SK2992001A3 - Essential genes from c. albicans and a method for screening antimycotic substances using said genes - Google Patents

Description

Oblasť techniky • Predkladaný vynález sa týka spôsobu na vyhladávanie anti* mykotických substancií, v ktorých sú esenciálne gény z hub, predovšetkým z Candida albicans (C. albicans), rovnako ako funkčne podobné gény z iných patogénnych hub, alebo príslušné kódované proteíny, použité ako ciele. Vynález sa takisto týka špecifických génov C. albicans.

Doterajší stav techniky

Spektrum známych mykotických infekcií siaha od mykotickýcíflnfekcií kože a nechtov po potenciálne nebezpečné mykotické infekcie vnútorných orgánov; také infekcie a následné ochorenia sú známe ako mykózy.

Antimykotické substancie (fungistatické alebo fungicídne) sú používané na liečbu mykóz. Avšak doposial je známych relatívne málo substancií s farmakologickými účinkami, ako je amfotericin B, Nystatin, Pimaricin, Griseofulvin, Clotrimazol,

5-fluoro-cytozín a Batraphene. Liečba mykotických infekcií je mimoriadne obťažná, najmä preto, že ako bunky hostiteľa, tak bunky hub, sú eukaryotické bunky. Podávanie liekov na báze známych antimykotických substancií má preto často nežiadúce

f. účinky, napríklad Amfotericin B má nefrotoxické účinky. Preto existuje silná potreba farmakologicky účinných substancií použiteľných na prípravu liekov, ktoré sú vhodné na profylaktickú liečbu pri stavoch s imunosupresiou alebo na liečbu existujúcej mykotickej infekcie. Okrem toho by tieto substancie mali vykazovať špecifické spektrum účinku pre selektívnu in-

	• ··	·· ··	·· ·
	• · · ·	• · ·	• · · ·
	• ··	• · ···	• · ·
2	··· ··	·· ··	·· ··

hibíciu rastu a proliferácie hub bez postihnutia liečeného organizmu.

Podstata vynálezu a

* Cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsob na identifikáciu antimykotických substancií a najmä na identifikáciu anti-Candidových substancií. Základným znakom tohto spôsobu je to, že esenciálne gény z hub sú použité ako ciele na vyhľadávanie liekov.

Predkladaný vynález sa preto týka spôsobu na vyhľadávanie antimykotických substancií, v ktorých sú esenciálne gény z hub, predovšetkým z Candida albicans (C. albicans), rovnako ako funkčne podobné gény z iných patogénnych hub, alebo príslušné kódované proteíny, použité ako ciele, a kde esenciálny gén je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 a CaJL039.

V jednom rozpracovaní spôsobu podľa predkladaného vynálezu sa bunky hub exprimujúce esenciálny gén, alebo funkčne podobný mykotický gén, v rôznej intenzite, inkubujú s testovanou substanciou a sleduje sa inhibičný efekt substancie na rast.

V inom rozpracovaní sa uvedený cieľový gén alebo zodpo.. vedajúci proteín kódovaný cieľovým génom kontaktuje in vitro j s testovanou substanciou a sleduje sa vplyv substancie na

- cieľ.

V inom rozpracovaní inhibujú vybrané substancie úplne alebo čiastočne funkčnú expresiu esenciálnych génov alebo funkčnú aktivitu kódovaných proteínov.

• ··	• ·	• ·	··
• · ·	•	• ·	• · «
• ··	•	• ···	• 1
• · · ·	··	• ·	·· ·

Podlá jedného rozpracovania inhibujú vybrané substancie čiastočne alebo úplne aktivitu dihydropteroát syntézy (DHPS) a/alebo 7,8-dihydro-6-hydroxymetylpterínpyrofosfokinázy (HPPK).

Podlá iného rozpracovania sú druhy hub vybrané zo skupiny zahŕňajúcej Basidiohuby, Ascohuby a Hyphohuby.

Podlá iného rozpracovania vynálezu sú uvedené funkčne podobné gény esenciálne gény z Candida spp., výhodne z Candida albicans, alebo z Aspergilus spp., výhodne z Aspergilus fumigatus.

V inom aspekte sa predkladaný vynález týka polynukleotidu majúceho sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ

ID NO:

6,

SEQ

ID NO:

7,

SEQ

ID NO: 9,

SEQ

ID NO: 10,

SEQ ID

NO:

11

alebo

SEQ

ID

NO:

13,

výhodne v

SEQ

ID NO: 2,

SEQ

ID NO:

4,

SEQ

ID

NO:

6,

SEQ

ID

NO:

9, SEQ ID

NO:

10, SEQ ID

NO:

11,

jeho homologov a funkčných fragmentov.

V inom aspekte sa predkladaný vynález týka génu vybraného zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 a CaJL039, lépe CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102 a CaIR012, alebo funkčne podobného génu alebo funkčného fragmentu.

</ Podlá iného rozpracovania má funkčne podobný gén alebo ~ homológny polynukleotid identitu sekvencie, na úrovni nukleotidov, s CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, v príslušnom poradí, aspoň 50%, lepšie aspoň 60%, a najlepšie aspoň 70%. Funkčný fragment je polynukleotidový fragment, ktorý si zachováva funkciu pôvodného produktu (nukleotidu alebo génu). Jedným príkladom je variant CaORllO • ·· ·· ·· • · · · · · · • ·· · ···· • · · · · · · • · · · · · ··· · · ·· ·· ·· · s alternatívnym zostrihom (ktorý je tiež homológny s pôvodným génom, s približne 90% identitou).

Pódia iného rozpracovania má funkčne podobný gén alebo . homológny polynukleotid identitu sekvencie kódovaného proteínu, na úrovni aminokyselín, s CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBRlO2,

·. CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, v príslušnom poradí, aspoň

50%, lepšie aspoň 60%, a najlepšie aspoň 70%.

Obrázky uvedené pre gény sa tiež týkajú polynukleotidov, rovnako ako termíny homológia a podobnosť.

V inom aspekte sa vynález týka proteínov kódovaných CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, v príslušnom poradí, génmi alebo funkcrfé podobnými génmi, alebo ich funkčných polypeptidových fragmentov.

V inom aspekte sa vynález týka plazmidu obsahujúceho CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, v príslušnom poradí, gény alebo funkčne podobné gény, alebo ich funkčné fragmenty.

V inom aspekte sa vynález týka plazmidu (baktérie obsahujúcej plazmid) uloženého v NCM (Inštitút Pasteur, Paris) 13.8.1998 pod prírastkovými č. 1-2065, 1-2063 a 1-2064, ktoré _ŕ zodpovedajú génom CaNL 256, CaBR102, CaIR012, v príslušnom / poradí.

V inom aspektu sa vynález týka plazmidu (baktérie obsahujúcej plazmid) uloženého v DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen, Germany) 6.8.1999 pod prírastkovými č. DSM 12977, DSM 12976, DSM 12978 a DSM 12979, ktoré

• ··	• ·	··	• · ·
• · ·	•	• ·	• · ··
• ··	•	• ···	• · ·
• · · ·	• ·	• ·	·· ··

zodpovedajú génom CaDR325, CaORllO, CaORllO variantu s alternatívnym zostrihom a CaMR212, v príslušnom poradí.

V inom aspektu poskytuje predkladaný vynález kit na diagnostiku mykotických infekcií obsahujúci gén vybraný zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBRlO2, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, funkčne podobné gény, ich funkčné fragmenty, príslušné kódované proteíny alebo ich funkčné polypeptidové fragmenty.

V inom aspekte predkladaný vynález poskytuje protilátku namierenú proti proteínu kódovanému CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, v príslušnom poradí, génom alebo funkčne podobným génom, alebo jeho polypeptidovému fragmentu.

V ešte inom aspekte predkladaný vynález poskytuje polynukleotid získateíný spôsobom zahŕňajúcim nasledujúce kroky:

(i) selekciu esenciálneho génu zo Saccharomyces cerevisiae;

(ii) porovnanie sekvencie uvedeného génu so sekvenciami genómu Candida albicans;

(iii) zistenie homológnych oligonukleotidových regiónov;

(iv) PCR amplifikáciu takto získaných oligonukleotidov;

(v) použitie amplifikovaných sekvencií zo stupňa (iv) na detekciu požadovaného kompletného génu;

amplifikované sekvencie zo stupňa (iv) sa použijú ako sondy na detekciu kompletného vybraného génu z genómovej alebo cDNA knižnice C. albicans; alebo

- kompletný gén sa získa 3' a 5' predĺžením ampliméru, napríklad pomocou PCR.

999 99 99 99 99 999

V predkladanom vynáleze je prvým krokom identifikácia uvedených esenciálnych génov a podľa takto identifikovaných génov môžu byt identifikované esenciálne gény z iných patogénnych hub. Pre praktické účely sa najskôr identifikujú esenciálne gény zo S. cerevisiae a podľa nich sa získajú esenciálne gény z iných patogénnych hub, ako je Candida.

Predkladaný vynález preto opisuje identifikáciu esenciálnych génov z C. albicans a ich použitie v spôsobe na vyhľadávanie antimykotických substancií, najmä anti-Candidových substancií .

Na identifikáciu esenciálnych génov S. cerevisiae sa jednotlivé genómové gény eliminujú homológnou rekombináciou. Pokial obsahujfe takto eliminovaný DNA segment esenciálny gén, potom je delécia letálna pre bunky S. cerevisiae v haploidnej forme.

Spôsob, v ktorom je študovaný gén S. cerevisiae nahradený markérovým génom, môže byt použitý na prípravu príslušných genómových delécií S. cerevisiae a na stanovenie toho, či bunky S. cerevisiae obsahujú deléciu.

Ako selekčný markér môže byt použitý dominantní selekčný markér (napríklad gén pre rezistenciu na kanamycín) alebo auxotrofný markér. Ako auxotrofné markéry je takisto možné použiť gény kódujúce kľúčové enzýmy na syntézu aminokyselín alebo báz nukleových kyselín. Napríklad je ako selekčné markéry možné použiť nasledujúce gény zo S. cerevisiae·. gén kódujúci metabolickú dráhu leucínu (napríklad Leu2-gén), histidínu (napríklad HIS3-gén) alebo tryptofánu (napríklad TRP-1 gén) alebo gén pre metabolizmus uracilu (napríklad URA3-gén).

• ·· • · · • ··	• · • · • ·	• · • ···	·· • · • ·	• ·
·· ··	··	• ·	• ·	··

Môžu byt použité auxotrofné kmene S. cerevisiae. Tieto auxotrofné kmene môžu rásť iba na živnom medie obsahujúcom príslušné aminokyseliny alebo bázy nukleových kyselín. Napríklad môžu byt použité všetky laboratórne kmene S. cerevisiae obsahujúce auxotrofné markéry. Ked sa použijú diploidné kmene S. cerevisiae, tak musí byt príslušný markérový gén homozygotne mutovaný. Môže byt použitý kmeň CEN.PK2 alebo jeho izogénny derivát.

Kmene neobsahujúce vhodný auxotrofný markér môžu byt tiež použité ako prototrofné kmene S. cerevisiae. Potom môže byt použitý dominantný selekčný markér, ako je napríklad gén pre rezistenciu, ako je napríklad gén pre rezistenciu na kanamycín. Na tento účel môže byt výhodne použitá loxP-KanMX-loxP kazeta.

Na homológnu rekombináciu nahradzujúcu celú DNA sekvenciu alebo čast génu S. cerevisiae sa použijú DNA fragmenty, v ktorých markérový gén susedí 5¹ a 3' so sekvenciami, ktoré sú homológne k 5' a 3' sekvenciám študovaného génu S. cerevisiae.

Rôzne spôsoby môžu byt použité na prípravu príslušných DNA fragmentov, ktoré sú tiež vhodné na deléciu akéhokolvek špecifického génu S. cerevisiae. Lineárny DNA-fragment sa použije na transformáciu vhodného kmeňa S. cerevisiae. Tento fragment sa potom integruje do genómu S. cerevisiae homológnou rekombináciou. Tento proces zahŕňa:

1. bežný spôsob na prípravu delečných kaziet (Rothstein,

R.J. (1983) Methods in Enzymology, zväzok 101, 202-211);

2. bežný spôsob využívajúci PCR techniky (modifikovaný bežný spôsob);

•	• ·· ·· · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	·· • · • ·	··
8	• e · ··· ··	• · ··	• · ··	• · ··	··

3. SFH (krátka susedná homológia) - PCR spôsob (Wach et al., 1994, Yeast 10: 1793-1808; Gultner, U. et al., 1996, Nucleic Acids Research 24: 2519-2524.

1. V bežnom spôsobe na prípravu delečných kaziet v genóme S. cerevisiae je študovaný gén buď už prítomný vo vhodnom vektore alebo je integrovaný do vhodného vektoru. V tejto metóde môže byt použitý napríklad pBR-, pUC- a pBluescript^R derivát. Hlavná čast sekvencie cieľového génu sa potom eliminuje z vektoru, napríklad pomocou vhodných reštrikčných miest, avšak za zachovania 3’ a 5' regiónov študovaného génu vo vektore. Vybraný markérový gén sa potom integruje medzi zostávajúce regióny.

2. V modifikovanej forme tejto bežnej metódy sa použije PCR. Táto metóda umožňuje amplifikáciu 3'- a 5'- terminálnych regiónov kódujúcej sekvencie študovaného génu S. cerevisiae. Táto metóda amplifikuje selektívne obidva koncové regióny študovaného génu a preto musia byt pre každý študovaný gén vykonané dve PCR reakcie, amplifikujúce raz 5'-koniec a raz 3'-koniec génu. Dĺžka amplifikovaných koncových DNA-fragmentov závisí od prítomných reštrikčných miest. Amplifikované terminálne konce študovaného génu majú zvyčajne dĺžku 50 až 5000 párov báz (bp), výhodne dĺžku 500 až 1000 bp.

Ako templát pre PCR reakcie môže byt použitá genómová DNA S. cerevisiae alebo prirodzené gény. Páry prajmerov (kódujúci a protizmyslový prajmer) sa pripravia tak, že zodpovedajú 3'-koncu a 5'-koncu sekvencie študovaného génu S. cerevisiae. Osobitne významné je to, aby bol prajmer vybraný tak, aby umožňoval svoju integráciu prostredníctvom vhodných reštrikčných miest.

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	• t • ···	·· • · · • ·
• · · ·	··	• ·	·· ·

Ako vektory môžu byť použité pBR-, pUC- a pBluescript^Rderiváty. Predovšetkým sú vhodné vektory už obsahujúce gén kódujúci selekčný markér. Konkrétne môžu byť použité gény, ktoré obsahujú selekčné markéry HIS3, LEU2, TRPÍ alebo URA3.

DNA segmenty študovaného génu S. cerevisiae, získané PCR, sa integrujú do vektoru na obidvoch stranách selekčného markéru tak, že selekčný markér je - rovnako ako v bežnej metóde - obklopený na obidvoch koncoch DNA sekvenciami, ktoré sú homologné k študovanému génu.

3. Homológna rekombinácia v S. cerevisiae prebieha veími účinným a presným spôsobom a dĺžka DNA sekvencie homologickej k študovanému génu S. cerevisiae obklopujúcemu gén pre selekčný markér môže byť významne kratšia ako v modifikovanej bežnej metóde. Použité susedné konce homologické k študovanému génu S. cerevisiae by mali mať dĺžku iba približne 20-60 bp, lepšie 30-45 bp. SFH-PCR metóda je predovšetkým výhodná preto, že môže byt vynechaný krok laboratórneho klonovania.

PCR reakcia sa uskutoční na DNA -templáte obsahujúcom gén pre selekčný markér, ktorý má byt použitý, kde prajmery sú konštruované tak, že DNA sekvencia kódujúceho prajmeru je homológna k 5'-koncu sekvencie selekčného markéru a tak, že prajmer obsahuje na 5'-konci región 40 nukleotidov, ktoré zodpovedajú 5'-koncovej sekvencií študovaného génu S. cerevisiae. Protizmyslový prajmer je pripravený analogickým spôsobom, tzn. je komplementárny k 3'-koncu sekvencie génu pre selekčný markér a obsahuje na 5'-konci región 40 nukleotidov, ktoré zodpovedajú komplementárnemu reťazcu 3'-koncovej kódujúcej sekvencie študovaného génu.

• ·· • · · • ··	··	·· • ···	·« • •	• · •
• •	• •
• · ·	•	•	• ·	•	•
·· ··	··		··	··	•

Na amplifikáciu génov S. cerevisiae študovaných SFH-PCR metódou môžu byť použité vektory obsahujúce gén pre auxotrofný markér alebo pre selekčný markér. Konkrétne je ako templát použitý plazmid pUG6. Tento plazmid obsahuje loxP-KanMX-loxP kazetu (Gultner, U. et al., 1996, Nucleic Acids Research 24: 2519-2524). V inom rozpracovaní je gén pre rezistenciu na kanamycín obklopený na obidvoch koncoch loxP sekvenciou (loxP-KanMX-loxP kazeta). Táto kazeta je výhodná v tom, že gén pre rezistenciu na kanamycín môže byt prípadne eliminovaný z genómu S. cerevisiae po integrácii loxP-KanMX-loxP kazety do študovaného génu S. cerevisiae. Na tento účel môže byť použitá Cre-rekombináza bakteriofágu Pl. Cre-rekombináza rozpoznáva loxP sekvencie a indukuje elimináciu DNA umiestnenej medzi dvoma loxP sekvenciami procesom homológnej rekombinácie. V dôsledku tohto deje zostáva len jedna^-LoxP sekvencia a dochádza k takzvanej regenerácii markéru, tzn. kmeň S. cerevisiae môže byt transformovaný znova pri použití loxP-KanMX-loxP kazety. Toto je osobitne výhodné vtedy, ked majú byt deletované aspoň dva funkčne podobné gény na získanie letálneho fenotypu.

V PCR metóde obsahujú PCR reakčné prajmery na 3'-konci sekvenciu s dĺžkou aspoň 20 nukleotidov, ktorá je homológna k sekvencií umiestnenej nalavo a/alebo napravo od loxP-KanMX-loxP kazety, a na 5'-konci sekvenciu s dĺžkou výhodne 40 nukleotidov, ktorá je homológna k terminálnym koncom študovaného génu.

Pri použití týchto troch metód je možné získat lineárne delečné kazety obsahujúce gén kódujúci selekčný markér, ktorý je obklopený na obidvoch koncoch homológnymi sekvenciami študovaného génu. Delečné kazety sa použijú na transformáciu diploidných kmeňov S. cerevisiae. Na tento účel môže byt použitý • ·· ·· ·· ·· ·· · · ··· ··· • ·· · φ φφφ φ φ

ΦΦ· φφ ·· ·· ·· · napríklad diploidný kmeň S. cerevisiae CEn.PK2 (Scientific Research and Devolopmnet GmbH, Oberursel).

