰＣ
Ｋ１、ＩＣＬ１又はそれらの部分例えばそれらの活性化配列(ＵＡＳ１及び／又
はＵＡＳ２)又は抑制配列(ＵＲＳ、upstream repression sequence)(Niederache
r等(1992), Curr.Genet.22:636-670；Proft等(1995) Mol.Gen.Gent.246:367-373
；Schuller等(1992) EMBO J;11:107-114；Guarente等(1984) Cell 36:503-511)
も用いることができる。
【００８１】 この方法で改変したＳ．セレビシエ変異株は、その調節されたプロモーターが
活性である生育条件下で、必須のＳ．セレビシエ遺伝子が発現されるように培養
することができる。これらのＳ．セレビシエ細胞を、次いで、研究中の真菌種の
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むライブラリーの典型的な量を用いてトランスフ
ォームする。トランスフォーマントは、その組換えベクター中にコード配列が存
在するタンパク質を追加的に発現する。
【００８２】 この方法は、選択した必須遺伝子が制御下にある調節されたプロモーターを阻
害するような仕方で生育条件が改変され得ることを企図している。特に、生育条
件は、生育培地を取り替えることにより変化させることができる。ＧＡＬ１プロ
モーター又はその誘導体を用いる場合には、ガラクトース含有培地(誘導状態)を
グルコース含有培地(抑制状態)により置き換えることができる。
【００８３】 これらの改変した条件は、組換えベクターが研究中の真菌種の機能的に類似の
ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを有していないＳ．セレビシエ細胞に対して致死的で
ある。対照的に、組換えベクターが研究中の真菌種の機能的に類似のコード配列
を発現するＳ．セレビシエ細胞は、致死的代謝欠損が機能的に類似の遺伝子にコ
ードされたタンパク質により補完されるので生存できる。
【００８４】 この方法は、組換えベクター(プラスミド)を生存しているトランスフォーマン
トから公知の方法を用いて単離することを企図している(Strathern, J.N.及びHi
ggins, D.R.(1991)。プラスミドを酵母から回収して大腸菌シャトルベクターに
組み込み(Guthrie, C.及びFink, G.R. Methods in Enzymology, 第194巻、Guide
to yeast genetic and molecular Biology. Academic Press, San Diego, 319-
329)、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡをＤＮＡ分析法例えばＤＮＡ配列決定法(Sange
r等(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467)を用いて分析する。
【００８５】 必須のＳ．セレビシエ遺伝子は、こうして他の真菌類における機能的に類似の
遺伝子及び／又は配列において相同な遺伝子の同定、特にヒト、動物及び植物に
対して病原性の真菌類における機能的に類似の及び／又は配列において相同な必
須遺伝子の同定に用いることができる。この目的のためには、例えば、藻菌類綱
又は真正菌類綱の真菌類を、詳細には、サブクラスの担子菌類、子嚢菌類、特に
、半子嚢菌類(酵母)及び不整子嚢菌目(糸状菌)及び裸胞子菌類(gymnascales)(皮
膚及び毛の真菌)、又は糸状不完全菌類のクラス、詳細には、サブクラスの分生
子菌類(conidiosporales)(皮膚の真菌)及び葉状体胞子菌目(出芽又は芽体形成真
菌)を用いることができる(これらの内では、特に、ケカビ、クモノスカビ、コク
シジオイデス、パラコクシジオイデス(ブラストミセス ブラジリエンシス)、エ
ンドミセス(ブラストミセス)、アスペルギルス、ペニシリウム(スコプラリオプ
シス)、白癬菌(クテノミセス)、表皮糸状菌、小胞子菌、ピエドライア、ルモデ
ンドラム、フィアロフォラ、スポロトリクム、クリプトコッカス、カンジダ、ゲ
オトリクム及びトリコスポロン種)。
【００８６】 特に興味深いのは、カンジダ種(特に、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・
グラブラタ)、アスペルギルス種(特に、アスペルギルス・フミガーツス)、コク
シジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラス
マ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマティティディス、パラコクシジオ
イデス・ブラジリエンス及びスポロトリックス・シェンキイの利用である。
【００８７】 上記の方法により同定されたＳ．セレビシエの遺伝子から出発して、出願人は
、Ｃ．アルビカンスから対応する必須遺伝子即ちＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１
２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣ
ａＪＬ０３９を下記の方法によりクローン化した。
【００８８】 先ず、Ｃ．アルビカンスの対応する断片を増幅するために、オリゴヌクレオチ
ドを、Ｓ．セレビシエ遺伝子の配列又は相同なＣ．アルビカンス配列において選
択する。クローニングの後に、得られた断片(約数百ｂｐの配列を示す)を、Ｃ．
アルビカンスの(ゲノム)ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプロー
ブとして利用する。このスクリーニングは、次のステップを含むことができる：
クローンをディッシュ上に広げて、フィルターで覆い、ＤＮＡを、これらのフィ
ルターに架橋させた(フィルターにハイブリダイズさせ、次いで、陽性クローン
を検出する)。選択したクローンを、次いで、配列決定する。
【００８９】 この方法は、必須の真菌遺伝子を用いて、これらの必須遺伝子の機能的発現及
び／又はコードされるタンパク質の機能的活性を部分的に又は完全に阻害するこ
とのできる物質を同定することを企図している。真菌類の生育を阻止し、例えば
薬物の製造において抗真菌剤として用いることのできる物質を、この様式で同定
することができる。
【００９０】 本発明は、特に、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢ
Ｒ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９から選択するＣ
．アルビカンス由来の必須遺伝子若しくは機能的に類似の他の病原性真菌類の遺
伝子又は対応するコードされるタンパク質を標的として利用するかかる阻害性物
質のスクリーニング方法をカバーしている。
【００９１】 機能的に類似の他の病原性真菌種の遺伝子とは、Ｃ．アルビカンスの同定され
た必須遺伝子と類似の又は同じ機能を有する遺伝子を意味する。機能的に類似の
他の病原性真菌類の遺伝子は、配列において、対応する必須のＣ．アルビカンス
遺伝子と相同であってよいが、必ずしもそうである必要はない。機能的に類似の
他の病原性真菌類の遺伝子は、ヌクレオチドレベルにおいて、対応する必須のＣ
．アルビカンス遺伝子に対する中位の配列相同性のみを示すことができる。中位
の配列相同性とは、本発明においては、ヌクレオチドレベルにおいて、少なくと
も５０％の、一層好ましくは少なくとも６０％の、最も好ましくは少なくとも７
