PL194483B1

PL194483B1 - Sposób wyznaczania funkcji biologicznej docelowego białka

Info

Publication number: PL194483B1
Application number: PL98340449A
Authority: PL
Inventors: Michael W. Pantoliano; Francis R. Salemme; Theodore E.Jr. Carver
Original assignee: Dimensional Pharmaceuticals 3
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-12
Publication date: 2007-06-29
Also published as: EP1030678A4; AU750501B2; WO1999024050A9; PL340449A1; DE69835531D1; ATE335498T1; HUP0100037A2; KR20030040425A; US20020168686A1; EP1030678A1; CA2309345C; IL136046A0; DK1030678T3; WO1999024050A1; KR100406310B1; EP1030678B1; JP2002514571A; US20010003648A1; AU1398099A; HUP0100037A3

Abstract

1. Sposób wyznaczania co najmniej jednej funkcji biologicznej docelowego bialka, znamienny tym, ze: (a) przeszukuje sie wiele róznych czasteczek pod wzgledem ich zdolnosci do modyfikowania stabilnosci wy- mienionego docelowego bialka, gdzie modyfikacja krzywej odfaldowania docelowego bialka przez czasteczke wskazuje, ze czasteczka wiaze sie z docelowym bialkiem, przy czym w etapie przeszukiwania: (a1) kontaktuje sie docelowe bialko z jedna lub wiecej z wymienionych wielu róznych czasteczek w kazdym z wielu róznych pojemników, (a2) traktuje sie docelowe bialko w kazdym z wielu pojemników w celu spowodowania odfaldowania bialka, (a3) mierzy sie w kazdym z pojemników fizyczne zmiany zwiazane z odfaldowaniem docelowego bialka, (a4) tworzy sie krzywa odfaldowania docelowego bialka dla kazdego z pojemników, (a5) porównuje sie kazda z krzywych odfaldowania z etapu (a4) z krzywa odfaldowania uzyskana dla wymie- nionego bialka w nieobecnosci wymienionych wielu róznych czasteczek, oraz (a6) okresla sie, czy któras z wielu róznych czasteczek modyfikuje stabilnosc bialka, przy czym o modyfikacji stabilnosci swiadczy przesuniecie krzywej odfaldowania; (b) gdy wykazano zmiane stabilnosci docelowego bialka w etapie (a6), okresla, sie co najmniej jedna funkcje biologiczna docelowego bialka nastepujaco: (b1) tworzy sie pierwsza liste czasteczek, które modyfikuja krzywa odfaldowania docelowego bialka, i (b2) porównuje sie pierwsza liste czasteczek z co najmniej jedna inna, druga lista czasteczek, przy czym cza- steczki tworzace druga liste sa znane jako modyfikujace krzywa odfaldowania grupy bialek o tej samej funkcji biologicznej, oraz (b3) ustala sie, czy jakakolwiek czasteczka z pierwszej listy jest zawarta na drugiej liscie, w ten sposób okre- slajac co najmniej jedna funkcje biologiczna docelowego bialka. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyznaczania co najmniej jednej funkcji biologicznej docelowego białka w oparciu o zdolność jednego lub więcej ligandów do modyfikowania stabilności, w szczególności stabilności termicznej białka, przy czym modyfikacja stabilności oznacza oddziaływanie pomiędzy ligandem a białkiem.

Około 3 x 10⁹ nukleotydów tworzących ludzki genom koduje w przybliżeniu 60-100000 zasadniczych białek (Alberts et al w: Molecular Biology of the Cell, wyd 3, wyd: Alberts BD i wsp (1994); Rowen L i wsp, Science 278, 605 (19&7)). Naukowcy pracujący nad Projektem Poznania Genomu Ludzkiego (HUGO) szybko identyfikują wszystkie geny w 23 parach homologicznych ludzkich chromosomów. Przyjmuje się, że produkty wspomnianych genów stanowią pole przyszłych badań nad nowymi lekami. O ile sekwencjonowanie genomu ludzkiego zostanie zakończone w ciągu kilku najbliższych lat, to wyjaśnianie funkcji wspomnianych genów pozostaje daleko w tyle. Potrzebne są zatem nowe technologie służące zrozumieniu funkcjonalnej organizacji genomu człowieka i umożliwiające przejście od „genomiki strukturalnej lub informacji liniowej DNA do „genomiki funkcjonalnej lub funkcji genów, oraz ich związków z prawidłowymi czy chorobowymi fenotypami (Hietler, Boguski, Science 278, 601 (1997)).

Trudność tak zakreślonego zadania jasno ilustruje niedawne odkrycie 4288 genów tworzących prosty genom bakterii E.coli, z których funkcja około 40% pozostaje całkowicie nieznana (Blattner i wsp Science 277, 1453, 1977). W istocie, dla 12 prostych organizmów dla których uzyskano pełną informację o ich genomach, wśród których genom S. cerevisiae jest największy (12,1 mpz, 6034 geny), zidentyfikowano tylko od 44% do 69% genów, stosując różnorodne metody, włączając w to techniki komputerowego porównania sekwencji DNA (Pennisi E, Science 277, 1433, 1977). Co więcej, bakteria powodująca syfilis posiada 1014 genów z których tylko 45% przypisano funkcje fizjologiczne (Fraser i wsp, Science 281,375-388, 1998). W rezultacie istnieje funkcjonalna luka informacyjna, stanowiąca wyzwanie wobec tradycyjnych metodologii, i jednocześnie możliwość odkrywania nowych sposobów leczenia.

Ponadto klasyfikacja białek o nieznanych funkcjach w oparciu o homologię sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej z białkami o znanych funkcjach jest niedokładna i zawodna. Białka wykazujące homologię strukturalną mogą posiadać różne funkcje. Na przykład lizozym i alfa-laktalbumina wykazują 40% homologię sekwencyjną, lecz całkiem różne funkcje. Lizozym jest hydrolazą, a alfalaktalbumina jest białkiem wiążącym wapń, zaangażowanym w syntezę laktozy, która następnie jest wydzielana z mlekiem karmiących ssaków (Qasba, Kumar, Crot Rev Biochem Mol Biol 32, 255-306, 1997).

Niektóre białka posiadają podobne funkcje, lecz nie wykazują homologii sekwencyjnej. Na przykład trypsyna (proteaza serynowa) i subtylizyna posiadają podobne funkcje, lecz wykazują całkowity brak homologii strukturalnej i funkcjonalnej (Tong i wsp, Nature Structural Biology 9, 819-826, 1998). Kinazy proteinowe zależne od cAMP z rodziny kinaz oraz ligazy D-Ala:D-Ala, należące do rodziny zawierającej motyw „uchwytu ATP”, nie wykazują homologii sekwencyjnej, jednak dzielą wspólne elementy strukturalne rozpoznające ATP i obie grupy enzymów są enzymami zależnymi od ATP (Denessiouk i wsp, Protein Science 7, 1768-1771, 1998). Niektóre białka wykazujące brak homologii sekwencyjnej, wykazują częściową homologię strukturalną, a jednak posiadają różne funkcje. Przykładami takich białek są białko oporności na bleomycynę, digoksygenaza 1,2-bifenylowa i ludzka glioksalaza (Bergdoll i wsp, Protein Science 7, 1661-1670, 1998).

Istnieje zatem potrzeba dokładnej, rzetelnej technologii umożliwiającej szybką, wysokowydajną klasyfikację białek o nieznanych funkcjach.

Wynalazek dostarcza sposobów funkcjonalnego klasyfikowania białek poprzez wyznaczenie funkcji biologicznej docelowego białka. Sposób dotyczy zdolności cząsteczek wybranych z wielu różnych cząsteczek do modyfikowania stabilności białka, a zatem do wiązania się z białkiem.

Sposób wyznaczania co najmniej jednej funkcji biologicznej docelowego białka zgodny z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że:

(a) przeszukuje się wiele różnych cząsteczek pod względem ich zdolności do modyfikowania stabilności wymienionego docelowego białka, gdzie modyfikacja krzywej odfałdowania docelowego białka przez cząsteczkę wskazuje, że cząsteczka wiąże się z docelowym białkiem, przy czym w etapie przeszukiwania:

(a1) kontaktuje się docelowe białko z jedną lub więcej z wymienionych wielu różnych cząsteczek w każdym z wielu różnych pojemników, (a2) traktuje się docelowe białko w każdym z wielu pojemników w celu spowodowania odfałdowania białka,

PL 194 483 B1 (a3) mierzy się w każdym z pojemników fizyczne zmiany związane z odfałdowaniem docelowego białka, (a4) tworzy się krzywą odfałdowania docelowego białka dla każdego z pojemników, (a5) porównuje się każdą z krzywych odfałdowania z etapu (a4) z krzywą odfałdowania uzyskaną dla wymienionego białka w nieobecności wymienionych wielu różnych cząsteczek, oraz (a6) określa się, czy któraś z wielu różnych cząsteczek modyfikuje stabilność białka, przy czym o modyfikacji stabilności świadczy przesunięcie krzywej odfałdowania;

(b) gdy wykazano zmianę stabilności docelowego białka w etapie (a6), określa się co najmniej jedną funkcję biologiczną docelowego białka następująco:

(b1) tworzy się pierwszą listę cząsteczek, które modyfikują krzywą odfałdowania docelowego białka, i (b2) porównuje się pierwszą listę cząsteczek z co najmniej jedną inną, drugą listą cząsteczek, przy czym cząsteczki tworzące drugą listę są znane jako modyfikujące krzywą odfałdowania grupy białek o tej samej funkcji biologicznej, oraz (b3) ustala się, czy jakakolwiek cząsteczka z pierwszej listy jest zawarta na drugiej liście, w ten sposób określając co najmniej jedną funkcję biologiczną docelowego białka.

Korzystnie, docelowe białko ulega odfałdowaniu na skutek zmiany termicznej i w etapie (a2) ogrzewa się je do utworzenia krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka w funkcji temperatury dla każdego z pojemników; i określa się co najmniej jedną funkcję biologiczną docelowego białka jeśli cząsteczki, które wywołują przesunięcie krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka, wywołują przesunięcie krzywych odfałdowania termicznego białek o tej samej funkcji biologicznej. Ponadto, w etapie przeszukiwania (a) korzystnie przeszukuje się wiele różnych cząsteczek z wymienionej drugiej listy.

Sposób według wynalazku korzystnie charakteryzuje się ponadto tym, że etap porównywania (a5) obejmuje uszeregowanie wymienionych cząsteczek z wielu różnych cząsteczek dla wiązania do docelowego białka, zgodnie ze zdolnością każdej z wielu różnych cząsteczek do przesuwania krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka.

W korzystnym wykonaniu etap ogrzewania (a2) wymienionych wielu pojemników polega na ich jednoczesnym ogrzewaniu.

Korzystnie, etap (a4) obejmuje ponadto określenie temperatury punktu pośredniego (Tm) z krzywej odfałdowania termicznego, przy czym etap (a5) obejmuje ponadto porównanie wartości Tm każdej ze wspomnianych krzywych odfałdowania termicznego z etapu (a4) z (1) wartością Tm każdej z wymienionych innych krzywych odfałdowania termicznego i z (2) wartością Tm krzywej odfałdowania termicznego dla białka docelowego w nieobecności jakiejkolwiek z różnych cząsteczek.

Korzystnie, etap (a3) obejmuje pomiar absorbcji światła przez zawartość każdego z pojemników.

W korzystnej realizacji wynalazku w etapie (a1) kontaktuje się docelowe białko z cząsteczką sondy fluorescencyjnej obecnej w każdym z wielu pojemników, przy czym w etapie (a3):

(i) wzbudza się światłem wymienioną cząsteczkę sondy fluorescencyjnej w każdym z wielu pojemników; i (ii) mierzy się fluorescencję z każdego z pojemników, przy czym mierzy się fluorescencję z każdego z pojemników, po jednym pojemniku, lub mierzy się fluorescencję z podgrupy wymienionych wielu pojemników jednocześnie, lub dodatkowo mierzy się fluorescencję z każdego z wymienionych wielu pojemników jednocześnie.

Korzystnie również w sposobie według wynalazku w etapie (a3):

(i) wzbudza się światłem reszty tryptofanowe docelowego białka w każdym z wielu pojemników; i (ii) mierzy się fluorescencję z każdego z pojemników.

W korzystnym wykonaniu wspomnianych wiele pojemników w etapie (a1) obejmuje wiele studzienek w mikropłytce.

W dalszym wykonaniu sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że prowadzi się go w urządzeniu obejmującym:

pierwszy przewodzący blok grzewczy w kontakcie z pierwszą wielością próbek umieszczonych w osobnych studzienkach płytki do mikromiareczkowania, przy czym każda z próbek zawiera docelowe białko i jeden lub więcej indywidualnych związków z biblioteki sond funkcjonalnych, kontroler temperatury sprzężony z pierwszym blokiem grzewczym, źródło światła umieszczone obok pierwszego przewodzącego bloku grzewczego,

PL 194 483 B1 czujnik emisji fluorescencji umieszczony obok pierwszego przewodzącego bloku grzewczego, oraz urządzenie do przetwarzania sygnału emisji spektralnej uzyskanego z czujnika emisji fluorescencji, przy czym wielość indywidualnych związków z biblioteki sond funkcjonalnych stanowi wielość witamin, wielość koenzymów, wielość związków posiadających grupy funkcyjne reszt aminokwasowych lub ich analogów, wielość chelatorów metali, wielość jonów metali, wielość węglowodanów, wielość kwasów nukleinowych, wielość lipidów, wielość enzymów, wielość steroidów, wielość hormonów aminowych, wielość alkaloidów, wielość cząsteczek leków generycznych i wielość produktów naturalnych, oraz biblioteka sond funkcjonalnych zawiera wystarczającą różnorodność związków, by wyznaczyć co najmniej jedną funkcję biologiczną docelowego białka podczas badania wielości związków z biblioteki sond funkcjonalnych przy pomocy wymienionego urządzenia pod względem zdolności do przesunięcia krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka w porównaniu z listą związków znanych jako modyfikujące stabilność grupy białek o tej samej funkcji biologicznej.

Istnieje wiele korzyści z zastosowania sposobów według wynalazku w procesie wykrywania leków, a szczególnie w odniesieniu do genomiki funkcjonalnej. Na przykład sposoby według wynalazku dostarczają szerokiej użyteczności krzyżowej względem cząsteczek docelowych, ponieważ oparte są na termodynamicznych właściwościach wspólnych wszystkim kompleksom ligand-receptor. Ponadto, sposoby według wynalazku umożliwiają bezpośrednią ocenę własności docelowych cząsteczek białka pochodzących z badań technikami genomiki, ponieważ nie wymagają znajomości specyficznych funkcji białek docelowych.

Dalsze korzyści osiągane dzięki sposobom według wynalazku polegają na tym, że sposoby według wynalazku można stosować uniwersalnie, w odniesieniu do dowolnego receptora będącego cząsteczką docelową leku. Nie jest konieczne wymyślanie nowego testu za każdym razem, gdy testowany jest nowy receptor. Zatem przeglądanie bibliotek związków rozpoczyna się natychmiast po przygotowaniu docelowego białka. Gdy badanym receptorem jest enzym, badacze mogą określić zakres porządku powinowactwa serii związków szybciej i łatwiej w porównaniu z klasycznymi metodami kinetycznymi. Ponadto, badacze mogą wykrywać ligand wiążący się z enzymem, niezależnie od tego czy do wiązania dochodzi w miejscu aktywnym, w miejscu wiązania kofaktora allosterycznego, czy w miejscu oddziaływania z substratem. Wynalazek można w równym stopniu zastosować w odniesieniu do receptorów nieenzymatycznych.

Kolejne korzyści wynikające z zastosowania sposobów według wynalazku polegają na możliwości wykorzystania wspomnianych sposobów w minitestach (objętości robocze 1-5 pl), co umożliwia zastosowanie płytek testowych w wysokiej gęstości upakowania studzienek (układ 16 x 24 = 386 studzienek lub 32 x 48 = 1536 studzienek) lub w innych handlowych zestawach. Do testu niezbędne jest od około 5 do 40 pikomoli białka (0,1 pg do 1,0 pg dla białka o masie 25 kD) na studzienkę, przy końcowym stężeniu około 1-4 pM. Zatem można stosować 1,0 mg białka do przeprowadzenia od 10³ do 10⁴ niezależnych testów w zminiaturyzowanym formacie.

Kolejna korzyść wynikająca z wynalazku polega na tym, że sposoby według wynalazku umożliwiają ultra wysokowydajne przeglądanie bibliotek związków np. funkcjonalnych bibliotek sond). Zatem sposoby według wynalazku umożliwiają przeszukiwanie od 10000 do 30000 związków w ciągu dnia na jednym stanowisku pracy. W tym tempie w ciągu dnia na jednym stanowisku roboczym można przeszukiwać co najmniej 2,5 do 6 docelowych białek, wobec funkcjonalnej biblioteki sond złożonej z 4000 związków. Zatem, co najmniej od 500 do 1200 leczniczych substancji docelowych można przeglądać w ciągu roku na jednym stanowisku roboczym względem funkcjonalnej biblioteki sond złożonej z 4000 związków. W ciągu pięciu lat na jednym stanowisku roboczym można przeszukać od 3 do 7,5% białek kodowanych przez genom człowieka.

Kolejna korzyść z zastosowania sposobów według wynalazku polega na tym, że w pojedynczym teście można badać szeroki zakres powinowactwa wiązania (co najmniej 12 rzędów wielkości, od stężeń femtomolarnych (10^-15M) do milimolarnych (10^-3M).

Kolejna korzyść z zastosowania sposobów według wynalazku polega na tym, że monitorować można oddziaływania z wieloma ligandami poprzez określanie najbliższej addytywności energii swobodnej wiązania liganda dla poszczególnych ligandów.

Ponadto sposoby według wynalazku dostarczają informacji dokładniejszej i bardziej rzetelnej w porównaniu z informacją uzyskiwaną konwencjonalnymi metodami określania homologii sekwencyjPL 194 483 B1 nej, takimi jak metody podane przez Tatusova RL i wsp, Science 278, 631-637, 1997 i Heitera P, Boguskiego M, Science 278, 601-602, 1997.