[CEN.PK2 Mata/MAT a ura3-52/ura3-52 leu2-3, 112/leu2-3, 112hÍs3Äl/hís3Äl trpl-289/trpl-289 MAL2-8^C/MAL2-8^C SUC2/SUC2]

Kmeň CEN.PK2 sa pripraví a kultivuje pri použití známych metód (Gietz, R.D. et al., 1992, Nucleic Acids Research 8:

1425; Guldner, U. et al., 1996, Nucleic Acids Research 24: 2519-2524) .

Bunky použitého kmeňa S. cerevisiae sa transformujú pri použití známych techník vhodným množstvom DNA lineárnej delečnej kazety (napríklad pozri Sambrook et al., 1989). Potom sa meSium, v ktorom sú bunky kultivované, nahradí novým médiom, takzvaným selektívnym médiom, ktoré neobsahuje príslušnú aminokyselinu (napríklad histidín, leucín alebo tryptofán) alebo bázu nukleových kyselín (napríklad uracil), alebo - pokial je použitá delečná kazeta obsahujúca gén pre rezistenciu na kanamycín, obsahujúcim geneticín (G418^R) (napríklad kompletné médium (YEPD) obsahujúce geneticin). Alternatívne môžu byt transformované bunky umiestnené na agarové platne pripravené pri použití príslušného média. Tak je možno selektovať bunky, v ktorých prebehla homológna rekombinácia, pretože iba tieto bunky môžu rásť za týchto modifikovaných podmienok.

Avšak vo väčšine prípadov je počas transformácie len jedna z dvoch kópií génu v dvoch chromo z orná Iných sadách diploidného kmeňa S. cerevisiae nahradená DNA delečnej kazety, čo vedie k vzniku heterozygótneho-diploidného mutantného kmeňa S. cerevisiae, v ktorom je jedna kópia študovaného génu nahradená selekčným markérom, zatial čo druhá kópia génu zostáva v genóme. Toto je výhodné v tom, že pri delécii esenciálneho • ·· ·· ·· ·· ·· · · ··· ··* • ·· · · ··· · · ··· ·· ·· ·· ·· génu je, z dôvodu prítomnosti druhej kópie esenciálneho génu, mutantný kmeň S. cerevisiae stále životaschopný.

Správna integrácia DNA delečnej kazety vo vopred určenom lokuse chromozómu (génovom lokuse študovaného génu) môže byt overená southernovým prenosom (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517) alebo diagnostickou PCR analýzou pri použití špecifických prajmerov (Guldener, U. et al., 1996, Nucleic Acids Research 24: 2519-2524).

Genetická separácia jednotlivých diploidných buniek môže byt monitorovaná tetrádovou analýzou. V tejto analýze je redukčné delenie (meióza) indukované v diploidných bunkách, predovšetkým heterozygótnych mutantných kmeňoch, pri použití známych metód, ako je poprášenie dusíkom na platniach obsahujúcich octan draselný (Sherman, F. et al., 1986, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Guthrie,

C. and Fink, G.R., 1991, Methods in Enzymology, zväzok 194, Academic Press, San Diego 3-21; Ausubel, F.M. et al., 1987, Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., kapitola 13). Meióza vedie k vzniku asci s štyrmi askospórami (segregovanými), ktoré môžu byt individualizované po čiastočnom enzymatickom štiepení steny askospór zymolyázou (Ausubel et al., 1987) pri použití mikromanipulátorov (napríklad SINGER). Napríklad, pokial je tetrádová analýza vykonaná na heterozygotnom-diploidnom mutantnom kmeni, v ktorom je esenciálny gén prítomný v dvojitej sade chromozómov nahradený na jednom chromozómu homológnou rekombináciou, tak sú len dve segregované askospóry životaschopné, konkrétne tie, ktoré nesú esenciálny gén. Dve zostávajúce segregované askospóry nie sú životaschopné, pretože neobsahujú esenciálny gén.

	• ·· ·· · · • ··	·· ·· • · · • · ···	·· · • · · e • · ·
13	··· ··	·· ··	·· ··

Na overenie toho, či sú gény študované touto technikou skutočne esenciálne alebo toho, čia homológna rekombinácia vedie k alterácii esenciálneho génu susediaceho s génovým lokusom študovaného génu, sa heterozygotný diploidný mutantný

- kmeň S. cerevisiae transformuje centromerovým plazmidom obsahujúcim študovaný gén.

e

Na transformantoch sa vykoná tetrádová analýza. Ked sú miesto dvoch získané štyri životaschopné segregáty, tak potom môže študovaný gén obsiahnutý v centromerovom plazmide doplňovať defekt dvoch neživotaschopných haploidných buniek S. cere vi siae/mutantného kmeňa, čo dokazuje, že študovaný gén S. cerevisiae je esenciálny.

Výhodne sa ako centromerové plazmidy použijú plazmidy prítomné v nízkom počte kópií, napríklad v počte jednej alebo dvoch kópií na bunku. Na tento účel môžu byt použité napríklad plazmidy pRS313, pRS314, pRS315 a pRS316 ((Sijkorski, R.S. a Hieter, P., 1989, Genetics 122: 19-27) alebo podobné plazmidy. Výhodne sú študované gény integrované v uvedených plazmidoch vrátane ich 3'- a 5'-koncových nekódujúcich regiónov.

Jednotlivé gény S. cerevisiae môžu byt študované pri použití hore uvedenej techniky, kde ich sekvencie môžu byt úplne alebo čiastočne známe. Kompletné genómové sekvencie S.

» cerevisiae sú dostupné na www (World Wide Web) od 24.4.1996.

f Sekvencie genómovej DNA S. cerevisiae sú uvedené na www na niekoíkých stránkach.

MIPS (Munich Information Centre of Protein Seguence). Adresa http://speedy.mips.biochem.mpg.de/mips/yeast/ • ·· ·· ·· ·· ·· · · ··· ··· • ·· · · ··· · · ··· ·· ·· ·· ·· ···

SGD (Saccharomyces Genome Database, Stanford)

Adresa: http://genome-www-stanford.edu/Saccharomyces

YPPD (Yeast Proteín Database, Cold Spring Harbor).

Adresa: http://www.proteome.com/YPDhome.html

Kompletná DNA sekvencia S. cerevisiae je tiež dostupná prostredníctvom FTP (filé transport protocol) v Európe (napríklad na adrese: ftp.mips.embnet-org), v USA (adresa: genome-ftp.stanford.edu) alebo v Japonsku (adresa ftp.nig.ac.jp).

Týmto spôsobom bolo identifikovaných sedem esenciálnych genómových génov S. cerevisiae·. YDR325w, YJL039C, YORllOw, YNL256W, YBR102C, YIR012W a YMR212C.

Esenciálne gény S. cerevisiae sa potom použili na identifikáciu príslušných funkčne podobných génov v iných hubách.

Termín funkčne podobné gény v iných druhoch hub označuje gény, ktoré majú funkciu podobnú alebo identickú funkcii esenciálnych génov S. cerevisiae. Funkčne podobné gény v iných hubách môžu, ale nemusia, mat homologickú sekvenciu s príslušnými esenciálnymi génmi S. cerevisiae. Funkčne podobné gény v iných druhoch hub môžu mat iba strednú homológiu sekvencie na nukleotidovej úrovni s príslušnými esenciálnymi +génmi S. cerevisiae. Strednou homológiou sekvencie sa rozumie v predkladanom vynáleze identita sekvencie, na úrovni nukleotidov, aspoň 50%, lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.

Ďalej, funkčne podobné gény v iných hubách môžu, ale nemusia, kódovať proteíny s homologickou sekvenciou vzhľadom na sekvenciu proteínov kódovaných esenciálnymi génmi S. cerevisiae. Funkčne podobné proteíny v iných hubách môžu mať strednú homológiu proteínovej sekvencie s proteínmi kódová15

• ··	··	··	• ·
• · ·	• · ·	• · ·
• ··	•	• ···	• ·
·· ··	··	··	• · ·

nými esenciálnymi génmi S. cerevisiae. Strednou homológiou sekvencie sa rozumie v predkladanom vynáleze identita sekvencie, na úrovni aminokyselín, aspoň 40%, lepšie aspoň 50%, ešte lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.

Gény s homológnou sekvenciou môžu byť izolované pri použití známych metód, napríklad pomocou vyhľadávania homológií (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.) alebo pri použití PCR techniky využívajúcej špecifické prajmery z genómových knižníc a/alebo cDNA knižníc príslušných hub.

V jednom rozpracovaní sú gény s homológnou sekvenciou izolované z cDNA knižníc. Za účelom nájdenia funkčne podobných génov v iných hubách je mRNA izolovaná zo študovaných hub známymi metódami (Sambrook etal., 1989) a cDNA sa syntetizuje pri použití známych metód (Sambrook et al., 1989; alebo pri použití kitov na syntézu cDNA, napríklad od STRATAGENE).

Pripravená cDNA sa priamo integruje do vhodného expresného vektoru.

Napríklad, syntéza prvého reťazca cDNA môže byť vykonaná v prítomnosti prajmerov majúcich vhodné reštrikčné miesta pre umožnenie následného klonovania v správnej orientácii s ohľadom na promotor expresného vektoru. Ako reštrikčné miesto môže byť použité akékoľvek známe reštrikčné miesto. Ako prajmer môže byt použitý napríklad nasledujúci prajmer s dĺžkou 50 nukleotidov:

5' -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTXXXXXXTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

	• ·· ·· · · • ··	·· ·· • · · • · ···	• · · • · ·· • · ·
16	• · · ··	·· ··	• · ··

Sekvencia (X)_g predstavuje vhodné reštrikčné miesto, napríklad pre Xhol.

Po syntéze dvoch reťazcov sa lepivé konce dvojretazcovej cDNA doplnia (tupo zakončia) a cDNA konce sa potom ligujú pri použití vhodnej DNA adaptorovej sekvencie. DNA adptorová sekvencia by mala obsahovať reštrikčné miesto, ktoré by malo byt odlišné od reštrikčného miesta použitého v prajmeri na syntézu prvého reťazca cDNA. DNA adaptér môže obsahovať napríklad 9alebo 13-merové oligonukleotidy, ktorých konce predstavujú kohezívne konce reštrikčného miesta. Tieto konce môžu byt napríklad EcoRI miesta:

5'-XXXXXGGCACGAG-3'

3'- XCCGTGCTC-5'

Jednoretazcové X v adaptorovej sekvencií predstavuje kohezívny koniec reštrikčného miesta.

cDNA opatrená príslušnými adaptorovými sekvenciami sa potom štiepi pri použití reštrikčnej endonukleázy, ktorej rozpoznávacie miesto bolo použité v prajmeri na syntézu prvého reťazca cDNA, napríklad Xhol. Takto získaná cDNA by mela mat podlá tohto príkladu 3-Xho a 5-EcoRI presahujúce konce a mala by byt preto priamo integrovaná do expresného vektoru štiepeného Xhol a EcoRI.

Ako expresné vektory môžu byt použité napríklad E. coli/ S. cerevisiae člnkové vektory, tzn. vektory použitelné ako v E. coli, tak v S. cerevisiae. Také vektory môžu byť potom amplifikované napríklad v E. coli. Ako expresné vektory môžu byť použité tie, ktoré sú prítomné v bunkách S. cerevisiae v nízkom počte kópií. Na tento účel sú vektory vybrané napríklad zo skupiny zahŕňajúcej pRS423 - pRS426 (pRS423, pRS424, ·· ·· ·· ·· • · · · ··· ·· · · ··· · · ··· ·· ·· 99 99 9 pRS425, pRS426) a/alebo pRS313-pRS316 (pRS313, pRS314, pRS315, pRS316) (Sikorki, R.S. a Hieter, P., 1989, Genetics 122:

19-27; Christianson, T.W. et al., 1992, Gene 110: 119-122).

Expresné vektory by mali obsahovat vhodné promotory a terminátory S. cerevisiae. V prípade, že neobsahujú tieto elementy sa príslušné promotory a terminátory inzertujú tak, aby bola možná následná inkorporácia vytvorenej cDNA. Osobitne vhodné sú promotory génov S. cerevisiae MET25, PGK1, TP11, ADHI, URA3. Je možno použit promotory prirodzeného génu v nemodifikovanej forme, rovnako ako promotory, ktoré sú modifikované tak, aby boli eliminované niektoré aktivátorové a/alebo represorové sekvencie. Ako terminátory sú vhodné napríklad terminátory génov S. cerevisiae MET25,

PGK1, TP11, ADHI, URA3.

V inom rozpracovaní sa gény s homológnou sekvenciou izolujú z genómových knižníc. Knižnica genómovej DNA z hub sa môže pripravit známymi postupmi (ako sú opísané napríklad v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.). Napríklad, genómová DNA z hub môže byt pripravená pri použití známych metód na lýzu kvasinkových buniek a na izoláciu genómovej DNA (napríklad pri použití komerčne dostupných kitov od BiolOl, Inc.). Genómová DNA môže byt čiastočne trávená pri použití reštrikčného enzýmu ako je Sau3AI a fragmenty môžu byt rozdelené podía velkosti elektroforézou na agarózovom géli. DNA fragmenty majúce veíkost napríklad 5-10 kb sa potom prečistí klasickými metódami (napríklad pri použití Gene Clean kitu od BiolOl) a inzertuje sa do E. caZi/kvasinkového člunkového vektoru, ako je YEP24 (ako je opísané v Sanglard, D., Kuchler, K., Ischer, F., Pagani J-L., Monod, M., a Bille, J., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, zväzok 39, č. 11, str. 2378-2386) natrávený reštrikčnými enzýmami vytvárajúcimi ·· · fl • · · · • ···· · ·· · ·· ·· ·· kompatibilné konce (napríklad BamHI pre Sau3AI-trávenou genómovou DNA). Výsledná expresná knižnica sa potom môže amplifikovat v E. coli. Avšak v predkladanom vynáleze môže byt na prípravu genómovej knižnice použitá akákoľvek známa metóda.

Na vyhľadanie génov v študovanom druhu hub, ktoré sú funkčne podobné esenciálnym génom S. cerevisiae, sa jeden esenciálny gén S. cerevisiae umiestni pod kontrolu regulovateľného promotoru, bud ako integrálny (1), alebo ako extrachromozomálny gén (2).

1. Na integráciu regulovateľného promotoru do genómu S. cerevisiae sa nahradí prirodzený promotor vybraného esenciálneho génu regulovatelným promotorom, napríklad homológnou rekombináciou prostredníctvom PCR (Guldner et al., 1996).““** Homológna rekombinácia prostredníctvom PCR môže byt vykonaná napríklad v diploidnom kmeni S. cerevisiae CEN.PK2. Úspešná integrácia do chromozómu môže byt overená v haploidných bunkách po tetrádovej analýze.

Pri tetrádovej analýze je možné získat štyri životaschopné askospóry, kde v dvoch haploidných segregátoch je vybraný esenciálny gén umiestnený pod kontrolou prirodzeného promotoru, zatiaľ čo v dvoch zostávajúcich segregátoch je esenciálny gén umiestnený pod kontrolou regulovateľného promotoru.

Neskoršie uvedené haploidné segregáty sa použijú na transformáciu cDNA alebo genómovú DNA prítomnú v rekombinantných vektoroch.

2. Pri použití extrachromozornáIného variantu sa vybraný esenciálny gén S. cerevisiae najskôr inzertuje do vhodného

• · • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
• · · ·	··	··	• · ·

expresného vektoru, napríklad do E. coli/s. cerevisiae člnkového vektoru. Na tento účel môže byt esenciálny gén amplifikovaný PCR z genómovej DNA s. cerevisiae začínajúcej od ATG iniciačného kodónu až do terminačného kodónu. Prajmery použité na tento účel môžu byt konštruované tak, že obsahujú rozpoznávacie miesta pre vhodné reštrikčné enzýmy, čo uľahčuje následnú inzerciu pod kontrolou regulovateľného promotoru v expresnom vektore.

Rekombinantný expresný vektor s plazmidovou kópiou esenciálneho génu S. cerevisiae pod kontrolou regulovateľného promotoru sa potom použije na transkomplementáciu príslušnej mutantnej alely. Príslušná mutantná alela môže byt vybraná z heterozygótneho diploidného mutantného^kmeňa pripraveného elimináciou, čiastočnou^alebo úplnou, esenciálneho mykotického génu uvedeného hore homológnou rekombináciou.

Expresný vektor s vybraným esenciálnym génom S. cerevisiae sa potom transformuje v príslušnom heterozygotnom-diploidnom mutantnom kmeni obsahujúcom miesto vybraného esenciálneho génu S. cerevisiae selektovateľný markérový gén. Transformanty sa potom selektujú podľa auxotrofného markéru obsiahnutého v použitom expresnom vektore. Takto transformované heterozygotne-diploidné mutantné kmene sa analyzujú tetrádovou analýzou. Získajú sa štyri životaschopné segregáty. Opakovaním selekcie podľa markérov mutantnej alely a expresného vektoru sa môžu transformované prirodzené segregáty odlíšiť od segregátov neobsahujúcich genómovú kópiu esenciálneho génu. Segregáty, ktoré neobsahujú genómovú kópiu vybraného esenciálneho génu, sa označia ako trans-komplementované haploidné mutantné kmene. Tieto sa potom použijú na transformáciu knižnicami cDNA alebo genómovej DNA z iných druhov hub, ktoré sú prítomné vo vhodných vektoroch.

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · • ·
·· ··	• ·	··	• ·

Ako regulovateíné promotory môžu byt použité indukovateíné alebo reprimovateíné promotory. Tieto promotory sa môžu skladat z prirodzených a/alebo artificiálne pripravených promótorových sekvencií.

Ako regulovatelné promotory môžu byť použité napríklad promotory GALI génu a zodpovedajúce deriváty promotorov, ako sú napríklad promotory, v ktorých boli eliminované rôzne UAS (predchádzajúce aktivačné sekvencie) (GALS, GALL; Mumberg, J. et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 5767-5768). Ako regulovatelné promotory môžu byť tiež použité promotory glukoneogénnych génov, ako je napríklad FBP1, PCKl, ICL1 alebo ich časti, ako sú napríklad ich aktivačné sekvencie (UAS1 a/alebo ~*UÁS2) alebo represné sekvencie (URS, predchádzajúce represné sekvencie) (Niederacher et al., 1992, Curr. Genet. 22: 636-670; Proft et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 246: 367-373; Schuller et al., 1992, EMBO J., 11: 107-114; Guarente et al., 1984, Celí, 36: 503-511).