０％の配列同一性を有する遺伝子を意味する。
【００９２】 更に、機能的に類似の他の病原性真菌類の遺伝子は、配列において、必須のＣ
．アルビカンス遺伝子にコードされるタンパク質と相同なタンパク質をコードす
ることができるが、必ずしもそうである必要はない。機能的に類似の他の真菌類
のタンパク質は、必須のＣ．アルビカンス遺伝子にコードされるタンパク質に対
する中位のタンパク質配列相同性を示すことができる。
【００９３】 中位のタンパク質配列相同性とは、本発明においては、アミノ酸レベルにおい
て、少なくとも４０％の、好ましくは少なくとも５０％の、一層好ましくは少な
くとも６０％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有するタンパ
ク質を意味する。
【００９４】 この方法の特別の特徴は、必須の真菌類遺伝子又は対応するコードされるタン
パク質をこれらの物質のスクリーニングのための標的として利用することである
。この方法は、必須のＣ．アルビカンス遺伝子並びに機能的に類似の遺伝子及び
／又は配列において他の病原性真菌類と相同な遺伝子又は対応するコードされる
タンパク質を標的として利用することを企図している。
【００９５】 この発明のスクリーニング方法の一具体例によれば、標的として用いられる必
須遺伝子を含む真菌細胞を用意し、それらの細胞を試験すべき物質とインキュベ
ートする。この方法により、この物質のこの必須標的遺伝子に関しての生育阻害
効果が測定される。
【００９６】 必須標的遺伝子を様々な程度に発現している真菌細胞を用い、次いで、これら
の細胞を試験すべき物質と共にインキュベートしてこの物質の生育阻害効果を測
定する。
【００９７】 この方法は、必須標的遺伝子を異なるレベルに発現するという点で異なってい
る２種類以上の真菌細胞又はそれらから誘導された株の利用を含んでいる。
【００９８】 例えば、２、３、４、５、１０種類の又はそれ以上の真菌細胞又は対応する真
菌株を限定した濃度で用いる物質の生育阻害効果に関して比較分析することがで
きる。かかる発現の程度のシリーズにより、抗真菌性物質を、細胞傷害性物質又
は不活性な物質から区別することができる。
【００９９】 この方法の特定の具体例は、一倍体真菌細胞／株の、特に、一倍体Ｓ．セレビ
シエ細胞／株のスクリーニングのための利用を含む。
【０１００】 この方法は、標的として選択した必須遺伝子の適当な発現ベクター中への組込
みを企図している。
【０１０１】 発現ベクターとしては、例えば、大腸菌／Ｓ．セレビシエシャトルベクターが
適当である。特に、細胞当たりのコピー数が異なるベクターを用いることができ
る。それ故、トランスフォームされたＳ．セレビシエ細胞中に高いコピー数で存
在するベクターを用いることもできるし、低いコピー数のものを用いることもで
きる。一具体例は、標的遺伝子のＳ．セレビシエゲノム中への組込みを可能にす
る発現ベクターの利用を含む。
【０１０２】 例えば、ベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、ｐＲＳ４２６
、ｐＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５、ｐＲＳ３１６、ｐＲＳ３０３、
ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６(Sikorki及びHieter, 1989；Christ
ianson等 1992)は、発現ベクターとして適当である。
【０１０３】 シリーズｐＲＳ４２３−ｐＲＳ４２６のベクターは、細胞当たり約５０〜１０
０コピーの高いコピー数で存在する。対照的に、シリーズｐＲＳ３１３−ｐＲＳ
３１６のベクターは、低いコピー数(１〜２コピー／細胞)で存在する。これらの
２つのシリーズからの発現ベクターを用いる場合には、標的遺伝子は、染色体外
コピーとして存在する。シリーズｐＲＳ３０３−ｐＲＳ３０６のベクターを用い
る場合には、標的遺伝子のゲノム中への組込みが可能となる。これらの３つの異
なる発現ベクター型を使用することにより、研究すべき機能的に類似の必須遺伝
子の漸次的発現が可能である。
【０１０４】 この方法は、物質の真菌細胞／株に関する生育阻害効果を、例えば細胞当たり
のベクターのコピー数の異なる発現ベクターを用いることにより比較測定するこ
とを含んでいる。
【０１０５】 かかる細胞は、必須標的遺伝子を様々な程度に発現することができ、この物質
に関して漸増する反応を示すことができる。
【０１０６】 この方法は又、標的遺伝子を発現ベクター中に特異的に選択したＳ．セレビシ
エプロモーターとターミネーターの間に挿入することにより、標的遺伝子の異な
る強度の発現を異なる真菌細胞において得ること(調節された過剰発現)をも含ん
でいる。構成的に発現されるが異なる強度を有するＳ．セレビシエプロモーター
は、適当である。かかるプロモーターの例は、Ｓ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ２５
、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１の天然のプロ
モーター並びに対応するこれらからの誘導体(例えば、特異的アクチベーター及
び／又はリプレッサー配列を有しないプロモーター誘導体)である。
【０１０７】 調節されたプロモーターは又、標的遺伝子の漸増する過剰発現にも適している
。ＧＡＬ１遺伝子の天然のプロモーター及び／又は対応するそれらの誘導体、例
えば、異なるＵＡＳエレメントが除去されているプロモーター。(ＧＡＬＳ、Ｇ
ＡＬＬ；Mumberg等(1994) Nucleic Acids Research 22:5767-5768)並びに糖新生
遺伝子のプロモーター、例えばプロモーターＦＢＰ１、ＰＣＫ１、ＩＣＬ１又は
これらの部分、例えばそれらのアクチベーター配列(ＵＡＳ１又はＵＡＳ２)又は
リプレッサー(ＵＲＳ)配列は、対応する活性化可能でない及び／又は抑制可能で
ない試験プロモーターにおいて用いられる(Schuller等(1992) EMBO J. 11:107-1
14)Guarente等(1984) Cell 36:503-511；Niederacher等(1992) Curr.Genet. 22:
363-370；Proft等(1995) Mol.Gen.Genet.246:367-373)。
【０１０８】 この発現ベクター中では、ターミネーター例えばＳ．セレビシエ遺伝子ＭＥＴ
２５、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨＩ、ＵＲＡ３のターミネーター配
列が用いられる。
【０１０９】 この方法は、巧妙に選択した発現ベクター型の利用及び／又は適当な発現ベク
ターの調製により、最終的に異なる強度の及び異なる調節を受けるプロモーター
を利用することにより、一連の発現ベクター(すべて、同じ標的遺伝子を含んで
いるが、その標的遺伝子を異なる程度に発現する点で異なっている)を構築する
ことができることを含んでいる。
【０１１０】 この方法は、Ｓ．セレビシエの一倍体野生型細胞における発現ベクターのトラ
ンスフォーメーションを含んでいる。こうして得られたＳ．セレビシエ細胞／株
を液体培地中で培養し、種々の濃度の試験する物質の存在下でインキュベートし
て、この物質の、標的遺伝子を異なる程度に発現する細胞／株の生育に対する効
果を比較分析する。この方法は又、標的遺伝子を有しないそれぞれの発現ベクタ
ー型を用いてトランスフォームした一倍体Ｓ．セレビシエ細胞／株を対照として