Ponadto, różne klasy enzymów można identyfikować i różnicować w oparciu o zdolność wiązania różnych zestawów analogów stanu przejściowego. Na przykład, pochodne kwasu benzenoboronowego (BBA) wiążą się w sposób odwracalny z różnymi proteazami serynowymi takimi jak subtylizyna (ze źródeł bakteryjnych) i alfa-chymotrypsyna (ze źródeł eukariotycznych) (Nakatani H i wsp J Biochem (Tokyo) 77, 905-8, 1975). Podobnie wykazano że boroargininowe analogi stanu przejściowego, posiadające grupę argininową w pozycji P1 osłoniętą syntetycznym peptydem, są bardziej specyficznymi inhibitorami proteaz serynowych, trombiny, trypsyny i plazminy (Tapparelli i wsp J Biol Chem 268, 4734-41, 1993) z obserwowaną specyficznością: K_d około 10 nM (trombina), K_d około 1000 nM (trypsyna) i K_d około 10000 nM (plazmina). Wskazuje to na ważną korzyść, którą dostarczają sposoby według wynalazku, w stosunku do klasyfikowania białek poprzez porównywanie sekwencji: przesunięcie AT_m oczekiwane w wyniku wiązania analogu stanu przejściowego (pochodnej kwasu boronowego) powinno być o wiele bardziej charakterystyczne dla proteazy serynowej (niezależnie od źródła pochodzenia białka) niż informacja uzyskana jedynie z porównania sekwencji nukleotydowej. Bakteryjne i eukariotyczne proteazy serynowe są podręcznikowymi przykładami ewolucji konwergentnej, a zatem wykazują niewielkie homologie sekwencyjne, pomimo że posiadają te same funkcje katalityczne.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w korzystnym przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1A przedstawia schemat ideowy sposobu według wynalazku, fig. 1B przedstawia kolejny schemat ideowy ilustrujący sposób według wynalazku, fig. 2 schematycznie przedstawia wygląd z góry aparatu testowego do mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego, fig. 3 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego wiązania pojedynczego liganda do trzech różnych klas miejsc wiążących ludzkiej a-trombiny, fig. 4 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego wiązania wieloligandowego do ludzkiej a-trombiny, fig. 5 przedstawia związki obecne na płytce 1 z funkcjonalnej biblioteki sondy, fig. 6 przedstawia spektrum aktywności uzyskane dla czynnika Xa z wykorzystaniem związków obecnych na płytce 1 z funkcjonalnej biblioteki sondy, fig. 7 przedstawia spektrum aktywności uzyskane dla receptora 1 czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR1) z wykorzystaniem związków obecnych na płytce 1 z funkcjonalnej biblioteki sondy, fig. 8 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego dla zrekombinowanego dimerycznego represora lac związanego z 21-nukleotydową sekwencją palindromową operatora lac, fig. 9 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego dla bydlęcej miozyny mięśniowej związanej z ATP, fig. 10 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego dla bydlęcej kinazy proteinowej zależnej od cAMP wyizolowanej z mięśnia sercowego związanej z ATP-g-S, fig. 11 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego dla reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) związanej z metotreksatem, a fig. 12 przedstawia wynik mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego dla reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) związanej z NADPH.

W dalszym opisie poczynione zostały odniesienia do terminów i metodologii dobrze znanych specjalistom z zakresu biochemii i farmakologii. Wymienione publikacje oraz inne odnośniki wskazują na odniesienie do całości cytowanych tekstów.

Wynalazek dostarcza sposobu funkcjonalnego klasyfikowania białka zdolnego do odfałdowania w wyniku zmiany warunków termicznych, w wyniku oddziaływania podgrupy cząsteczek, z wielu różnych cząsteczek, zdolnych do modyfikowania stabilności białka. Białko może zostać odfałdowane w wyniku działania czynnika denaturującego (takiego jak mocznik, chlorowodorek guanidyny, tiobursztynian guanidyny itp.), detergentu, przez traktowanie białka podwyższonym ciśnieniem, poprzez ogrzewanie białka itp.

Wynalazek dostarcza sposobu funkcjonalnego klasyfikowania białka obejmującego określenie czy przesunięta zostaje krzywa termicznego odfałdowania białka. Wyłącznie cząsteczki zdolne do przesunięcia krzywej termicznego odfałdowania białka uznawane są za ligandy wiążące się z białkiem. Korzystnie, do określenia, czy krzywa termicznego odfałdowania białka zostaje przesunięta stosuje się mikropłytkowy test przesunięcia termicznego. Mikropłytkowy test przesunięcia termicznego obejmuje określenie, czy cząsteczki testowane pod względem ich zdolności do wiązania przesuwają krzywą termicznego odfałdowania białka. Mikropłytkowy test przesunięcia termicznego opisano w zgłoszeniu PCT/US97/08154 (opublikowanym 13.11.1997, jako publikacja WO97/42500).

W korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu klasyfikowania docelowego białka zdolnego do odfałdowania w wyniku zmiany termicznej. W jednym z zastosowań białko docelowe kontaktowane jest z jedną cząsteczką z wielu różnych cząsteczek z wielu różnych pojemników. Po6

PL 194 483 B1 jemniki są następnie ogrzewane, w odstępach czasu, w określonym zakresie temperatur. Korzystnie wiele pojemników ogrzewanych jest jednocześnie. Po każdym okresie ogrzewania mierzona jest fizyczna zmiana związana z termicznym odfałdowaniem cząsteczki docelowej. W alternatywnym zastosowaniu sposobu według wynalazku pojemniki są ogrzewane w sposób ciągły. Krzywa termicznego odfałdowania wykreślana jest jako funkcja temperatury dla cząsteczki docelowej w każdym pojemniku. Korzystnie wskazywana jest temperatura punktu środkowego T_m dla każdej krzywej termicznego odfałdowania, a następnie porównywana z wartościami T_m krzywej odfałdowania termicznego uzyskiwanej dla cząsteczki docelowej w nieobecności innych cząsteczek w pojemniku. Alternatywnie, cała krzywa odfałdowania termicznego może być porównywana z inną krzywą odfałdowania termicznego przy użyciu analitycznych technik komputerowych.

Sposoby według wynalazku, które obejmują określanie, czy cząsteczki przesuwają krzywą odfałdowania termicznego białka są różne od metod, które nie obejmują określania czy cząsteczki przesuwają krzywą odfałdowania termicznego, takie jak test podatności na proteolizę, wiązanie powierzchniowe, wiązanie przeciwciała do białka, wiązanie czaperonu, różnicowe wiązanie do unieczynnionego liganda i test agregacji białka. Testy takie są dobrze znane specjalistom. Na przykład porównaj: patent USA nr 5,585,277 i patent USA nr 5,679,582. Sposoby ujawnione w patentach USA nr 5,582,277 i 5,679,582 obejmują porównywanie wartości fałdowania i/lub odfałdowania białka w obecności i nieobecności cząsteczki testowanej pod względem zdolności wiązania. Sposoby te nie obejmują określania, czy dowolna z cząsteczek wiążących się z białkiem przesuwa krzywą odfałdowania termicznego wspomnianego białka.

Termin „funkcjonalna klasyfikacja białka” odnosi się do klasyfikowania białka względem jego funkcji biologicznych, biochemicznych, fizycznych czy chemicznych, takich jak zdolność do hydrolizowania reszt fosforanowych (funkcja fosfatazy), dodawania reszt fosforanowych (funkcja kinazy) itd. Białka można klasyfikować jako posiadające jedną lub więcej z wielu różnych funkcji i sposób według wynalazku nie jest ograniczony do klasyfikowania białek jako fosfataz, kinaz czy innych enzymów.

Termin „wiele różnych cząsteczek”, „wiele różnych związków” czy „wiele różnych pojemników” oznacza co najmniej dwie cząsteczki, związki lub pojemniki.

Termin „podgrupa cząsteczek” wybrana z wielu różnych cząsteczek odnosi się do grupy cząsteczek mniejszej niż wiele różnych cząsteczek.

Termin „wieloimienny”, „wieloimienność” („multivariable”) oznacza więcej niż jedną zmienną eksperymentalną.

Termin „przeszukiwanie” („przeglądanie”, „skrining”) oznacza testowanie wielu różnych cząsteczek lub związków pod względem ich zdolności do wiązania się z cząsteczką docelową, która jest zdolna do odfałdowania w wyniku ogrzewania. Proces przeszukiwania jest powtarzalny, powtarzalny jest sposób, w który cząsteczki są testowane pod względem ich zdolności do wiązania się z białkiem w teście odfałdowania, a szczególnie w teście przesunięcia termicznego. Na przykład, jeżeli podgrupa cząsteczek w obrębie funkcjonalnej biblioteki sondy przeszukiwanej pod względem zdolności do wiązania białka nie ulega związaniu z białkiem, przeszukiwanie to jest powtarzalne z wykorzystaniem cząsteczek z innej funkcjonalnej biblioteki sondy.

Stosowany tutaj termin „przeszukiwanie z wykorzystaniem funkcjonalnej sondy oznacza ocenę np. w teście, zdolności wielu różnych cząsteczek z funkcjonalnej biblioteki sondy do wiązania z białkiem docelowym i modyfikowania stabilności termicznej białka docelowego.

Termin „funkcjonalna biblioteka sondy oznacza jedną lub wiele różnych cząsteczek testowanych pod względem ich zdolności do wiązania się z białkiem docelowym i modyfikowania jego stabilności, a w szczególności stabilności termicznej białka w odpowiedzi na odfałdowanie (np. odfałdowanie termiczne). Przeprowadzenie testu stabilności, a korzystnie mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego względem białka w obecności każdej z cząsteczek należących do funkcjonalnej biblioteki sondy, polega na inkubowaniu związków z białkiem docelowym osobno i/lub w grupach w celu określenia, które ligandy pojedynczo lub w grupach wiążą się ściśle i specyficznie z białkiem docelowym.

Funkcjonalna biblioteka sondy może być rodzajem biblioteki cząsteczek, obejmującej bibliotekę białek, bibliotekę podjednostek białkowych, bibliotekę peptydów, bibliotekę witamin i kofaktorów, bibliotekę inhibitorów enzymów, bibliotekę kwasów nukleinowych, bibliotekę węglowodanów, ogólną bibliotekę leków, bibliotekę związków naturalnych lub bibliotekę kombinatoryczną. Dla cząsteczek tworzących funkcjonalną bibliotekę sondy, które wiążą się z białkiem docelowym możliwe jest ocenianie efektów wiązania zarówno w testach in vivo jak in vitro.

PL 194 483 B1

Jeżeli funkcjonalną biblioteką sondy jest biblioteka kombinatoryczna, wtedy korzystnie jest biblioteką kombinatoryczną utworzoną z zastosowaniem systemu DirectedDiversity. System DirectedDiversity ujawniony jest w patencie USA nr 5,463,564.

Termin „spektrum aktywności odnosi się do listy związków (tj. ligandów) wiążących się z białkiem docelowym i modyfikującym stabilność (np. stabilność termiczną) białka docelowego, i odpowiednich powinowactw ligandów względem białka docelowego. Termin „profil wiązania funkcjonalnej sondy i „spektrum aktywności są synonimami. Zmniejszenie wartości T_m sugeruje, że związek lub cząsteczka blokuje wiązanie innej cząsteczki która stabilizowałaby białko. Na przykład, jeżeli chelator metalu zmniejsza wartość T_m sugeruje to, że białko wiąże metal (np. oddziaływanie między wapniem a a-laktalbuminą). Jeżeli czynnik redukcyjny zmniejsza wartość T_m sugeruje to, że białko zawiera jedno lub więcej wiązań dwusiarczkowych.

Termin „referencyjna lista spektrum funkcjonalnego odnosi się do listy klas białka docelowego (włączając w to odnośniki do użytecznych elektronicznych baz danych), związanych ligandów, i odpowiadających im stałych wiązania, które można stosować do klasyfikowania białka docelowego. Alternatywnie, referencyjna lista spektrum funkcjonalnego może być ustalona dla jednego lub więcej spektrów aktywności dla jednego lub więcej znanych białek. Zatem spektrum aktywności danego białka może służyć jako „odcisk palca, charakterystyczny dla tego białka i dla funkcjonalnej klasy białek, do której wspomniane białko należy.

Termin „referencyjna lista funkcjonalna jest listą białek posiadających wspólną jedną lub więcej cechę, taką jak zdolność do wiązania konkretnych ligandów lub wykazywanie wspólnej aktywności.

Termin „komparator spektrum aktywności odnosi się do graficznej lub wyliczeniowej metody, dzięki której można porównać spektrum aktywności, uzyskane na podstawie obserwowania efektów zastosowania funkcjonalnej biblioteki sondy względem białka docelowego, z referencyjną listą spektrum funkcjonalnego. Na przykład, komparator spektrum aktywności może być programem komputerowym łatwo dostępnym specjalistom. Na przykład, można zastosować MicroSoft Excel (MicroSoft Inc, Redmont, USA).

W wielu przypadkach funkcję genu można określić hipotetycznie na podstawie występowania homologii z sekwencjami o znanej funkcji („hipoteza funkcjonalna wynikająca z homologii sekwencyjnej). Test przesunięcia termicznego można stosować do weryfikowania hipotezy funkcjonalnej lub do identyfikowania właściwych funkcji z listy funkcji możliwych implikowanych homologią sekwencyjną. Na przykład istnieją białka hydrolizujące ATP i przekształcające uzyskaną energię chemiczną w energię mechaniczną, zwane „motorami molekularnymi. Białka te obejmują helikazy DNA i RNA, kinezyny, czaperoniny, i białkowe kompleksy wici bakteryjnych. Białka te posiadają wspólną sekwencję (homologię sekwencyjną) w domenie odpowiedzialnej za hydrolizę ATP, podczas gdy inne domeny są różne. W jednym z zastosowań sposobu według wynalazku znana sekwencja homologiczna do części białka docelowego (np. domeny ATPazy) może być użyta do zaprojektowania testu przesunięcia termicznego z wykorzystaniem specyficznej biblioteki funkcjonalnej sondy, zaprojektowanej tak by wykrywać różne możliwe funkcje białka docelowego (np. biblioteki zawierające cząsteczki do wykrywania specyficznych aktywności czaperonin, helikaz, kinezyn i innych motorów molekularnych). Alternatywnie, białko docelowe można identyfikować poprzez wykrywanie homologii sekwencyjnej jako kinazę tyrozynową i wynalazek można zastosować do przeszukiwania białka docelowego względem biblioteki peptydowej obejmującej wiele możliwych substratów miejsc fosforylacji. Przykłady te ilustrują fakt, że wynalazek jest wysoce komplementarny względem sposobów przypisywania funkcji z wykorzystaniem homologii sekwencyjnej, ponieważ wynalazek można zastosować w celu potwierdzenia, odrzucenia lub udoskonalenia hipotezy funkcjonalnej wyprowadzonej na podstawie homologii sekwencyjnej.

Wynalazek dostarcza zatem również sposobu funkcjonalnego klasyfikowania białka, który to sposób obejmuje (a) przeszukiwanie jednej lub więcej cząsteczki w wielu różnych cząsteczek o których wiadomo, że wiążą się z określoną klasą białek, powodując modyfikację stabilności wspomnianego białka, a zdolność modyfikowania stabilności białka wskazuje, że cząsteczka wiąże się z białkiem, (b) tworzenie spektrum aktywności dla białka z punktu (a), gdzie spektrum aktywności odzwierciedla zestaw cząsteczek, z wielu różnych cząsteczek, które modyfikują stabilność białka i (c) klasyfikowanie białka jako należącego do wymienionej klasy białek, jeżeli jedna lub więcej z wielu różnych cząsteczek modyfikuje stabilność białka.

Należy zauważyć, że podany powyżej sposób wskazywania funkcji białka z wykorzystaniem testu przesunięcia termicznego można stosować również do weryfikacji hipotez funkcjonalnych otrzymanych z zastosowaniem innych metod przypisywania funkcji białku (np. modelowaniu przestrzennemu białek i kwasów nukleinowych, wzorów ekspresji komórkowej mRNA lub białek kodowanych przez

PL 194 483 B1 docelowy gen, i określania efektów fenotypowych zmiany genu docelowego, tak by zmiana ta powodowała zmianę funkcjonalną na poziomie organizmalnym).

Ponadto, stosując sposób według wynalazku można oceniać wiązanie jednego lub więcej liganda do jednego lub więcej miejsca na białku i klasyfikowania białka zgodnie z charakterem podgrupy cząsteczek wiążących się z białkiem. Na przykład białko o nieznanej funkcji, które wiąże się z DNA i z ATP można zaklasyfikować jako białko wpływające na strukturę DNA. Zatem wykorzystanie informacji obejmujących wiązanie wielu ligandów pozwala na ograniczenie możliwych klas białkowych do niewielu.

Ponadto, sposoby według wynalazku można stosować do poszukiwania białka o znanej funkcji, posiadającego dodatkową funkcję, poprzednio nieznaną. Korzystnie, mikropłytkowy test przesunięcia termicznego można zastosować do przeszukiwania biblioteki funkcjonalnej sondy wobec testowanego białka.

Termin „funkcja oznacza funkcję biologiczną białka, peptydu lub polipeptydu. Na przykład kinaza jest białkiem, którego funkcją jest katalizowanie kowalencyjnego dodawania grupy fosforanowej do innego białka.

Termin „cząsteczka odnosi się do związku testowanego w teście powinowactwa wiązania względem cząsteczki docelowej. Termin ten obejmuje związki chemiczne o dowolnej strukturze, włączając w to w sposób nieograniczający kwasy nukleinowe, takie jak DNA i RNA, i peptydy. Dokładniej, termin „cząsteczka obejmuje związki lub bibliotekę kombinatoryczną. Termin „cząsteczka i „ligand są synonimami.

Termin „kontaktowanie białka docelowego oznacza ogólnie umieszczenie białka docelowego w roztworze z cząsteczką testowaną pod względem zdolności wiązania. Dokładniej, kontaktowanie odnosi się do mieszania, wstrząsania, wytrząsania itp. roztworu białka docelowego i cząsteczki testowanej pod względem zdolności wiązania. Dokładniej, kontaktowanie odnosi się do mieszania białka docelowego z cząsteczką testowaną pod względem zdolności wiązania. Mieszanie można przeprowadzić, na przykład, poprzez kilkukrotne pipetowanie. Korzystnie, kontaktowanie odnosi się do zrównania wiązania pomiędzy białkiem docelowym a cząsteczką testowaną. Kontaktowanie może następować w pojemniku lub przed tym, gdy białko docelowe i cząsteczka testowana umieszczone są w pojemniku.

Termin „pojemnik odnosi się do dowolnego naczynia lub komory w którym receptor i cząsteczka testowana pod względem zdolności do wiązania są umieszczane. Termin „pojemnik obejmuje probówki reakcyjne (np. probówki testowe, mikroprobówki, naczynka itp). Korzystnie, termin „pojemnik oznacza mikropłytkę wielostudzienkową lub płytkę do rozcieńczeń.

Termin „próbka odnosi się do zawartości pojemnika.

Terminy „emisja spektralna, „zmiana termiczna i „zmiana fizyczna obejmują uwolnienie energii w formie światła lub ciepła, absorbcję energii w formie ciepła lub światła, zmianę w przejrzystości lub zmianę polaryzacji światła. Dokładniej, terminy te odnoszą się do emisji fluorescencji, przeniesienia energii fluorescencji, absorbcji światła ultrafioletowego, zmiany polaryzacji emisji fluorescencji, zmiany w tempie wymiany fluorescencji w czasie (np. czas fluorescencji), zmiany anizotropii fluorescencji, zmiany energii rezonansu fluorescencji, zmiany przejrzystości, zmiany aktywności enzymatycznej. Korzystnie, terminy te odnoszą się do fluorescencji, bardziej korzystnie do emisji fluorescencji. Emisja fluorescencji może być inherentną właściwością białka lub może być wynikiem dodania fluorescencyjnej cząsteczki reporterowej. Zastosowanie technik fluorescencyjnych do monitorowania odfałdowania białka jest dobrze znane specjalistom. Patrz np. Eftink RM, Biophysical J 66, 482-501, 1994.