Mutantný kmeň S. cerevisiae modifikovaný týmto spôsobom môže byt kultivovaný za kultivačných podmienok, za ktorých je regulovatelný promotor aktívny, takže je esenciálny gén S. cerevisiae exprimovaný. Bunky S. cerevisiae sú potom transformované reprezentatívnym množstvom knižnice obsahujúcej cDNA alebo genómovej DNA študovaného druhu hub. Transformanty exprimujú čfalej proteín, ktorého kódujúca sekvencia je prítomná v rekombinantnom vektore.

Metóda predpokladá, že kultivačné podmienky môžu byť modifikované tak, aby bola dosiahnutá inhibícia regulovateíného promotoru, ktorý riadi vybraný esenciálny gén. Konkrétne, kultivačné podmienky môžu byt zmenené výmenou kultivačného média.

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
· ··	··	··	·· ·

Ked* je použitý napríklad GALI promotor alebo jeho derivát, tak je možné nahradit médium obsahujúce galaktózu (indukčné médium) médiom obsahujúcim glukózu (inhibičné médium).

Tieto modifikované podmienky sú letálne pre bunky S. cerevisiae, v ktorých nenesie rekombinantný vektor funkčne podobnú genómovú DNA alebo cDNA študovaného druhu hub. Naopak, bunky S. cerevisiae, v ktorých rekombinantný vektor exprimuje funkčne podobnú kódujúcu sekvenciu študovaného druhu hub sú životaschopné, pretože v týchto bunkách je letálny metabolický efekt komplementovaný proteínom kódovaným funkčne podobným génom.

Metóda predpokladá, že rekombinantný vektor (plazmid) je izolovaný z prežívajúcich transformantov pri použití známej techniky (Strathern, J.N., and Higgins, D.R, 1991, Plasmids are recovered from yeast into Escherichia coli shuttle vectors, v: Guthrie, C. and Fink, G.R., Methods in Enzymology, zväzok 194, Guide to yeast genetic and molecular Biology, Academic Press, San Diego, 319-329) a cDNA alebo genómová DNA sa analyzuje pri použití metód na analýzu DNA, ako je DNA sekvenovanie (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467).

Esenciálne gény S. cerevisiae môžu byt teda použité na identifikáciu funkčne podobných génov a/alebo génov s homológnou sekvenciou v iných hubách, predovšetkým génov pôsobiacich podobne a/alebo s homológnou sekvenciou v hubách patogénnych pre človeka, zviera a rastliny. Na tento účel môžu byt použité napríklad huby triedy fykomycét alebo eumycét, najmä podtried basidiomycét, ascomycét, najmä mehiascomycét (kvasiniek) a plectascales (plesní) a gymnascales (kožných a vlasových hub) alebo triedy hyphomycét, konkrétne podtriedy • ·· ·· ·· ·· ···· ··· ··· • ·· · · ··· · · ··· ·· ·· ·· ·· · conidiosporales (kožných mycét) a thallosporales (pučích hub), a z nich najmä druhy mucor, rhizopus, coccidioides, paracoccidioides (blastomyces brasiliensis), endomyces (blastomyces), aspergillus penicilium (scopulariopsis), trichophyton (ctenomyces), epidermofyton, microsporon, piedraia, hormodendron, phialophora, sporotrichon, cryptococcus, candida, geotrichum a trichosporon.

Osobitne významné je použitie Candida spp., najmä Candida albicans, Candida glabrata, Aspergillus spp., najmä Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis a Sporothrix schenckii.

Podlá génov S. cerevisiae identifikovaných horé'uvedeným spôsobom vynálezcovia klonovali príslušné esenciálne gény z C. albicans, tzn. CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, pri použití nasledujúcej techniky.

Najskôr sa vybrali oligonukleotidy v sekvencií génu S. cerevisiae alebo homologickej sekvencií C. albicans na amplifikáciu príslušného fragmentu C. albicans. Po klonovaní sa získaný fragment (majúci sekvenciu približne niekolko stoviek bp) použil na prehladávanie (genómovej) DNA knižnice C. albicans. Prehladávanie môže zahŕňať nasledujúce kroky: klony sa kultivujú na diskoch, prekryjú sa filtrami, na ktoré je naviazaná DNA, filtre sa hybridizujú a potom sa detekujú pozitívne kolónie. Vybrané klony sa potom sekvenujú.

Metóda predpokladá, že esenciálne mykotické gény sa použijú na identifikáciu substancií, ktoré môžu úplne alebo čiastočne inhibovať funkčnú expresiu týchto esenciálnych génov a/alebo funkčnú aktivitu kódovaných proteínov. Týmto spôsobom ·· · · • ·· ·· ·· • · · • · ··· ··· ·· ·· ·· ·· · môžu byť identifikované substancie, ktoré inhibujú rast hub a ktoré môžu byt použité ako antimykotické činidlá, napríklad na výrobu liekov.

&14D

Predkladaný vynález sa predovšetkým týka metódy na vyhľadávanie takých inhibičných substancií, v ktorých je ako cieľ použitý esenciálny gén C. albicans vybraný zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039, alebo funkčne podobný gén z iných patogénnych hub alebo príslušný kódovaný proteín.

Termín funkčne podobné gény v iných patogénnych druhoch hub označuje gény, ktoré majú funkciu podobnú alebo identickú s funkciou esenciálnych génov C. albicans. Funkčne podobné gény v iných patogéíflfiVčh hubách môžu, ale nemusia, mať homologickú sekvenciu s príslušnými esenciálnymi génmi C. albicans. Funkčne podobné gény v iných druhoch hub môžu mat len strednú homológiu sekvencie na nukleotidovej úrovni s príslušnými esenciálnymi génmi C. albicans. Strednou homológiou sekvencie sa rozumie v predkladanom vynáleze identita sekvencie, na úrovni nukleotidov, aspoň 50%, lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.

Ďalej, funkčne podobné gény v iných patogénnych hubách môžu, ale nemusia, kódovať proteíny s homologickou sekvenciou vzhľadom na sekvenciu proteínov kódovaných esenciálnymi génmi C. albicans. Funkčne podobné proteíny v iných hubách môžu mať strednú homológiu proteínovej sekvencie s proteínmi kódovanými esenciálnymi génmi C. albicans.

Strednou homológiou sekvencie sa rozumie v predkladanom vynáleze identita sekvencie, na úrovni aminokyselín, aspoň • ·· ·· ·· ·· ·· · · ··· ··· • ·· · · ··· · · ··· ·· ·· ·· ·· ·

40%, lepšie aspoň 50%, ešte lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.

Rysom tejto metódy je to, že esenciálne mykotické gény alebo príslušné kódované proteíny sú použité ako ciele na vyhíadávanie substancií. Spôsob predpokladá, že esenciálne gény C. albicans, rovnako ako funkčne podobné gény a/alebo gény s homológnou sekvenciou iných patogénnych hub alebo príslušné kódované proteíny môžu byt použité ako ciele.

V jednom rozpracovaní vyhĺadávacieho spôsobu podía predkladaného vynálezu sú poskytnuté mykotické bunky, ktoré obsahujú esenciálny gén použitý ako ciel, a tieto bunky sú inkubované s testovanou substanciou. Týmto spôsobom sa určí inhibičný “úťriňok nä rast tejto substancie sprostredkovaný cez esenciálny cieíový gén.

Použijú sa bunky, ktoré exprimujú esenciálny cieíový gén v rôznej úrovni, a tieto bunky sa potom inkubujú s testovanou substanciou a sleduje sa inhibičný účinok tejto substancie na rast.

Spôsob zahŕňa použitie dvoch alebo viacerých mykotických buniek, alebo kmeňov získaných z týchto buniek, ktoré sa líšia v tom, že exprimujú esenciálny cieíový gén v rôznom stupni.

Napríklad môžu byť komparatívne analyzované dva, tri, štyri, päť, desať alebo viac mykotických buniek alebo príslušných mykotických kmeňov s ohľadom na inhibíciu rastu substancie použitej v definovanej koncentrácii. Pomocou takej série kmeňov s rôznou úrovňou expresie môžu byť antimykotické substancie odlíšené od cytotoxických alebo inaktívnych substancií.

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	·· • · · • ·
·· ··	··	··	• · ·

Konkrétne rozpracovanie spôsobu zahŕňa použitie haploidných mykotických buniek/kmeňov na vyhľadávanie substancií, konkrétne haploidných buniek/kmeňov S. cerevisiae.

Spôsob predpokladá integráciu esenciálneho génu vybraného ako ciel do vhodného expresného vektoru.

Ako expresné vektory môžu byť použité napríklad E. coli/ S. cerevisiae člnkové vektory. Použijú sa najmä vektory, ktoré sa líšia v počte kópií na bunku. Tak je možné použiť vektory, ktoré sú prítomné v transformovaných bunkách S. cerevisiae vo vysokom počte kópií, alebo vektory, ktoré sú prítomné v nízkom počte kópií. Jedno rozpracovanie zahŕňa použitie expresných vektorov, ktoré umožňujú integráciu cielového génu do genómu S. cerevisiae.

Vhodné expresné vektory sú vybrané napríklad zo skupiny zahŕňajúcej pRS423, pRS424, pRS425, pRS426, pRS313, pRS314, pRS315, pRS316, pRS303, pRS304, pRS305, pRS306 (Sikorki a Hieter, 1989; Christianson et al., 1992).

Vektory série pRS423-pRS426 sú prítomné vo vysokom počte kópií, približne 50-100 kópií/bunku. Naopak, vektory série pRS313-pRS316 sú prítomné v nízkom počte kópií (1-2 kópie/ bunku). Ked sú použité vektory týchto dvoch sérií, potom je cielový gén prítomný ako extrachromozornáIna kópia. Použitie vektorov série pRS303-pRS306 umožňuje integráciu cielového génu do genómu. Použitie týchto troch rôznych typov expresných vektorov umožňuje stupňovať expresiu študovaného funkčne podobného esenciálneho génu.

• ·· ·· ·· ·· ···· · · · ·· • ·· · · ··· · · ····· ·· ·· ··

Spôsob predpokladá porovnávanie inhibičného účinku substancie na rast mykotických buniek/kmeňov pri použití expresných vektorov líšiacich sa napríklad v počte kópií vektoru na bunku.

Také bunky môžu exprimovat esenciálny delový gén v rôznej úrovni a môžu vykazovať stupňovanú reakciu na substancii.

Spôsob takisto zahŕňa to, že rôzna úroveň expresie delového génu (regulovaná nadmerná expresia) sa získa v rôznych mykotických bunkách pomocou inzercie delového génu v expresnom vektore medzi špecifickými vybranými promótormi a terminátormi S. cerevisiae. Vhodné sú promotory S. cerevisiae, ktoré sú konštitutívne exprimované, ale v rôznej úrovni. Prikladmi takých promotorov sú prirodzené promotory génov S. cerevisiae MET25, PGK1, TPI1, TDH3, ADH1, URA3, TRPÍ, rovnako ako ich príslušné deriváty, napríklad deriváty bez špecifických aktivačných a/alebo represívnych sekvencii.

Regulovateľné promotory sú tiež vhodné na stupňovanú nadmernú expresiu delového génu. Prirodzené promotory GALI génov a/alebo ich zodpovedajúce deriváty, ako sú napríklad promotory, v ktorých boli eliminované rôzne UAS elementy (GALS, GALL; Mumberg, J. et al., 1994, Nucleic Acids Research .» 22: 5767-5768), rovnako ako promotory glukoneogénnych génov, ako sú napríklad promotory FBP1, PCK1, ICL1 alebo ich časti, ako sú napríklad ich aktivačné sekvencie (UAS1 a/alebo UAS2) alebo represné sekvencie (URS), môžu byt použité v príslušných neaktivovatelných a/alebo nereprimovateIných testovacích promotorech (Schuller et al., 1992, EMBO J. 11: 107-114; Guarante et al., 1984, Celí 36: 503-511; Niederacher et al., 1992, Curr.

	• ··	• ·	··	• ·
	·· · ·	•	• ·	• · ·
	• ··	•	• ···	• ·
27	··· ··	··	··	• · ·

Genet. 22: 363-370; Proft et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 246: 367-373).

V expresných vektoroch môže byt ako terminátor použitá napríklad terminačná sekvencia z génov S. cerevisiae MET25, PGK1, TPI1, TDH3, ADH1, URA3.

Spôsob zahŕňa to, že pomocou správne vybraných typov expresných vektorov a/alebo prípravy expresných vektorov, prípadne použitie rôzne silných promotorov a rôzne regulovaných promotorov, môže byt pripravená séria expresných vektorov, ktoré všetky obsahujú rovnaký cielový gén, ale ktoré sa líšia v tom, že exprimujú cielový gén v rôznom rozsahu.

Spôsob zahŕňa transformáciu'ngkpresného vektoru v haploidných prirodzených bunkách S. cerevisiae. Takto získané bunky/kmene S. cerevisiae sa kultivujú v kvapalnom médie a inkubujú sa v prítomnosti rôznych koncentrácií testovanej substancie a analyzuje sa vplyv tejto substancie na charakter rastu buniek/kmeňov exprimujúcich cieľový gén v rôznych úrovniach. Spôsob tiež zahŕňa použitie haploidných buniek/kmeňov S. cerevisiae transformovaných pri použití príslušného expresného vektoru bez cieľového génu ako referenčného kmeňa.

Spôsob takisto zahŕňa to, že vyhľadávanie substancií môže byt vykonané v rôznom médie pri použití regulovateľných promotorov, najmä GALI promotoru a jeho derivátov (GALS a GALL), pretože stupeň expresie môže byt do značnej miery ovplyvnený voľbou príslušného média. Tak sa stupeň expresie GALI promotoru znižuje nasledujúcim spôsobom: 2% galaktóza > 1% galaktóza + 1% glukóza > 2% glycerín > 2% glukóza.

• ·· ·· ·· ·· ···· · · · ··· • ·· · · ··· · · ··· ·· ·· ·· ·· ·

Vplyv substancií inhibujúcich rast prirodzených buniek S. cerevisiae môže byt čiastočne alebo úplne kompenzovaný nadmernou expresiou funkčne podobného génu v inom druhu hub.

V jednom rozpracovaní je spôsob na vyhľadávanie antimykotických substancií vykonaný in vitro kontaktovaním esenciálneho alebo funkčne podobného génu alebo príslušného kódovaného proteínu s testovanou substanciou a stanovením vplyvu substancie na cieľ. Akýkoľvek in vitro test vhodný na stanovenie interakcie medzi dvoma molekulami, ako je hybridizačný test alebo funkčný test, môže byt použitý (napríklad enzymatické testy, ktoré sú podrobne opísané v Bergmeyer, H.U., Methods of Enzymatic Analysis, VHC Publishers). Pokiaľ je vyhľadávanie vykonané pri použití kódovaného proteínu ako cieľa, tak je zodpovedajúci esenciálny gén inzertovaný akoukoľvek vhodnou technikou, ako je PCR amplifikácia pri použití sady prajmerov obsahujúcich vhodné reštrikčné miesta (Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons., Inc.) do expresného systému, ako je E. coli, bakulovírus alebo kvasinka, a exprimovaný proteín je potom úplne alebo čiastočne prečistený spôsobom známym v odbore. Akýkoľvek spôsob prečistenia vhodný na prečistenie exprimovaných proteínov, ako je afinitná chromátografia, môže byt použitý. Pokial je funkcia cieľového proteínu známa, môže byt vykonaný funkčný test, v ktorom je určený vplyv antimykotickej substancie na funkciu proteínu. Pokial je funkcia proteínu neznáma, môže byt testovaná substancia, ktorá interaguje s cieľovým proteínom, napríklad ktorá sa viaže na cieľový proteín. V takom prípade môže byt použitý test ako je chránenie cieľového proteínu pred enzymatickým štiepením vhodnými enzýmami.

V špecifickom rozpracovaní spôsob na vyhľadávanie antimykotických substancií zodpovedá enzymatickému testu, v ktorom

• ·· • · · • ··	• é • · • ·	·· • ···	·· • · · 9 t
·· ··	*·	··	·· ·

sa určuje aktivita dihydropteroát syntázy (DHPS) a/alebo 7,8-dihydro-6-hydroxymetylpterínpyrofosfokinázy (HPPK); enzymatické testy môžu byt vykonané spôsobom opísaným v Bergmeyer,

H.U., Methods of Enzymatic Analysis, VHC Publishers.

Dihydropteroát syntéza (DHPS) katalyzuje kondenzáciu 6-hydroxymety1-7,8-dihydropterín pyrofosfátu na kyselinu paraaminobenzoovú za vzniku 7,8-dihydropteroátu, ktorý zodpovedá druhému stupni v trojstupňovej dráhe z 6-hydroxymety1-7,8-dihydropterínu k 7,8-dihydrofolátu. 7,8-dihydro-6-hydroxymetylpterínpyrofosfokináza (HPPK) katalyzuje naviazanie pyrofosfátu na 6-hydroxymetyl-7,8-dihydropterín za vzniku 6-hydroxymetyl-7,8-dihydropterínpyrofosfátu, ktorý zodpovedá prvému stupni v trojstupňovej dráhe vedúcej k 7,8-dihydrofolátu. Všetky organizmy vyžadujú redukované folátové kofaktory pre syntézu rôznych metabolitov. Väčšina organizmov musí syntetizovat folát de novo, pretože nemajú aktívny transportný systém buniek vyšších stavovcov, ktorý umožňuje týmto organizmom využívať foláty z potravy. Enzýmy účastniace sa biosyntézy folátu sú preto cielmi pre rôzne antimikrobiálne činidlá. Tieto enzýmové aktivity sú preto esenciálne pre mikroorganizmy a nie sú prítomné u človeka.

Spôsob tiež zahŕňa identifikáciu génov u človeka, zvierat alebo rastlín, ktoré sú funkčne podobné a/alebo ktoré majú homológnu sekvenciu s esenciálnymi génmi C. albicans. Príslušné ludské, zvieracie alebo rastlinné gény môžu byt použité ako cielové gény pri testovaní toho, či majú antimykotické substancie efekt na tieto cielové gény.

Výhodou tejto metódy je to, že môžu byť týmto spôsobom identifikované substancie, ktoré účinne inhibujú rast hub a takisto môže byť stanovený vplyv týchto substancií na príslu30 šné ľudské, zvieracie alebo rastlinné funkčne podobné gény a/alebo gény majúce homogénnu sekvenciu s esenciálnymi génmi

C. albicans.

···· · ·· ····

Spôsob zahŕňa tiež možnosť overenia existencie funkčne podobných génov a/alebo ľudských, zvieracích alebo rastlinných génov s homológnou sekvenciou vzhľadom na príslušné esenciálne mykotické gény, napríklad pomocou overenia homológie identifikovaného esenciálneho mykotického génu alebo jeho časti so sekvenciou ludského, zvieracieho alebo rastlinného génu dostupného v databanke. Týmto spôsobom je možné vybrať v časnom štádiu z identifikovaných mykotických génov tie, pri ktorých napríklad neexistuje u človeka funkčne podobný gén a/alebo gén s homologickou sekvenciou.