用いることをも含んでいる。
【０１１１】 この方法は、これらの物質のスクリーニングは、調節されたプロモーター特に
ＧＡＬ１プロモーター及びその誘導体(ＧＡＬＳ及びＧＡＬＬ)を用いて種々の培
地において実施することができる(何故なら、発現の程度は、それぞれの培地の
選択により大いに影響され得るから)ということを含んでいる。従って、ＧＡＬ
１プロモーターの発現の程度は、次の様式で減少する：２％ガラクトース ＞
１％ガラクトース＋１％グルコース ＞ ２％グリセリン ＞ ２％グルコース
。
【０１１２】 Ｓ．セレビシエの野生型細胞の生育を阻害する物質の効果は、機能的に類似の
他の真菌種の遺伝子の過剰発現により部分的に又は完全に補償され得る。
【０１１３】 一具体例によれば、この抗真菌性物質のスクリーニング法を、必須遺伝子若し
くは機能的に類似の遺伝子又は対応するコードされるタンパク質の試験すべき物
質への接触及びその物質の標的に対する効果の測定によりイン・ビトロで実施す
る。２つの分子の相互作用を測定するのに適した任意のイン・ビトロ試験例えば
ハイブリダイゼーション試験又は機能試験を用いることができる(例えば、Bergm
eyer H.U., Methods of Enzymatic Analysis, VCH Publishersに詳述されている
酵素的試験)。コードされるタンパク質を標的として用いてスクリーニングを行
うならば、対応する必須遺伝子を当分野で公知の任意の適当な方法例えば適当な
制限部位を含むプライマーのセットを用いるＰＣＲ増幅(Current Protocol in M
olecular Biology, John Wiley and Sons, Inc)により発現システム例えば大腸
菌、バキュロウイルス又は酵母に挿入し、次いで、発現されたタンパク質を当分
野で公知の方法により完全に又は部分的に精製する。発現されたタンパク質の精
製に適した任意の精製法例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いること
ができる。もし標的タンパク質の機能が公知であるならば、抗真菌性物質のその
タンパク質の機能に対する効果を測定する機能試験を行うことができる。もしこ
のタンパク質の機能が未知の場合には、この標的タンパク質と相互作用し得る(
例えば、コードされるタンパク質に結合する)物質を試験することができる。か
かる場合には、適当な酵素による酵素的消化からの標的タンパク質の保護等の試
験を用いることができる。
【０１１４】 １つの特別の具体例によれば、抗真菌性物質のスクリーニング法は、ジヒドロ
プロテロエートシンターゼ(ＤＨＰＳ)及び／又は７，８−ジヒドロ−６−ヒドロ
キシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼ(ＨＰＰＫ)の活性を測定する酵素アッ
セイに対応し；この酵素アッセイは、「Bergmeyer H.U., Methods in Enzymatic
analysis, VCH Publishers」に開示されたようなものであってよい。
【０１１５】 ジヒドロプテロエートシンターゼ(ＤＨＰＳ)は、６−ヒドロキシメチル−７，
８−ジヒドロプテリンピロホスフェートのパラアミノ安息香酸への縮合を触媒し
て７，８−ジヒドロプテロエートを形成し、これは、６−ヒドロキシメチル−７
，８−ジヒドロプテリンから７，８−ジヒドロ葉酸への３ステップの経路中の第
２ステップに相当する。７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピ
ロホスホキナーゼ(ＨＰＰＫ)は、ピロホスフェートの６−ヒドロキシメチル−７
，８−ジヒドロプテリンへの結合を触媒して６−ヒドロキシメチル−７，８−ジ
ヒドロプテリンピロホスフェートを形成し、これは、７，８−ジヒドロ葉酸への
３ステップの経路の第１ステップに相当する。すべての生物は、様々な代謝産物
の合成のために還元葉酸補因子を必要とする。殆どの微生物は、高等脊椎動物細
胞の能動輸送システム(これらの生物が食餌中の葉酸を利用することを可能にす
る)を欠くので葉酸をデ・ノボ合成しなければならない。葉酸の生合成に関与す
る酵素は、それ故、様々な抗菌剤の標的である。従って、これらの酵素の活性は
微生物に必須であり、ヒトには存在しない。
【０１１６】 この方法は又、ヒト、動物又は植物に由来する必須のＣ．アルビカンス遺伝子
に機能的に類似し及び／又は配列において相同である遺伝子の同定をも含んでい
る。これらの対応するヒト、動物又は植物の遺伝子は、適宜、この方法における
標的遺伝子として抗真菌性物質がこれらの標的遺伝子に対する効果を示すかどう
かを試験するために用いることができる。
【０１１７】 この方法の特別の利点は、この方法においては、効率的に真菌類の生育を阻害
する物質を同定することができ且つこれらの物質の対応する機能的に類似の遺伝
子及び／又はヒト、動物若しくは植物に由来する必須のＣ．アルビカンス遺伝子
と配列において相同な遺伝子に対する影響をも測定することができることである
。
【０１１８】 この方法は又、機能的に類似の遺伝子及び／又は対応する必須の真菌遺伝子と
配列において相同なヒト、動物若しくは植物の遺伝子の存在を、例えば、同定さ
れた必須の真菌遺伝子又はその部分のヒト、動物若しくは植物の配列遺伝子(デ
ータバンクにて利用可能)との相同性を調べることにより調べる可能性をも含ん
でいる。この方法においては、目的に依って、例えば、機能的に類似の遺伝子及
び／又は配列において相同な遺伝子が存在しないものを、初期ステージにおいて
、同定された必須の真菌遺伝子から選択することが可能である。
【０１１９】 それにより、この方法は、抗真菌性効果を有するがヒトに対する有害な影響は
有しない物質を選択的に同定する多くの可能性を提供する。
【０１２０】 例えば、真菌症の治療のため又は免疫抑制状態における予防のための薬物の製
造に利用できる物質を同定するが可能である。これらの物質は、例えば、ＡＩＤ
Ｓ又は糖尿病のような病気の際に起きる真菌感染の治療に用いることのできる薬
物の製造のために用いることができる。殺真菌剤特にヒト及び動物に無害の殺真
菌剤の製造に用いることのできる物質を同定することもできる。
【０１２１】 その上、この方法は、特異的な真菌種の生育のみを選択的に阻害する抗真菌性
物質を同定する可能性を提供する。
【０１２２】 このスクリーニング法は、遺伝子が必須であるかどうかを知れば十分であり、
必須遺伝子の機能又はコードされるタンパク質の機能に関する如何なる更なる情
報も必要でない限り、特に有利である。加えて、それは、必須のＳ．セレビシエ
遺伝子と機能的に類似の遺伝子の他の真菌類(多くの遺伝子についてＤＮＡ配列
が利用できないもの)における同定に特に有利である。
【０１２３】 他の面によれば、この発明は、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２
５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５又はＣａＪＬ０３９遺
伝子によりコードされるタンパク質又はそれらのポリペプチド性断片に対する抗
体を提供する。用語「抗体」は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を包含
する。該抗体は、当分野で周知の方法例えば「Antibodies, a laboratory manua
l」Harbow及びDavid Lane編(Cold Spring Harbor Laboratory編、1988)に開示さ