Termin „odfałdowanie („unfolding) odnosi się do utraty struktury, takiej jak krystaliczne uporządkowanie łańcuchów bocznych aminokwasów, drugo-, trzecio- lub czwartorzędowej struktury białek.

Terminy „fałdowanie, „ponowne fałdowanie i „renaturacja dotyczą nabywania poprawnego uporządkowania łańcuchów bocznych aminokwasów, drugo-, trzecio- lub czwartorzędowej struktury białek, co nadaje pełne chemiczne i biologiczne funkcje, biomolekule.

Termin „białko zdenaturowane odnosi się do białka które zostało potraktowane w celu usunięcia naturalnego uporządkowania łańcuchów bocznych aminokwasów, drugo-, trzecio- lub czwartorzędowej struktury białka. Termin „białko natywne oznacza białko posiadające uporządkowane łańcuchy boczne aminokwasów, drugo-, trzecio- lub czwartorzędową strukturę zapewniającą, że białko posiada pełne chemiczne i biologiczne funkcje. Białko natywne nie było ogrzewane lub nie było traktowane czynnikiem powodującym odfałdowanie lub substancją chemiczną taką jak mocznik.

Stosowane terminy „białko i „polipeptyd są synonimami.

Termin „krzywa odfałdowania jest krzywą odzwierciedlającą zmianę fizycznych własności związanych z odfałdowaniem białka, jako funkcja temperatury, stężenia denaturanta, ciśnienia itp. „Krzywa

PL 194 483 B1 denaturacji jest krzywą odzwierciedlającą zmianę fizycznych własności związanych ze zjawiskiem denaturacji białka lub kwasu nukleinowegoo, jako funkcja temperatury, stężenia denaturanta, ciśnienia itp.

Termin „krzywa odfałdowania termicznego jest krzywą odzwierciedlającą zmianę fizycznych własności związanych z odfałdowaniem białka, jako funkcji temperatury. Termin „krzywa denaturacji termicznej jest krzywą odzwierciedlającą zmianę fizycznych własności związanych z denaturacją białka, jako funkcji temperatury. Patrz na przykład Davidson i wsp, Nature Structural Biology 2, 859, 1995; i Clegg RM i wsp PNAS USA 90, 2994, 1993.

Termin „przesunięcie krzywej termicznego odfałdowania odnosi się do przesunięcia krzywej odfałdowania termicznego białka związanego z ligandem w porównaniu z krzywą odfałdowania termicznego tegoż białka w nieobecności liganda.

Termin „modyfikacja stabilności oznacza zmianę w wartości ciśnienia, ilości ciepła, stężeniu detergenta, stężeniu denaturanta niezbędnego do spowodowania danej wartości zmiany fizycznej własności białka docelowego związanego lub niezwiązanego z ligandem, w porównaniu z wartością ciśnienia, ilością ciepła, stężeniem detergenta, stężeniem denaturanta niezbędnego do wytworzenia tej samej zmiany w fizycznej właściwości białka docelowego w nieobecności żadnego z ligandów. Modyfikacja stabilności może powodować zmniejszenie bądź zwiększenie stopnia stabilności. Modyfikacja stabilności białka przez ligand wskazuje że ligand wiąże się z białkiem. Modyfikacja stabilności białka przez więcej niż jeden ligand wskazuje że ligandy wiążą się z wspomnianym białkiem.

Termin „modyfikacja stabilności termicznej odnosi się do zmiany w ilości energii termicznej niezbędnej do wytworzenia danego stopnia zmiany fizycznej białka docelowego związanego z jednym lub więcej ligandami, w stosunku do ilości energii termicznej niezbędnej do wytworzenia tego samego stopnia zmiany fizycznej białka docelowego w nieobecności żadnych ligandów. Modyfikacja stabilności termicznej może powodować zmniejszenie bądź zwiększenie stopnia stabilności termicznej. Modyfikacja stabilności termicznej białka przez ligand wskazuje, że ligand wiąże się z białkiem. Modyfikacja stabilności termicznej białka przez więcej niż jeden ligand wskazuje, że ligandy wiążą się z wspomnianym białkiem.

Termin „temperatura punktu środkowego, T_m odnosi się do temperatury punktu środkowego krzywej odfałdowania termicznego. Wartość T_m można łatwo określić stosując sposoby dobrze znane specjalistom. Patrz na przykład: Weber PC i wsp J Am Chem Soc 116, 2717, 1994; i Clegg RM i wsp PNAS USA 90, 2994, 1993.

Jak przedyskutowano to powyżej, korzystne jest określenie wpływu jednej lub więcej cząsteczek na stabilność termiczną białka docelowego zgodnie ze zmianą wartości Tm krzywej odfałdowania termicznego wspomnianego białka. Alternatywnie, efekt oddziaływania jednej lub więcej cząsteczek na stabilność termiczną białka docelowego można określić zgodnie ze zmianą całej krzywej odfałdowania termicznego białka docelowego.

Termin „cząsteczka fluorescencyjnej sondy odnosi się do zewnętrznego fluoroforu, będącego cząsteczką fluorescencyjną lub związkiem zdolnym do wiązania się z niesfałdowanym lub zdenaturowanym receptorem i po wzbudzeniu światłem o określonej długości fali, emisji energii, fluorescencyjnej. Termin „cząsteczka fluorescencyjnej sondy obejmuje wszystkie fluorofory. Dokładniej, dla białek termin ten obejmuje fluorofory takie jak tioinozyna, N-etylenoadenozyna, formycyna, dansyl, pochodne dansylu, pochodne fluoresceiny, 6-propionylo-1,2-(dimetyloamino)-naftalen (PRODAN), 2-anilinonaftalen i pochodne siarczanu N-arylamino-naftalenu, takie jak 1-anilinonaftaleno-8-sulfonian (1,8-ANS), 2-anilinonaftaleno-6-sulfonian (2,6-ANS), 2-amino-naftaleno-6-sulfonian, N,N-dimetylo-1,2-aminonaftaleno-6-sulfonian, N-fenylo-1,2-aminonaftalen, N-cykloheksylo-1,2-aminonaftaleno-6-sulfonian, N-fenylo-1-aminonaftaleno-6-sulfonian, N-fenylo-N-metylo-2-aminonaftaleno-6-sulfonian, N-(o-toluilo)-2-amino-naftaleno-6-sulfonian, N-(m-toluilo)-2-aminonaftaleno-6-sulfonian, N-(p-toluilo)-2-aminonaftaleno-6-sulfonian, 2-(p-toluidynylo)-2-aminonaftaleno-6-sulfonian, 2-(p-toluidynylo)-naftaleno-6-sulfonian (2,6-TNS), 4-(dicyjanowinylo)julolidyna (DCVJ), 6-dodekanoylo-2-dimetyloaminonaftalen (LAURDAN), chlorek 6-heksadekanoylo-2-(((2-(trimetyloamono)etylo)metylo)-amino)naftalenu (PATMAN), N-fenylo-1-naftylamina, 1,1-dicyjano-2[6-(dimetyloamino)naftalen-2-ylo]propen (DDNP), 4,4'-dianililo-1,1-binaftylo-5,5-disulfonian (bis-ANS) i pochodne 5-(4''-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolu (nazwa handlowa DAPOXYL, Molecular Probes Inc, Eugene, USA), włączając w to barwniki 5-(4''-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolowe według Diwu Z i wsp, Photochemistry and Photobiology 66, 424-431,997 i BioProbes 25, 8-9, Molecular Probes, Eugene, USA, 1997.

Przykłady pochodnych 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolu (i odpowiednie numery katalogowe Molecular Probes), obejmują 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolo-butylosul10

PL 194 483 B1 fonamid (D-12801), 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazol-(2-aminoetylo)sulfonamid (D-10460), 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolobutylosulfonamid (D-12801), 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolo-3-sulfonamidofenyloboronian (D-10402), 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolosulfonian (sól sodowa) (D-12800), hydrazynę 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolosulfonianu (D-10430), 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazol-(2-bromoacetamidoetylo)sulfonamid (D-10300), 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazol-2-(3-(2-pirydyloditio)-propionamidoetylo)sulfonamid (D-10301), chlorek 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolosulfonylu (D-1-160), ester bursztynyloamidylowy 5-(4''-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)-oksazolo-3-sulfonamidopropionianu (D-1-162), ester bursztynyloamidylowy kwasu 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolokarboksylowego (D-10161).

Korzystnie, termin „fluorescencyjna cząsteczka sondy odnosi się do 1,8-ANS lub 2,6-TNS i barwników pochodnych 5-(4-dimetylolaminofenylo)-2-(4'-fenylo) oksazolowych (nazwa handlowa DAPOXYL), takich jak opisane przez Diwu Z i wsp, Photochemistry and Photobiology 66, 424-431, 1997. Korzystniej, termin ten odnosi się do barwników pochodnych 5-(4-dimetyloaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolowych (nazwa handlowa DAPOXYL), takich jak opisane przez Diwu Z i wsp, Photochemistry and Photobiology 66, 424-431, 1997. Najkorzystniej, termin ten odnosi się do soli sodowej 5-(4-dimetyloaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolosulfonianu (D-12800).

Termin „nośnik obejmuje platformę lub inny obiekt dowolnego kształtu zdolny do podtrzymania co najmniej dwu pojemników. Nośnik może być wykonany z dowolnego materiału, włączając w to w sposób nieograniczający szkło, plastik, lub metal. Korzystnie, nośnik jest mikropłytką wielostudzienkową. Termin mikropłytka i płytka do rozcieńczeń są synonimami. Nośnik można oddzielić od elementu grzejnego. Według wynalazku można stosować wiele nośników. Według wynalazku każdy nośnik utrzymuje wiele pojemników.

Termin „pomiary spektralne, „pomiary spektrofotometryczne są synonimiczne i odnoszą się do pomiarów zmian absorpcji światła. Pomiary zmętnienia, pomiary absorpcji światła widzialnego, i pomiary absorpcji światła ultrafioletowego są przykładami pomiarów spektralnych. Pomiary wewnętrznej fluorescencji białka docelowego i fluorescencji zewnętrznego fluoroforu tworzącego kompleks lub związanego z białkiem docelowym, są przykładami pomiarów spektralnych i pomiarów spektrofotometrycznych.

Termin „pomiary polarymetryczne odnosi się do pomiarów zmian we właściwościach polaryzacyjnych światła i emisji fluorescencyjnej. Dichroizm kołowy i rotacja optyczna są przykładami polaryzacyjnych właściwości światła, które można mierzyć polarymetrycznie. Pomiary dichroizmu kołowego i rotacji optycznej dokonywane są spektropolarymetrem. Pomiary „niepolarymetryczne to te, które nie są dokonywane za pomocą spektropolarymetru.

Znajomość komórkowych i/lub biologicznych własności białek stanowić może zaletę w odkrywaniu nowych leków, jako że może być użyteczna w rozwijaniu pogłębionego rozumienia hipotezy terapeutycznej, dotyczącej funkcji leku, projektowania specyficznej strategii dla projektowania leku i ujawnianiu możliwych efektów ubocznych leku.

Istnieją dziesiątki tysięcy różnych enzymów i receptorów stanowiących potencjalne elementy docelowe dla leków, a coraz więcej jest wykrywanych dzięki badaniom nad sekwencją genomu. Białka te i receptory komórkowe wykazują specyficzne funkcje w systemie biologicznym, które to funkcje są praktycznie określane przez molekularne ligandy oddziałujące z nimi w specyficzny sposób. Typowe oddziaływania o znaczeniu biologicznym obejmują oddziaływania enzymów z ligandami, takimi jak substraty lub analogi substratów, kofaktory, domeny adaptorowe, kwasy nukleinowe itp, oraz oddziaływania receptora ze specyficznymi ligandami, innymi receptorami, kompleksami powierzchniowymi komórek, kwasami nukleinowymi, polisacharydami itp.

Choć możliwe będzie w większości przypadków wyizolowanie lub sklonowanie i ekspresja białek, które są potencjalnymi elementami docelowymi leków, to w wielu przypadkach nie wiadomo nic na temat funkcji wspomnianych białek, co może utrudniać odkrywanie nowych leków. Jednakże, znacząca część znanych białek należy do klas posiadających wspólne cechy, włączając w to wiązanie specyficznych ligandów, kofaktorów enzymatycznych, substratów i ich analogów. Możliwe jest zatem klasyfikowanie białek o nieznanych funkcjach pod względem ich zdolności do specyficznego wiązania różnych rodzajów ligandów, osobno lub w kombinacjach.

Gdy białko wiąże się z biologicznym ligandem w sposób funkcjonalnie znaczący, wywierany jest efekt na fizyczny stan białka, co znajduje wyraz w stabilności białka w porównaniu ze stanem białka niezwiązanego z ligandem. Zatem, można klasyfikować funkcjonalnie białko o nieznanej funkcji poprzez inkubowanie z panelem sondy złożonym z ligandów biologicznych i kofaktorów (funkcjonalna

PL 194 483 B1 biblioteka sondy) i mierzenie, które ligandy wywierają wpływ na stabilność białka. Alternatywnie, można określać nieznane funkcje białka posiadającego również inne, znane funkcje, poprzez inkubowanie z panelem sondy złożonym z ligandów biologicznych i kofaktorów (funkcjonalna biblioteka sondy) i mierzenie, które ligandy wywierają wpływ na stabilność białka.

Jak to zostało ustalone z badań termodynamicznych nad oddziaływaniami pomiędzy białkiem a ligandem, gdy dwie cząsteczki łączą się tworząc korzystny termodynamicznie i specyficzny kompleks, oddziaływania te związane są ze zmniejszeniem energii swobodnej kompleksu i ogólną stabilizacją kompleksu białko-ligand w porównaniu do białka nie związanego z ligandem. Przekładając to na pojęcia praktyczne: gdy enzym lub receptor oddziałuje ze swoim specyficznym kofaktorem lub analogiem kofaktora, enzym lub receptor ulega stabilizacji dzięki wspomnianemu oddziaływaniu. Jednakże, możliwe jest w specyficznych sytuacjach, że ligand destabilizuje białko docelowe. Na przykład, pewne białka zawierają więcej niż jedną domenę lub miejsca allosteryczne, do których może wiązać się jeden lub więcej ligandów.

Przegląd sposobów według wynalazku

Sposoby według wynalazku schematycznie przedstawiono na fig. 1A i 1B.

A. Identyfikacja przypuszczalnego genu docelowego

Białka docelowe są białkami, do których mogą wiązać się leki wywołując w ten sposób efekt terapeutyczny. Zasadnicza charakterystyka białek docelowych może być użyteczna w procesie projektowania leków. Wiele genów będących potencjalnymi elementami docelowymi leczniczych interwencji zidentyfikowano poprzez badanie korelacji pomiędzy defektem genowym a stanem chorobowym (np. w chorobach dziedzicznych związanych z defektem specyficznego enzymu lub receptora) lub poprzez określanie wzoru ekspresji białka w tkankach osób zdrowych i chorych.

W wielu przypadkach możliwe jest określenie niektórych „funkcji produktu genu poprzez poznanie homologii sekwencyjnej z białkiem homologicznym o znanych cechach funkcjonalnych lub strukturalnych. Jednakże w zasadniczej liczbie przypadków homologia sekwencyjna nie wystarcza do ustalenia związków funkcjonalnych i konieczne jest stosowanie alternatywnych sposobów ustalania funkcji, w sposób ułatwiający proces odkrywania nowych leków.

B. Klonowanie i ekspresja białka

W celu stosowania sposobów według wynalazku konieczne jest uzyskanie białka docelowego w wystarczającej ilości do przeprowadzenia testu biologicznego. Białka będące potencjalnymi elementami docelowymi nowych leków i/lub wymagające charakterystyki funkcjonalnej można izolować bezpośrednio z naturalnych źródeł z zastosowaniem wielu różnych metod izolacji biochemicznej.

Dostępność pełnej sekwencji genu z baz danych sekwencji genomowych umożliwia klonowanie i ekspresje białka docelowego zidentyfikowanego poprzez metodami genomiki. Na przykład znana sekwencja docelowa DNA może zostać użyta do zaprojektowania sondy oligonukleotydowej w celu wybrania klonu cDNA pełnej długości zawierającego pełną sekwencje kodującą cDNA interesującego nas genu z reprezentatywnej biblioteki klonów cDNA. W innym przykładzie znana docelowa sekwencja DNA może zostać wykorzystana do zaprojektowania starterów PCR do selektywnej amplifikacji i sklonowania interesującego nas genu z całkowitego genomowego DNA. Te i inne sposoby do wysokowydajnego klonowania i ekspresji są dobrze znane specjalistom. Zatem dane o pełnej sekwencji genu automatycznie dostarczają bezpośrednich sposobów do wysokowydajnego, równoległego wytwarzania białka docelowego, co jest koniecznym pierwszym elementem w każdej strategii wysokowydajnego, funkcjonalnego przeszukiwania białek.

C. Określanie stabilności termicznej

W celu przeprowadzenia mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego białka docelowego konieczne jest określenie warunków testu optymalnych dla jego przeprowadzenia. Białka są liniowymi polimerami złożonymi z aminokwasów, które fałdują spontanicznie, dając stabilne, wysoce zorganizowane, trójwymiarowe struktury. Biologiczna aktywność i funkcje białka docelowego, włączając w to zasadniczo wszystkie cechy specyficznego wiązania i własności katalityczne białka zależy od jego struktury trzeciorzędowej.

Zasadniczo wszystkie, sfałdowane, aktywne domeny białka zachowują się pod względem cech termicznych jak kryształy organiczne, które ulegają topnieniu w sposób kooperacyjny, opisanym równaniem przejścia fazowego pseudo pierwszego rzędu, tj. ulegają topnieniu w częściowo nieuporządkowany, organiczny, podobny do płynnego stanu, w dobrze określonej temperaturze topnienia (T_m), oddającą wolną energię stabilizacji trójwymiarowej struktury białka w warunkach eksperymentalnych. Technologia mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego wykorzystuje wrażliwe na otoczenie

PL 194 483 B1 barwniki fluorescencyjne w celu czułego wykrywania procesu termicznego odfałdowania i bezpośredniego śledzenia wpływu na stabilność białka zakłóceń w cechach roztworu lub wpływu wiązania ligandów do białka.

Stabilność trójwymiarowej, sfałdowanej struktury białka może zostać zakłócona na szereg sposobów. Jednym jest zmiana własności rozpuszczalnika, w którym białko uległo wstępnie sfałdowaniu z nieuorganizowanego polimeru w trójwymiarową, uporządkowaną strukturę. Poprzez zmianę większości własności roztworu naokoło białka można zmienić stabilność sfałdowanej struktury. Możliwość ta dostarcza użytecznej strategii poszukiwania optymalnych warunków pomiaru wpływu wiązania liganda i stanowi podstawę teoretyczną przeszukiwania w oparciu o zmianę stabilności.