Tak táto metóda ponúka veľa možností pre selektívnu identifikáciu substancií s antimykotickými účinkami, ktoré nemajú škodlivé účinky pre človeka.

Napríklad je možné identifikovať substancie použiteľné na prípravu liekov na liečbu mykóz alebo na profylaxiu pri imunodeficitných stavoch. Tieto substancie môžu byť použité napríklad na výrobu liekov použiteľných na liečbu mykotických infekcií, ktoré sa vyskytujú pri ochoreniach ako je AIDS alebo diabetes. Tiež môžu byt identifikované substancie použiteľné na výrobu fungicídov, predovšetkým fungicídov neškodných pre človeka.

Ďalej tento spôsob umožňuje identifikáciu antimykotických substancií, ktoré selektívne inhibujú rast len špecifického druhu hub.

• ·· • · · • ··	• · • · • ·	·· • ···	·· • · · • ·
• · ··	··	··	• · ·

Vyhladávacia metóda je najmä výhodná preto, že ked je známe, ktoré gény sú esenciálne, nie sú potrebné ďalšie informácie týkajúce sa funkcie esenciálnych génov alebo funkcie kódovaných proteínov. Ďalej je táto metóda osobitne výhodná na identifikáciu funkčne podobných génov - vzhíadom na esenciálne gény S. cerevisiae - v iných hubách, ked sekvencia DNA nie je dostupná pre mnohých z týchto génov.

V inom aspekte vynález poskytuje protilátku namierenú proti proteínu kódovanému CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039 génom alebo k jeho polypeptidovému fragmentu. Termínprotilátka zahŕňa monoklonálne a polyklonálne protilátky. Uvedené protilátky môžu byť pripravené spôsobmi dobre známymi v odbore, ako sú spôsoby opísané v Aňťibodies, a laboratory manual, Ed. Harbow and Dávid Lane,

Cold Spring Harbor Laboratory eds., 1988.

V inom aspekte poskytuje vynález kit na diagnostiku mykotických infekcií obsahujúci gén vybraný zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 a CaJL039, funkčne podobné gény, ich funkčné fragmenty, príslušné kódované proteíny, ich funkčné polypeptidové fragmenty alebo protilátky namierené proti proteínu kódovanému CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 alebo CaJL039 génom alebo k jeho polypeptidovému fragmentu. Také kity môžu byť pripravené pri použití metód známych v odbore.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: CaNL256

Internetová adresa Stanford (http;//candida.stanford.edu/) uvádza predbežné sekvencie genómu C. albicans. Jedna z týchto

• · · • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
• · · ·	··	··	• · ·

sekvencii má homológiu s YNL256 génom S. cerevisiae. Dva oligonukleotidy boli vybrané z tejto sekvencie (5'-ATTCATCCCATCA GTGCAGAAAG-3 ' a 5 '-ATTGACCAATAGCTCTAATTAATG-3 ' ) na amplifikáciu príslušného fragmentu C. albicans. Po klonovaní sme získali sekvenciu s veľkosťou 399 bp podobnú predpokladanej sekvencii (SEQ ID NO: 1). Odvodený proteín bol porovnávaný s YNL256 a bola zistená 53% podobnosť a 43% identita (obr. 1). Tento fragment s veľkosťou 399 bp C. albicans bol použitý ako sonda na prehľadávanie genómovej knižnice C. albicans. Knižnica bola pripravená čiastočným trávením genómovej DNA C. albicans Sau3AI a klonovaním do YEP24 vektoru v BamHI mieste. Klony knižnice bol potom kultivované do hustoty 2000 klonov na disk. Každý disk bol prekrytý nitrocelulózovým filtrom, ktorý sa potom postupne spracoval: NaOH, 0,5 M, 5 minút; Tris, 1 M, pH 7,7, minút; Tris, 0,5 M, pH 7,7, NaCl 1,25 M, 5 minút. Po sušení sa filtre uchovávali počas 2 hodín pri 80°C. Prehybridizácia a hybridizácia boli vykonané v tlmivom roztoku tvorenom 40% formamidom, 5x SSC, 20 mM Tris, pH 7,7, lx Denhart, 0,1% SDS. Sonda bola značená ³²P pri použití RediPrim kitu a dCTP od Amersham UK. Hybridizácia prebiehala počas 17 hodín pri 42°C. Filtre sa potom premyli v lx SSC, 0,1% SDS, trikrát počas 5 minút pri teplote okolia a potom dvakrát počas 30 minút pri 60°C a potom sa autorádiografovali cez noc. Kolónie zodpovedajúce získaným škvrnám sa reizolovali rekultiváciou pri nízkej denzite a potom sa vykonala ďalšia hybridizácia. Takto sa získali tri klony (z 40000), ktoré sa sekvenovali na ABI377 prístroji. Sekvencie sa kompilovali pri použití ABI softwaru a potom sa analyzovali pri použití GCG softwarového balíčku. Jeden z týchto troch získaných klonov obsahoval kompletnú kódujúcu sekvenciu zodpovedajúcu použitej sonde; tento gén bol označený CaNL256 a jeho sekvencia je uvedená v SEQ ID NO:

2. CaNL256 má 52 % nukleotidov identických s YNL256 S. cerevisiae. Kódujúci región je kratší na N-konci. Pri translácii * ·· ·· ·· ·· · · · · · • ·· · · ··· • · · · · · · • · · · · · • · · ·· ·· ·· ·· • · • · aminokyselín bola braná do úvahy skutočnosť, že - pri C. albicans - je CTG kodón translatovaný na serín (v CaNL256 sú prítomné tri CTG kodóny). Odvodený proteín má 40 % aminokyselín identických s YNL256 S. cerevisiae a 41 % s FAS (syntéza kyseliny listovej) Pneumocystis carinii. Prehľadávanie databáz pri použití Blast softwaru ukázalo homológiu dvoch častí CaNL256 proteínu s, v príslušnom poradí, bakteriálnymi enzýmami dihydropteroát syntézou (EC 2.5.1.15) (DHPS) Haemophilus influenzae, Staphylococcus haemolyticus, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Clostridium acetobutylicum, Escherichia coli, Mycobacterium leprae (P hodnota menšia ako e-28) a 7,8-dihydro-6-hydroxymetylpterín-pyrofosfokinázou (EC 2.7.6.3) (HPPK) Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae (P hodnota menšia ake*e-20).' Jednotky charakteristické pre DHPS a HPPK sa takiso vyskytujú v CaNL256.

Príklad 2: CaBR102

Internetová adresa Stanford (http;//candida.stanford.edu/) uvádza predbežné sekvencie genómu C. albicans. Jedna z týchto sekvencií má homológiu s YBR102 génom S. cerevisiae. Dva oligonukleotidy boli vybrané z tejto sekvencie (5'-AGTATTCAATTGGG TATTCC-3' a 5'-CCGGCATCATCÄGTAACTCC-3') na amplifikáciu príslušného fragmentu C. albicans. Po klonovaní sme získali sekvenciu s veíkosťou 647 bp (SEQ ID NO: 3). Odvodený proteín bol porovnávaný s YNL102 a bola zistená 35% podobnosť a 26% identita (obr. 2). Tento fragment bol amplifikovaný pri použití Pfu polymerázy (Stratagene). PCR produkt sa prečistil (High Pure PCR Product Purification Kit, Boehringer Mannheim) a bol použitý ako sonda na prehladávanie knižnice genómovej DNA C. albicans. Knižnica bola pripravená čiastočným trávením genómovej DNA C. albicans SauIIIA a klonovaním do YEP-24Trpl

• ·· • · · • ··	• · • · • ·	·· • ···	·· · • · ·· • · ·
• · · ·	• ·	··	·· ··

vektoru v BamHI reštrikčnom mieste. 40000 klonov knižnice bolo potom kultivovaných do hustoty 2000 klonov na disk. Každý disk bol prekrytý nitrocelulózovým filtrom (Membráne Hybond N⁺, Amersham), ktorý sa potom postupne spracoval: 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH, 5 minút; 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl, pH 7,2/1 mM EDTA, minúty, dvakrát; DNA sa naviazala na filtre (Amersham Life Science, zositenie pomocou činidla citlivého na ultrafialové žiarenie). Sonda (100 ng) sa označila ³²P pri použití RediPrime kitu a dCTP (Amersham Life Science). Filtre sa hybridizovali v tlmivom roztoku tvorenom 30% formamidom, 5x SSC,

5% Denhartovho roztoku, 1% SDS, 100 μg/ml lososej spermatickej DNA a za koncentrácie sondy 10⁶ cpm/ml pri 42’C počas 1 hodiny. Membrány sa potom premyli trikrát pri teplote okolia v 2x SSC/0,1% SDS, počas 5 minút, a potom trikrát v lx SSC/ 0,1% SDS pri 60°C počas 2-0-oninút. ‘ Filtre sa potom exponovali cez noc na rôntgenovom filme. Kolónie zodpovedajúce pozitívnym klonom sa izolovali a vyšetrovali sa druhýkrát rovnakým postupom. Nakoniec sa získali dva pozitívne klony, ktoré sa sekvenovali na ABI377 prístroji. Sekvencie sa kompilovali pri použití ABI softwaru a potom sa analyzovali pri použití GCG softwarového balíčku. Nukleotidové sekvencie týchto dvoch klonov boli identické a obsahovali kompletnú kódujúcu sekvenciu zodpovedajúcu použitej sonde a tento gén bol označený CaBR102 a jeho sekvencia je uvedená v SEQ ID NO: 4. Bola analyzovaná translácia tejto nukleotidovej sekvencie a bola braná do úvahy skutočnosť, že pri C. albicans je CTG kodón translatovaný na serín (v CaBR102 sú prítomné tri CTG kodóny). Odvodený proteín má 24% identitu so S. cerevisiae génom YBR102.

Príklad 3: CaIR012

Chromozomálna DNA z C. albicans kmeň Caf2-1 bola izolovaná pri použití Yeast Celí Lysis Prep Kitu a Genome DNA kitu

• ·· • · · • ··	• · • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
• · · ·	··	• ·	·· ·

z BI0101. 343 bp fragment z genómovej DNA C. albicans (SEQ ID NO: 5) bol amplifikovaný pri použití oligonukleotidových prajmerov CaYIRO12-5' (5'-GACGTCGTAGACGATACTCAAGAAG-3') a CaYIR012-3 ' ( 5'-CTGCAGTAAACCCTCCAGATATAACAG-3') pomocou PowerScript DNA polymerázy (PAN Systems GbmH) pri použití techniky horúceho štartu. PCR produkt sa prečistil z agarózového gélu a značil sa fluoresceínom (Gene image random prime labelling module, Amersham Life Science) podlá návodu výrobca. Plazmidová DNA z E. coli sa izolovala pri použití Qiagen kolón podlá návodu výrobca. PrehľadávanieXZAPII cDNA knižnice C. albicans sa vykonávalo podlá návodu výrobca (Stratagene, Ltd.) Nylonové filtre /Schleicher and Schuell) sa preniesli z LB platní (150 mm) s 15000 pfu/platňu, denaturovali sa 5 minút v 1,5 M NaCI, 0,5 M NaOH, neutralizovali sa 3 minúty v 1,5 M NaCI, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, premyli sa 3 minúty v 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5, 2xSSC a DNA sa naviazala na filtre (Stratagene UV zositovacie činidlo). Filtre sa vopred hybridizovali 4 hodiny pri 60’C a hybridizovali sa s fluoresceínom značenou DNA sondou cez noc pri 60’C. Detekcia sa vykonala s antifluoresceín AP konjugátom (Signál amplification module for Fluorolmager, Amersham Life Science) a analýza sa uskutočnila po 20 hodinách pri použití merača fluorescencie (Strom 860, Molecular Dynamics). Pozitívne povlaky sa zoškrabali a inkubovali sa s 0,5 ml SM-tlmivého roztoku (100 mM NaCI, mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01% želatína). Vybrané klony sa riedili, titrovali sa s hostiteľskými bunkami XL1Blue a vyšetrovali sa a prečisíovali sa druhýkrát rovnakým postupom. Nakoniec sa pBluescript SK(-) fágemid obsahujúci požadovaný DNA inzert zachytil pri použití ExAssist helper Phage systému podľa protokolu od Stratagene. Z celkom 75000 vyšetrovaných povlakov sa identifikovali 3 pozitívne klony. Izolovala sa pBluescript SK(-) fágemidová DNA, sekvenovala sa s T3 a T7 prajmermi a sekvencia sa rozšírila pri použití

• · · • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
• · · ·	··	··	·· ·

bežným spôsobom syntetizovaných oligonukleotidových prajmerov. Analýza nukleotidovej sekvencie sa vykonala pri použití Gene Data softwarového balíčku (Gene Data AG, Basel Switzerland). Podobné prehľadávania Swissprot databázy sa uskutočnila pri použití BLAST programu (Gish, Warren and Dávid J. States,

1993, Identification of protein coding regions by database similarity search, Nat. Genet. 3: 266-72). Jeden z týchto troch klonov nakoniec obsahoval kompletný kódujúci región zodpovedajúci použitej sonde; tento gén bol označený ako CaIR1012 a jeho sekvencia je uvedená v SEQ ID NO: 6.

Príklad 4: CaJL039

Sekvencia CaJL039 je uvedená v SEQ ID NO: 7.

CaJL039 gén bol klonovaný na základe údajov o génovom fragmente získaných z verejnej Stanford Candida albicans databázy.

(a) Identifikoval sa fragment, ktorý vykazoval homológiu so Saccharomyces cerevisiae YJL039c, ktorého sekvencia je uvedená v SEQ ID NO: 8.

Pri použití postupu opísaného v príklade 3 s párom oligonukleotidových prajmerov (Ca039s: TAG CTC AAC CTA CCA CCA ATC /Ca039r: ATC ACA AGA CTG TCA ATG TAA AT), sa krátky PCR fragment (dľžka 234 párov báz) amplifikoval za účelom prehľadávania Candida albicans cDNA lambda ZAP II knižnice (dar Alistair Brown, Aberdeen).

Získali sa 3 pozitívne klony pre 3 kódujúci región (# 21t7, llt3, 21t3).

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
• · · ·	• ·	··	·· ·

(b) 3'- a 5' extenzia vnútorného fragmentu pri použití metódy prechádzania prajmerom

Sanglard genómová DNA knižnica kandidy s YEp24 vektorovým skeletom sa použila na ďalšiu amplifikáciu 3' a 5'-kódujúcich sekvencii. Amplifikácia sa uskutočnila pri použití nasledujúcich oligonukleotidových prajmerov špecifických pre vektor a prajmerov špecifických pre CaJLO39 fragment:

cggaattcctatcgactacgcgatcatgg: YEp24for (špecifický pre vektor) gcgaattccgatataggcgccagcaac: YEp24ba (špecifický pro vektor) caattgctttgactcgggtgttattaagt: Ca039-51 (CaJL039: 5'záchyt) cttggcacaacttgataagaatctgt: Ca039-52 (') taggtgtacgcgaaagccaagtagaac: Ca039-53 (') ttgttaatcgtacacctaaggtgttgac: Ca039-31 (ea^Ľ039: '3'záchyt) ttgcagattgatgctagcaatgtatttg: Ca039-32 (')

Pomocou techniky prechádzania prajmerom môže byť amplifikovaná celá 5-sekvencia (kloň 14b-l-l a kloň 17b-3-4).

Chýbajúca 3'-sekvencia bola dostupná od GTC PathoGenome Release 5.0, súbor #2830.

bol identifikovaný interagujúci proteín (C82, zložka RNA polymerázy III v kvasinkách).

Príklad 5: CaORllO

5.1. CaORllO

Sekvencia CaORllO je uvedená v SEQ ID NO: 9. CaORllO sa klonovala podľa údajov pre génový fragment získaných z verejnej Stanford Candida albicans databázy sekvencii.

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	·· • ···	• · • · · • ·
·· ··	··	··	·· ·

(a) Malý ScORIlO-homológny fragment sa použil v hybridizačnom pokuse na identifikáciu CaORllO klonov v Candida albicans lambda ZAPII cDNA knižnice (od Alistair Brown). Zoradenie Candida albicans CaORllO sekvencie s fragmentom použitým na hybridizáciu je uvedené na obr. 3. Homológny fragment sekvencie je uvedený v SEQ ID NO: 17.

(b) 3 a 5' extenzia vnútorného fragmentu:

Sanglard knižnica genómovej DNA kandidy (získaná od RMV) v skelete YEP24 vektoru sa použila na amplifikáciu 3' a 5' kódujúcich a nekódujúcich sekvencií. Táto amplifikácia bola uskutočnená pri použití oligonukleotidov špecifických pre vektor (smerovaných k inz-ertu) a oligonukleotidov špecifických pre CaORllO fragment (smerovaných k sekvenciám obklopujúcim vektor), ako sú opísané dalej:

cggaattcctatcgactacgcgatcatgg: YEP24for gcgaattccgatataggcgccagcaac: YEP24ba cgggatccggtaaccaattggatctataaccgtg: 110-ba-lSO gcggatcctggtgcccttggtggtgaatg: CaYORllOA gcggatccctcacaatatgacgattgaaact: CaYORllOB ggcgtcgactcaggcgccagttttacgtacttcaaattcatc: CaYORllOC tgtgaattcttgacacagggtga: CaYORllOD caaaccttcagcacaactcca: CaYORllOE

Konečná zostavená sekvencia, ktorá obsahovala tiež 3' a 5' nekódujúce sekvencie, bola overená sekvenovaním. Kódujúci región bol subklonovaný do p414RSGALL-vektoru.

Mapa je uvedená na obr. 4.

• ·· • · · • ··	• t • · • ·	·· • ···	·· • · · • ·
·· ··	··	··	·· ·

Homológny kvasinkový ORF (YORllOw) bol opísaný ako podjednotka TFC7 transkripčného faktoru interagujúca s TFC1 v TFIIIC polymerázovom komplexe (Manaud et al., 1998, Mol. Celí. Biol. 18: 3191-3200).

5.2. CaORllO variant s alternatívnym zostrihom

Pre CaORllO byl identifikovaný další variant s alternatívnym zostrihom. Klony pre variant CaORllO s alternatívnym zostrihom boli získané z Candida albicans cDNA knižnice.

Sekvencia je uvedená v SEQ ID NO: 10.

Zostrihový variant využíva donorové miesto gtacgt v pozícii 907~^)ôvodnej CaORllO sekvencie. Akceptorové miesto je v pozícii 1047.