れているものによって製造することができる。
【０１２４】 他の面によれば、本発明は、ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５
６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５若しくはＣａＪＬ０３９
よりなる群から選択する遺伝子、それらと機能的に類似する遺伝子、それらの機
能的断片、対応するコードされるタンパク質、それらの機能的なポリペプチド断
片、又はＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、
ＣａＩＲ０１２、ＣａＤＲ３２５若しくはＣａＪＬ０３９遺伝子により若しくは
機能的に類似の遺伝子によりコードされるタンパク質若しくはそれらのポリペプ
チド性断片に対する抗体を含む、真菌感染の診断のためのキットを提供する。か
かるキットは、当分野で周知の任意の適当な方法を用いて製造することができる
。
【０１２５】 実施例 実施例１：ＣａＮＬ２５６ スタンフォードのインターネットサイト(http://candida.stanford.edu/)は、
Ｃ．アルビカンスのゲノムの仮配列へのアクセスを与える。これらの配列の１つ
は、Ｓ．セレビシエのＹＮＬ２５６遺伝子との相同性を有している。Ｃ．アルビ
カンスの対応する断片を増幅するために、この配列中の２つのオリゴヌクレオチ
ド(5'-ATTCATCCCATCAGTGCAGAAAG-3'及び5'-ATTGACCAATAGCTCTAATTAATG-3')を選
択した。クローニング後に、我々は、予想された配列に近い３９９ｂｐの配列(S
EQ ID NO:１)を得た。その演繹されるタンパク質をＹＮＬ２５６の１つと比較し
て、５３％の類似性及び４３％の同一性を示した(図１)。Ｃ．アルビカンスのこ
の３９９ｂｐの断片を、Ｃ．アルビカンスのゲノムライブラリーをスクリーニン
グするためのプローブとして用いた。後者は、Ｃ．アルビカンスのゲノムＤＮＡ
のＳａｕ３ＡＩによる部分消化及びＹＥＰ２４ベクター中のＢａｍＨＩ部位への
クローニングにより調製した。このライブラリーのクローンを、次いで、ディッ
シュ当たり２０００クローンの密度で広げた。各ディッシュをニトロセルロース
フィルターで覆ってから、続けて、０．５Ｍ ＮａＯＨ(５分間)；１Ｍトリス(
ｐＨ７．７、５分間)；０．５Ｍトリス(ｐＨ７．７)、１．２５Ｍ ＮａＣｌ(５
分間)で処理した。乾燥後に、これらのフィルターを２時間８０℃に保持した。
予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、４０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭトリス(ｐＨ７．７)１×デンハート０．１％ＳＤＳの
緩衝液中で行った。このプローブをＲｅｄｉＰｒｉｍｅキット及びAmersham UK
製のｄＣＴＰを用いて３２Ｐで標識した。ハイブリダイゼーションは、１７時間
にわたって４２℃で起きた。その後、これらのフィルターを１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで、室温で５分間３回洗ってから６０℃で３０分間２回洗い、次いで、
一晩オートラジオグラフィーにかけた。得られたスポットに対応するコロニーを
低密度に再び広げてから更にハイブリダイゼーションを行うことにより再び単離
した。３つのクローンが、こうして得られ(４０，０００から)、それらを、ＡＢ
Ｉ３７７装置で配列決定した。それらの配列をＡＢＩソフトウェアを用いて編集
してからＧＣＧソフトウェアパッケージを用いて分析した。これらの３つのクロ
ーンの内の１つが用いたプローブに対応する完全なコード配列を含むことが判明
し、この遺伝子はＣａＮＬ２５６と呼ばれた(その配列をSEQ ID NO:２に示す)。
ＣａＮＬ２５６は、Ｓ．セレビシエのＹＮＬ２５６と同じヌクレオチドを５２％
有している。そのコード領域は、Ｎ末端において一層短い。アミノ酸への翻訳に
ついては、Ｃ．アルビカンスにおいては、ＣＴＧコドンがセリンに翻訳されると
いう事実に注意を払った(ＣａＮＬ２５６中には、３つのＣＴＧコドンがある)。
この演繹したタンパク質は、Ｓ．セレビシエのＹＮＬ２５６と同一の４０％のア
ミノ酸を有し且つニューモシスチシ・カリニのＦＡＳ(葉酸シンターゼ)と同一の
４１％のアミノ酸を有した。Ｂｌａｓｔソフトウェアを用いたデータベースへの
調査は、ＣａＮＬ２５６タンパク質の２つの部分が、それぞれ、ハエモフィルス
・インフルエンザ、スタフィロコッカス・ハエモリチクス、ネイセリア・メニン
ギチディス、ストレプトコッカス・ニューモニア、バチルス・スブチリス、クロ
ストリジウム・アセトブチリクム、大腸菌、ミコバクテリウム・レプラの細菌酵
素ジヒドロプテロエートシンターゼ(ＥＣ２．５．１．１５)（ＤＨＰＳ）と相同
であること(Ｐ値ｅ−２８未満)及びバチルス・スブチリス、大腸菌、ハエモフィ
ルス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ニューモニアの７，８−ジヒドロ
−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼ(ＥＣ２．７．６．３)(
ＨＰＰＫ)と相同であること(Ｐ値ｅ−２０未満)を示した。ＤＨＰＳ及びＨＰＰ
Ｋに特徴的なユニットは、ＣａＮＬ２５６中にも見出される。
【０１２６】 実施例２：ＣａＢＲ１０２ スタンフォードのインターネットサイト(http://candida.stanford.edu/)は、
Ｃ．アルビカンスのゲノムの仮配列へのアクセスを与える。これらの配列の１つ
は、Ｓ．セレビシエのＹＢＲ１０２遺伝子との相同性を有している。Ｃ．アルビ
カンスの対応する断片を増幅するために、この配列中の２つのオリゴヌクレオチ
ド(5'-AGTATTCAATTGGGTATTCC-3'及び5'-CCGGCATCATCAGTAACTCC-3')を選択した。
クローニング後に、我々は、６４７ｂｐの配列(SEQ ID NO:３)を得た。その演繹
されるタンパク質をＹＮＬ１０２の１つと比較して、３５％の類似性及び２６％
の同一性を示した(図２)。この断片をＰｆｕポリメラーゼ(Stratagene)を用いて
増幅した。ＰＣＲ産物を精製し(High Pure PCR Product Purification Kit, Boe
hringer Mannheim)、Ｃ．アルビカンスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするためのプローブとして用いた。後者は、Ｃ．アルビカンスゲノムＤＮＡ
をＳａｕＩＩＩＡで部分消化してＹＥＰ−２４ＴＲＰ１ベクター中のＢａｍＨＩ
制限部位にクローン化することにより調製した。このライブラリーの４０，００
０クローンを、次いで、ディッシュ当たり２０００クローンの密度に広げた。各
ディッシュをニトロセルロースフィルター(Ｍｅｍｂｒａｎａ Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎ＋、Amersham)で覆ってから、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ(５分
間)；１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．２)／１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ(３分間、２回)で続けて処理し；ＤＮＡをこれらのフィルター(紫外線架