D. Mikropłytkowy test przesunięcia termicznego do optymalizacji skriningu

Optymalizacja skriningu polega na przygotowaniu zestawu cech rozpuszczalnika i barwników fluorescencyjnych używanych do określania optymalnych warunków prowadzenia testu przesunięcia termicznego dla białka docelowego. Białko poddawane jest wpływowi różnych warunków rozpuszczalnika i/lub barwników fluorescencyjnych w celu oceny zachowania białka i/lub odczytu testu.

Przykłady zmiennych warunków mogą obejmować dodanie rozpuszczalników organicznych, zmiany pH, stężenia soli itp. które mogą potencjalnie zmieniać względną stabilność białka w stanie sfałdowanym i nie sfałdowanym. Przykłady zmian cech barwników mogą obejmować barwniki o różnym ładunku, polarności, fali wzbudzenia, fali emisji, intensywności sygnału bazowego i innych własności, które mogą oferować korzyści przy precyzyjnym pomiarze, miniaturyzacji lub optymalizacji wartości rzeczywistej sygnału w warunkach testowych. Optymalizacja warunków umożliwiających stabilny skrining jest procesem empirycznym, dobrze znanym specjalistom.

E. Funkcjonalna biblioteka sondy

Zasadnicza część białek które mogą stanowić potencjalne elementy docelowe leków zalicza się do klas dzielących wspólne cechy. Na przykład wiele enzymów wykorzystuje ATP jako kofaktor energetyczny, inne wykorzystują nukleotydy pirydynowe jako kofaktory, niektóre wykorzystują oba itd.

Przeglądając literaturę naukową lub stosując techniki eksperymentalne można określić zestaw substratów enzymatycznych, analogów substratów, kofaktorów, adaptorowych domen białek, analogów nukleotydów, polisacharydów, kwasów tłuszczowych, kwasów nukleinowych, peptydów efektorowych lub innych cząsteczek które mogą wiązać się specyficznie z określoną klasą cząsteczek lub o których wiadomo że są funkcjonalnie związane z klasą cząsteczek o znanej funkcji.

Termin „funkcjonalna biblioteka sondy oznacza jedną lub wiele różnych cząsteczek testowanych pod względem ich zdolności do wiązania się z białkiem docelowym i modyfikowania jego stabilności, a w szczególności stabilności termicznej białka w odpowiedzi na odfałdowanie (np. odfałdowanie termiczne). Przeprowadzenie testu stabilności, a korzystnie mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego względem białka w obecności każdej z cząsteczek należących do funkcjonalnej biblioteki sondy, polega na inkubowaniu związków z białkiem docelowym osobno i/lub w grupach w celu określenia które ligandy pojedynczo lub w grupach wiążą się ściśle i specyficznie z białkiem docelowym.

Przykłady cząsteczek które mogą tworzyć funkcjonalną bibliotekę sondy obejmują w sposób nieograniczający następujące cząsteczki.

1. Witaminy i koenzymy

NADH/NAD, NADPH/NADP, ATP/ADP, ATP-g-S, acetylo-CoA, biotyna, S-adenozylo-metionina, pirofosforan tiaminy (TPP), sulfonowane oligosacharydy, oligosacharydy podobne do heparyny, GTP, GTP-y-S, gamma-S, pirydoksalo-5-fosforan, mononukleotyd flawinowy (FMN), dinukleotyd flawinowoadninowy (FAD), kwas foliowy, kwas tetrahydrofoliowy, metotreksat, witamina K, witamina E, witamina D₃, witamina D₃-25-)H, witamina D₃-1-a-25dihydroksy, witamina B₁₂, witamina C, witamina B₆, koenzym A, butyrylo koenzym A, kwas trans-retinowy, hem.

2. Funkcjonalne grupy aminokwasów i ich analogi składniki budulcowe:

grupy guanidynowe grupy imidazolowe grupy fenylowe grupy indolowe łańcuchy alifatyczne pojedyncze aminokwasy i blokowane pochodne struktury wyższego rzędu: hormony peptydowe

PL 194 483 B1 wazopresyna insulina

THR kortykotropina glukagon domeny SH₂, domeny SH₃, domeny plekstrynowe peptydy bioaktywne lektyny

3. chelatory metali chelatory wapnia (Calbiochem, SanDiego, USA) chelatory żelaza

4. Jony metali metale przejściowe wapń, magnez

5. węglowodany elementy budulcowe: glukoza galaktoza ksyloza biomolekuły wyższego rzędu celuloza skrobia fruktoza mannoza sacharoza laktoza węglowodany bioaktywne (Sigma Chemicals Co, St Louis, USA)

6. kwasy nukleinowe elementy budulcowe: uracyl tymidyna cytozyna adenina guanina struktury wyższego rzędu: oligonukleotydy kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) kwas rybonukleinowy (RNA)

Sposoby według wynalazku można zastosować również do przeszukiwania białek wobec bibliotek syntetycznych i występujących naturalnie kwasów nukleinowych (na przykład oligonukleotydów) w celu wykrywania różnych klas białek wiążących kwasy nukleinowe. Na przykład istnieje wiele białek wiążących DNA które można zidentyfikować przez ich zdolność do wiązania się z określonymi sekwencjami DNA. Duże biblioteki obejmujące wiele różnych sekwencji kwasów nukleinowych (na przykład obejmujące 4096 możliwych syntetycznych heksamerów) są dostępne handlowo lub można je zsyntezować. W wysokich stężeniach można wykryć wszystkie lub część miejsc wiążących specyficzne sekwencje kwasów nukleinowych. W przypadku gdy białko wiąże się z kilkoma różnymi sekwencjami miejsca wiązania można zrekonstruować syntezując różne kombinacje sekwencji nukleotydowych, i prowadząc następnie mikropłytkowy test przesunięcia termicznego lub inny test mierzący powinowactwo wiązania.

Istnieje wiele białek wiążących się z DNA które można zidentyfikować ze względu na ich zdolność do wiązania się z niektórymi klasami sekwencji DNA z wysoką specyficznością. Na przykład wiadomo że niektóre czynniki transkrypcyjne wiążą się preferencyjnie z wieloma sekwencjami bogatymi w pary AT w porównaniu z sekwencjami bogatymi w pary GC. Telomerazy rozpoznają sekwencje bogate w pary GC. Helikazy wiążą się z krótkimi fragmentami jednoniciowego DNA w wysoką specy14

PL 194 483 B1 ficznością. Małe, bardziej ogólne biblioteki mogą obejmować następujące składniki służące wykrywaniu tych i innych białek wiążących się z DNA:

trakty bogate w pary AT:

d(T)32/d(A)32 d(ATAT)8/d(TATA)8 d(AAAT)8/d(TTTA)8 d(AAATT)6/d(TTTAA)6 d(AAAATTTT)4/d(TTTTAAAA)4 trakty bogate w pary GC:

d(C)32/d(G)32 d(GCGC)8/d(CGCG)8 d(GGGCCC)6/d(CCCGGG)6 d(GGGGCCCC)4/d(CCCCGGGG)4 inne:

d(CA)32/d(GT)32 d(CT)32/d(GA)32 d(AG)32/d(TC)32 składniki jednoniciowe obejmujące powyższe sekwencje dwuniciowe d(T)₄₀/d(A)₂o (przykład fragmentu posiadającego fragment dwu- i jednoniciowy jednocześnie) cięty ludzki chromosomalny DNA fragmenty powstałe w wyniku amplifikacji całego genomu (WGA) zastosowane do różnych ludzkich chromosomów cięty DNA ze spermy śledzia cięty DNA z bakterii superzwinięty plazmidowy DNA produkty amplifikacji PCR ze specyficznych regionów chromosomów (np. telomerów i centromerów) inne znane miejsca rozpoznawane przez czynniki uczestniczące w transkrypcji RNA, procesowaniu RNA i transpozycji

7. lipidy elementy składowe: cholina kwas fosforowy glicerol kwas palmitynowy kwas oleinowy cholesterol struktury wyższego rzędu: fosfatydylocholina

8. inhibitory enzymów inhibitory proteaz (Sigma Chemical Co StLouis, USA)

PMSF leupeptyna pepstatyna A bestatyna inhibitory proteazy cystynowej (cystatyna) inhibitory białkowych kinaz tyrozynowych (Calbiochem San Diego, USA) inhibitory fosfataz proteinowych (Calbiochem San Diego, USA) inhibitory kinaz proteinowych (Calbiochem San Diego, USA) aktywatory kinaz proteinowych (Calbiochem San Diego, USA) inhibitory fosfodiestraz (Calbiochem San Diego, USA) inhibitory fosfolipaz analogi stanu przejściowego

Podobnie, metaloproteazy cynkowe, takie jak enzym konwertujący angiotensynę i karboksypeptydazy można identyfikować (a) przez destabilizację przez EDTA lub ortofenantrolinę (chelacja jonu cynkowego) i (b) przez stabilizację w obecności fosforoamidany i hydroksyamiany naśladujące stan przejściowy dla hydrolizy wiązania peptydowego przez jon cynku.

PL 194 483 B1

Funkcjonalna biblioteka sondy może również obejmować związki steroidowe, hormony i związki alkaloidowe.

Funkcjonalna biblioteka sondy może być również biblioteką ogólną leków. Alternatywnie funkcjonalna biblioteka sondy może być biblioteką produktów naturalnych. Patrz np. Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Foods, Drugs and Cosmetics, 2ed ed, eds. Leung, Foster., Wiley Intercience 1996.

F. Stosowanie funkcjonalnej sondy

Poza procesem optymalizacji warunków modyfikujących stabilność białka, można również zastosować inny sposób wpływania na stabilność sfałdowanego białka: poprzez specyficzne wiązanie cząsteczek albo do sfałdowanej albo do nie sfałdowanej postaci białka. Ponieważ zasadniczo wszystkie biologicznie aktywne białka są sfałdowane w uorganizowane, trójwymiarowe struktury, dużo uwagi przywiązuje się do cząsteczek ligandów wiążących się z białkiem i stabilizujących jego stan sfałdowany.

Jak rozważano to powyżej stosowanie funkcjonalnej sondy jest testem zdolności wielu różnych cząsteczek tworzących funkcjonalną bibliotekę sondy do wiązania się z białkiem docelowym i modyfikowania stabilności białka docelowego w odpowiedzi na termiczne odfałdowanie. Zastosowanie wspomnianej technologii umożliwia bezpośredni pomiar powinowactwa wiązania mniejszych lub większych ligandów do białka docelowego poprzez pomiar wpływu na średnią temperaturę odfałdowania (Tm) lub profil odfałdowania termicznego w czasie białka docelowego. Istnieje ilościowa zależność, opisana dla cząsteczek wiążących się z białkami w stanie sfałdowanym, cząsteczek obejmujących większość ligandów o właściwościach biologicznych, pomiędzy powinowactwem wiązania liganda a stopniem w jakim wartość Tm dla białka związanego z ligandem ulega przesunięciu w stosunku do wartości Tm dla białka nie związanego z ligandem.

Większość białek wykazuje funkcje które są odzwierciedlone w ich zdolności do wiązania albo małych, albo dużych ligandów z wysoką specyficznością i wysokim powinowactwem. Wiele białek należy do klas funkcjonalnych (np. kinaz, fosfataz, oksydoreduktaz zależnych od nukleotydu pirydynowego itd) które wiążą się ze specyficznymi kofaktorami lub katalizują specyficzne reakcje, wykorzystując ograniczony zestaw reakcji katalitycznych. Konsekwentnie cząsteczki w obrębie konkretnej klasy funkcjonalnej takiej jak kinazy wykorzystujące ATP jako kofaktor, zasadniczo wiążą nie ulegający hydrolizie analog kofaktora ATP, taki jak AMPPNP, co jest własnością wykrywalną z zastosowaniem sposobów według wynalazku.

Ponadto wiele białek wiąże kombinacje ligandów lub uczestniczy w wielokrotnych oddziaływaniach z biologicznymi domenami adaptorowymi. O tyle o ile owe oddziaływania są niezależne tworzą one dodatkowe zakłócenia stabilności nie zawierającej liganda formy białka.

Gdy białko zostanie wstępnie zaklasyfikowane do określonej klasy można przeszukiwać ponownie wspomniane białko z wykorzystaniem biblioteki związków wiążących się z tą klasą białek.

G. Spektrum aktywności

Po przeprowadzeniu testu stabilności termicznej (korzystnie mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego) względem białka w obecności każdego z przedstawicieli funkcjonalnej biblioteki sondy, określić można które ligandy wiążą się ściśle i specyficznie z białkiem docelowym i modyfikują stabilność termiczną białka docelowego. Lista związków (tj. ligandów) wiążących się z białkiem docelowym i modyfikująca termiczną stabilność białka docelowego i odpowiednie powinowactwa ligandów do białka docelowego obejmują spektrum aktywności białka docelowego.

H. Referencyjna lista spektrum funkcjonalnego

Jak przedyskutowano to powyżej „referencyjna lista spektrum funkcjonalnego jest zestawieniem klas białka docelowego (włączając w to odpowiednie elektroniczne bazy danych), związane ligandy, odpowiadające im stałe wiązania, które można wykorzystać do funkcjonalnej klasyfikacji białka. Alternatywnie referencyjna lista spektrum funkcjonalnego może być zestawem jednego lub więcej spektrów aktywności dla jednego lub więcej znanych białek. Jak podano to wyżej „funkcjonalna referencyjna lista jest zestawieniem białek wykazujących jedną lub więcej wspólnych cech, takich jak wiązanie z określonym ligandem lub wykazywanie wspólnej aktywności. Przykład referencyjnej listy funkcjonalnej podany jest w Tabeli 1. Cechy wspólne białek zestawionych w Tabeli 1 obejmują zdolność wiązania NAD i wykazywanie aktywności dehydrogenazy. Zestawienie białek w Tabeli 1 pokazuje w jaki sposób funkcjonalnie określona klasa białek może zostać rozpoznawana dzięki wspólnie wykazywanej zdolności do wiązania różnych rodzajów ligandów. Na przykład białka wiążące dinukleotyd adeninonikotynamidowy (NAD), NADPH lub NADH oraz jabłczan, co wykazano jako zdolność tych związków do modyfikowania stabilności termicznej wspomnianego białka, można zaklasyfikować

PL 194 483 B1 jako dehydrogenazę jabłczanową. Inny przykład białka którego stabilność termiczna modyfikowana jest przez etanol i NAD, to białko zaklasyfikowane na tej podstawie jako dehydrogenaza alkoholowa.

T a b e l a 1

Referencyjna lista funkcjonalna

klasa 3 dehydrogenaza aldehydowa

ludzka δ dehydrogenaza alkoholowa

dehydrogenaza a-hydroksysteroidowa

dehydrogenaza jabłczanowa

dehydrogenaza alkoholowa z wątroby konia

dehydrogenaza alkoholowa

dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa

ludzka dehydrogenaza β-alkoholowa

dehydrogenaza dihydropterydynowa

D-2dehydrogenaza - hydroksyizokapronianowa

reduktaza enoylo ACP z Brassica napus

dehydrogenaza 7-a-hydroksysteroidowa

dehydrogenaza holo-D-gliceroaldehydo-3-fosforanowa

reduktaza glutationowa

dehydrogenaza 3-izopropylomaleinianowa

ludzka dehydrogenaza β-3 alkoholowa

dehydrogenaza izocytrynianowa

dehydrogenaza alkoholowa z wątroby konia

dehydrogenaza M4 mleczanowa

dehydrogenaza dihydrolipoamidowa

epimeraza 4-UDP-galaktozowa

dehydrogenaza D-3-fosfoglicerynianowa

ludzka wątrobowa dehydrogenaza χχ alkoholowa

dehydrogenaza 20 β-hydroksysteroidowa

dehydrogenaza L-mleczanowa

peroksydaza NADH

I. Komparator spektrum aktywności

Termin „komparator spektrum aktywności jak podano to wyżej odnosi się do graficznej lub wyliczeniowej metody, dzięki której można porównać spektrum aktywności, uzyskane na podstawie obserwowania efektów zastosowania funkcjonalnej biblioteki sondy względem białka docelowego, z referencyjną listą spektrum funkcjonalnego. Na przykład komparator spektrum aktywności może być programem komputerowym łatwo dostępnym specjalistom. Na przykład można zastosować MicroSoft Excel (MicroSoft Inc, Redmont, USA).

J. Klasyfikacja funkcjonalna

W sposobach według wynalazku funkcja białka wskazywana jest przez układ ligandów wiążących się z wspomnianym białkiem. Stosując komparator spektrum w celu porównania obserwowanego spektrum białka docelowego z referencyjną listą funkcjonalną można sklasyfikować funkcjonalnie białko docelowe w oparciu o dane uzyskane dla innych białek. Na przykład białko może być sklasyfikowane w oparciu o zestaw ligandów które stabilizują białko przed odfałdowaniem termicznym.

PL 194 483 B1

Zatem, porównując stopień w jakim wiele różnych cząsteczek lub związków modyfikuje stabilność termiczną białka (a zatem wiąże się z białkiem) ze stopniem w jakim te same cząsteczki modyfikują stabilność termiczną znanego białka (a zatem wiążą się z tym białkiem) można wydedukować do jakiej klasy należy testowane białko.

Alternatywnie białko można sklasyfikować przez porównanie spektrum aktywności białka docelowego w porównaniu z spektrum znanego, sklasyfikowanego białka. Na przykład można przejrzeć elektroniczne bazy danych, takie jak PDR Online, Medline, SciFinder, STNExpress, NAPRALERT Online, the Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Foods, Drugs and Cosmetics, 2ed ed, eds. Leung, Foster.,

Wiley Intercience 1996 i Handbook of Enzyme Inhibitors część A i B wyd 2gie, wyd. Ellner ECH 1990.

Test przesunięcia termicznego i aparat

Zasadniczo dowolny sposób pomiaru efektu inkubowania białka w obecności zestawu ligandów sondy w celu określenia które ligandy sondy wpływają na stabilność białka docelowego jest wystarczający jako sposób funkcjonalnej klasyfikacji białka. Korzystnie w celu określenia wpływu jednej lub wielu cząsteczek lub ligandów na stabilność termiczną białka docelowego stosuje się mikropłytkowy test przesunięcia termicznego. Mikropłytkowy test przesunięcia termicznego jest bezpośrednim i ilościowym sposobem oceny wpływu jednej lub więcej cząsteczek na stabilność termiczną białka docelowego.

Test przesunięcia termicznego oparty jest na zmianie krzywej odfałdowania termicznego receptora takiego jak białko lub kwas nukleinowy, zależnej od liganda. Podczas ogrzewania w szerokim zakresie temperatur receptor ulega odfałdowaniu. Wykreślając wartość stopnia odfałdowania jako funkcje temperatury uzyskuje się krzywą odfałdowania termicznego receptora. Użytecznym punktem odniesienia na krzywej odfałdowania termicznego jest temperatura punktu środkowego (T_m), wskazująca punkt w którym połowa cząsteczek receptora uległa odfałdowaniu.