Mapa je uvedená na obr. 5.

Zoradenie pôvodného CaORllO a variantu s alternatívnym zostrihom je uvedené na obr. 6.

Príklad 6 : CaMR212

Sekvencia CaMR212 je uvedená v SEQ ID NO: 11.

(a) CaMR212 sa klonoval podlá údajov pre génové fragmenty z verejnej Standford Candida albicans databázy sekvencii.

Sekvencia fragmentu vykazovala homológiu (Blast prehladávanie) s génom YMR212C Saccharomyces cerevisiae a je uvedená v SEQ ID NO: 12.

·· ·· ·· ·· ·· ··· ··· ·· · t ··· * · • · · ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

Podľa týchto údajov boli navrhnuté nasledujúce oligonukleotidy, ktoré umožnili amplifikáciu tohto fragmentu (490 bp fragmentu) z genómovej DNA Candida albicans.

Oligonukleotidy:

CaYMR212for: 5' cacctgtgaacaacccaccatc-3'

CaYMR212back: 5' gaatatcctttttaactcaagag -3' (b) 3' a 5' extenzia tohto vnútorného fragmentu z CaMR212

Na tento účel boli použité knižnice genómovej kandidovej DNA od Dominique Sanglard (získanej z RMV). YEp24 skelet tejto knižnice sa použil na amplifikáciu 3'- a 5'- kódujúcej a nekódujúcej sekvencie pomocou PCR. Toto bolo uskutočnené pri použití oligonukleotidov špecifických pre CaMR212 490 bp-fragment (pre regióny susediace s vektorom) a oligonukleotidov špecifických pre vektor (pre inzert)

Oligonukleotidy:

YEP24for (špecifický pre vektor):

5'-cggaattcctatcgactacgcgatcatgg

YEP24ba (špecifický pre vektor):

5'-gcgaattccgatataggcgccagcaac

Prajmery YEp24for a CaMR212for vedú k vzniku 500 bp fragmentu kódujúcemu 5'-UTR a 5'-kódujúci región z CaMR212.

Pri použití prajmeru YEp24for a CaMR212back sa amplifikoval 1400 bp CaMR212-fragment. Pomocou sekvencie tohto 1400bp-fragmentu boli navrhnuté nasledujúce nové prajmery, špecifické pre tento fragment.

• ·· ·· ·· ·· • · · · ··· ··· • ·· · ···· · · ·· · · · ·· ··· · • · · ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

Oligonukleotidy:

Ca212-1: 5'-gctttcccagcaggataacattg

Ca 212-2: 5’-tgagttataatgcagctgttgg

Ca212-3: 5'-catctcgtgtgaacatgattgg

Prajmery YEP24for a Ca212-3 vedú k zisku 1600 bp fragmentu kódujúcemu 3'- kódujúci región a 3'-UTS región.

Z 3 PCR fragmentov bola zostavená 2900 bp sekvencia (obsahujúca kódujúce a 3* a 5' nekódujúce sekvencie). Pri použití nasledujúcich nových prajmerov bola kódujúca sekvencia amplifikovaná z genómovej DNA a bola klonovaná do p413GALL-vektoru.

Oligonukleotidy na amplifikáciu kódujúceho regiónu: —* Ca212for: 5'- agtttcttcaacttccagatccaag Ca212back: 5'- gtatatttgcaactgtctctctctc

Kvasinkový homológ YMR212c má význam pre funkciu bunkovej steny, pretože vyradenie jeho funkcie môže byt obnovené v IM sorbitole. Ďalej, YMR212c pdo riadením GAL-promotorom vykazuje vyššiu senzitivitu voči konžskej červeni a Calcofluórovej bielobe. YMR212c je integrálny membránový proteín a je lokalizovaný v plazmatickej membráne (čo je preukázané mikroskopovou analýzou YMR212-GFP fúznych proteínov a biochemickou analýzou YMR212-GST fúznych proteínov).

Príklad 7: CaDR325

Sekvencia CaDR325 je uvedená v SEQ ID NO 13.

CaDR325 sa klonoval podľa údajov pre génové fragmenty z verejnej Standford Candida albicans databázy sekvencii.

·· ·· ·· ·· · • · · · • · · • ·· • · · • ··· · • · · · · • · · · ·· ·· (a) Identifikovali sa 3 fragmenty vykazujúce homológiu so Saccharomyces cerevisiae YDR325, ktorých sekvencie sú uvedené v SEQ ID NO 14, 15 a 16.

Podía týchto údajov boli navrhnuté nasledujúce oligonukleotidy, ktoré umožnili verifikáciu sekvencií v databáze a amplifikáciu približne 2200 bp vnútorného CaDR325 fragmentu z genómovej DNA.

cgagcatctacttgttcaaccac: hybCaYDR325ba Oligo gaatctctggctcgctc: 325-juls Oligo gaccgagatacacgagaat: 325-julr Oligo ggttaaatgatcgtgatgaat: Ca325r Oligo caacctcactgacaaatactt: Ca325s Oligo

Výsledný subklonovaný 2200 bp vnútorný fragment sa amplifikoval pomocou kombinácie oligonukleotidov hybCaYDR325ba + 325-julr.

(c) 3' a 5' extenzia vnútorného fragmentu:

Sanglard genómová knižnica Candida DNA (od RMV) v skelete tvorenom YEP24 vektorom sa použila na amplifikáciu 3' a 5' kódujúcich a nekódujúcich sekvencií. Toto bolo uskutočnené pri použití nasledujúcich oligonukleotidov špecifických pre vektor (pre smer k inzertu) a oligonukleotidov špecifických pre CaDR325 2200 bp fragment (smerom k sekvenciám susediacim s vektorom):

cggaattcctatcgactacgcgatcatgg: YEP24for (špecifický pre vektor) gcgaattccgatataggcgccagcaac: YEP24ba (špecifický pre vektor) acgcttccaatgtattattctcg: Oligo 1-10-A back • ·· ·· ·· ·· ···· · · ··· • ·· · · ··· · · • · ··· ·· ··· · • · · ···· ·· ··· · · ·· ·· · ggatgccaatttccctga: Oligo 1-10-B for catccagaagatataacggct: Oligo 1-10-C for tgcataatctactcagcgaca: Oligo 1-10-D back gtggttgaacaagtagatgctcg: Oligo 1-10-E for gcgcttgaaaccactagtgaattg: Ca325Klon_2_Fo caattcactagtggtttcaagcgc: Ca325Klon_3_Ba

Výsledná zostavená 4700 bp sekvencia, ktorá obsahovala tiež 3'- a 5'- nekódujúce sekvencie, bola verifikovaná sekvenovaním. Kódujúci región bol subklonovaný do p413RSGALL vektoru .

Mapa je uvedená na obr. 7.

Čísla sekvencii sú uvedené pod bodom 130 v zozname sekvencii.

• ·· • · · • ··	··	·· • ···	• •	·· • · •
• •	• •
• e ·	•	•	• ·	•	•
·· ··	··		··		·· ·

Zoznam sekvencií <110> Hoechst Marion Roussel <120> Esenciálne gény z C. albicans <130> SEQ ID NO: 1 <140>

<141>

<160> 1 <17Hä* Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 399 <212> DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: Sonda <400> 1 attcatccca tcagtgcaga aagtttgcat agccatttac aacaattaat aaatgataaa 60 cctcaagaga cagtacaaga atcgtctgat ttattacaat ttatcccagt ctctagatta 120 cctgtcaaag ataatatttt gaaatttgat caaattaatc ataaatctcc tactttgatt 180 atgggtatat tgaatatgac tcctgattca tttagt^atg gtgggaaaca ttttggaaaa 240 gaactagata atattgtgaa gcaggcagag aaattagtca gtgagggtgc tacgattatt 300 gacattggag gagtttccac acgaccagga agtgttgaac ccactgagga agaagaattg 360 gaacgtgtga ttccattaat tagagctatt cgtcaatca 399

• · • · · • ··	··	·· • ···	·· • · • ·	··
• •	• •
• · ·	•	•	• ·	• ·
·· ··		··	··	··	··

<110> Hoechst Marion Roussel <120> Esenciálne gény z C. albicans <130> SEQ ID NO: 2 <140>

<141>

<16O> 2 <170> Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 2367 <212> DNA <213> candida albicans <220>

<221> CDS <222> (1)...(2364) <220>

<221> gén <222> (1)...(2364) <223> ge'n CaNL256 <400> 1

atg ttg aaa aac

gat acc

gtt Val

ttc act aaa gat att

tct Ser

tgt acg gcg Cys Thr Ala 15

48

Met 1

Leu

Lys Asn

Asp 5

Thr

Phé

Thr

Lys 10

Asp

íle

ata

act

ggt

aaa

gat

gcc

tgg

aat

cgg

cca

aca

cca

caa

cca

atc

act

96

Íle

Thr

Gly

Lys

Asp

Ala

Trp

Asn

Arg

Pro

Thr

Pro

Gin

Pro

íle

Thr

20

25

30

ata

tca

tta

tct

ttc

aat

act

gat

ttc

cat

aag

gca

tcg

gaa

ttg

gat

144

íle

Ser

Leu

Ser

Phe

Asn

Thr

Asp

Phe

His

Lys

Ala

Ser

Glu

Leu

Asp

35

40

45

aat

ttg

aaa

tac

tca

att

aat

tat

get

gtt

att

acc

aga

aat

gta

act

192

Asn

Leu

Lys

Tyr

Ser

Zle

Asn

Tyr

Ala

Val

íle

Thr

Arg

Asn

Val

Thr

50

55

60

gaa

ttt

atg

aaa.

, tca’

aat

gag

cat

tta

aat

ttc

aag

tca

tta

gga

aat

240

• ·· ·· ·· ·· ···· ··· ··· • ·· é · ··· · · ··· ···· ·· · ··· ·· ·· ·· ·· ···

Glu Phe Met £5

Lys

Ser

Asn 70

Glu

His

Leu

Asn

Phe Lys 75 '

Ser Leu Gly

Asn 80

att

get

caa

gca

att

agt

gat

att

gga

tta

gat

caa

tet

aga

ggt

ggt

288

íle

Ala

Gin

Ala

íle

Ser

Asp

íle

Gly

Leu

Asp

Gin

Ser

Arg

Gly

Gly

85

90

95

gga

tet

att

gtg

gat

gtg

acg

ata

aaa

agt

ttg

aaa

tca

gaa

ata

aga

336

Gly

Ser

íle

Val

Asp

Val

Thr

íle

Lys

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

íle

Arg

100

105

110

get

gaa

agt

gtc

gaa

tat

aaa

att

aat

aga

aac

act

ttg

ggt

caa

ccc

384

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Tyr

Lys

íle

Asn

Arg

Asn

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

115

120

125

gtt

cca

tta

gat

att

ttc

caa

gtt

aat

aaa

ttg

aga

tta

ttg

acg

att

432

Val

Pro

Leu

Asp

íle

Phe

Gin

Val

Asn

Lys

Leu

Arg

Leu

Leu

Thr

íle

130

135

140

att

gga

gtt

ttc

aca

ttt

gaa

aga

tta

caa

aaa

caa

ata

gtt

gat

gtt

480

íle

Gly

Val

Phe

Thr

Phe

Glu

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

íle

Val

Asp

Val

145

150

155

160

gat

ttg

caa

ttt

aaa

att

gaa

cct

aat

tcc

aat

tta

tat

ttc

cat

caa

528

Asp

Leu

Gin

Phe

Lys

íle

Glu

Pro

Asn

Ser

Asn

Leu

Tyr

Phe

His

Gin

165

170

175

ata

att

get

gat

att

gtt

tca

tac

gtg

gaa

tca

tet

aat

ttc

aaa

act

576

íle

íle

Ala

Asp

íle

Val

Ser

Tyr

Val

Glu

Ser

Ser

Asn

Phe

Lys

Thr

160

185

190

gta

gaa

gca

ttg

gtg

tet

aag

att

ggt

caa

ttg

aca

ttt

cag

aaa

tat

624

Val

Glu

Ala

Leu

Val

Ser

Lys

íle

Gly

Gin

Leu

Thr

Phe

Gin

Lys

Tyr

195

200

205

. ·. ·.

-

gac

gga

gta

get

gaa

gtt

gtt

get

act

gtc

act

aaa

ccg

aat

gca

ttt

672

Asp

Gly

Val

Ala

Glu

Val

Val

Ala

Thr

Val

Thr

Lys

Pro

Asn

Ala

Phe

210

215

220

agt

cat

gtt

gaa

ggt

gtt

gga

gta

tca

tet

acc

atg

gtc

aaa

gac

aat

720

Ser

His

Val

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Ser

Ser

Thr

Met

Val

Lys

Asp

Asn

225

230

235

240

ttc

aaa

gat

atg

gaa

cca

gtt

aaa

ttt

gaa

aac

aca

att

get

caa

act

768

Phe

Lys

Asp

Met

Glu

Pro

Val

Lys

Phe

Glu

Asn

Thr

íle

Ala

Gin

Thr

245

250

255

aat

aga

gca

ttc

. aat

tta

cct

gtt

gaa

aat

gag

aaa

act

gag

gat

tat

816

• ·· ·· ·· ·· ···· · · · ··· • ·· · e é·· · · ··· ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

Asn

Arg Ala Phe 260

Asn Leu

Pro Val Glu Asn Glu Lys Thr Glu Asp Tyr

265

270

acc

ggg

tac

cac

act

gca

ttt

att

gcc

ttt

gga

tcc

aat

act

gga

aat

864

Thr

Gly

Tyr

His

Thr

Ala

Phe

íle

Ala

Phe

Gly

Ser

Asn

Thr

Gly

Asn

275

280

285

caa

gta

gaa

aat

att

acc

aat

tca

ttc

gaa

ttg

ttg

caa

aaa

tat

gga

912

Gin

Val

Glu

Asn

íle

Thr

Asn

Ser

Phe

Glu

Leu

Leu

Gin

Lys

Tyr

Gly

290

295

300

atc

acc

ata

gaa

gca

acc

tca

tca

ttg

tac

att

tcc

aaa

cca

atg

tat

960

íle

Thr

íle

Glu

Ala

Thr

Ser

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser

Lys

Pro

Met

Tyr

305

310

•

315

320

tac

ttg

gat

caa

cca

gat

ttc

ttc

aat

gga

gta

aCC

aaa

gtg

aat

ttc

1008

Tyr

Leu

Asp

Gin

Pro

Asp

Phe

Phe

Asn

Gly

Val

íle

Lys

Val

Asn

Phe

325

330

335

caa

aac

att

tca

cct

ttc

cag

ttg

ttg

aaa

att

cca

aaa

.gat

att

gaa

1056

Gin

Asn

íle

Ser

Pro

Phe

Gin

Leu

LéíTTÍiys

íle

Leu

Lys

Asp

íle

Glu

340

345

350

tat

aaa

cat

tta

gaa

agg

aaa

aaa

gac

ttt

gat

aat

ggg

CCC

aga

tca

1104

Tyr

Lys

His

Leu

Glu

Arg

Lys

Lys

Asp

Phe

Asp

Asn

Gly

Pro

Arg

Ser

355

360

365

ata

gat

ttg

gat

att

ata

cta

tat

gac

gat

tta

caa

tta

aat

acc

gag

1152

íle

Asp

Leu

Asp

íle

íle

Leu

Tyr

Asp

Asp

Leu

Gin

Leu

Asn

Thr

Glu

370

375

380

aat

cta

att

att

cca

cat

aaa

tca

atg

tta

gaa

aga

aca

ttt

gta

tta

1200

Asn

Leu

íle

íle

Pro

His

Lys

Ser

Met

Leu

Glu

Arg

Thr

Phe

Val

Leu

385

390

395

400

caa

cca

tta

tgt

gaa

gta

ttg

ccc

cct

gat

tat

att

cat

CCC

atc

agt

1248

Gin

Pro

Leu

Cys

Glu

Val

Leu

Pro

Pro

Asp

Tyr

íle

His

Pro

íle

Ser

405

410

415

gca

gaa

agt

ttg

cat

agc

cat

tta

caa

caa

tta

ata

aat

gat

aaa

cct

1296

Ala

Glu

Ser

Leu

His

Ser

His

Leu

Gin

Gin

Leu

íle

Asn

Asp

Lys

Pro

420

425

430

caa

gag

aca

gta

caa

gaa

tcg

tct

gat

tta

tta

caa

ttt

atc

cca

gtc

1344

Gin

Glu

Thr

Val

Gin

Glu

Ser

Ser

Asp

Leu

Leu

Gin

Phe

íle

Pro

Val

435

440

445

tct aga ttg cct gtc aaa gat aat att ttg aaa ttt gat caa att aat 1392 ·· • · φφ • · • · • ·· • Φ ·· • · · • e ·φφ • · · · · • · · · ·· φφ

Ser Arg Leu Pro

Val

Lys Asp Asn íle Leu 455

Lys

Phe 460

Asp

Gin

íle

Asn

450

cat

aaa

tct

cct

act

ttg

att

atg

ggt

ata

ttg

aat

atg

act

cct

gat

1440

His

Lys

Ser

Pro

Thr

Leu

íle

Met

Gly

íle

Leu

Asn

Met

Thr

Pro

Asp

465

470

475

480

cca

ttt

agt

gat

ggt

ggg

aaa

cat

ttt

gga

aaa

gaa

cta

gat

aat

act

1488

Ser

Phe

Ser

Asp

Gly Gly

Lys

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Leu

Asp

Asn

Thr

485

490

495

gtg

aag

cag

gca

gag

aaa

tta

gtc

agt

gag

ggt

get

acg

att

att

gac

1536

Val

Lys

Gin

Ala

Glu

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Ala

Thr

íle

íle

Asp

500

505

510

atc

gga

gga

gtt

tcc

aca

ege

cca

gga

agt

gtt

gaa

ccc

act

gag

gaa

1584

íle

Gly Gly

Val

Ser

Thr

Arg

Pro

Gly

Ser

Val

Glu

Pro

Thr

Glu

Glu

515

520

525

gaa

gaa

ttg

gaa

cgt

gtg

att

cca

tta

att

aaa

get

att

cgt

caa

tca

1632

Glu

Glu

Leu

GltrKrg

Val

íle

Pro

Leu

íle

Lys

Ala

íle

Arg

Gin

Ser

530

535

540

ctg

aac

cct

gat

tta

ctg

aag

gtg

ttg

att

tcg

gtt

gat

act

tat

cgt

1680

Leu

Asn

Pro

Asp

Leu

Leu

Lys

Val

Leu

íle

Ser

Val

Asp

Thr

Tyr

Arg

545

550

555

560

agg

aac

gtt

get

gaa

caa

agt

tta

ctt

gtg

ggt

get

gac

ata

atc

aac

1728

Arg

Asn

Val

Ala

Glu

Gin

Ser

Leu

Leu

Val

Gly

Ala

Asp

íle

íle

Asn

565

570

575

gat

atc

tca

atg

ggc

aaa

tat

gat

gaa

aaa

ata

ttt

gat

gtg

gtt

get

1776

Asp

íle

Ser

Met

Gly

Lys

Tyr

Asp

Glu

Lys

íle

Phe

Asp

Val

Val

Ala

580

585

590

aaa

tac

gga

tgt

cct

tat

atc

atg

aat

cat

act

ega

gga

tca

cct

aaa

1824

Lys

Tyr

Gly

Cys

Pro

Tyr

íle

Met

Asn

His

Thr

Arg

Gly

Ser

Pro

Lys

595

600

1,

605

acc

atg

tct

aaa

ttg

acc

aat

tat

gaa

tca

aat

aca

aat

gat

gat

att

1872

Thr

Met

Ser

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Glu

Ser

Asn

Thr

Asn

Asp

Asp

íle

610

615

620

atc

gaa

tat

ata

att

gat

cct

aaa

tta

gga

cat

caa

gaa

ttg

gat

ttg

1920

íle

Glu

Tyr

íle

íle

Asp

Pro

Lys

Leu

Gly

His

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu

625

630

635

640

cca cct aaa atc aag aat tta ctc aat gga atc agt cgt gaa ttg agt 1968

• ··	··		• e	• 4
• · ·	•	•	•	•	•
• ··	•	•	···	•	•
• · · ·· ··	• ··	•	• · • ·	• ··	•