橋剤、Amersham Life Science)に架橋した。このプローブを、ＲｅｄｉＰｒｉｍ
ｅキット及びｄＣＴＰ(Amersham Life Science)を用いて３２Ｐで標識した。こ
れらのフィルターを、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５％デンハート溶液、
１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ及び濃度１０６ｃｐｍ／ｍｌのプ
ローブを含む緩衝液中で、４２℃で、１６時間にわたってハイブリダイズさせた
。その後、これらのメンブレンを３回室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で各
５分間洗い、そして３回６０℃で１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で各２０分間洗
った。次いで、各フィルターを一晩Ｘ線フィルムに露光した。陽性クローンに対
応するコロニーを単離して、同じ手順によって第二次スクリーニングを行った。
２つの陽性クローンが最終的に得られ、それらを、ＡＢＩ３７７装置で配列決定
した。これらの配列をＡＢＩソフトウェアを用いて編集してから、ＧＣＧソフト
ウェアパッケージを用いて分析した。これらの２つのクローンのヌクレオチド配
列は同じであって、用いたプローブに対応する完全なコード配列を含んでいた(
この遺伝子は、ＣａＢＲ１０１と呼ばれ、その配列をSEQ ID NO:４に示す)。こ
のヌクレオチド配列の翻訳を調べたが、Ｃ．アルビカンスにおいてはＣＴＧコド
ンがセリンに翻訳されるという事実に注意を払った(ＣａＢＲ１０２中には、３
つのＣＴＧコドンがある)。この演繹されたタンパク質は、Ｓ．セレビシエ遺伝
子ＹＢＲ１０２に対して２４％の同一性を有している。
【０１２７】 実施例３：ＣａＩＲ０１２ Ｃ．アルビカンスＣａｆ２−１株に由来する染色体ＤＮＡを、Ｙｅａｓｔ Ｃ
ｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ及びＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ(BIO
101製)を用いて単離した。Ｃ．アルビカンスのゲノムＤＮＡに由来する３４３ｂ
ｐの断片(SEQ ID NO:５)を、オリゴヌクレオチドプライマーＣａＹＩＲ０１２−
５’(5'-GACGTCGTAGACGATACTCAAGAAG-3')及びＣａＹＩＲ０１２−３’(5'-CTGCA
GTAAACCCTCCAGATATAACAG-3')を用いて、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＤＮＡポリメラ
ーゼ(PAN Systems GmbH)により増幅した(ホットスタート技術使用)。このＰＣＲ
産物をアガロースゲルから精製して、フルオレセイン(Ｇｅｎｅ ｉｍａｇｅ
ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ、Amersham Lif
e Science)により製造業者の指示に従って標識した。大腸菌由来のプラスミドＤ
ＮＡを、Ｑｉａｇｅｎカラムを用いて製造業者の勧めるようにして単離した。λ
ＺＡＰＩＩＣ．アルビカンスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを、製造業
者(Stratagene社)の指示に従って行った。ナイロンフィルター(Schleicher&Schu
ell)を、１５０００ｐｆｕ／プレートのＬＢプレート(１５０ｍｍ)からリフトし
て、１．５Ｍ ＮａＣＬ、０．５Ｍ ＮａＯＨ中で５分間変性し、１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)中で３分間中和し、０．２Ｍトリ
ス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２×ＳＳＣ中で３分間洗い、ＤＮＡをそれらのフィル
ターに架橋させた(Stratagene製、ＵＶ架橋剤)。これらのフィルターを、６０℃
で４時間予備ハイブリダイズさせ、６０℃で一晩、フルオレセイン標識したＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズさせた。抗フルオレセインＡＰコンジュゲート(Ｓ
ｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒ
Ｉｍａｇｅｒ、Amersham LIFE SCIENCE)を用いて検出を行い、２０時間後にＦｌ
ｕｏｒｉｍａｇｅｒ(Ｓｔｏｒｍ８６０、Molecular Dynamics)を用いて分析した
。陽性プラークをピックアップして０．５ｍｌのＳＭ緩衝液(１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．０１％
ゼラチン)と共にインキュベートした。これらの選択したクローンを希釈し、宿
主細胞ＸＬ１−Ｂｌｕｅを用いて滴定し、同じ手順によって第二次の精製を行っ
た。最後に、関心あるＤＮＡインサートを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ(−)
ファージミドをStratageneのプロトコールに従ってＥｘＡｓｓｉｓｔ Ｈｅｌｐ
ｅｒ Ｐｈａｇｅシステムによりレスキューした。全部で７５０００のスクリー
ニングしたプラークから、３つの陽性クローンが同定された。ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ(−)ファージミドＤＮＡを単離して、Ｔ３及びＴ７プライマーを用い
て配列決定し、これらの配列をカスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーを用
いて伸長させた。ヌクレオチド配列分析を、Ｇｅｎｅ Ｄａｔａ ソフトウェア
パッケージ(スイス国、Basel在、Gene Data AG)を用いて行った。Ｓｗｉｓｓｐ
ｒｏｔデータベースでの類似性調査をＢＬＡＳＴプログラム(Gish, Warren及びD
avid J. States(1993), Identification of protein coding regions by databa
se similarity search, Nat.Genet. 3:266-72)を用いて行った。これらの３つの
クローンの内の１つは、用いたプローブに対応する完全なコード配列を含むこと
が判明した(この遺伝子は、ＣａＩＲ０１２と呼ばれ、その配列は、SEQ ID NO:
６に示してある)。
【０１２８】 実施例４：ＣａＪＬ０３９ ＣａＪＬ０３９配列をSEQ ID NO:７に描写してある。 ＣａＪＬ０３９遺伝子を、公開のスタンフォードカンジダアルビカンス配列デ
ータベースから提供された遺伝子断片データに基づいてクローン化した。
【０１２９】 (ａ)Ｓ．セレビシエＹＪＬ０３９ｃに対する相同性を示す断片を同定した(そ
の配列をSEQ ID NO:８に与える)。
【０１３０】 実施例３に開示した手順をオリゴヌクレオチドプライマー対(Ｃａ０３９ｓ：T
AG CTC AAC CTA CCA CCA ATC /Ｃａ０３９ｒ：ATC ACA AGA CTG TCA ATG TAA AT
)を用いて、短いＰＣＲ断片(２３４塩基対長)を、カンジダ・アルビカンスｃＤ
ＮＡラムダＺＡＰＩＩライブラリー(Aberdeen、Alistair Brown提供)をスクリー