Test przesunięcia termicznego oparty jest na zmianie zależnej od liganda dla punktu środkowego krzywej odfałdowania termicznego, AT_m, dla kompleksu liganda i receptora (w stosunku do receptora nie związanego z ligandem), jako wartości obserwowalnej bezpośrednio zależnej od powinowactwa wiązania liganda, K_d, w wyniku sprzęgnięcia funkcji energii swobodnych liganda i receptora (Schellman JA, Biopolymers 15, 999-1000, 1976; Brandts JF, Biochemistry 29, 6927-6949, 1990. Strategia skriningu fizycznej wartości termalnej wykorzystuje pomiar wartości stabilności termicznej mieszaniny receptora i liganda, jako wskaźnika powinowactwa wiązania liganda i receptora. Test ten był tradycyjnie prowadzony jeden na raz w różnicujących kolorymetrach skanujących (DSC) monitorujących zmiany pojemności cieplnej w czasie przejścia białka od stanu sfałdowanego do rozfałd owa nego Brandts JF, Biochemistry 29, 6927-6949, 1990; Weber P i wsp J Am Chem Soc 116, 2717-2724, 1994. Alternatywnie test przesunięcia termicznego można wykonać, znów jeden na raz, z wykorzystaniem urządzeń optycznych monitorujących absorbancję (Chavan AJ i wsp Biochemistry 33, 71937202, 1994); fluorescencję (Chavan AJ i wsp Biochemistry 33, 7193-7202, 1994);lub dichroizm kołowy (Bouvier M i wsp Science 265, 398-402, 1994; Morton A i wsp Biochemistry 34, 8564-8575, 1995) zmieniające się w trakcie termicznego odfałdowania białka.

Istnieje wiele korzyści z zastosowania testu przesunięcia termicznego, jako że nie wymaga on stosowania związków znakowanych radioaktywnie, ani fluorescentów lub innych chromoforów w celu towarzyszenia śledzeniu wiązania ligandów. Test wykorzystuje termiczne odfałdowanie biomolekuł, proces fizyczny cechujący wiele, jeśli nie wszystkie, biomolekułu, które mogą stać się związkami docelowymi leków. Ogólna stosowalność testu jest jego ważnym aspektem, ponieważ nie wymaga on wymyślania nowego testu za każdym razem, gdy dostępny jest nowy terapeutyczny receptor lub białko. Test jest szczególnie dobrze przystosowany do pomiarów wiązania ligandów do nie enzymatycznych elementów docelowych, na przykład do badania oddziaływań czynników wzrostowych/receptorów, gdzie niemożliwe jest zwykle zastosowanie technik spektrofotometrycznych. Jednakże, unikalna konfiguracja testu przesunięcia termalnego, tak jak jest on zwykle wykonywany, ogranicza zastosowanie tej techniki szczególnie w przypadku wysokowydajnego przeglądania bibliotek związków.

Udało się nam znacznie przyspieszyć proces skriningu poprzez opracowanie strategii wysokowydajnego skriningu w 96 studzienkowej płytce (lub płytce o większej gęstości), pozwalającej identyfikować i klasyfikować związki na podstawie ich zdolności do termodynamicznej stabilizacji kompleksów receptor/ligand.

Wiązanie liganda stabilizuje receptor (Schellman JA, Biopolymers 15, 999-1000, 1976). Stopień tego wiązania i energia swobodna oddziaływań są równolegle funkcją stężenia liganda Schellman JA,

PL 194 483 B1

Biopolymers 15, 999-1000, 1976; Barcelo F i wsp, Chem Biol Interactions 74, 316-324, 1990. W rezultacie stabilizacji przez ligand potrzeba więcej energii (ciepła) do odfałdowania receptora. Zatem, wiązanie liganda przesuwa krzywą odfałdowania termicznego. Zatem, wiązanie liganda zwiększa stabilność termiczną białka. Cechę tę można wykorzystać w celu określenia czy ligand wiąże się z receptorem: powoduje zmianę, lub przesunięcie krzywej odfałdowania termicznego i zatem zmianę wartości Tm sugerując wiązanie receptora i liganda.

Podstawy termodynamiczne testu przesunięcia termicznego przedstawione są w: Schellman JA, Biopolymers 15, 999-1000, 1976; Brandts JF, Biochemistry 29, 6927-6949, 1990. Badania z wykorzystaniem różnicujących kolorymetrów skanujących przedstawił Brandts JF, Biochemistry 29, 69276949, 1990, wykazując że dla ścisłego wiązania systemy o stechiometrii 1:1, dla których istnieje tylko jedno przejście form sfałdowanych, można wyliczyć powinowactwo wiązania przy Tm z równania:

równanie 1

gdzie K¹™ jest stałą wiązania liganda w punkcie T_m

T_m - punkt środkowy dla białka ulegającemu odfałdowaniu w obecności liganda T_o - punkt środkowy dla białka ulegającemu odfałdowaniu w nieobecności liganda DH^Tu° - entalpia białka ulegającego odfałdowaniu w nieobecności liganda przy T_oDC_pu - zmiana w pojemności cieplnej w trakcie odfałdowania białka w obecności liganda L_Tm - stała gazowa

Wyrażenie to jest użyteczne dla projektowania strukturalnego ligandów azobenzenowych dla streptoawidyny, przy wykorzystaniu DSC do badania różnych mieszanin liganda i streptoawidyny umożliwiających pomiary powinowactwa wiązania w T_m (Weber P i wsp, J Am Chem Soc 116, 27172724, 1994). Pomiary te były następnie sprawdzone przez mieszanie lub kolorymetryczne miareczkowanie izotermiczne, w których uzyskano wyniki zgodne z pomiarami uzyskanymi z wykorzystaniem DSC. Łatwość i powtarzalność sposobu określania odfałdowania termicznego białka w celu określenia powinowactwa liganda wskazało nam drogę dalszego polepszania i rozszerzania tego podejścia metodycznego w celu opracowania uniwersalnego narzędzia odkrywania nowych leków.

Parametry DH^Tu^T i DC_pu zwykle rejestrowane w trakcie eksperymentów z użyciem DSC i są one specyficzne dla każdego białka. Pomiary kolorymetryczne wartości DH^Tu^T i DC_pu są najdokładniejszym szacunkami tych parametrów ponieważ kolorymetry zbierają dane co 0.1°C. Parametry te można również wyliczyć w mikropłytkowym teście przesunięcia termicznego, gdzie wartość DH^Tu^T nie jest entalpią kolorymetryczną lecz jest porównywalna do entalpii van't Hoffa w oparciu o dane o odfałdowaniu białka zbierane co 2.0°C z wykorzystaniem protokołu według wynalazku. Ponadto nawet jeśli brak jest optymalnych danych o DH^Tu^T i DCpu parametry te są stałymi specyficznymi dla białka testowanego i są zatem niezmienne pomiędzy studzienkami mikropłytki, a w rezultacie nie wpływają na wyliczenia względnych wartości stałych powinowactwa np. KT^m i Tm.

Poza parametrami DH^Tu^T i DC_pu konieczne jest uzyskanie wartości T_m i T_o w celu rozwiązania KT^m z równania 1. Dokonuje się tego stosując obliczenia komputerowe nieliniowych najmniejszych kwadratów dla danych odfałdowania białka dla każdej poszczególnej studzienki według równania:

równanie 2

PL 194 483 B1 równanie 2 wykorzystuje pięć parametrów DH_u, DC_pu, T_m, Y_f i Y_u gdzie Y_f i Y_u, są odpowiednio poziomami fluorescencji przed i po przejściu fazowym. Wyliczenia komputerowe określane są przez przeprowadzenie tych parametrów do wartości minimum sumy kwadratów stosując algorytm Levenberga-Marquardta. Wartość T₀ uzyskana jest dla studzienek nie zawierających liganda i jest przyjmowana jako wartość odniesienia. Handlowo dostępne oprogramowanie do wykreślania krzywych jest łatwo dostępne i znane specjalistom. Na przykład można stosować Kaleidograph 3.0 (Synergy, Readind, USA).

Możliwe jest również wyliczanie stałej równowagi asocjacji liganda w dowolnej temperaturze,

K_L w T, stałej równowagi asocjacji liganda w temperaturze T_m z wykorzystaniem równania 3, jeżeli znane są mieszane dane kalorymetryczne dla entalpii wiązania w T, DH_L i zmiana w pojemności cieplnej podczas wiązania liganda DC_pL .

równanie 3

gdzie K = stała asocjacji liganda w dowolnej temperaturze T K^TL = stała asocjacji liganda w temperaturze T_mT_m = punkt pośredni dla odfałdowania białka w obecności liganda DH^tl = entalpia wiązania liganda w temperaturze T

DC_pL = zmiana pojemności cieplnej w czasie wiązania liganda

R = stała gazowa

Drugie wyrażenie równania 3 jest zwykle na tyle małe, że zaniedbywalne, tak że przybliżone wartości K_L w T można uzyskać stosując jedynie pierwsze wyrażenie równania, tak że równanie 3 redukuje się do równania 4:

równanie 4

'1
T	Tm

Parametr DH^TL można mierzyć stosując kalorymetryczne miareczkowanie izotermalne, stosując urządzenia takie jak Omega (MicroCal, Northampton, USA). Gdy dane kalorymetryczne są niedostępne, wartość DH^tl można oszacować na około -10.0 kcal/mol, co jest średnią entalpią wiązania (Wiesman i wsp, Anal Biochem 179, 131-137, 1989).

Do monitorowania odfałdowania termicznego wykorzystywana jest korzystnie spektrometria fluorescencyjna. Metodologia fluorescencyjna jest bardziej czuła niż metodologia absorbcyjna. Zastosowanie wewnętrznej fluorescencji białka i sondy fluorescencyjnej w eksperymentach z zastosowaniem spektroskopii fluorescencyjnej jest dobrze znane specjalistom. Patrz na przykład: Bashford CL i wsp Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A practical approach. IRL Press str. 91-114, 1987; Bell JE, Spectroscopy in Biochemistry, tom 1, CRC Press, str. 155-194, 1981; Brandts L i wsp, Ann Rev Biochem 41,843, 1972.

Mikropłytkowy test przesunięcia termicznego jest opisany ponadto w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/853,464 zarejestrowanym 9 maja 1997 oraz w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US97/08154, opublikowanym 13 listopada 1997, jako publikacja WO 97/42500, podane tu na zasadzie odnośnika.

Odczyty spektralne, korzystnie odczyty fluorescencji, można zbierać ze wszystkich próbek jednocześnie. Alternatywnie odczyty można zbierać z próbek w grupach co najmniej po dwie na raz.

System wizualizacji fluorescencji, na przykład system wizualizacji emisji fluorescencyjnej, można zastosować do śledzenia odfałdowania termicznego cząsteczki docelowej lub receptora. Systemy wizualizacji fluorescencji są dobrze znane specjalistom. Na przykład: ALPHAIMAGER Gel Documentation and Analysis System (Alpha Innotech, San Leandro, USA) wykorzystuje wysokowydajną kamerę CCD o rozdzielczości 768 x 494 pikseli. Kamera CCD sprzęgnięta jest z komputerem a analiza dokonywana jest za pomocą firmowego oprogramowania. CHEMIIMAGER (Alpha Innotech) wykorzystuje chłodzoną kamerę CCD, wykonującą wszystkie funkcje ALPHAIMAGERa oraz dodatkowo zbierająca obrazy chemiluminescencji próbek oraz próbek o niskiej intensywności. CHEMIIMAGER wyko20

PL 194 483 B1 rzystuje procesor Pentium (1.2 Gb dysk twardy, 16Mb RAM), oprogramowanie AlphaEase, osłonę nieprzezroczystą, oraz transiluminator ze światłem UV i widzialnym. Na przykład system MRC-1024 UV/Visible Laser Confocal Imaging System (BioRad, Richmond, USA) umożliwia jednoczesne zbieranie obrazu z więcej niż jednego fluoroforu przy oświetleniu o długości fali od 350 do 700 nm. System GelDoc 1000 Fluorescent Gel Documentation System (BioRad, Richmond, USA) umożliwia łatwą wizualizację powierzchni roboczej o wielkości 20 x 20 cm lub tak małej jak 5x4 cm. Co najmniej 2 płytki 96-cio studzienkowe można zmieścić na powierzchni 20 x 20 cm. System GelDoc 1000 umożliwia również prowadzenie eksperymentów w zmiennym czasie.

System wizualizacji fluorescencji na przykład system wizualizacji emisji fluorescencji można stosować do monitorowania odfałdowania receptora w mikropłytkowym teście przesunięcia termicznego. W tym zastosowaniu wiele próbek ogrzewanych jest jednocześnie w zakresie temperatur od 25 do 110°C. Odczyty emisji fluorescencji zbierane są z wielu próbek jednocześnie. Na przykład można monitorować jednocześnie fluorescencję z każdej studzienki 96 lub 384 studzienkowej płytki. Alternatywnie odczyty fluorescencji można zbierać w sposób ciągły i jednoczesny dla każdej próbki. W niższych temperaturach wszystkie próbki wykazują niskie poziomy fluorescencji. Gdy temperatura wzrasta fluorescencja w każdej próbce wzrasta. Studzienki zawierające ligand wiążący się z cząsteczką docelową z wysokim powinowactwem przesuwają krzywą odfałdowania termicznego ku wyższej temperaturze. W rezultacie studzienki zawierające ligand wiążący się z cząsteczką docelową z wysokim powinowactwem produkują mniej fluorescencji, w danej temperaturze poniżej wartości T_m dla cząsteczki docelowej w nieobecności liganda niż studzienki które nie zawierają liganda o wysokim powinowactwie. Jeżeli próbki ogrzewane są skokowo, fluorescencja wszystkich próbek jest jednocześnie wizualizowana na każdym etapie ogrzewania. Jeżeli próbki ogrzewane są w sposób ciągły emisja fluorescencyjna wszystkich próbek zbierana jest w sposób ciągły w czasie ogrzewania.

Test przesunięcia termicznego można prowadzić w objętości 100 pl. Jednakże z następujących powodów korzystne jest prowadzenie testu w objętości 1-10 pl. Po pierwsze około 10 do 100 razy mniej białka potrzebne jest w teście zminiaturyzowanym, następnie tylko od 4 do 40 pmoli białka wymagane jest do testu zminiaturyzowanego (0.1-1.0 pg białka o masie 25 kD) o objętości od 1 do 10 pl przy stężeniu cząsteczki docelowej 1-4 pM. Zatem 1 mg białka można wykorzystać do przeprowadzenia 1000 - 10000 testów zminiaturyzowanych. Jest to szczególnie korzystne, gdy cząsteczka docelowa dostępna jest w ilościach niewielkich.

Po drugie potrzeba od 10 do 100 razy mniej liganda w przypadku testu zminiaturyzowanego. Jest to szczególnie korzystne przy przeglądaniu bibliotek kombinatorycznych w których związki tworzące bibliotekę syntezowane są w minimalnych ilościach. W przypadku ludzkiej a-trombiny idealne stężenie liganda wynosi około 50 pM, co przekłada się na 25-250 pmoli liganda lub 10-100 ng (zakładając MW około 500 D) liganda na test zminiaturyzowany.

Po trzecie mniejsza objętość reakcyjna umożliwia potencjalne stosowanie płytek o większej złożoności. Na przykład płytki 384 studzienkowe (układ 16 x 24) lub 864 (24 x 36) mają takie same wymiary jak płytki 96 studzienkowe (8.5 x 12.5 cm). Płytka 384 studzienkowa i 846 studzienkowa umożliwiają prowadzenie odpowiednio 4 i 9 razy więcej testów, niż płytka 96 studzienkowa. Alternatywnie można stosować płytki 1536 studzienkowe (32 x 48, Matrix Technologies Corp). Płytka 1536 studzienkowa umożliwia 16x szybszy przerób próbek w porównaniu z płytką 96 studzienkową.

Zatem zastosowanie płytki 1536 studzienkowej zwiększa szybkość testowania 16 razy w porównaniu z testowaniem w płytce 96 studzienkowej. Układ 8x12 (w płytce 96 studzienkowej) umożliwia prowadzenie 96 testów/godzinę lub około 2300 testów na dobę. Układ 32 x 48 umożliwia prowadzenie 1536 testów/godzinę lub około 37000 testów na dobę.

Objętość testowanej próbki może wynosić od 1 do 100 pl. Korzystnie objętość testowana wynosi 1-50 pl. Bardziej korzystnie objętość testowana wynosi 1-25 pl. Jeszcze korzystniej objętość testowana wynosi od 1 do 10 pl. Bardziej korzystnie objętość testowana wynosi 1-5 pl. Nadal bardziej korzystnie objętość testowana wynosi 5 pl. Najkorzystniej objętość testowana wynosi 1 pl lub 2 pl.

Alternatywnie test można przeprowadzić w polikarbonowych, polistyrenowych butelkach typu V lub polipropylenowych płytkach lub zagłębionych płytkach. Płytki zagłębione są płytkami zawierającymi wiele okrągłodennych studzienek o całkowitej pojemności 15 pl.

Mikropłytkowy test przesunięcia termicznego można prowadzić przez (a) kontaktowanie białka z jedną lub więcej cząsteczką z wielu różnych cząsteczek w pojemniku, (b) ogrzewanie wielu pojemników według punktu (a), korzystnie jednocześnie, (c) mierzenie każdego z pojemników pod względem zmian fizycznych związanych z odfałdowaniem termicznym cząsteczki docelowej w wyniku ogrzewaPL 194 483 B1 nia, (d) tworzeniu krzywej termicznego odfałdowania dla cząsteczki docelowej jako funkcji temperatury dla każdego pojemnika, i (e) porównanie krzywych odfałdowania uzyskanych w punkcie (d) do (l) dowolnej innej krzywej odfałdowania termicznego i (2) do krzywej odfałdowania termicznego uzyskanej dla białka w nieobecności wielu różnych cząsteczek; i (f) określanie czy wiele różnych cząsteczek modyfikuje stabilność białka, gdzie modyfikacja stabilności termicznej wskazywana jest przez przesunięcie krzywej termicznego odfałdowania cząsteczki.

Punkt (d) obejmować może ponadto porównanie wyliczonych punktów środkowych temperatury (T_m). Punkt (e) może obejmować ponadto porównanie wartości T_m dla każdej z krzywych odfałdowania termicznego uzyskanych w punkcie (d) z (1) wartością T_m każdej z krzywych odfałdowania termicznego i (2) z wartością T_m krzywej odfałdowania termicznego uzyskanej dla białka docelowego w nieobecności żadnej z cząsteczek.

W celu wykonania testu według wynalazku z wykorzystaniem spektroskopii fluorescencyjnej lub wizualizacji, punkt (a) obejmuje kontaktowanie białka docelowego z sondą fluorescencyjną obecną w każdym z wielu pojemników i punkt (c) obejmuje (c1) wzbudzanie cząsteczki sondy fluorescencyjnej, w każdym z wielu pojemników światłem i (c2) pomiar fluorescencji w każdym z wielu pojemników. Fluorescencja, na przykład emisja fluorescencji, może być mierzona dla każdego z wielu pojemników dla każdego pojemnika po kolei, z podgrupy wielu pojemników w sposób ciągły lub z każdego z wielu pojemników w sposób ciągły.