Ser

Pro Glu

íle

Lys 645

Asn

Leu Leu

Asn Gly íle Ser Arg Glu Leu Ser

650

655

tta

caa

atg

ttt

aaa

gcc

atg

get

aaa

gga

gtg

aaa

aaa

tgg

caa

att

2016

Leu

Gin

Met

Phe

Lys

Ala

Met

Ala

Lys

Gly

Val

Lys

Lys

Trp

Gin

íle

660

665

670

att

ttg

gat

cct

ggt

att

gga

ttt

get

aaa

aat

ttg

aat

caa

aat

tta

2064

íle

Leu

Asp

Pro

Gly

íle

Gly

Phe

Ala

Lys

Asn

Leu

Asn

Gin

Asn

Leu

675

680

685

gca

gtt

att

cgt

aat

gcc

tcg

ttt

ttt

aaa

aaa

tat

tet

att

caa

att

2112

Ala

Val

íle

Arg

Asn

Ala

Ser

Phe

Phe

Lys

Lys

Tyr

Ser

íle

Gin

íle

690

695

700

aat

gaa

cgt

gtt

gat

gat

gtg

aca

atc

aaa

cat

aaa

tat

tta

agt

ttt

2160

Asn

Glu

Arg

Val

Asp

Asp

Val

Thr

íle

Lys

His

Lys

Tyr

Leu

Ser

Phe

705

710

715

720

aat

ggt

get

tgt

gtt

ttg

gtg

ggg

aca

tca

aga

aag

aag

ttt

ttg

ggg

2208

Asn

Gly

Ala

Čys

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Ser

Arg

Lys

Lys

Phe

Leu

Gly

725

730

735

aca

tta

act

ggt

aat

gaa

gtg

cct

ctg

gat

ega

gta

ttt

ggc

act

ggt

2256

Thr

Leu

Thr

Gly

Asn

Glu

Val

Pro

Leu

Asp

Arg

Val

Phe

Gly

Thr

Gly

740

745

750

gca

aca

gtg

tet

gcg

tgt

att

gaa

caa

aac

act

gat

att

gta

aga

gtt

2304

Ala

Thr

Val

Ser

Ala

Cys

íle

Glu

Gin

Asn

Thr

Asp

íle

Val

Arg

Val

755

760

765

cat

gat

gtt

aaa

gaa

atg

aaa

gat

gta

gta

tgt

ata

agt

gat

gca

att

2352

His

Asp

Val

Lys

Glu

Met

Lys

Asp

Val

Val

Cys

íle

Ser

Asp

Ala

íle

770

775

780

fcat

aaa

aat

gta

taa

2367

Tyr Lys Asn Val 785 <210> 2 ·· • ·· ·· ···· · · · ··· ·········· ου · · · · · ·· ··· · ··· · · · · · ····· ·· ·· ·· · <211> 788 <212> PRT <213> Candida albicans

Met Leu Lys Asn Asp Thr Val Phe Thr Lys Asp íle _Ser Cys Thr Ala 1 S m

íle

Thr

Gly

Lys

Asp

Ala

Trp

Asn

Arg

Pro

Thr

Pro

Gin

Pro

íle

Thr

20

25

30

íle

Ser

Leu

Ser.

Phe

Asn

Thr

Asp

Phe

His

Lys

Ala

Ser

Glu

Leu

Asp

•

35

40

45

Asn

Leu

Lys

Tyr

Ser

íle

Asn

Tyr

Ala

Val

íle

Thr

Arg

Asn

Val

Thr

50

55

60

Glu

Phe

Met

Lys

Ser

Asn

Glu

His

Leu

Asn

Phe

Lys

Ser

Leu

Gly

Asn

65

70

75

80

íle

Ala

Gin

Ala

íle

Ser

Asp

íle

Gly

Leu

Asp

Gin

Ser

Arg

Gly

Gly

85

90

95

Gly

Ser

íle

Val

Asp

Val

Thr

íle

Lys

Ser

Leu

Lys

Ser

Glu

íle

Arg

100

105

110

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Tyr

Lys

íle

Asn

Arg

Asn

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

115

120

125

Val

Pro

Leu

Asp

Íle

Phe

Gin

Val

Asn

Lys

Leu

Arg

Leu

Leu

Thr

íle

130

135

140

íle

Gly

Val

Phe

Thr

Phe

Glu

Arg

Leu

Gin

Lys

Gin

íle

Val

Asp

Val

145

150

155

160

Asp

Leu

Gin

Phe

Lys

íle

Glu

Pro

Asn

Ser

Asn

Leu

Tyr

Phe

His

Gin

165

170

175

íle

íle

Ala

Asp

íle

Val

Ser

Tyr

Val

Glu

Ser

Ser

Asn

Phe

Lys

Thr

.·

180

185

>»

190

Val

Glu

Ala

Leu

Val

Ser

Lys

íle

Gly

Gin

Leu

Thr

Phe

Gin

Lys

Tyr

195

200

205

Asp

Gly

Val

Ala

Glu

Val

Val

Ala

Thr

Val

Thr

Lys

Pro

Asn

Ala

Phe

210

215

220

Ser

His

Val

Glu

Gly

Val

Gly

Val

Ser

Ser

Thr

Met

Val

Lys

Asp

Asn

225

230

235

240

Phe

Lys

Asp

Met

Glu

Pro

Val

Lys

Phe

Glu

Asn

Thr

íle

Ala

Gin

Thr

245

250

255

Asn

Arg

Ala

Phe

Asn

Leu

Pro

Val

Glu

Asn

Glu

Lys

Thr

Glu

Asp

Tyr

260

265

270

·· ·· ·· ·· • · ··· ··· ·· t · ··· · ·

SI • · · · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ··

Thr Gly

Tyr His Thr Ala Phe íle Ala Phe Gly Ser Asn

Thr

Gly

Asn

275

280

285

Gin

Val

Glu

Asn

íle

Thr

Asn

Ser

Phe

Glu

Leu

Leu

Gin

Lys

Tyr

Gly

290

295

300

íle

Thr

íle

Glu

Ala

Thr

Ser

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser

Lys

Pro

Met

Tyr

w

305

310

315

320

Tyr

Leu

Asp

Gin

Pro

Asp

Phe

Phe

Asn

Gly

Val

íle

Lys

Val

Asn

Phe

• ·

325

330

335

Gin

Asn

íle

Ser

Pro

Phe

Gin

Leu

Leu

Lys

íle

Leu

Lys

Asp

íle

Glu

340

345

•

350

Tyr

Lys

His

Leu

Glu

Arg

Lys

Lys

Asp

Phe

Asp

Asn

Gly

Pro

Arg

Ser

355

360

365

íle

Asp

Leu

Asp

íle

íle

Leu

Tyr

Asp

Asp

Leu

Gin

Leu

Asn

Thr

Glu

370

375

380

Asn

Leu

íle

íle

Pro

His

Lys

Ser

Met

Leu

Glu

Arg

Thr

Phe

Val

Leu

3S5

390

395

400

Gin

Pro

Leu

Cys

Glu

Val

Leu

Pro

Pro

Asp

Tyr

íle

His

Pro

íle

Ser

405

410

415

Ala

Glu

Ser

Leu

His

Ser

His

Leu

Gin

Gin

Leu

íle

Asn

Asp

Lys

Pro

420

425

430

Gin

Glu

Thr

Val

Gin

Glu

Ser

Ser

Asp

Leu

Leu

Gin

Phe

íle

Pro

Val

435

440

445

Ser

Arg

Leu

Pro

Val

Lys

Asp

Asn

íle

Leu

Lys

Phe

Asp

Gin

íle

Asn

.·

450

455

460

His

Lys

Ser

Pro

Thr

Leu

íle

Met

Gly

íle

Leu

Asn

Met

Thr

Pro

Asp

« ·

465

470

•

•475

480

Ser

Phe

Ser

Asp

Gly Gly

Lys

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Leu

Asp

Asn

Thr

485

490

495

Val

Lys

Gin

Ala

Glu

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Ala

Thr

íle

íle

Asp

500

505

510

íle

Gly

Gly

Val

Ser

Thr

Arg

Pro

Gly

Ser

Val

Glu

Pro

Thr

Glu

Glu

515 520 525 • ·· ·· ·· ·· ···· · · · ··· • ·· · ···· · t ··· · · · ·· · ··· ·· ·· ·· ·· ···

Glu Glu Leu 530

Glu

Arg Val

Íle Pro Leu íle Lys Ala íle Arg Gin Ser

535

540

Leu

Asn

Pro

Asp

Leu

Leu

Lys

Val

Leu

íle

Ser

Val

Asp

Thr

Tyr

Arg

545

550

555

560

Arg

Asn

Val

Ala

Glu

Gin

Ser

Leu

Leu

Val

Gly

Ala

Asp

íle

íle

Asn

565

570

575

Asp

íle

Ser

Met

Gly

Lys

Tyr

Asp

Glu

Lys

íle

Phe

Asp

Val

Val

Ala

580

585

590

Lys

Tyr

Gly

Cys

Pro

Tyr

Íle

Met

Asn

His

Thr

Arg

Gly

Ser

Pro

Lys

595

600

605

Thr

Met

Ser

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Glu

Ser

Asn

Thr

Asn

Asp

Asp

íle

610

615

620

íle

Glu

Tyr

íle

íle

Asp

Pro

Lys

Leu

Gly

His

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu

£25

630

635

-

640

Ser

Pro

Glu

íle

Lys

Asn

Leu

Leu

Asn

Gly

íle

Ser

Arg

Glu

Leu

Ser

645

'650

655

Leu

Gin

Met

Phe

Lys

Ala

Met

Ala

Lys

Gly

Val

Lys

Lys

Trp

Gin

íle

660

665

670

íle

Leu

Asp

Pro

Gly

íle

Gly

Phe

Ala

Lys

Asn

Leu

Asn

Gin

Asn

Leu

675

680

685

Ala

Val

íle

Arg

Asn

Ala

Ser

Phe

Phe

Lys

Lys

Tyr

Ser

íle

Gin

íle

690

695

700

Asn

Glu

Arg

Val

Asp

Asp

Val

Thr

íle

Lys

His

Lys

Tyr

Leu

Ser

Phe

705

710

715

720

Asn

Gly

Ala

Cys

Val

Leu

Val

Gly

Thr

Ser

Arg

Lys

Lys

Phe

Leu

Gly

725

730

735

Thr

Leu

Thr

Gly

Asn

Glu

Val

Pro

Leu

Asp

Arg

Val

Phe

Gly

Thr

Gly

740

745

750

Ala

Thr

Val

Ser

Ala

Cys

íle

Glu

Gin

Asn

Thr

Asp

íle

Val

Arg

Val

755

760

76S

Hifi

Asp

Val

Lys

Glu

Met

Lys

Asp

Val

Val

Cys

íle

Ser

Asp

Ala

íle

770 775 780

• ·· • · · • ··	··	·· • ···	• ·	··
• •	• •	• •	• •
• · ·	•	•	• ·	•	•
·· ··	··		··		• ·	··

Tyr Lys Asn Val 785 <110> Hoechst Marion Roussel <120> Esenciálne gény z C. albicans <130> SEQ ID NO: 3

I <140>

<141>

<160> 1 <170> Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 647 <212> DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> opis artificiálnej sekvencie: Sonda <400> 1 agtattcaat tgggtattcc cagtaataaa aagaaagatc gatcatcaat tatggtgctt 60 aaaaaaatgt gggattctca attacaatca ttatttaaac atgttgacgg tgcatcaaaa 120 tttgtgcaac cattacccaa tagacacatt gtcgcggaaa gtggacgatg gtttgaagtt 180 aatgtgggga attggaaacc aagttatcca actcatttat ttatatttaa tgatttaatt 240 ttaattgccg ttaaaaaatc accatctagt agtcaggaac'‘ctactacagg gggaagtaat '300 ggtggttcaa aatcgagatt acaagcggtt caatgttggc cctcaactca agtatcatta 360 caacaaatca aatcaccgaa aaaagatgac gataagatgt attttatcaa tcttaaatcc 420 aaatctttaa gttatgtata cctgacggat cgttatgatc attttgtgaa agttacggaa 480 gcatttaata aaggtagaaa tgaaatgatt caaagtgaaa gattattaga ttcaagactt 540 tcatctcctt caaataataa tggagattct aaagaagaga aacgacaatt acgggaatca 600 ttaagaaact caggcaatta taaagaagga gttactgatg atgccgg 647 • ·· · · · • ·· • · · • · · ··· ·· ·· ·· • · · • · ··· • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· · <110> Hoechst Marion Roussel <120> Esenciálne gény z C. albicans <130> SEQ ID NO: 4 <140>

<141>

<160> 2 <170> Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 2373 <212> DNA <213> Candida albicans <220>

<221> CDS <222> (1)...(2373) <220>

<221> gen <222> (1)...(2373) <223> gen CaBR102 <400> 1

atg gat Met Asp 1

aat ctt gat ccc

aat tet agt tta caa gta gag aaa tta ega

48

Asn

Leu

Asp 5

Pro

Asn Ser

Ser

Leu Gin 10

Val

Glu

Lys Leu 15

Arg

aac

agg

aaa

agc

agg

get

gta

tgg

cag

aat.

aac

aac

act

tet

act

cat

96

Asn

Arg

Lys

Ser

Arg

Ala

Val

Trp

Gin

Asn

Asn

Asn

Thr

Ser

Thr

His

20

25

30

aat

aat

cct

tat

get

aat

tta

agc

act

ggt

gaa

aaa

agt

agg

agt

ege

144

Asn

Asn

Pro

Tyr

Ala

Asn

Leu

Ser

Thr

Gly

Glu

Lys

Ser

Arg

Ser

Arg

35

40

45

cat

aac

act

ggt

agt

tet

tat

gtt

tet

cca

tat

ggc

ggc

ggt

aat

gga

192

His

Asn

Thr

Gly

Ser

Ser

Tyr

Val

Ser

Pro

Tyr

Gly Gly Gly

Asn

Gly

50

55

60

gag gag aat get.tat act ggg aat aac aac aaa tca aat act agt ggt 240 ·· ·· ·· • · ·· • ·· • · · • · ··· φ φ · φ · • · · · φφ ·· • Φ • · • · φ φ · • · φφ

Glu 65

Glu

Asn

Ala

Tyr

Thr 70

Gly

Asn

Asn

Asn

Lys 75

Ser

Asn

Thr

Ser

Gly 80

aat:

tta

tta

caa

gtt

cct

gga

gca

gga

gga

gga

gga

gat

ttg

aat

tet

288

Asn

Leu

Leu

Gin

Val 85

Pro

Gly

Ala

Gly

Gly Gly Gly 90

Asp

Leu

Asn 95

Ser

aat

aag

aaa

caa

agt

ega

aga

atg

agt

att

cat

gca

tca

get

cgt

caa

336

Asn

Lys

Lys

Gin 100

Ser

Arg

Arg

Met

Ser 105

íle

His

Val

Ser

Ala 110

Arg

Gin

cat

gga

aga

tca

ttt

tca

caa

act

ggt

cca

att

gat

atg

gca

aat

tta

384

Kis

Gly

Arg 115

Ser

Phe

Ser

Gin

Thr 120

Gly

Pro

íle

Asp

Met 125

Ala

Asn

Leu

ccg

gca

tta

cct

aaa

ata

ggt

ggt

gtt

act

act

agt

ggt

gtt

ggc

ggt

432

Pro

Ala 130

Leu

Pro

Lys

Íle

Gly 135

Gly

Val

Thr

Thr

Ser 140

Gly

Val

Gly Gly

get

ggt

ggt

gat

gtt

atg

aca

agg

act

ggg

gga

ttg

acg

ata

gaa

caa

480

Ala 145

Gly

Gly

Asp

Val

Met 150

Thr

Arg

Thr

Gly

Gly 155

Leu

Thr

íle

Glu

Gin 160

aaa

ata

ttc

aaa

gaa

tta

agt

caa

gga

tca

gca

get

gaa

gtt

gat

gat

528

Lys

Íle

Phe

Lys

Glu 165

Leu

Ser

Gin

Gly

Ser 170

Ala

Ala

Glu

Val

Asp 175

Asp

tat

tae

aag

aca

tta

ttg

aaa

cag

aaa

aat

tta

atc

act

cgt

gac

att

576

Tyr

Tyr

Lys

Thr 180

Leu

Leu

Lys

Gin

Lys 185

Asn

Leu

íle

Thr

Arg 190

Asp

íle

-

aag

gat

aat

att

aat

cag

aat

caa

aaa

aat

att

tta

caa

tta

aca

aaa

624

Lys

Asp

Asn 195

Íle

Asn

Gin

Asn

Gin 200

Lys

Asn

íle

Leu

Gin 205

Leu

Thr

Lys

gac

ttg

aaa

gag

acc

caa

gaa

gaa

ttg

att

gaa

ttg

aga

gga

acc

act

672

Asp

Leu 210

Lys

Glu

Thr

Gin

Glu 215

Glu

Leu

íle

Glu

Leu '220

Arg

Gly

Thr

Thr

aaa

gaa

tta

tat

gaa

gtt

tta

ggt

tat

ttc

aaa

gaa

tca

get

caa

cgt

720

Lys 225

Glu

Leu

Tyr

Glu

Val 230

Leu

Gly

Tyr

Phe

Lys 235

Glu

Ser

Ala

Gin

Arg 240

aga

tta

gaa

ttg

gaa

ttt

gaa

cca

gaa

aca

caa

aaa

gaa

ctt

cat

ctg

76B

Arg

Leu

Glu

Leu

Glu 245

Phe

Glu

Pro

Glu

Thr 250

Gin

Lys

Glu

Leu

His 2S5

Leu

cct caa aaa agt.aat caa ttg ggt att cct agt aat aaa aag aaa gat 816 • ·· ·· ·· ·· ···· · · · ··· • ·· · · ··· · · ··· ···· ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