ニングするために増幅した。
【０１３１】 ３`コード領域の３つの陽性クローンが得られた(＃２１ｔ７、１１ｔ３、２１
ｔ３)。
【０１３２】 (ｂ)プライマーウォーキング法を用いる内部断片の３`及び５`伸長 SanglardカンジダゲノムＤＮＡライブラリー(ＹＥｐ２４ベクター主鎖使用)を
、３`及び５`コード配列の更なる増幅に用いた。増幅を下記のベクター特異的オ
リゴヌクレオチドプライマーとＣａＪＬ０３９断片に特異的なプライマーを用い
て行った： cggaattcctatcgactacgcgatcatgg：ＹＥｐ２４ｆｏｒ(ベクター特異的) gcgaattccgatataggcgccagcaac：ＹＥｐ２４ｂａ(ベクター特異的) caattgctttgactcgggtgttattaagt：Ｃａ０３９−５１(ＣａＪＬ０３９：５`フ
ィッシング) tcttggcacaacttgataagaatctgt：Ｃａ０３９−５２(`) taggtgtacgcgaaagccaagtagaac：Ｃａ０３９−５３(`) ttgttaatcgtacacctaaggtgttgac：Ｃａ０３９−３１(ＣａＪＬ０３９：３`フィ
ッシング) ttgcagattgatgctagcaatgtatttg：Ｃａ０３９−３２(`)
【０１３３】 プライマーウォーキングの技術を用いて、完全な５`配列を増幅することがで
きる(クローン１４ｂ−１−１及びクローン１７ｂ−３−４)。
【０１３４】 失われた３`配列を、ＧＴＣ ＰａｔｈｏＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｌｅａｓｅ５．
０、コンティグ＃２８３０から入手した。
【０１３５】 相互作用タンパク質(Ｃ８２、酵母のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのコンポーネ
ント)が同定された。
【０１３６】 実施例５：ＣａＯＲ１１０ ５．１．ＣａＯＲ１１０ ＣａＯＲ１１０配列をSEQ ID NO:９に描いてある。 ＣａＯＲ１１０を、公開のスタンフォードカンジダアルビカンス配列データベ
ースから提供された遺伝子断片データに基づいてクローン化した。
【０１３７】 (ａ)小さいＳｃＯＲ１１０相同断片をハイブリダイゼーション実験で用いて、
カンジダ・アルビカンスラムダＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリー(Alistair Brow
n提供)中のＣａＯＲ１１０クローンを同定した。カンジダ・アルビカンスＣａＯ
Ｒ１１０配列のハイブリダイゼーションに用いた断片とのアラインメントを図３
に与える。この相同な断片の配列をSEQ ID NO:１７に与える。
【０１３８】 (ｂ)内部断片の３’及び５’伸長： ＹＥＰ２４ベクター主鎖中のSanglardカンジダゲノムＤＮＡライブラリー(Ｒ
ＭＶより)を、３’及び５’コード配列及び非コード配列の増幅に用いた。この
増幅を下記のベクター特異的なオリゴ(インサートに向かう向き)とＣａＯＲ１１
０断片特異的なオリゴ(ベクターのフランキング配列に向かう向き)を用いて行っ
た： cggaattcctatcgactacgcgatcatgg：ＹＥＰ２４ｆｏｒ gcgaattccgatataggcgccagcaac：ＹＥＰ２４ｂａ cgggatccggtaaccaattggatctataaccgtg：１１０−ｂａ−１５０ gcggatcctggtgcccttggtggtgaatg：ＣａＹＯＲ１１０Ａ gcggatccctcacaatatgacgattgaaact：ＣａＹＯＲ１１０Ｂ ggcgtcgactcaggcgccagttttacgtacttcaaattcatc：ＣａＹＯＲ１１０Ｃ tgtgaattcttgacacagggtga：ＣａＹＯＲ１１０Ｄ caaaccttcagcacaactcca：ＣａＹＯＲ１１０Ｅ
【０１３９】 最終的に組み立てられた３’及び５’非コード配列をも含む配列を配列決定に
より確認した。このコード領域をｐ４１４ＲＳＧＡＬＬベクター中にサブクロー
ン化した。
【０１４０】 マップを図４に描いてある。 相同な酵母ＯＲＦ(ＹＯＲ１１０ｗ)が、ＴＦＩＩＩＣポリメラーゼ複合体にお
いてＴＦＣ１と相互作用する転写因子サブユニットＴＦＣ７として記載されてい
る(Manaud等、1998, Mol.Cell.Biol. 18:3191-3200)。
【０１４１】 ５．２．ＣａＯＲ１１０スプライシング変異体 ＣａＯＲ１１０について、更なるスプライシング変異体が同定された。ＣａＯ
Ｒ１１０のスプライシング変異体のためのクローンを、カンジダ・アルビカンス
ｃＤＮＡライブラリーから得た。
【０１４２】 その配列をSEQ ID NO:１０に描いてある。 このスプライシング変異体は、元のＣａＯＲ１１０配列の９０７位のドナー部
位「ｇｔａｃｇｔ」を使用する。アクセプター部位は、１０４７である。このマ
ップを図５に開示する。
【０１４３】 元のＣａＯＲ１１０とスプライシング変異体とのアラインメントを図６に与え
る。
【０１４４】 実施例６：ＣａＭＲ２１２ ＣａＭＲ２１２配列をSEQ ID NO:１１に描いてある。 (ａ)ＣａＭＲ２１２を公開のスタンフォードカンジダアルビカンス配列データ
ベースからの遺伝子断片データに基づいてクローン化した。
【０１４５】 サッカロミセス・セレビシエ遺伝子ＹＭＲ２１２ｃに対する相同性を示す断片
の配列(Ｂｌａｓｔサーチ)をSEQ ID NO:１２に与える。
【０１４６】 これらのデータに基づいて、この断片のカンジダ・アルビカンスゲノムＤＮＡ
からの増幅を可能にする下記のオリゴをデザインした。 オリゴ： ＣａＹＭＲ２１２ｆｏｒ： 5'-cacctgtgaacaacccaccatc-3' ＣａＹＭＲ２１２ｂａｃｋ：5'-gaatatcctttttaactcaagag-3'
【０１４７】 (ｂ)ＣａＭＲ２１２からのこの内部断片の３’及び５’伸長 この目的のために、Dominique SanglardからのカンジダゲノムＤＮＡライブラ
リー(ＲＭＶから)を用いた。このライブラリーのＹＥｐ主鎖を用いて、３’及び
５’コード配列及び非コード配列をＰＣＲを用いて増幅した。これを、ＣａＭＲ
２１２の４９０ｂｐの断片に特異的なオリゴ(ベクターのフランキング領域に向
かう向き)とベクターに特異的なオリゴ(インサートに向かう向き)を用いて行っ
た。 オリゴ： ＹＥＰ２４ｆｏｒ(ベクター特異的)： 5'-cggaattcctatcgactacgcgatcatgg ＹＥＰ２４ｂａ(ベクター特異的)： 5'-gcgaattccgatataggcgccagcaac
【０１４８】 プライマーＹＥｐ２４ｆｏｒ及びＣａＭＲ２１２ｆｏｒは、ＣａＭＲ２１２由
来の５’−ＵＴＲ及び５’コード領域をコードする５００ｂｐの断片を与えた。
【０１４９】 プライマーＹＥＰ２４ｆｏｒ及びＣａＭＲ２１２ｂａｃｋを用いて、１４００
ｂｐのＣａＭＲ２１２断片を増幅した。この１４００ｂｐの断片の配列を用いて
、この断片に特異的な下記の新規なプライマーをデザインした。 オリゴ： Ｃａ２１２−１：5'-gctttcccagcaggataacattg Ｃａ２１２−２：5'-tgagttataatgcagctgttgg Ｃａ２１２−３：5'-catctcgtgtgaacatgattgg
【０１５０】 プライマーＹＥＰ２４ｆｏｒ及びＣａ２１２−３は、３’コード領域と３’Ｕ
ＴＳ領域をコードする１６００ｂｐの断片を与えた。
【０１５１】 これらの３つのＰＣＲ断片を用いて、２９００ｂｐの断片(コード配列と３’
及び５’非コード配列を含む)を組み立てた。下記の新規なプライマーを用いて