W celu utworzenia spektrum aktywności cząsteczki szeregowane są w zależności od stopnia w którym stabilizują białko docelowe przed odfałdowaniem termicznym. Po uszeregowaniu cząsteczek spektrum aktywności dla białka docelowego dla cząsteczek tworzących funkcjonalną bibliotekę sondy porównywane jest z jedną lub więcej referencyjną listą spektrum funkcjonalnego.

Użyteczne aparaty do ogrzewania do zastosowania według wynalazku są dobrze znane specjalistom. Na przykład można zastosować ROBOCYKLER Gradient Temperature Cycler (Stratagene, LaJolla, USA) (patent USA nr 5,525,300). Alternatywnie gradientowy blok grzewczy (USA patent nr 5,255,976). Fluorescencję można odczytywać stosując użyteczne urządzenie do spektroskopii fluorescencyjnej. Na przykład można stosować CytoFluor II (PerSeptive Biosystems, Framingham, USA).

Element na którym ogrzewany jest pojemnik może być jednym z elementów zdolnych do ogrzewania próbek szybko i w sposób powtarzalny. Według wynalazku wiele różnych próbek ogrzewanych jest jednocześnie. Wiele różnych próbek ogrzewanych jest jednocześnie na jednym elemencie grzejnym. Alternatywnie wiele różnych próbek ogrzewanych jest do danej temperatury na jednym elemencie grzejnym a następnie przenoszonych jest na drugi element grzejny o innej temperaturze. Ogrzewanie można prowadzić w regularnych bądź nieregularnych odstępach czasu. W celu utworzenia gładkiej krzywej odfałdownia termicznego próbki powinny być grzane jednorodnie, z interwałami od 1 do 2°C. Zakres temperatur do których mogą być grzane próbki wynosi od 4 do 110°C. Odczyty spektralne i w szczególności odczyty fluorescencji zbierane są na każdym etapie ogrzewania. Próbki można ogrzewać i odczytywać w urządzeniu do odczytów spektralnych, na przykład w kamerze wizualizującej fluorescencję, w sposób ciągły. Alternatywnie, po każdym etapie ogrzewania, próbki można chłodzić do niskiej temperatury przed pobraniem odczytu spektralnego. Korzystnie próbki ogrzewane są w sposób ciągły a odczyty spektralne zbierane są w czasie ogrzewania próbek. Odczyty spektralne tj. fluorescencyjne można zbierać z wszystkich próbek jednocześnie. Alternatywnie odczyty można zbierać z grup próbek, co najmniej dwa odczyty na raz. Ostatecznie, odczyty można zbierać pojedynczo z każdej próbki.

Korzystnie aparat stosowany do prowadzenia mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego obejmuje skaner i softwerowy system kontrolny. Fluorescencja, na przykład emisja fluorescencji, wykrywana jest przez fotopowielacz w ciemnej komorze. Oprogramowanie działa na komputerze osobistym i działanie skanera kontrolowane jest przez odpowiedni program.

Przykładowy aparat 200 przedstawiony jest na Fig 2. Precyzyjny mechanizm X-Y skanuje mikropłytki z wykorzystaniem światłowodowej sondy w celu pomiaru fluorescencji z każdej studzienki. Mikropłytka i próbki mogą pozostawać nieruchome w czasie skanowania każdego rządka próbek, tak że ruchomym elementem jest sonda światłowodowa. Alternatywnie mikropłytka i próbki mogą poruszać się od pozycji do pozycji pod sondą światłowodową. System skanujący zdolny jest do skanowania 96 próbek na minutę. Skaner może wykorzystywać wiele filtrów wzbudzenia i wiele filtrów emisyjnych w celu pomiaru użytecznych fluoroforów. Zatem, pomiary emisji fluorescencji można dokonywać pojedynczo dla każdej próbki lub jednocześnie dla podgrupy próbek.

PL 194 483 B1

Element przewodzący ciepło lub blok grzejny może być dowolnym elementem zdolnym do szybkiego i powtarzalnego ogrzewania próbek. Wiele próbek może być ogrzewanych na jednym, elemencie. Alternatywnie wiele różnych próbek ogrzewanych jest do danej temperatury na jednym elemencie grzejnym a następnie przenoszonych jest na drugi element grzejny o innej temperaturze. Ogrzewanie można prowadzić w regularnych bądź nieregularnych odstępach czasu. W celu utworzenia gładkiej krzywej odfałdownia termicznego próbki powinny być grzane jednorodnie, z interwałami od 1 do 2°C. Zakres temperatur do których mogą być grzane próbki wynosi od 4 do 110°C.

Korzystnie próbki ogrzewane są w sposób ciągły. Jeżeli próbki ogrzewane są w dyskretnych odstępach czasu, w sposób „schodkowy, odczyty spektralne dokonywane są po każdym etapie ogrzewania. Alternatywnie po każdym etapie ogrzewania próbki są chłodzone do niskiej temperatury przed zebraniem odczytów spektralnych. Alternatywnie próbki ogrzewane są w sposób ciągły i odczyty spektralne zbierane są w czasie ogrzewania.

Aparat testowy można zaprojektować tak by zawierał pojedynczy blok grzejny. Alternatywnie aparat testowy może zawierać wiele różnych przewodzących ciepło bloków na ruchomej platformie. Platforma może być platformą przekładalną, która może być przekładana serwomechanizmem napędzanym napędem liniowym. Przykłady napędów liniowych obejmują model SA A5M400 (IAI America, USA). W tym zastosowaniu sensor uzyskuje emisję spektralną z każdej próbki na danym bloku przewodzącym ciepło. Platforma jest następnie przenoszona do innego bloku przewodzącego ciepło wraz z próbkami, z których znów zbierane są dane spektralne. Platforma jest przenoszona do czasu uzyskania emisji spektralnej z wszystkich próbek ze wszystkich bloków grzejnych.

Alternatywnie platforma może być platformą rotacyjną, jak pokazuje to Fig A, która może być obracana, na przykład serwomechanizmem o zmiennej osi. W tym zastosowaniu sensor otrzymuje emisje spektralne z każdej próbki na określonym bloku przewodzącym ciepło. Platforma następnie obraca się do innego elementu przewodzącego ciepło z towarzyszącymi jej próbkami i dostaje się pod sensor który odczytuje emisję spektralną z każdej próbki znajdującej się na elemencie grzejnym. Platforma obraca się do czasu uzyskania emisji spektralnej z wszystkich próbek na wszystkich blokach grzejnych.

W aparacie 200, wiele bloków przewodzących ciepło 204, każdy z nich obejmuje wiele studzienek dla wielu próbek 210, są umieszczone na obrotowej platformie lub karuzeli 206. Platforma lub karuzela 206 zbudowana jest z materiału przewodzącego ciepło, takiego jak materiał z którego zbudowany jest blok przewodzący ciepło 204. Oś 208 przyłączona jest obrotowo do podstawy 202. Platforma obrotowa 206 umocowana jest osiowo w sposób umożliwiający obrót dookoła osi 208. Obrót osi 208 kontrolowany jest przez kontroler serwomechanizmu 210. Kontroler serwomechanizmu 210 kontrolowany jest przez kontroler komputerowy 250 w sposób znany specjalistom. Kontroler komputerowy 250 i kontroler serwomechanizmu 210 umożliwiają rotację osi 208, pociągającą za sobą obrót platformy 206. W ten sposób bloki przewodzące ciepło 204 są kolejno umieszczane pod sondą optyczną 212.

Każdy z wielu bloków przewodzących ciepło 204 może być kontrolowany niezależnie przez kontroler temperatury 214. Zatem temperatura w pierwszym bloku przewodzącym ciepło 204 może być wyższa lub niższa od temperatury drugiego bloku przewodzącego ciepło 204. Podobnie temperatura w trzecim bloku przewodzącym ciepło 204 może być wyższa lub niższa od temperatury pierwszego lub drugiego bloku przewodzącego ciepło 204.

Kontroler temperatury 214 podłączony jest do bloku przewodzącego ciepło 204 za pomocą połączenia termoelektrycznego 230. W czasie działania kontrolera temperatury 214 temperatura bloku przewodzącego ciepło 204 może wzrastać, zmniejszać się lub być utrzymywana stała. Kontroler temperatury 214 może być skonfigurowany tak, by ustalał temperaturę platformy obrotowej 206. W takim przypadku, gdy platforma obrotowa jest ogrzewana, element przewodzący ciepło 204 jest również ogrzewany. Alternatywnie, temperatura każdego z bloków przewodzących ciepło 204 może być kontrolowana przez system cyrkulacji wody, taki jak podano wyżej. Szczególnie temperatura bloku przewodzącego ciepło 204 może być zmieniana przez kontroler temperatury 214 zgodnie z określonym wcześniej profilem zmian temperatury. Korzystnie, dodany jest komputerowy kontroler temperatury 214, wykorzystujący system komputerowy.

Termin „profil temperatury odnosi się do zmian temperatury w czasie. Termin „profil temperatury obejmuje stałe zmniejszanie się lub zwiększanie temperatury, zmiany zarówno liniowe jak nieliniowe. Termin obejmuje również dowolne etapowe zmiany protokołu, włączając w to protokoły charakteryzujące się krokowym zmniejszaniem lub zwiększaniem temperatury w czasie których temperatura wzrasta lub maleje i przerywana okresami w których temperatura pozostaje stała. W aparacie przedstawionym na Fig 2 profil temperatury może być ustalony wstępnie przez zaprogramowanie komputePL 194 483 B1 rowego kontrolera temperatury 214. Na przykład profile temperatury można przechowywać w pamięci kontrolera komputerowego temperatury 214 lub profile mogą być wprowadzane przez operatora do komputerowego kontrolera temperatury 214.

Aparat testowy 200 obejmuje również źródło światła 218 emitujące wzbudzającą falę światła. Światło wzbudzające ze źródła światła 218 wzbudza próbki 216 światłem wzbudzającym. Zastosować można dowolne użyteczne źródło światła. Światło wzbudzające powoduje emisję spektralną z próbek 216. Emisja spektralna może być promieniowaniem elektromagnetycznym o dowolnej długości fali. Korzystnie emisja spektralna jest fluorescencją, światłem UV lub światłem widzialnym. Najkorzystniej emisja spektralna jest emisją fluorescencyjną.

Sensor odłączalny przymocowany jest do twornika sensora 226. Przykładowy sensor jest sondą światłowodową 212. Sonda światłowodowa 212 obejmuje światłowód zdolny do transmitowania światła wzbudzającego do próbki 216 i światłowód zdolny do wychwytywania emisji spektralnej próbki 216. Promieniowanie elektromagnetyczne przekazywane jest ze źródła światła wzbudzającego 218 do sondy światłowodowej 212 przez światłowodowy kabel wejściowy 228.

Kontroler serwomechanizmu źródła światła wzbudzającego 258 kontroluje aperturę filtra źródła światła wzbudzającego 256. Źródło światła wzbudzającego 218 i kontroler serwomechanizmu źródła światła wzbudzającego 258 połączone są w sposób umożliwiający działanie z kontrolerem komputerowym źródła światła wzbudzającego 254. Kontroler komputerowy 254 kontroluje długość światła przekazywanego do próbek 216 przez kontrolowanie filtra źródła światła wzbudzającego 258. Światło wzbudzania przenoszone jest przez światłowód wyjściowy 228 do sondy optycznej 212 i do próbek 216.

Emisja spektralna pochodząca z próbek 216 zbierana jest przez sondę optyczną 212 i przekazywana do filtra spektralnego 238 przez przewód światłowodowy 250. Kontroler serwomechanizmu emisji spektralnej 240 kontroluje aperturę filtra emisji spektralnej 238, kontrolując w ten sposób długość fali emisji spektralnej przekazywanej do fotopowielacza 220. Kontroler serwomechanizmu emisji spektralnej 240 kontrolowany jest przez kontroler komputerowy 242.

Emisja spektralna pochodząca z próbek 216 przekazywana jest do fotopowielacza 220. Wyjście elektryczne 244 łączy fotopowielacz 220 z elektrycznym połączeniem 224. Elektryczne połączenie 224 łączy wyjście elektryczne 244 z komputerem 222. Komputer 222 wraz z odpowiednim oprogramowaniem obrabia sygnał emisji spektralnej pochodzący od próbek 216. Przykładowe oprogramowanie to graficzny interfejs automatycznie analizujący dane uzyskane z próbek 216. Oprogramowanie jest dobrze znane specjalistom i może obejmować CytoFluor II (czytnik płytkowy firmy PerSeptive Biosystems) wykorzystujący Cyclocalc Data Analysis System (PerSeptive Biosystems, Framingham, USA). Inne użyteczne oprogramowanie obejmuje MicroSoft Excel lub dowolne kompatybilne oprogramowanie.

Element poruszający twornik czujnika 260 porusza czujnik twornika 226 w kierunkach 234 i 236. Drugi element poruszający 232 porusza twornik czujnika 226 w kierunkach 246 i 248 tak, że sonda optyczna 212 może poruszać się i odczytywać emisję spektralną próbek 216.

Jak przedyskutowano to powyżej element odczytujący emisję spektralną lub sensor aparatu testowego według wynalazku może obejmować fotopowielacz. Alternatywnie element odczytujący emisję spektralną lub sensor aparatu testowego obejmuje kamerę CCD. W kolejnym alternatywnym zastosowaniu element odczytujący emisję spektralną lub sensor aparatu testowego obejmuje układ diod. Kamera CCD wykonana jest z półprzewodnikowego silikonu. Gdy fotony światła docierają do niej, uwalniane są wolne elektrony.

Ponadto kamera CCD może być wykorzystywana do wizualizacji fluorescencji, takiej jak emisja fluorescencji. Wysokorozdzielcza kamera CCD może wykrywać niewielkie ilości energii elektromagnetycznej, niezależnie od tego czy jest ona wytwarzana przez odległe gwiazdy, czy pochodzi z dyfrakcji na kryształach, lub czy jest emitowana przez fluorofory. Jako urządzenie wizualizujące, kamera CCD jest szczególnie użyteczna do wizualizacji emisji fluorescencyjnej ponieważ może wykrywać niewielkie obiekty, zapewniać czułe wykrywanie szerokiego zakresu spektrum, zapewnia uzyskiwanie niskiego poziomu szumów, oraz wykrywanie sygnałów w szerokim zakresie dynamiki - tak że kamera CCD może jednocześnie wykrywać obiekty jasne i słabo świecące. Ponadto wyjście jest liniowe tak, że ilość zbieranych elektronów jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości padających na kamerę CCD fotonów. Oznacza to że jasność mierzona jest jako jasność rzeczywista obiektu, co nie jest osiągalne przy stosowaniu na przykład emulsji fotograficznej. Użyteczne kamery CCD można uzyskać z firm: AlphaInnotech (San Leandro, USA), Stratagene (LaJolla, USA) i BioRad (Richmond, USA).

Aparaty użyteczne do prowadzenia testu mikropłytkowego przesunięcia termicznego są ponadto opisane w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/853,459 zarejestrowanym 9 maja 1997 i w międzyna24

PL 194 483 B1 rodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US97/08154 opublikowanym 13 listopada 1997 jako publikacja o numerze WO97/42500, co zostało podane na zasadzie odnośnika.

Wynalazek został w ten sposób w ogólny sposób opisany, co zostanie dokładniej wyłożone przez odniesienie do następujących specyficznych przykładów, podanych tu jedynie dla ilustracji w sposób nieograniczający.

Przykład 1

Szeroka stosowalność testu mikropłytkowego przesunięcia termicznego

Dotychczas w teście mikropłytkowego przesunięcia termicznego testowano szereg różnych terapeutycznych białek (dane zebrano w Tabeli 2). Obejmują one wiele różnych białek o różnorodnych funkcjach in vivo. Obejmują różnorodne proteazy serynowe, białka wiążące się z DNA (represor lac), dwa czynniki wzrostowe (podstawowy czynnik wzrostowy fibroblastów bFGF oraz kwasowy czynnik wzrostowy fibroblastów aFGF) oraz receptor 1 czynnika wzrostowego (domena II czynnika wzrostu fibroblastów (D9II) FGFR1).

T a b e l a 2

terapeutyczne czynniki docelowe testowane w teście mikropłytkowym przesunięcia termicznego
czynnik docelowy	MW	testy/mg (format 10 pl)
a-trombina	37.0 kD	1430 0.7 pg/test (20 pmoli)
czynnik D	25.0 kD	1000 1.0 pg/test (40 pmoli)
czynnik Xa	45.0 kD	1667 0.6 pg/test (7 pmoli)
bFGF	17.5 kD	2000 0.5 pg/test (29 pmoli)
D (II) FGFR1	13.5 kD	588 1.7 pg/test (126 pmoli)
represor lac	77.0 kD	1200 0.8 pg/test (10 pmoli)
urokinaza	28.0 kD	714 1.4 pg/test (50 pmoli)
białko NFkB	65.0 kD	3030 0.33 pg/test (5 pmoli)
receptor GLP1	26.0 kD
MHCII	45.0 kD
czynnik von Willebranda	500 kD	400 2.5 pg/test
aFGF	18.0 kD

Masy cząsteczkowe białek docelowych wahały się od 13.5 kD do około 500 kD. Średnio możliwe jest przeprowadzenie 1322 testów na 1.0 mg białka stosując objętość próbki 10 pl. Liczbę testów można podwoić zmniejszając objętość próbki do 5 pl.

Wszystkie mikropłytkowe testy przesunięcia termicznego prowadzono w polikarbonowych płytkach 96 studzienkowych o ostrych dnach (V-bottom) stosując 200 pM 1,8-ANS jako sondę fluorescencyjną do monitorowania termicznego odfałdowania dla mieszaniny białko/ligand. Zmiany emisji fluorescencji przy 460 nm monitorowano stosując czytnik płytek CytoFluorll (PerSeptive Biosystems), wzbudzenie przy 360 nm i stosując wzrost temperatury w 2°C interwałach, stosując RoboCycler Gradient Temperature Cycler (Stratagene, LaJolla).

Testowano wiele innych białek stosując test mikropłytkowy przesunięcia termicznego, włączając w to następujące białka z następujących klas: proteazy serynowe (trombina, czynnik Xa, czynnik D, urokinaza, trypsyna, chymotrypsyna, subtylizyna); receptory powierzchniowe komórki (receptor FGF, MHC klasy II, receptor GLP1, receptor beta2 adrenergiczny, receptor fibronektyny (liblla); białka motoryczne (miozyna, helikaza); oksydoreduktazy (peroksyaza z korzenia chrzanu, cytochrom c, dehydrogenaza mleczanowa, laktoperoksydaza, dehydrogenza jabłczanowa, oksydaza cholesterolowa, dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa, karboksylaza PEP, reduktaza dihydrofolianowa); enzymy modyfikujące węglowodany (celulaza, alfa-amylaza, hialuronidaza, beta-glukozydaza, inwertaza); immunoglobuliny (IgG Fab, IgG Fc); DNazy (DNaza I, DNaza ll), RNazy (RNazaA); wewnątrzkomórkowe receptory wapniowe (kalmodulina, białko S100); hydrolazy neurotransmiterów (acetylocholinoesteraza); wymiatacze wolnych rodników (dysmutaza nadtlenkowa); białko wiążące biotynę (streptawidyna); białko wiążące tlen (mioglobina) i inhibitor proteaz (inhibitor trypsyny).