Pro

Gin

Lys

Ser 260

Asn

Gin

Leu

Gly

íle 265

Pro

Ser

Asn

Lys

Lys 270

Lys

Asp

ega

tca

tca

att

atg

gtg

ctt

aaa

aaa

atg

tgg

gat

tet

caa

tta

caa

864

Arg

Ser

Ser 275

íle

Met

Val

Leu

Lys 280

Lys

Met

Trp

Asp

Ser 285

Gin

Leu

Gin

tca

tta

ttt

aaa

cat

gtt

gac

ggt

gca

tca

aaa

ttt

gtc

caa

cca

tta

912

Ser

Leu 290

Phe

Lys

His

Val

Asp 295

Gly

Ala

Ser

Lys

Phe 300

Val

Gin

Pro

Leu

ccc

aat

aga

cac

att

gtc

gcg

gaa

agt

gga

ega

tgg

ttt

gaa

gtt

aat

960

Pro 305

Asn

Arg

His

íle

Val 310

Ala

Glu

Ser

Gly

Arg 315

Trp

Phe

Glu

Val

Asn 320

gtg

ggg

aat

tgg

aaa

cca

agt

tat

cca

act

cat

tta

ttt

ata

ttt

aat

1008

Val

Gly

Asn

Trp

Lys 325

Pro

Ser

Tyr

Pro

Thr 330

His

Leu

Phe

íle

Phe 335

Asn

gat

tta

att

tta

att

act

gtt

aaa

aaa

tca

tca

tet

agt

agt

cag

gaa

1056

Asp

Leu

íle

Leu 340

íle

Thr

Val

Lys

Lys 345

Ser

Ser

Ser

JS£JL.Ser 350

Gin

Glu

cct

act

aca

ggg

gga

agt

aat

ggt

ggt

tca

aaa

tcg

aga

tta

caa

gcg

1104

Pro

Thr

Thr 355

Gly

Gly

Ser

Asn

Gly 360

Gly

Ser

Lys

Ser

Arg 365

Leu

Gin

Ala

gtt

caa

tgt

tgg

ccc

tta

act

caa

gta

tca

tta

caa

caa

atc

aaa

tca

1152

Val

Gin 370

Cys

Trp

Pro

Leu

Thr 375

Gin

Val

Ser

Leu

Gin 380

Gin

íle

Lys

Ser

-

ccg

aaa

aaa

gat

gac

gat

aag

atg

tat

ttt

atc

aat

ctt

aaa

tcc

aaa

1200

Pro 385

Lys

Lys

Asp

Asp

Asp 390

Lys

Met

Tyr

Phe

íle 395

Asn

Leu

Lys

Ser

Lys 400

tet

tta

agt

tat

gta

tac

ctg

acg

gat

cgt

tat

gat

cat

ttt

gtg

aaa

1248

Ser

Leu

Ser

Tyr

Val 405

Tyr

Leu

Thr

Asp

Arg 410

Tyr

Asp

His

Phe

Val 415

Lys

gtt

aeg

gaa

gca

ttt

aat

aaa

ggt

aga

aat

gaa

atg

att

caa

agt

gaa

1296

Val

Thr

Glu

Ala 420

Phe

Asn

Lys

Gly

Arg 425

Asn

Glu

Met

íle

Gin 430

Ser

Glu

aga

tta

tta

gat

tca

aga

ctt

tca

tet

cct

tca

aat

aat

aat

gga

gat

1344

Arg

Leu

Leu 435

Asp

Ser

Arg

Leu

Ser 440

Ser

Pro

Ser

Asn

Asn 445

Asn

Gly

Asp

tet

aaa

gaa

gag

. aaa

ega

caa

tta

cgg

gaa

tca

tta

aga

aac

tcä

ggc '

1392

·· ·· ·· • t • ··· ·· • ·

Ser Lys Glu 450

Glu Lys

Arg Gin Leu Arg Glu Ser Leu Arg Asn Ser Gly

455

460

aat

tat

aaa

gaa

gga

gtt

act

gat

gat

gcc

ggt

gga

get

gca

act

ggt

1440

Asn

Tyr

Lys

Glu

Gly

Val

Thr

Asp

Asp

Ala

Gly

Gly

Ala

Ala

Thr

Gly

465

470

475

480

ggt

ggt

agg

aaa

agt

gcc

ggt

act

cct

aat

aga

aat

agt

act

gat

tac

1488

Gly

Gly

Arg

Lys

Ser

Ala

Gly

Thr

Pro

Asn

Arg

Asn

Ser

Thr

Asp

Tyr

485

490

495

gtt

tta

cat

gat

ata

tct

get

ega

gta

cat

tca

cgt

aat

ega

tca

caa

1536

Val

Leu

His

Asp

íle

Ser

Ala

Arg

Val

His

Ser

Arg

Asn

Arg

Ser

Gin

500

505

510

gat

tta

999

aat

aat

ttc

aaa

tta

get

aat

aat

ggg

aaa

tca

caa

ttt

1584

Asp

Leu

Gly

Asn

Asn

Phe

Lys

Leu

Ala

Asn

Asn

Gly

Lys

Ser

Gin

Phe

515

520

525

ttc

aat

gaa

atc

aa-a«act

tta

gaa'

gat

ega

tta

gat

gat

gtt

gac

gtt

1632

Phe

Asn

Glu

íle

Lys

Thr

Leu

Glu

Asp

Arg

Leu

Asp

Asp

Val

Asp

Val

530

535

540

gaa

ata

tcg

cat

aat

caa

tat

get

gaa

gcc

gtg

gaa

tta

ata

tca

ata

1680

Glu

íle

Ser

His

Asn

Gin

Tyr

Ala

Glu

Ala

Val

Glu

Leu

íle

Ser

íle

545

550

555

560

att

gaa

tct

aaa

tta

cgt

aat

att

gaa

aat

gca

tta

act

aat

caa

cgt

1726

íle

Glu

Ser

Lys

Leu

Arg

Asn

íle

Glu

Asn

Ala

Leu

Thr

Asn

Gin

Arg

565

570

575

aat

gga

ggt

aaa

aat

gtc

aat

att

get

gat

gaa

tta

tta

ctt

tta

gat

1776

Asn

Gly

Gly

Lys

Asn

Val

Asn

íle

Ala

Asp

Glu

Leu

Leu

Leu

Leu

Asp

580

585

590

gta

tca

aaa

ttg

aaa

att

aaa

aat

cgg

aaa

gaa

aat

gta

tct

aat

gga

1824

Val

Ser

Lys

Leu

Lys

íle

Lys

Asn

Arg

Lys

Glu

Asn

Val

Ser

Asn

Gly

595

600

605

tta

ata

ttt

gat

tta

caa

cat

aat

ata

get

aaa

ctt

aaa

caa

gat

gat

1872

Leu

íle

Phe

Asp

Leu

Gin

His

Asn

íle

Ala

Lys

Leu

Lys

Gin

Asp

Asp

610

615

620

att

gat

aat

att

ttg

acg

tta

ttt

gat

aat

tta

gag

caa

tta

gat

ega

1920

íle

Asp

Asn

íle

Leu

Thr

Leu

Phe

Asp

Asn

Leu

Glu

Gin

Leu

Asp

Arg

625

630

•

635

640

999

gtt

caa

gg*a

tat

ttg

gat

tca

atg

tca

get

tat

tta

tca

act

aca

1968

·· • · • · · • · • ·· ·« ·· • · · • · ··· • · · · • · · · ·· ·· ·« • · · • · • · · • · • · ·

Gly Val Gin Gly Tyr Leu Asp Ser

Met Ser Ala Tyr Leu Ser Thr

Thr

645

650

655

gta

tca

aaa

tta

att

gtt

ggt

tta

caa

gga

tca

acg

aaa

atc

gat

gtt

2016

Val

Ser

Lys

Leu

íle

Val

Gly

Leu

Gin

Gly

Ser

Thr

Lys

íle

Asp

Val

660

665

670

gtt

aat

tat

ctt

tcc

aat

tta

atg

gtt

att

aat

gta

tcg

att

gtg

aaa

.2064

Val

Asn

Tyr

Leu

Ser

Asn

Leu

Met

Val

íle

Asn

Val

Ser

íle

Val

Lys

675

680

685

cgt

aca

att

caa

act

tat

gaa

caa

ata

att

get

cca

att

tta

aaa

cgt

2112

Arg

Thr

íle

Gin

Thr

Tyr

Glu

Gin

íle

íle

Ala

Pro

íle

Leu

Lys

Arg

690

695

700

cat

ggt

gat

gtt

gat

tca

agt

gga

ttg

att' aat

tgg

tgt

att

gat

gaa

2160

His

Gly

Asp

Val

Asp

Ser

Ser

Gly

Leu

íle

Asn

Trp

Cys

íle

Asp

Glu

705

710

715

720

tct

act

aaa

Ctt

tgt

aaa

caa

att

aaa

aaa

cat

ttg

tat

gga

aca

ttg

2208

Phe

Thr

Lys

Leu

Cys

Lys

Gin

íle

Lys

Lys

His

Leu

Tyr

Gly

Thr

Leu

- -

725

730

735

ttg

ata

tct

tct

ggg

att

aat

atg

gaa

act

gat

gaa

cca

att

tat

aaa

2256

Leu

íle

Ser

Ser

Gly

íle

Asn

Met

Glu

Thr

Asp

Glu

Pro

íle

Tyr

Lys

740

745

750

gtt

aaa

gaa

aga

aaa

tta

tat

gat

aat

ttc

ttg

aag

att

atg

caa

cca

2304

Val

Lys

Glu

Arg

Lys

Leu

Tyr

Asp

Asn

Phe

Leu

Lys

íle

Met

Gin

Pro

755

760

765

caa

ttg

gaa

gaa

tta

aaa

ctg

gtg

gga

tta

aat

gtt

gat

tat

ata

ttt

2352

Gin

Leu

Glu

Glu

Leu

Lys

Leu

Val

Gly

Leu

Asn

Val

Asp

Tyr

íle

Phe

770

775

*

780

gag

tct

ata

tta

aat

ctt

gaa

2373

Glu

Ser

íle

Leu

Asn

Leu

Glu

785

790

<210> 2 ·· b a ·· ·· ·· • · · • · ··· ·· · a · ·· • · · • · · ·· ··· <211> 791 <212> PRT <213> Candida albicans

Met Asp Asn Leu Asp Pro Asn Ser Ser Leu Gin Val Glu Lys Leu Arg

1

5 Arg

10

15 Thr

His

>

Asn

Arg Lys Ser 20

Ala

Val Trp

Gin'Asn Asn 25

Asn

Thr Ser 30

Asn

Asn

Pro

Tyr

Ala

Asn

Leu

Ser

Thr

Gly

Glu

Lys

Ser

Arg

Ser

Arg

•

35

40

45

His

Asn

Thr

Gly

Ser

Ser

Tyr

Val

Ser

Pro

Tyr

Gly

Gly

Gly

Asn

Gly

50

55

60

Glu

Glu

Asn

Ala

Tyr

Thr

Gly

Asn

Asn

Asn

Lys

Ser

Asn

Thr

Ser

Gly

65

70

75

80

Asn

Leu

Leu

Gin

Val

Pro

Gly

Ala

Gly

Gly

Gly Gly

Asp

Leu

Asn

Ser

85

90

95

Asn

Lys

Lys

Gin

Ser

Arg

Arg

Met

Ser

íle

His

Val

Ser

Ala

Arg

Gin

100

105

110

His

Gly

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Thr

Gly

Pro

íle

Asp

Met

Ala

Asn

Leu

115

120

125

Pro

Ala

Leu

Pro

Lys

íle

Gly

Gly

Val

Thr

Thr

Ser

Gly

Val

Gly

Gly

130

135

140

Ala

Gly

Gly

Asp

Val

Met

Thr

Arg

Thr

Gly

Gly

Leu

Thr

íle

Glu

Gin

145

150

155

160

Lys

íle

Phe

Lys

Glu

Leu

Ser

Gin

Gly

ser

Ala

Ala

Glu

Val

Asp

Asp

.·

165

170

175

Tyr

Tyr

Lys

Thr

Leu

Leu

Lys

Gin

Lys

Asn

Leu

íle

Thr

Arg

Asp

íle

180

185

f.

190

Lys

Asp

Asn

Íle

Asn

Gin

Asn

Gin

Lys

Asn

íle

Leu

Gin

Leu

Thr

Lys

195

200

205

Asp

Leu

Lys

Glu

Thr

Gin

Glu

Glu

Leu

íle

Glu

Leu

Arg

Gly

Thr

Thr

210

215

220

Lys

Glu

Leu

Tyr

Glu

Val

Leu

Gly

Tyr

Phe

Lys

Glu

Ser

Ala

Gin

Arg

225

230

235

240

Arg

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Glu

Pro

Glu

Thr

Gin

Lys

Glu

Leu

His

Leu

Pro Gin Lys Ser Asn Gin Leu Gly íle Pro Ser Asn Lys Lys Lys Asp 260. 265 270

245 250 255 ·· • · • ··· • · <

Arg Ser Ser

íle

Met Val

Leu

Lys Lys Met Trp Asp Ser Gin Leu Gin

275

280

285

Ser

Leu

Phe

Lys

His

Val

Asp

Gly

Ala

Ser

Lys

Phe

Val

Gin

Pro

Leu

290

295

300

Pro

Asn

Arg

His

íle

Val

Ala

Glu

Ser

Gly

Arg

Trp

Phe

Glu

Val

Asn

305

310

315

320

Val

Gly

Asn

Trp

Lys

Pro

Ser

Tyr

Pro

Thr

His

Leu

Phe

íle

Phe

Asn

325

330

335

Asp

Leu

Íle

Leu

íle

Thr

Val

Lys

Lys

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Gin

Glu

340

345

•

350

Pro

Thr

Thr

Gly

Gly

Ser

Asn

Gly

Gly

Ser

Lys

Ser

Arg

Leu

Gin

Ala

355

360

365

Val

Gin

Cys

Trp

Pro

Leu

Thr

Gin

Val

Ser

Leu

Gin

Gin

Íle

Lys

Ser

370

375

380

Pro

Lys

Lys

Asp

Asp

Asp

Lys

Met

Tyr

Phe

.íle

Asn

Leu

Lys

Ser

Lys

385

390

395

400

Ser

Leu

Ser

Tyr

Val

Tyr

Leu

Thr

Asp

Arg

Tyr

Asp

His

Phe

Val

Lys

405

410

415

Val

Thr

Glu

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Arg

Asn

Glu

Met

íle

Gin

Ser

Glu

420

425

430

Arg

Leu

Leu

Asp

Ser

Arg

Leu

Ser

Ser

Pro

Ser

Asn

Asn

Asn

Gly Asp

435

440

445

Ser

Lys

Glu

Glu

Lys

Arg

Gin

Leu

Arg

Glu

Ser

Leu

Arg

Asn

Ser Gly

450

455

460

Asn

Tyr

Lys

Glu

Gly

Val

Thr

Asp

Asp

Ala

Gly

Gly

Ala

Ala

Thr

Gly

465

470

475

480

Gly Gly

Arg

Lys

Ser

Ala

Gly

Thr

Pro

Asn

Arg

Asn

Ser

Thr

Asp

Tyr

485

490

495

Val

Leu

His

Asp

íle

Ser

Ala

Arg

Val

His

Ser

Arg

Asn

Arg

Ser

Gin

500 505 510

Asp Leu Gly Asn Asn Phe Lys Leu Ala Asn Asn Gly Lys Ser Gin Phe 515 520 525 • ·· ·· ·· ·· ···· ··· ··· • ·· · ···· e · • · · ···· ·· * ··· · ·· ·· ·· ···

Phe Asn Glu 530

íle Lys

Thr Leu Glu Asp Arg Leu Asp Asp Val Asp Val

535

540

Glu

íle

Ser

His

Asn

Gin

Tyr

Ala

Glu

Ala

Val

Glu

Leu

íle

Ser

íle

545

550

555

560

íle

Glu

Ser

Lys

Leu

Arg

Asn

íle

Glu

Asn

Ala

Leu

Thr

Asn

Gin

Arg

565

570

575

Asn

Gly

Gly

Lys

Asn

Val

Asn

íle

Ala

Asp

Glu

Leu

Leu

Leu

Leu

Asp

580

585

590

Val

Ser

Lys

Leu

Lys

íle

Lys

Asn

Arg

Lys

Glu

Asn

Val

Ser

Asn

Gly

595

600

605

Leu

íle

Phe

Asp

Leu

Gin

His

Asn

íle

Ala

Lys

Leu

Lys

Gin

Asp

Asp

610

615

620

íle

Asp

Asn

íle

Leu

Thr

Leu

Phe

Asp

Asn

Leu

Glu

Gin

Leu

Asp

Arg

625

630

635

640

Gly

Val

Gin

Gly

Tyr

Leu

Asp

Ser

Met

Ser

Ala

Tyr

Leu

Ser

Thr

Thr

645

650

655

Val

Ser

Lys

Leu

íle

Val

Gly

Leu

Gin

Gly

Ser

Thr

Lys

íle

Asp

Val

660

665

670

Val

Asn

Tyr

Leu

Ser

Asn

Leu

Met

Val

íle

Asn

Val

Ser

íle

Val

Lys

675

680

685

Arg

Thr

íle

Gin

Thr

Tyr

Glu

Gin

íle

íle

Ala

Pro

íle

Leu

Lys

Arg

690

695

700

His

Gly

Asp

Val

Asp

Ser

Ser

Gly

Leu

íle

Asn

Trp

Cys

íle

Asp

Glu

705

710

715

720

Phe

Thr

Lys

Leu

Cys

Lys

Gin

íle

Lys

Lys

His

Leu

Tyr

Gly

Thr

Leu

725

730

735

Leu

íle

Ser

Ser

Gly

íle

Asn

Met

Glu

Thr

Asp

Glu

Pro

íle

Tyr

Lys

740

745

750

Val

Lys

Glu

Arg

Lys

Leu

Tyr

Asp

Asn

Phe

Leu

Lys

íle

Met

Gin

Pro

755 760 765

Gin Leu Glu Glu Leu Lys Leu Val Gly Leu Asn Val Asp Tyr íle Phe 770 , 775 780 ·· ·· ·· • · · · ·· · · ··· ·· • · · • · ····· ·· ·· ·· ·