、これらのコード配列をゲノムＤＮＡライブラリーから増幅してｐ４１３ＧＡＬ
Ｌベクター中にクローン化した。 コード領域を増幅するためのオリゴ： Ｃａ２１２ｆｏｒ： 5'-agtttcttcaacttccagatccaag Ｃａ２１２ｂａｃｋ：5'-gtatatttgcaactgtctctctctc
【０１５２】 酵母同族体ＹＭＲ２１２ｃは、細胞壁機能においてある役割を果たしている(
何故なら、そのノックアウトが１Ｍソルビトール中でレスキューされ得るから)
。加えて、ＧＡＬプロモーターの調節下のＹＭＲ２１２ｃは、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅ
ｄ及びＣａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅに対する増大された感度を示す。ＹＭ
Ｒ２１２ｃは膜内在性タンパク質であり、原形質膜に局在している(ＹＭＲ２１
２−ＧＦＰ融合タンパク質の顕微鏡検査及びＹＭＲ２１２−ＧＳＴ融合タンパク
質の生化学的分析により示される)。
【０１５３】 実施例７：ＣａＤＲ３２５ ＣａＤＲ３２５配列をSEQ ID NO:１３に与える。 ＣａＤＲ３２５を、公開のスタンフォードカンジダアルビカンス配列データベ
ースからの遺伝子断片データに基づいてクローン化した。
【０１５４】 (ａ)サッカロミセス・セレビシエＹＤＲ３２５に対する相同性を示す３つの断
片が同定された(それらの配列をSEQ ID NO:１４、１５及び１６に開示する)。
【０１５５】 これらのデータに基づいて、データベース配列の確認及び約２２００ｂｐの内
部ＣａＤＲ３２５断片のゲノムＤＮＡからの増幅を可能にする下記のオリゴをデ
ザインした： cgagcatctacttgttcaaccac：ｈｙｂＣａＹＤＲ３２５ｂａオリゴ gaatctctggctcgctc： ３２５−ｊｕｌｓオリゴ gaccgagatacacgagaat： ３２５−ｊｕｌｒオリゴ ggttaaatgatcgtgatgaat： Ｃａ３２５ｒオリゴ caacctcactgacaaatactt： Ｃａ３２５ｓオリゴ
【０１５６】 最終的にサブクローン化された２２００ｂｐの内部断片を、ｈｙｂＣａＹＤＲ
３２５ｂａ＋３２５−ｊｕｌｒオリゴの組合せによって増幅した。
【０１５７】 (ｃ)内部断片の３’及び５’伸長： ＹＥＰ２４ベクター主鎖中のSanglardカンジダゲノムＤＮＡライブラリー(Ｒ
ＭＶから)を３’及び５’コード鎖及び非コード鎖の増幅に用いた。これを、下
記のベクター特異的オリゴ(インサートに向かう向き)とＣａＤＲ３２５の２２０
０ｂｐの断片に特異的なオリゴ(ベクターのフランキング配列に向かう向き)を用
いて行った： cggaattcctatcgactacgcgatcatgg： ＹＥＰ２４ｆｏｒ(ベクター特異的) gcgaattccgatataggcgccagcaac： ＹＥＰ２４ｂａ(ベクター特異的) acgcttccaatgtattattctcg： オリゴ１−１０−Ａｂａｃｋ ggatgccaatttccctga： オリゴ１−１０−Ｂｆｏｒ catccagaagatataacggct： オリゴ１−１０−Ｃｆｏｒ tgcataatctactcagcgaca： オリゴ１−１０−Ｄｂａｃｋ gtggttgaacaagtagatgctcg： オリゴ１−１０−Ｅｆｏｒ gcgcttgaaaccactagtgaattg： Ｃａ３２５Ｋｌｏｎ＿２＿Ｆｏ caattcactagtggtttcaagcgc： Ｃａ３２５Ｋｌｏｎ＿３＿Ｂａ
【０１５８】 ３’及び５’非コード配列をも含む最終的に組み立てられた４７００ｂｐの配
列を配列決定により確認した。そのコード領域をｐ４１３ＲＳＧＡＬＬベクター
中にサブクローン化した。
【０１５９】 地図を図７に開示する。 配列数は、配列表のフィールド１３０において同定されている。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/569 Ａ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/569 Ｃ１２Ｒ 1:725） // Ｃ１２Ｐ 21/08 1:66） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:725） Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニコラス カルヴァティス ドイツ連邦共和国 デー64646 ヘッペン カイム、クロークスヴェーク 15 (72)発明者 トーマス レイウー ドイツ連邦共和国 デー86926 グリーフ ェンベルク、アルシュピッツヴェーク 11 (72)発明者 ダニエル マルゲリエ ドイツ連邦共和国 デー60487 フランク フルト アム マイン、ファルクシュトラ ーセ 104 (72)発明者 アルムート ニッチェ ドイツ連邦共和国 デー82152 クライリ ング、ベルクシュトラーセ 20 (72)発明者 ユッタ ラインハルトリュップ ドイツ連邦共和国 デー81375 ミュンヒ ェン、ノイフリーデンハイマーシュトラー セ 82アー Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA34 AA35 BB14 BB29 BB51 DA13 DA36 FB02 FB03 FB08 4B024 AA11 AA13 BA80 CA04 EA04 FA15 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ07 QQ20 QQ21 QQ26 QR56 QR59 QR62 QR75 QR76 QR80 QS05 QS24 QS25 QS34 QS38 4B064 AG01 AG27 CA02 CA06 CA19 CA20 CC24 DA13 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA15 DA76 DA86 EA50 EA61 FA72 FA74

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７
    、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１又はSEQ ID NO:１３に描かれ
    た配列、これらの同族体及びこれらの機能的断片を有するポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:９
    、SEQ ID NO:１０又はSEQ ID NO:１１に描かれた配列、これらの同族体及びこれ
    らの機能的断片を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 遺伝子ＣａＮＬ２５６、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 遺伝子ＣａＢＲ１０２、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 遺伝子ＣａＩＲ０１２、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 遺伝子ＣａＭＲ２１２、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 遺伝子ＣａＤＲ３２５、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 遺伝子ＣａＯＲ１１０、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 遺伝子ＣａＪＬ０３９、その同族体及びその機能的断片であ