PL 194 483 B1

Przykład 2

Oddziaływania wieloligandowe z pojedynczym białkiem docelowym

Prawie uniwersalne stosowanie mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego ilustrowane jest również jego zastosowaniem do testowania wieloligandowych oddziaływań z pojedynczym białkiem docelowym. Zdolność do oceny wiązania wielu różnych rodzajów ligandów do pojedynczego białka bez konieczności przekonstruowania testu jest dużą zaletą tej technologii i ułatwia stosowanie jej do zadania przypisywania funkcji nieznanym białkom. Znajomość wiązania różnych ligandów do białka umożliwia ocenę funkcjonalną białka.

Jak wykazano to poprzednio, mikropłytkowy test przesunięcia termicznego można stosować do przeszukiwania ligandów pod względem zdolności do wiązania się z pojedynczym miejscem w obrębie białka docelowego. Jednakże w oparciu o prawie pełną addytywność energii swobodnej wiązania liganda i odfałdowania białka możliwe jest również zastosowanie testu mikropłytkowego przesunięcia termalnego do analizy wieloligandowych intereakcji wiązania do białka docelowego. Zasadniczo, jeżeli energia swobodna wiązania różnych ligandów do tego samego białka jest prawie addytywna to można analizować system wieloligandowego wiązania zarówno w sposób kooperatywny, jak nie kooperatywny (pozytywny lub negatywny).

Z tego powodu ludzka trombina stanowi idealny model do testowania użyteczności testu do analizy wieloligandowych oddziaływań ponieważ posiada co najmniej cztery różne miejsca wiązania: (1) katalityczne miejsce wiązania; (2) miejsce wiązania fibryny (miejsce zewnętrzne I); (3) miejsce wiązania heparyny (miejsce zewnętrzne II); (4) miejsce wiązania jonu Na, położone około 15 A od miejsca katalitycznego.

Po pierwsze określono sposób wiązania poszczególnych ligandów. 3DP-4660, Hurgen (hirudin 53-64)(Sigma) i heparyna 5000 (CalBiochem) wiążą się do miejsca katalitycznego, miejsca wiązania fibryny oraz miejsca wiązania heparyny.

Stokowy roztwór trombiny rozcieńczono do stężenia 1 pM w 50 mM HEPES pH 7.5, 0.1 M NaCl, 1 pM CaCl₂ i 100 pM 1,9-ANS. Każdy ligand trombiny włączano do roztworu pojedynczo w różnych kombinacjach do trombiny o stężeniu 1 pM w końcowym stężeniu 50 pM każdego, za wyjątkiem heparyny 5000 o stężeniu 200 pM. 100 pl roztworu trombiny lub trombiny i liganda rozpipetowano do 96 studzienek płytki polikarbonowej o ostrych dnach. Zawartość wymieszano przez pipetowanie. Ostatecznie na wierzch każdej studzienki dodano kroplę oleju mineralnego (Sigma) w celu uniknięcia parowania przy podwyższonej temperaturze. Płytkę ogrzewano przez 3 minuty w RoboCycler Gradient Temperature Cycler (Stratagene) z utworzonym gradientem temperatury w poprzek bloku, a następnie chłodzono przez 30 sekund w temperaturze 25°C i odczytywano w czytniku fluorescencyjnym płytek. Data analizowano metodą najmniejszych kwadratów.

Rezultaty poszczególnych reakcji wiązania przedstawia Fig 3. Uszeregowanie powinowactw wiązania było następujące: 3Dp-4660>hirugen>heparyna 5000, odpowiadające wartościom K_d 15 nM, 185 nM i 3434 nM odpowiednio dla ligandów wiążących się w Tm (patrz równanie 1).

Następnie badano mieszaniny dwu ligandów. Dane przedstawia Fig 4. Wyniki przedstawione na Fig 4 ujawniają, że przesunięcie termalne jest nieco mniejsze niż należałoby tego oczekiwać przy pełnej addytywności reakcji. Na przykład hirugen osobno dawał AT_m równe 5.8°C i 3DP-4660 osobno dawał AT_m równe 7.7°C, jednak razem dawały AT_m równe 12.2°C (a nie 13.5°C, czego można by oczekiwać gdyby energie swobodne sumowały się całkowicie). Wynik ten może oznaczać iż powinowactwa wiązania jednego lub więcej ligandów zmniejszają się gdy oba ligandy wiążą się z trombiną, i może być przykładem kooperacji negatywnej pomiędzy miejscem wiązania fibryny a katalitycznym miejscem wiązania. Wynik ten jest zgodny z danymi literaturowymi na temat trombiny, które wskazują że kinetyka hydrolizy różnych substratów chromogennych zależy od ligandów wiążących się z miejscem zewnętrznym I. Istotnie, w obecności hirugenu obserwowano około 60% spadek wartości K_m dla hydrolizy D-fenyloalanylopipekolyloarginylo-p-nitroanilidu (Dennis i wsp, Eur J Biochem 188, 61066, 1990). Ponadto istnieją również wskazówki strukturalne, na oddziaływania kooperacyjne pomiędzy miejscem katalitycznym a miejscem zewnętrznym I. Porównanie izomorficznych struktur trombiny związanej z PPACK (inhibitorem miejsca katalitycznego trombiny) a trombiny związanej z hirugenem wskazuje na zmiany konformacyjne występujące w miejscu katalitycznym w wyniku wiązania hirugenu do miejsca zewnętrznego I (Vijayalakshimi i wsp, Protein Sci 3, 2254-2271, 1994). Zatem zjawisko kooperacji obserwowane między centrum katalitycznym a miejscem zewnętrznym I jest zgodne z danymi funkcjonalnymi i strukturalnymi.

PL 194 483 B1

Można by oczekiwać że jeśli energie wiązania wszystkich trzech ligandów są w pełni addytywne, zmiana AT_m równa 17.7°C powinna być obserwowana. Jednakże gdy trzy ligandy obecne są razem AT_m równa jest 12.9°C. Efekt ten wskazuje na dalsze negatywne oddziaływanie kooperacyjne obejmujące ligandy wiążące się ze wszystkimi trzema miejscami wiązania. Istnieją dane literaturowe zgodne z tym podejrzeniem. Na przykład trombina w kompleksie potrójnym z heparyną i monomerem fibryny posiada zmniejszoną aktywność skierowaną wobec substratowego tripeptydu chromogennego protrombiny (Hogg i Jackson, J Biol Chem 265, 248-255, 1990) i zasadniczo zmniejszoną reaktywność wobec antytrombiny (Hogg i Jackson, PNAS USA 86, 3619-3623, 1989). Również niedawne obserwacje Hotchkissa i ws (Blood 84, 498-503, 1994) wskazują że kompleks potrójny tworzy się również w osoczu i znacząco obniża zdolność antykoagulacyjną heparyny.

Podsumowanie wyników wieloligandowego wiązania heparyny przedstawia Tabela 3. Z wyników zamieszczonych na Fig. 3 i 4 oraz w Tabeli 3 można wyciągnąć następujące wnioski. Po pierwsze w obecności heparyny 5000, hirudyna 53-65 wiąże się z trombiną około 21 razy silniej niż przy braku heparyny. W obecności heparyny 5000, 3DP-4660 wiąże się z trombiną około 10 razy słabiej niż w nieobecności heparyny.

Po drugie w obecności hirudyny 53-65, heparyna wiąże się z trombiną około 18 razy słabiej niż przy braku hirudyny. W obecności hirudyny 53-65 3DP-4660 wiąże się z trombiną około 3 razy słabiej niż w nieobecności hirudyny 53-65.

Po trzecie w obecności 3DP-4660, heparyna wiąże się z trombiną o około 25% silniej niż przy braku 3DP-460. W obecności 3DP-4660 hirudyna wiąże się z trombiną około 2.3 raza słabiej niż w nieobecności 3DP-4660.

Tabela 3

Test ligandów wiążących się do miejsca aktywnego, miejsca zewnętrznego i miejsca wiązania heparyny trombiny
białko/ligand	[ligand] (PM)	1—	ATm (°K)	Kd przy Tm (nM)^(a)	Kd przy 98°K (nM)
trombina (TH)	brak	323.75	0.0
TH/heparyna5000	200	327.95	4.2	3434	470
TH/hirudyna53-65	50	329.52	5.8	185	23
TH/3dp-4660	50	331.40	7.7	29	3
TH/heparyna5000	200	327.95
TH/Hep/Hir	50	330.57	2.6	4254	478
TH/Hep5000	200	327.95
TH/Hep/3dp4660	50	333.20	5.3	350	32
TH/Hir 53-65	50	329.52
TH/Hir/Hep	200	330.57	1.1	75422	8467
TH/Hir53-65	50	329.52
TH/Hir/3dp-4660	50	335.97	6.5	117	9
TH/3dp-4660	50	331.40
TH/3dp-4660/Hep	200	333.20	1.8	38205	351
TH/dp-4660	50	331.40
TH/3dp-4660/Hir	50	335.97	4.6	731	54

a: wyliczenia K_d przy T_m wykonano stosując równanie (1) przy DH^Tu° = 200.0 kcal/mol, jak obserwowano to dla pretronibiny przez Leintza i wsp, Biochemistry 33, 5460, 1994 i przyjęto oszacowaną wartość DC_pu = 2.0 kcal/mol - °K i K_d = 1/K_a b: Szacunki K_d przy T = 298°K wykonano stosując równanie 3, gdzie DHL = -10.0 kcal/mol.

PL 194 483 B1

Zatem mikropłytkowy test przesunięcia termalnego oferuje szereg korzyści przy analizie wieloligandowych interakcji w funkcjonalnej analizie genomikowej. NA przykład w tym samym teście można jednocześnie wykrywać wiązanie różnych rodzajów ligandów wiążących się do miejsc białka docelowego. Każde zidentyfikowane oddziaływanie liganda umożliwia użytkownikowi testu przypisanie funkcji białku. Gdy uzyskane funkcje zsumuje się, otrzymuje się krzywą charakterystyczną dla poszczególnych klas białek.

Na przykład jeżeli rozważa się informacje uzyskane z badań nad trombiną i przez chwilę zapomni się jakie własności posiada to białko, dane dotyczące wiązania heparyny mogą sugerować funkcję pozakomórkową białka, jako że heparyna i inne sulfonowane oligosacharydy są istotnymi składnikami matriks pozakomórkowego w tkankach wyższych organizmów. Ligand wiążący się z miejscem katalitycznym 3DP-4660 jest nie peptydowym związkiem naśladującym naturalny peptyd posiadającym łańcuch boczny arginylowy w pozycji P1 charakterystyczny dla substratów i inhibitorów proteaz serynowych podobnych do trypsyny. Podobnie borarginionowe analogi stanu przejściowego posiadające grupę arginylową w pozycji P1 są również specyficznymi inhibitorami proteaz serynowych, trombiny, trypsyny i plazminy (Tapperelli i wsp, J Biol Chem 268, 4734-4741, 1993) wykazujące stałe specyficzności K_d około 10 nM (trombina), około 1000 nM (trypsyna) i około 10000 nM (plazmina). Zatem łączne informacje o wiązaniu heparyny, z obserwowanymi zdolnościami do wiązania analogów stanu przejściowego szybko zawężają grupę poszukiwanych funkcji białka na białkach pełniących proteolityczną rolę w przestrzeniach pozakomórkowych, nawet przy braku innych informacji.

Ponadto mikropłytkowy test przesunięcia termalnego może być zastosowany w sposób wysokowydajny, do wykrywania efektu kooperatywnego oddziaływania ligandów. Informacja o efekcie kooperatywnego oddziaływania ligandów uzyskiwana jest bardzo szybko, w ciągu kilku godzin, a nie kilku miesięcy, jak to było dotąd dostępne przy zastosowaniu metod konwencjonalnych.

Przykład 3

Przeszukiwanie funkcjonalnej biblioteki sondy wobec ludzkiego czynnika Xa

Funkcjonalna biblioteka sondy przedstawiona jest na Fig. 5. Płytka 96 studzienkowa (płytka 1) zawiera 94 związki (i dwie kontrole) i obejmuje wiele związków które uznawane są za dostarczające informacji o preferencjach w wiązaniu liganda a zatem możliwych funkcjach białka. Na przykład kofaktory takie jak NAD i ATP występują odpowiednio w studzienkach A4 i A5. Ta konkretna płytka obejmuje również wiele jonów metali.

W celu sprawdzenia skuteczności przeszukiwania biblioteki dwa znane białka inkubowano ze związkami z płytki 1 i badano za pomocą testu przesunięcia termalnego. Na przykład spektrum aktywności uzyskane dla czynnika Xa (Enzyme Research Labs) przedstawia Fig. 6.

Czynnik Xa zakupiono w Enzyme Research Labs. Reakcje prowadzono w 96 studzienkowej płytce polikarbonowej z ostrymi dnami studzienek. Końcowe stężenie czynnika Xa wynosiło 1.4 pM (55 ng/ml) w 200 mM TRIS-HCl pH 8.0. Końcowe stężenie 1,8-ANS wynosiło pM. Końcowe stężenia każdej z testowanych molekuł przedstawiono na Fig 6. Zawartość mieszano przez pipetowanie. Ostatecznie na wierzch każdej studzienki dodano kroplę oleju mineralnego (Sigma) w celu uniknięcia parowania przy podwyższonej temperaturze.

Płytki ogrzewano jednocześnie w dwu gradientach temperatury od 40 do 70°C w RoboCycler Gradient Temperature Cycler (Stratagene). Następnie chłodzono do temperatury 25°C. Fluorescencję odczytywano po każdym etapie ogrzewania i odczytywano w czytniku fluorescencyjnym płytek CytoFlour II (PerSeptive Biosystems). 1,8-ANS wzbudzano światłem o długości 360 nm. Emisję fluorescencji mierzono przy 460 nm.

Znaleziono sześć warunków w których następowała stabilizacja enzymu z AT_m > 1.0°C: (1)

0.5 M (NH4)SO4, (2) 0.5 M MgSO4, (3) 0.5 M Li₂SO4, (4) 0.5 M KCl, (4) 0.1 M kwas trifosforan i (6) 0.1 M CaCl₂. Dwa ostatnie warunki były zapewne najważniejsze, ponieważ kwas trifosforanowy jest polielektrolitem naśladującym heparynę i inne sulfonowane oligosacharydy i jego wiązanie z białkiem sugeruje obecność miejsca wiązania heparyny, co wiadomo o czynniku Xa. Podobnie wiązanie jonów wapniowych jest charakterystyczne dla domeny Gla.

Niektóre z jonów metali wykazywały silny efekt destabilizujący na czynnik Xa. Na przykład [Co(NH₃)₆]Cl₃, BaCl₃, CdCl₂, YCl₂ i NiSO₄ destabilizowały czynnik Xa w temperaturach od 6 do 17°C. Nieznana jest przyczyna tej destabilizacji. Możliwe jest, że wspomniane jony metali preferencyjnie wiążą się z odfałdowaną formą czynnika Xa. Możliwe jest również pewne oddziaływanie poprzez sondę fluorescencyjną.

PL 194 483 B1

Przykład 4

Przeglądanie funkcjonalnej biblioteki sondy wobec ludzkiego D(II)FGR1

Związki tworzące funkcjonalną bibliotekę sondy na płytce 1 wykorzystano również do wytworzenia spektrum aktywności dla ludzkiego D(II)FGR1. D(II)FGR1 sklonowano i eksprymowano w E.coli. Zrekombinowany D(II)FGR1 renaturowano z ciałek inkluzyjnych zasadniczo według Wetmore DR i wsp, Proc Cos Mtg San Diego 1994, za wyjątkiem tego, że znaczniki sześciohistydynowe wprowadzono na końcu N w celu ułatwienia odzyskania białka w wyniku zastosowania chromatografii powinowactwa na kolumnie z Ni²⁺ (Janknecht R i wsp, PNAS USA 88, 8972-8976, 1991. D(II)FGR1 oczyszczano następnie na kolumnie z immobilizowaną heparyną (Kan M i wsp, Science 259, 1918-1921, 1993; Pantoliano WM i wsp, Biochemistry 33, 10229-10248, 1994. Czystość wynosiła >95% (według SDS-PAGE). Białko D(II)FGR1 zagęszczono do 12 mg/ml (około 1 mM) i przechowywano w 4°C.

Reakcję przygotowano w 96 studzienkowej płytce polikarbonowej z ostrymi dnami studzienek. Końcowe stężenie D(II)FGR1 wynosiło 50 pM w 200 mM TRIS-HCl pH 8 w każdej z studzienek płytki. Końcowe stężenie 1,8 - ANS wynosiło 100 pM. Końcowe stężenia każdej z testowanych cząsteczek przedstawiono na Fig 7. Zawartość mieszano przez pipetowanie. Ostatecznie na wierzch każdej studzienki dodano kroplę oleju mineralnego (Sigma) w celu uniknięcia parowania przy podwyższonej temperaturze.

Płytki ogrzewano jednocześnie w dwu gradientach temperatury od 25 do 60°C w RoboCycler Gradient Temperaturę Cycler (Stratagene). Następnie chłodzono do temperatury 25°C. Fluorescencję odczytywano po każdym etapie ogrzewania i odczytywano w czytniku fluorescencyjnym płytek CytoFlour II (PerSeptive Biosystems). 1,8-ANS wzbudzano światłem o długości 360 nm. Emisję fluorescencji mierzono przy 460 nm.

Otrzymane spektrum aktywności przedstawia Fig 7. Wiele związków stabilizuje D(II)FGR1. Na przykład wszystkie cukry, D (+) glukoza, D (+) sacharoza, ksylitol i sorbitol stabilizują i prawdopodobnie wiążą się z D(II)FGR. Wyniki te mogą być zgodne z znanymi właściwościami białek wiążących heparynę, a więc i białka badanego. Kwas trispolifosforowy znany związek naśladujący heparynę powodował największe przesunięcie krzywej - około 11°C. Wynik ten jest zgodny z właściwością charakterystyczną dla białka wiążącego heparynę (Pantoliano MW i wsp, Biochemistry 33, 10229-10248, 1994.

Zatem, w sytuacji gdy badacz nie wie nic o właściwościach badanego białka informacje uzyskane w wyniku przeszukiwania nawet tylko związków z płytki 1 dostarczają informacji pozwalających zaklasyfikować D(II)FGR1 jako białko wiążące heparynę.