Glu Ser íle Leu Asn Leu Glu 785 790 <110> Hoechst Marion Roussel <120> Esenciálne gény z C. albicans <130> SEQ ID NO: 5 <140>

<141>

<160> 1 <12D> Patentln vér. 2.1 <210> 1 ^: <211> 343 <212> DNA <213> Artificiálna sekvencia <220>

<223> Opis artificiálnej sekvencie: Sonda <400> 1 ctgcagtaaa ccctccagat ataacagact ctttatgtcc agtgatttcg ccaacaaatc 60 ttggtggttg ggtgtgtgtg gtccataagt atgccgtgtt gtcaccaccc ccagtcaata 120 ccattggcaa tttaggatgt gaaaaaatag taaatatact atcggtatgt ttatcaaaat 180 aagtccatga attgttggac atgtcaattt ctaaagtctc atgctcatca tctaattcca 240 tctcctcatc ttcttcatcg ggtggcgctt gatcatcatc., tgcaacttcc tcagceactť300 cattaacatt gatatattct tcttgagtat cgtctacgac'gcc 343 ·· ·· ·· ·· ·· ··· ··· ·· · · ··· · · <110> Hoechst Marion Roussel <120> Esenciálne gény z C. albicans <130> SEQ ID NO: 6 <140>

<141>

<160> 2 <170> Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 1248 <212> DNA <213> Candida albicans <220>

<221> .CDS - <222> (1)...(1245) <220>

<221> gén

<222> (1)...(1245)

<223>

gén

CaIR0l2 1

<400>

1

atg

tca

cac

caa

caa

gaa

gac

gtc

gta

gac

gat

act

caa

gaa

gaa

tat

48

Met

Ser

His

Gin

Gin

Glu

Asp

Val

Val

Asp

Asp

Thr

Gin

Glu

Glu

Tyr

1

5

10

15

atc

aat

gtt

aat

gaa

gtg

get

gag

gaa

gtt

gca

gat

gat

gat

caa

gcg

96

íle

Asn

Val

Asn

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Val

Ala

Asp

Asp

Asp

Gin

Ala

20

25

30

cca

ccc

gat

gaa

gaa

gat

gag

gag

atg

gaa

tta

gat

gat

gag

cat

gag

144

Pro

Pro

Asp

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

Met

Glu

Leu

Asp

Asp

Glu

His

Glu

35

40

45

act

tta

gaa

att

gac

atg

tcc

aac

aat

tca

tgg

act

tat

ttt

gat

aaa

192

Thr

Leu

Glu

íle

Asp

Met

Ser

Asn

Asn

Ser

Trp

Thr

Tyr

Phe

Asp

Lys

50

55

60

cat acc gat agt. ata ttt act att ttt tca cat cct aaa ttg cca atg 240

• · ·	• ·	• ·	9 · ·
• · ·	• · ·	• · · ·
• ··	•	• ···	• · ·
• · · ·	• ·	··	·· ··

His 65

Thr

Asp

Ser

íle

Phe 70

Thr

íle Phe

Ser

HIS 75

ťro

Lys

Leu

Pro

Met 80

gta

ttg

act

ggg

ggt

ggt

gac

aac

acg

gca

tac

tta

tgg

acc

aca

cac

288

Val

Leu

Thr

Gly

Gly

Gly

Asp

Asn

Thr

Ala

Tyr

Leu

Trp

Thr

Thr

His

85

90

95

acc

caa

cca

cca

aga

ttt

gtt

ggc

gaa

atc

act

gga

cat

aaa

gag

tet

336

Thr

Gin

Pro

Pro

Arg

Phe

Val

Gly

Glu

íle

Thr

Gly

His

Lys

Glu

Ser

100

105

110

get

aca

tet

gga

ggg

ttt

act

gca

gac

ggc

aag

ttt

gtt

gtt

act

gca

384

Val

Íle

Ser

Gly

Gly

Phe

Thr

Ala

Asp

Gly

Lys

Phe

Val

Val

Thr

Ala

115

120

125

gac

atg

aat

gga

tta

att

caa

gtt

ttc

aaa

gcc

aca

aaa

gga

ggt

gaa

432

Asp

Met

Asn

Gly

Leu

íle

Gin

Val

Phe

Lys

Ala

Thr

Lys

Gly

Gly

Glu

130

135

140

cag

tgg

gtg

aaa

ttt

ggt

gaa

ttg

gac

gaa

gtt

gaa

gaa

gtg

ttg

ttt

480

Gin

Trp

Val

Lys

Phe

Gly

Glu

Leu

Asp

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Leu

Phe

145

150

155

160

gtt

act

gtg

cat

cca

aca

tta

cca

ttc

ttt

gcc

ttt

ggt

get

acc

gat

528

Val

Thr

Val

His

Pro

Thr

Leu

Pro

Phe

Phe

Ala

Phe

Gly

Ala

Thr

Asp

165

170

175

gga

tet

ata

tgg

gtc

tac

caa

ata

gac

gaa

tcc

agt

aaa

ctg

cta

gtg

576

Gly

Ser

íle

Trp

Val

Tyr

Gin

íle

Asp

Glu

Ser

Ser

Lys

Leu

Leu

Val

180

185

190

caa

att

atg

tet

ggg

ttc

tca

cac

aca

tta

gaa

tgt

aat

ggt

get

gta

624

Gin

Íle

Met

Ser

Gly

Phe

Ser

His

Thr

Leu

Glu

Cys

Asn

Gly

Ala

Val

195

200

205

ttt

ata

caa

gga

aaa

gat

gaa

aat

gat

ttg

aca

ttg

gtc

tet

ata

agt

672

Phe

Íle

Gin

Gly

Lys

Asp

Glu

Asn

Asp

Leu

Thr

Leu

Val

Ser

íle

Ser

210

215

-

220

gaa

gat

ggt

act

gtg

gtg

aac

tgg

aac

tgt

ttt

aca

gga

caa

gtg

aat

720

Glu

Asp

Gly

Thr

Val

Val

Asn

Trp

Asn

Cys

Phe

Thr

Gly

Gin

Val

Asn

225

230

235

240

tat

aaa

ttg

caa

cct

cat

gat

gac

ttt

aaa

gga

gtt

gaa

agt

ccg

tgg

768

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

His

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Pro

Trp

245

250

255

gcc acg gtc aaa gta cat ggt aat ctt gtg gcc att ggt ggc aga gat 816

• ··	11	• I	• I I
• II ·	•	•	•	• I	• I
• II	•	•	• II	• I
• I i	•	•	• I	• I
··· II	• I	• I	• I	• I

Val Thr Val Lys

Val

His

Gly Asn Leú Val Ala íle Gly Gly Arg Asp

260

265

270

ggc

cag

cta

tca

att

gtg

aac

aat

gac

act

ggt

aaa

atc

gtt

cat

act

864

Gly

Gin

Leu

Ser

íle

Val

Asn

Asn

Asp

Thr

Gly

Lys

íle

Val

His

Thr

275

280

285

ctt

aaa

aca

ttg

gat

aat

gtc

gac

gac

att

gca

gaa

ctc

tca

att

gag

912

Leu

Lys

Thr

Leu

Asp

Asn

Val

Asp

Asp

íle

Ala

Glu

Leu

Ser

íle

Glu

290

295

300

gca

ttg

agt

tgg

tgt

gaa

age

aaa

aat

att

aac

ctc

ttg

gca

gtg

ggt

960

Ala

Leu

Ser

Trp

Cys

Glu

Ser

Lys

Asn

íle

Asn

Leu

Leu.

Ala

Val

Gly

305

310

315

320

ttg

gtt

tct

ggt

gac

gtt

tta

tta

ttt

gat

act

cag

caa

tgg

aga

ttg

1008

Leu

Val

Ser

Gly

Asp

Val

Leu

Leu

Phe

Asp

Thr

Gin

Gin

Trp

Arg

Leu

325

330

335

aga

aag

aac

ttg

aaa

gtt

gac

gat

gcc

atc

acc

aaa

tta

caa

ttt

gtt

1056

Arg

Lys

Asn

Leu

Lys

Val

Asp

Asp

Ala

íle

Thr

Lys

Leu

Gin

Phe

Val

340

345

350

—t

ggc

gaa

acc

ccc

att

ttg

gtg

gga

agt

agt

atg

gat

ggt

aaa

att

tac

1104

Gly

Glu

Thr

Pro

íle

Leu

Val

Gly

Ser

Ser

Met

Asp

Gly

Lys

íle

Tyr

355

360

365

aaa

tgg

gac

get

aga

act

ggt

gaa

gag

ttg

ttt

get

ggt

gtg

gga

cac

1152

Lys

Trp

Asp

Ala

Arg

Thr

Gly

Glu

Glu

Leu

Phe

Ala

Gly

Val

Gly

His

370

375

380

aac

atg

gga

gta

ttg

gac

ttt

get

att

tta

gat

gga

ggt

aaa

aag

ttg

1200

Asn

Met

Gly

Val

Leu

Asp

Phe

Ala

íle

Leu

Asp

Gly

Gly

Lys

Lys

Leu

385

390

395

400

gtt

act

get

ggt

gat

gaa

ggt

gtt

tca

ttg

gtc

ttt

gta

cat

gaa

tag

1248

Val

Thr

Ala

Gly

Asp

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Val

Phe

Val

His

Glu

405

410

415

<210> 2 <211> 415 <212> PRT <213> Candida albicans

Met Ser His Gin Gin Glu Asp Val Val Asp Asp Thr Gin Glu Glu Tyr • ·· ·· · · • ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · ··· · · • · · ···· ·· · ··· ·· ·· ·· ·· ···

íle

Asn

Val

Asn

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Val

Ala

Asp

Asp

Asp

Gin

Ala

20

25

30

Pro

Pro

Asp

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

Met

Glu

Leu

Asp

Asp

Glu

His

Glu

35

40

45

Thr

Leu

Glu

íle

Asp

Met

Ser

Asn

Asn

Ser

Trp

Thr

Tyr

Phe

Asp

Lys

50

S5

60

His

Thr

Asp

Ser

íle

Phe

Thr

íle

Phe

Ser

His

Pro

Lys

Leu

Pro

Met

65

70

75

80

Val

Leu

Thr

Gly

Gly

Gly

Asp

Asn

Thr

Ala

Tyr

Leu

Trp

Thr

Thr

His

85

90

95

Thr

Gin

Pro

Pro

Arg

Phe

Val

Gly

Glu

íle

Thr

Gly

His

Lys

Glu

Ser

100

105

110

Val

íle

Ser

Gly

Gly

Phe

Thr

Ala

Asp

Gly

Lys

Phe

Val

Val

Thr

Ala

.115

120

125

Asp

Met

Asn

Gly

Leu

íle

Gin

Val

Phe

Lys

Ala

Thr.

Lys

Gly

Gly

Glu

130

135

140

Gin

Trp

Val

Lys

Phe

Gly

Glu

Leu

Asp

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Leu

Phe

145

150

155

160

Val

Thr

Val

His

Pro

Thr

Leu

Pro

Phe

Phe

Ala

Phe

Gly

Ala

Thr

Asp

165

170

175

Gly

Ser

íle

Trp

Val

Tyr

Gin

íle

Asp

Glu

Ser

Ser

Lys

Leu

Leu

Val

180

185

190

Gin

íle

Met

Ser

Gly

Phe

Ser

His

Thr

Leu

Glu

Cys

Asn

Gly

Ala

Val

195

200

205

Phe

íle

Gin

Gly

Lys

Asp

Glu

Asn

Asp

Leu

Thr

Leu

Val

Ser

íle

Ser

210

215

>4

220

Glu

Asp

Gly

Thr

Val

Val

Asn

Trp

Asn

Cys

Phe

Thr

Gly

Gin

Val

Asn

225

230

235

240

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

His

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Val

Glu

Ser

Pro

Trp

245 250 255

Val Thr Val Lys Val His Gly Asn Leu Val Ala íle Gly Gly Arg Asp 260 265 270

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polynukleotid majúci sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO:
2. 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 alebo SEQ ID NO: 13, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.

   2. Polynukleotid podlá nároku 1 majúci sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 alebo SEQ ID NO: 11, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
3. 3. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaNL256, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
4. 4. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaBR102, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
5. 5. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaIR012, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
6. 6. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaMR212, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
7. 7. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaDR325, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
8. 8. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaORllO, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
9. 9. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorým je gén CaJL039, jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.

   ·· • · · • · • · • ·· ·· ·· • · • ··· ··· ·· ·· ·· ·
10. 10. Gén podlá akéhokolvek z nárokov 3 až 9, kde funkčne podobný gén má identitu sekvencie, na úrovni nukleotidov, aspoň 50%, lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.
11. 11. Gén podlá akéhokolvek z nárokov 3 až 9, kde funkčne podobný gén má identitu sekvencie, na úrovni aminokyselín kódovaného proteínu, aspoň 40%, lepšie aspoň 50%, lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.
12. 12. Proteín kódovaný polynukleotidom podlá akéhokolvek z nárokov 1 až 11 alebo jeho funkčný polypeptidový fragment.
13. 13. Plazmid obsahujúci gén podlá akéhokolvek z nárokov 3 až 9.
14. 14. Plazmid uložený v CNCM pod prírastkovým číslom 1-2065.
15. 15. Plazmid uložený v CNCM pod prírastkovým číslom 1-2063.
16. 16. Plazmid uložený v DSMZ pod prírastkovým číslom DSM 12977
17. 17. Plazmid uložený v DSMZ pod prírastkovým číslom DSM 12976
18. 18. Plazmid uložený v DSMZ pod prírastkovým číslom DSM 12978
19. 19. Plazmid uložený v DSMZ pod prírastkovým číslom DSM 12979
20. 20. Polynukleotid získatelný spôsobom zahŕňajúcim následujúce kroky:

    (i) selekciu esenciálneho génu zo Saccharomyces cerevisiae·, (ii) porovnanie sekvencie uvedeného génu so sekvenciami genómu Candida albicans·, ·· • · · • · · ·· · · • ·· ·· ·· • · • ··· ··· ·· ·· ·· ·· · (iii) zistenie homológnych oligonukleotidových regiónov;

    (iv) PCR araplifikáciu takto získaných oligonukleotidov;

    (v) použitie amplimérov zo stupňa (iv) na detekciu požadovaného úplného génu;

    a jeho homológy a jeho funkčné fragmenty.
21. 21. Polynukleotid podľa nároku 20, v ktorom krok (v) zahŕňa krok použitia amplimérov kroku (iv) ako sond na detekciu úplného požadovaného génu z genómovej knižnice Candida albicans.
22. 22. Polynukleotid podľa nároku 20, v ktorom krok (v) zahŕňa krok použitia amplimérov kroku (iv) ako sond na detekciu úplného požadovaného génu z cDNA knižnice Candida albicans.
23. 23. Polynukleotid podľa nároku 20, v ktorom krok (v) zahŕňa krok 3' a 5' extenzie ampliméru pomocou PCR metódy.
24. 24. Protilátka namierená proti proteínu podľa nároku 12 alebo jeho funkčnému polypeptidovému fragmentu.
25. 25. Spôsob na vyhľadávanie antimykotických substancií, vyznačujúci sa tým, že esenciálny gén z hub alebo funkčne podobný gén z iných hub, alebo príslušný kódovaný proteín, je použitý ako cieľ, a tým, že esenciálnym génom je gén podľa akéhokoľvek z nárokov 3 až 9.
26. 26. Spôsob podľa nároku 25,vyznačujúci sa tým, že mykotické bunky, ktoré exprimujú esenciálny gén alebo funkčne podobný mykotický gén v rôznej úrovni, sa inkubujú s testovanou substanciou a stanoví sa inhibičný účinok substancie na rast.

    ·· • ·

    I ·· • · • ···
27. 27. Spôsob podlá nároku 25,vyznačujúci sa tým, že uvedený cielový gén alebo príslušný cielový kódovaný proteín je kontaktovaný in vitro s testovanou substanciou a stanoví sa vplyv substancie na ciel.

    •
28. 28. Spôsob podlá akéhokoľvek z nárokov 25-27, vyznáčujúci sa tým, že objavené substancie čiastočne alebo úplne inhibujú funkčnú expresiu esenciálnych génov alebo funkčnú aktivitu kódovaných proteínov.
29. 29. Spôsob podlá akéhokoľvek z nárokov 25-28, vyznačujúci sa tým, že objavené substancie čiastočne alebo úplne inhibujú aktivitu dihydropteroát syntázy (DHPS) a/alebo

    7,8-dihydro-6-hydroxymetylpterínpyrofosfokinázy (HPPK).
30. 30. Spôsob podlá akéhokoľvek z nárokov 25-29, vyznačujúci sa tým, že druhy hub sú vybrané zo skupiny zahŕňajúcej Basidiomycéty, Ascomycéty a Hyphomycéty.
31. 31. Spôsob podlá akéhokoľvek z nárokov 25-30, vyznačujúci sa tým, že uvedené funkčne podobné gény sú esenciálne gény z Candida spp. alebo Aspergilus spp.
32. 32. Spôsob podlá nároku 31,vyznačujúci sa tým, že uvedené funkčne podobné gény sú esenciálne gény z Candida albicans alebo Aspergilus fumigatus.

    ,
33. 33. Spôsob podlá akéhokolvek z nárokov 25-32, vyznačujúci sa tým, že uvedený funkčne podobný gén má identitu sekvencie, na úrovni nukleotidov, s príslušným esenciálnym génom, aspoň 50%, lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.

    ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ·· · · ι·ι · ·
34. 34. Spôsob podía akéhokoívek z nárokov 25-33, vyzná čujúci sa tým, že uvedený funkčne podobný gén kóduje proteín majúci identitu sekvencie, na úrovni aminokyselín, s príslušným proteínom kódovaným esenciálnym génom, aspoň 40%, lepšie aspoň 50%, ešte lepšie aspoň 60% a najlepšie aspoň 70%.
35. 35. Kit na diagnostiku mykotických infekcií, vyznačujúci sa tým, že obsahuje gén vybraný zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 a CaJL039, funkčne podobný gén, funkčný fragment, príslušný kódovaný proteín alebo jeho funkčný polypeptidový fragment, alebo protilátku namierenú proti proteínu kódovanému génom vybraným zo skupiny zahŕňajúcej CaORllO, CaMR212, CaNL256, CaBR102, CaIR012, CaDR325 a CaJL039 alebo funkčne podobným gehom alebo proti jeho polypeptidovému fragmentu.