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 機能的に類似の遺伝子が、ヌクレオチドレベルで、少なく
    とも５０％の、好ましくは少なくとも６０％の、最も好ましくは少なくとも７０
    ％の配列同一性を有する、請求項３〜９の何れか１つに記載の遺伝子。
  11. 【請求項１１】 機能的に類似の遺伝子が、アミノ酸レベルで、コードされ
    るタンパク質と少なくとも４０％の、好ましくは少なくとも５０％の、一層好ま
    しくは少なくとも６０％の、最も好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有
    する、請求項３〜９の何れか１つに記載の遺伝子。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１の何れか１つに記載のポリヌクレオチドに
    よりコードされるタンパク質、その機能的ポリペプチド断片。
  13. 【請求項１３】 請求項３〜９の何れか１つに記載の遺伝子を含むプラスミ
    ド。
  14. 【請求項１４】 ＣＮＣＭに受入番号Ｉ−２０６５で寄託されたプラスミド
    。
  15. 【請求項１５】 ＣＮＣＭに受入番号Ｉ−２０６３で寄託されたプラスミド
    。
  16. 【請求項１６】 ＤＳＭＺに受入番号ＤＳＭ１２９７７で寄託されたプラス
    ミド。
  17. 【請求項１７】 ＤＳＭＺに受入番号ＤＳＭ１２９７６で寄託されたプラス
    ミド。
  18. 【請求項１８】 ＤＳＭＺに受入番号ＤＳＭ１２９７８で寄託されたプラス
    ミド。
  19. 【請求項１９】 ＤＳＭＺに受入番号ＤＳＭ１２９７９で寄託されたプラス
    ミド。
  20. 【請求項２０】 下記のステップを含む方法により得られるポリヌクレオチ
    ド及びその同族体及びその機能的断片： (ｉ)必須遺伝子をサッカロミセス・セレビシエから選択し； (ｉｉ)該遺伝子の配列をカンジダ・アルビカンスのゲノム配列と比較し； (ｉｉｉ)相同なオリゴヌクレオチド領域を演繹し； (ｉｖ)こうして得られたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅し； (ｖ)ステップ(ｉｖ)のアンプリマーを関心ある完全な遺伝子を検出するために
    利用する。
  21. 【請求項２１】 ステップ(ｖ)がステップ(ｉｖ)のアンプリマーを関心ある
    完全な遺伝子をカンジダ・アルビカンスゲノムライブラリーから検出するための
    プローブとして利用するステップよりなる、請求項２０に記載のポリヌクレオチ
    ド。
  22. 【請求項２２】 ステップ(ｖ)がステップ(ｉｖ)のアンプリマーを関心ある
    完全な遺伝子をカンジダ・アルビカンスｃＤＮＡライブラリーから検出するため
    のプローブとして利用するステップよりなる、請求項２０に記載のポリヌクレオ
    チド。
  23. 【請求項２３】 ステップ(ｖ)がＰＣＲ法を用いるアンプリマーの３’及び
    ５’伸長のステップよりなる、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】 請求項１２に記載のタンパク質又はその機能的ポリペプチ
    ド断片に対する抗体。
  25. 【請求項２５】 抗真菌性物質のスクリーニング方法であって、真菌類由来
    の必須遺伝子又は他の病原性真菌類由来の機能的に類似の遺伝子又は対応するコ
    ードされるタンパク質を標的として用い、必須遺伝子が請求項３〜９の何れか１
    つに記載のものである、当該スクリーニング方法。
  26. 【請求項２６】 必須遺伝子又は機能的に類似の真菌遺伝子を異なるレベル
    に発現する真菌細胞を試験すべき物質とインキュベートしてその物質の生育阻害
    効果を測定する、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記の標的遺伝子又は対応するコードされる標的タンパク
    質を試験すべき物質とイン・ビトロで接触させてその物質のこの標的に対する効
    果を測定する、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 スクリーニングされた物質が、必須遺伝子の機能的発現又
    はコードされるタンパク質の機能的活性を部分的に又は完全に阻害する、請求項
    ２５〜２７の何れか１つに記載の方法。
  29. 【請求項２９】 スクリーニングされた物質が、ジヒドロジヒドロプテロエ
    ートシンターゼ(ＤＨＰＳ)及び／又は７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチル
    プテリン−ピロホスホキナーゼ(ＨＰＰＫ)の活性を部分的に又は完全に阻害する
    、請求項２５〜２８の何れか１つに記載の方法。
  30. 【請求項３０】 真菌種を、担子菌類、子嚢菌類及び糸状不完全菌類よりな
    る群から選択する、請求項２５〜２９の何れか１つに記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記の機能的に類似の遺伝子が、カンジダ種又はアスペル
    ギルス種由来の必須遺伝子である、請求項２５〜３０の何れか１つに記載の方法
    。
  32. 【請求項３２】 前記の機能的に類似の遺伝子が、カンジダ・アルビカンス
    又はアスペルギルス・フミガーツスに由来する必須遺伝子である、請求項３１に
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】 機能的に類似の遺伝子が、ヌクレオチドレベルで、対応す
    る必須遺伝子と、少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも６０％の、最も好
    ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２５〜３２の何れか１
    つに記載の方法。
  34. 【請求項３４】 機能的に類似の遺伝子が、アミノ酸レベルで、対応する必
    須遺伝子にコードされるタンパク質と、少なくとも４０％の、好ましくは少なく
    とも５０％の、一層好ましくは少なくとも６０％の、最も好ましくは少なくとも
    ７０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項２５〜３３の何れ
    か１つに記載の方法。
  35. 【請求項３５】 真菌感染の診断のためのキットであって、ＣａＯＲ１１０
    、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ０１２、ＣａＤ
    Ｒ３２５及びＣａＪＬ０３９よりなる群から選択する遺伝子、これらの断片、そ
    の対応するコードされるタンパク質又はこれらの機能的ポリペプチド断片又は、
    ＣａＯＲ１１０、ＣａＭＲ２１２、ＣａＮＬ２５６、ＣａＢＲ１０２、ＣａＩＲ
    ０１２、ＣａＤＲ３２５及びＣａＪＬ０３９よりなる群から選択する遺伝子又は
    機能的に類似の遺伝子によりコードされるタンパク質又はそのポリペプチド断片
    に対する抗体を含む、当該キット。
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