Przykład 5

Identyfikacja białek docelowych zawierających miejsca wiążące DNA

Represor lac jest zwykle białkiem tetramerycznym, dimerem dimerów. Jednakże białko to wiąże się z DNA w formie dimerycznej. Lewis i wsp przedstawili strukturę krystaliczną represora lac związanego z DNA (Lewis i wsp Science 271, 1247-1254, 1996). Od Dr Mitcha Lewisa z Uniwersity of Pennsylwania uzyskano dimer zmieniony genetycznie niezdolny do tworzenia tetrameru, oraz syntetyczny 21 oligonukleotyd zawierający palindromową sekwencje operatora z którą wiąże się represor lac. W teście mikropłytkowym przesunięcia termicznego badano zdolność syntetycznego operatora lac do wiązania zmutowanego represora lac.

Reakcję przygotowano w 96 studzienkowej płytce polikarbonowej z ostrymi dnami studzienek. Końcowe stężenie represora lac wynosiło 60 pM w 200 mM TRIS-HCl pH 8 w każdej z studzienek płytki. Końcowe stężenie 1,8 - ANS wynosiło 100 pM. Końcowe stężenia każdej z testowanych cząsteczek przedstawiono na Fig 7. Zawartość mieszano przez pipetowanie. Ostatecznie na wierzch każdej studzienki dodano kroplę oleju mineralnego (Sigma) w celu uniknięcia parowania przy podwyższonej temperaturze.

Płytki ogrzewano jednocześnie w dwu gradientach temperatury od 25 do 75°C w RoboCycler Gradient Temperature Cycler (Stratagene). Następnie chłodzono do temperatury 25°C. Fluorescencję odczytywano po każdym etapie ogrzewania i odczytywano w czytniku fluorescencyjnym płytek CytoFlour II (PerSeptive Biosystems). 1,8-ANS wzbudzano światłem o długości 360 nm. Emisję fluorescencji mierzono przy 460 nm. W obecności 80 pM syntetycznego operatora DNA wartość T_m dla odfałdowania represora lac została przesunięta o 5.6°C (Fig 8). Wyliczona wartość Kd przy T_m wynosiła 6 pM.

Stosując założoną wartość DHL = -10.0 kcal/mol wartość K_d przy 25°C wynosiła 1.2 pM a wyliczona wartość K_d dla temperatury fizjologicznej 37°C wynosiła 3.4 pM. Sonda fluorescencyjna 1,8-ANS nie wiązała się sama z DNA (zatem sygnał fluorescencyjny nie pojawiał się w reakcji kontrolnej do której nie dodano represora lac).

Wyniki wykazują że mikropłytkowy test przesunięcia termicznego można stosować do badania interakcji pomiędzy DNA a białkiem.

PL 194 483 B1

Przykład 6

Test dla wiązania ATP

Wiązanie ATP i analogów ATP można badać stosując mikropłytkowy test przesunięcia termicznego. W buforze A rozcieńczono do stężenia 2 mg/ml miozynę z mięśni bydlęcych (Sigma), kinazę cAMP zależną z mięśnia sercowego bydlęcia (Sigma) i kinazę pirogronianową z mięśni kurczaka (Sigma). MgCl₂, ATP-g-S, AlF₃ i NaF rozpuszczono w buforze A (50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl) otrzymując roztwory stokowe. Przygotowano roztwór Dapoxylu 12800 przez rozcieńczenie roztworu wyjściowego 20 mM Dapoxylu 12800 (5-(4-dimetyloaminofenylo)-2-(4'-fenylo)oksazolo sulfonian (sól sodowa) Molecular Probes) w DMSO do uzyskania odpowiedniego stężenia w buforze A.

Dla reakcji z ATP i ATP-g-S każda próbka zawierała 12 pl roztworu wyjściowego białka (2mg/ml), 9.6 pl każdego związku (ATP i ATP-g-S, 50 mM), 4.8 pl MgCl₂ (100 mM) i 21.6 pl roztworu 222 pl M dapoxylu 12800 w buforze A. W przypadku ATP, AlF₃ i NaF każda próbka zawierała 12 pl roztworu wyjściowego białka (2 mg/ml), 9.6 pl ATP (50 mM), 9.6 pl AlF₃ (50 mM) = NaF (50 mM) 4.8 pl 100 mM MgCl2 i 12 pl roztworu 400 pM dapoxylu 12800 w buforze A.

Dla celów testu odpipetowano 4 porcje 10 pl mieszaniny reakcyjnej do 4 studzienek zlokalizowanych w różnych częściach termocyklera MJ Research 384. Każdą studzienkę pokryto 10 pl oleju mineralnego w celu uniknięcia parowania. Dane zbierano w trakcie ogrzewania płytki w temperaturach wskazanych przez 3 minuty. Na przykład płytkę ogrzewano do temperatury podanej, a następnie chłodzono do temperatury 25°C przez minutę, oświetlano światłem UV i zbierano dane. Następnie płytkę ogrzewano do wyższej temperatury, i tak dalej. Oświetlanie UV wykonywano stosując długość światła 200-420 nm, z pikiem przy 365 nm. Fluorescencję uwidaczniano stosując kamerę CCD z filtrem ustalonym na 550 nm.

Figura 9 przedstawia wyniki mikropłytkowego testu przesunięcia termicznego dla ATP wiążącego się z miozyną z mięśni bydlęcych. Dane wykreślone są jako intensywność fluorescencji wobec temperatury. Wartość T_m kontroli bez ATP wynosi 49.3°C (płytka K2). Wartość T_m dla miozyny z mięśnia bydlęcego związanej z ATP wynosi 51.4°C (płytka K16). Zatem AT_m dla wiązania ATP wynosi 2.1°C. K_d wynosi 440 pM.

Figura 10 przedstawia wyniki testu mikropłytkowego dla ATP-g-S i zależnej od 3',5'-cAMP kinazy białkowej. Dane wykreślone są jako intensywność fluorescencji wobec temperatury. Wartość T_mkontroli bez ATP-g-S wynosi 46.2°C (płytka E14). Wartość T_m dla kinazy zależnej od cAMP związanej z ATP-g-S wynosi 51.8°C (płytka M15). Zatem AT_m dla wiązania ATP-g-S wynosi 5.6°C. K_d wynosi 200 pM. Wyniki obejmujące także wyniki dla kinazy pirogronianowej zebrane są w tabeli 4.

T a b e l a 4

białko	referencyjna Tm	ATP-g-S (10 mM) ATm	ATP (10 mM) ATm	ATP + AIF3 (10 mM) ATm
miozyna	49.4	0.0(±0.2)	2.2(±0.4)	-0.44(±0.1)
kin.białk. 3'-5'cAMP	47	5.6(±1.7)	7.5(±0.7)	8.2(±1.4)
kinaza pirogronian	54.5	0.8(±0.11)	-0.44(±0.1)	-0.27(±0.2)

Przykład 7

Test wiązania kwasu foliowego

Wiązanie kwasu foliowego można śledzić wykorzystując test mikropłytkowy przesunięcia termicznego. Reduktaza dihydrofolianowa z wątroby bydlęcej (DHFR, Sigma), reduktaza dihydrofolianowa z wątroby kurczaka (DHFR, Sigma), acetyotransferaza arylaminowa z wątroby gołębia (ArAcT, Sigma) oraz świńska, wątrobowa transferaza kwasu formimino-glutaminowego (FGT, Sigma) zostały rozpuszczone w buforze A (50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl) w celu uzyskania roztworu wyjściowego o stężeniu 2 mg/mI. Przygotowano rozcieńczenie kwasu dihydrofoliowego (FAH₂), metotreksatu, NADP, przez rozpuszczenie stałych naważek w buforze A tuż przed użyciem. Roztwór dapoxylu 12800 przygotowano z roztworu stokowego 20 mM dapoxylu 12800 w DMSO, rozcieńczając buforem A.

Każda próbka zawierała 12 pl roztworu wyjściowego białka (2 mg/ml), 4.8 pl albo FAH₂ albo metatreksatu (roztworów wyjściowych, 1 mM), 31.2 roztworu 154 pM dapoxylu 12800 w buforze A. Każda próbka zawierała 12 pl roztworu wyjściowego białka (2 mg/ml), 4.8 pl albo NADP (roztworu wyjściowego, 50 mM), 31.2 roztworu 154 pM dapoxylu 12800 w buforze A.

PL 194 483 B1

Dla celów testu mikropłytkowego odpipetowano 4 porcje 10 pl mieszaniny reakcyjnej do 4 studzienek zlokalizowanych w różnych częściach termocyklera MJ Research 384. Każdą studzienkę pokryto 10 pl oleju mineralnego w celu uniknięcia parowania. Dane zbierano w trakcie ogrzewania płytki w temperaturach wskazanych przez 3 minuty, następnie chłodzono do temperatury 25°C przez minutę, oświetlano światłem UV i zbierano dane. Rezultaty zebrano w tabeli 5.

T a b e l a 5.

Wyniki wiązania metotreksatu, FAH2 i NADP do białek. Wartości w nawiasach to odchylenia standardowe

białko	Referencyjna Tm	Metotrexat (100 pM) ATm	FAH2 (100 pM) ATm	NADP (5 mM) ATm
DHFR	52.47	7.0(±0.1)	-0.64(±0.2)	3.2(±0.13)
DHFR	56.6	8.6(±0.2)	2.5(±0.2)	3.8(±0.4)
ArAcT	49.8	1.0(±0.4)	-1.8(±0.5)	2.8(±0.4)
transferaza formimino kwasu L-glutaminowego	47.2	0.9(±0.5)	3.62(±0.4)	0.0(±0.2)

P r z y k ł a d 8

Test wiązania metotreksatu/NADP(H)

Zdolność do pomiaru przesunięcia termicznego dla wiązania metotreksatu i NADPH, zarówno osobno, jak łącznie jest kolejnym przykładem zastosowania wynalazku w pomiarach oddziaływań wieloligandowych. W tym przypadku miejsca wiązania dwu ligandów są położone proksymalnie i istnieje dodatnia kooperacja w wiązaniu obu ligandów, jak wykazał to test przesunięcia termalnego w przypadku łącznego wiązania ligandów, które jest od 2 do 4 razy silniejsze niż w przypadku stosowania pojedynczych ligandów (Tabela 6).

Wiązanie metotreksatu (MTX) i NADPH można śledzić w mikropłytkowym teście przesunięcia termalnego. Reduktaza dihydrofolianowa z wątroby bydlęcej (DHFR, Sigma), reduktaza dihydrofolianowa z wątroby kurczaka (DHFR, Sigma) zostały rozpuszczone w buforze A (50 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl) w celu uzyskania roztworu wyjściowego o stężeniu 2 mg/Im. Wszystkie rozcieńczenia przygotowano z naważek w buforze A tuż przed użyciem.

Przygotowano rozcieńczenia roztworów stokowych NADPH (100 mM), NADP (20 mM), oraz MTX (1 mM) w buforze A do roztworów 2x wyjściowych: MTX (200 pM), NADP (20 mM), NADPH (20 mM). Roztwór dapoxylu 12800 przygotowano z roztworu stokowego 20 mM dapoxylu 12800 w DMSO, rozcieńczając buforem A. 5 pl każdego z roztworów stokowych białka dodano do 25 pl 2x roztworu stokowego liganda zmieszano z 20 pl roztworu Depoxylu 12800 (250 pM w buforze A).

Ostateczne stężenie ligandów wynosiło 10 mM NADP, 10 mM NADPH i 100 pM MTX.

Dla celów testu mikropłytkowego odpipetowano 4 porcje 10 pl mieszaniny reakcyjnej do 4 studzienek zlokalizowanych w różnych częściach termocyklera MJ Research 384. Każdą studzienkę pokryto 10 pl oleju mineralnego w celu uniknięcia parowania.

Dane zbierano w trakcie ogrzewania płytki w temperaturach wskazanych przez 3 minuty, następnie chłodzono do temperatury 25°C przez minutę, oświetlano światłem UV i zbierano dane.

Figura 11 przedstawia wyniki testu mikropłytkowego wiązania MTX dla reduktazy dihydrofolianowej. Dane wykreślone są jako intensywność fluorescencji wobec temperatury.

Wartość Tm kontroli bez MTX wynosi 47.2°C (płytka M1). Wartość Tm dla DHFR związanej z MXT wynosi 56.4°C (płytka G6). Zatem AT_m dla wiązania MTX wynosi 9.2°C, K_d wynosi 24 nM.

Figura 12 przedstawia wyniki testu mikropłytkowego wiązania NADPH dla reduktazy dihydrofolianowej. Dane wykreślone są jako intensywność fluorescencji wobec temperatury. Wartość T_m kontroli bez NADPH wynosi 50.8°C (płytka G8). Wartość T_m dla DHFR związanej z NADPH wynosi 53.8°C (płytka B20). Zatem AT_m dla wiązania NADPH wynosi 3°C. K_d wynosi 0.7 pM.

PL 194 483 B1

T a b e l a 6.

Wartości ATm liganda skompleksowanego z DHFR. Wartości w nawiasach to odchylenia standardowe

białko	NADP	MTX	suma^a	NADP+M TX ^b	NADPH	MTX	suma^a	NADPH+ MTX^b)
DHFR (kurczak)	7.5 (±0.38)	10.1 (±0.32)	17.6	20.9 (±0.4)	11.9 (±0.32)	10.1 (±0.32)	22	23.8 (±0.4)
DHFR (krowa)	6.3 (±0.1)	7.7 (±0.3)	14	18.1 (±0.4)	9.7 (±0.2)	7.7 (±0.3)	17.4	24.6 (±0.6)

^a-wartość jest sumą indywidualnych ATm obserwowanych dla białka inkubowanego oddzielnie z każdym ligandem ^b- wartość pokazuje ATm obserwowanych gdy białko inkubowano łącznie z oboma ligandami

Przykład 9

Kwas dihydrofoliowy jest substratem reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Metotreksat jest analogiem kwasu foliowego, który wiąże się z DHFR. Jako dowód, że sposób według wynalazku jest rzetelny wykazano, że sposób można wykorzystać do wykrywania wiązania kwasu dihydrofoliowego do DHFR. Bydlęcą wątrobową DHFR mieszano z 80 związkami w celu określenia funkcji białka i wykryto wiązanie jedynie do MTX, a nie do innych związków.

Każda studzienka płytki #198104 zawierała jeden z 80 różnych związków w stężeniu 10 Mm w DMSO. Roztwór każdego związku przygotowano w buforze A (50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl) do końcowego stężenia 200 pM w oddzielnych studzienkach 384 studzienkowej polistyrenowej płytki. Po 5 pl roztworu zostało przeniesione następnie do płytki polistyrenowej firmy MJ Research zawierającej po 5 pl DHFR z bydlęcej wątroby (w stężeniu 0.5 mg/ml i Dapoxyl 12800 w stężeniu 200 pM, uzyskując stężenie końcowe 100 pM liganda, 0.25 mM/ml DHFR i 100 pM dapoxylu w objętości końcowej 10 pl w każdej studzience.

Każdą studzienkę pokryto 10 pl oleju mineralnego w celu uniknięcia parowania. Profile odfałdowania termicznego mierzono dla każdej studzienki w temperaturach od 25 do 70°C, zbierając dane dla każdej temperatury, w odstępach jednego stopnia. Dane zbierano w trakcie ogrzewania płytki w temperaturach wskazanych przez 3 minuty, a następnie chłodzono do temperatury 25°C przez minutę, oświetlano światłem UV i zbierano dane stosując kamerę CCD.

Dane zbierano dla czterech powtórzeń dla 80 związków w czterech kwadratach 384 studzienkowej płytki. Kwadraty pomiarowe składały się z: studzienek A2-H11 (1 kwadrat), studzienek A14-H23 (drugi kwadrat), studzienek I2-P11 (trzeci kwadrat) i studzienek I14-I23 (czwarty kwadrat). Kolumny 1, 12, 13 i 24 zawierały wzorce (DHFR i DMSO).

Studzienki F2, F14, N2 i N14 zawierały MTX. Wiązanie identyfikowano komputerowo (kolor czerwony). MTX przesunął wartość T_m o 5.13 +/- 0.19 stopnia (średnia dla czterech kwadratów), inne związki na płytce nie wykazały wpływu na krzywą (kolor studzienek prawie biały). Wyniki te wskazują że tylko MTX wiąże się z DHFR.

Wszystkie publikacje i patenty wymienione powyżej zostały włączone na zasadzie odniesienia literaturowego.

Wynalazek został opisany w pewnych szczegółach dla lepszego zrozumienia jego istoty, i jest jasne dla specjalistów, że możliwe są różne zmiany i modyfikacje w formie i szczegółach nie zmieniające zakresu wynalazku i dołączonych zastrzeżeń.

Claims

1. Sposób wyznaczania co najmniej jednej funkcji biologicznej docelowego białka, znamienny tym, że:

(a1) kontaktuje się docelowe białko z jedną lub więcej z wymienionych wielu różnych cząsteczek w każdym z wielu różnych pojemników,

PL 194 483 B1 (a2) traktuje się docelowe białko w każdym z wielu pojemników w celu spowodowania odfałdowania białka, (a3) mierzy się w każdym z pojemników fizyczne zmiany związane z odfałdowaniem docelowego białka, (a4) tworzy się krzywą odfałdowania docelowego białka dla każdego z pojemników, (a5) porównuje się każdą z krzywych odfałdowania z etapu (a4) z krzywą odfałdowania uzyskaną dla wymienionego białka w nieobecności wymienionych wielu różnych cząsteczek, oraz (a6) określa się, czy któraś z wielu różnych cząsteczek modyfikuje stabilność białka, przy czym o modyfikacji stabilności świadczy przesunięcie krzywej odfałdowania;

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelowe białko ulega odfałdowaniu na skutek zmiany termicznej i w etapie (a2) ogrzewa się je do utworzenia krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka w funkcji temperatury dla każdego z pojemników; i określa się co najmniej jedną funkcję biologiczną docelowego białka jeśli cząsteczki, które wywołują przesunięcie krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka, wywołują przesunięcie krzywych odfałdowania termicznego białek o tej samej funkcji biologicznej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie przeszukiwania (a) przeszukuje się wiele różnych cząsteczek z wymienionej drugiej listy.

4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że etap porównywania (a5) obejmuje uszeregowanie wymienionych cząsteczek z wielu różnych cząsteczek dla wiązania do docelowego białka, zgodnie ze zdolnością każdej z wielu różnych cząsteczek do przesuwania krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap ogrzewania (a2) wymienionych wielu pojemników polega na ich jednoczesnym ogrzewaniu.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etap (a4) obejmuje ponadto określenie temperatury punktu pośredniego (Tm) z krzywej odfałdowania termicznego, przy czym etap (a5) obejmuje ponadto porównanie wartości Tm każdej ze wspomnianych krzywych odfałdowania termicznego z etapu (a4) z (1) wartością Tm każdej z wymienionych innych krzywych odfałdowania termicznego i z (2) wartością Tm krzywej odfałdowania termicznego dla białka docelowego w nieobecności jakiejkolwiek z różnych cząsteczek.

7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etap (a3) obejmuje pomiar absorbcji światła przez zawartość każdego z pojemników.

8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (a1) kontaktuje się docelowe białko z cząsteczką sondy fluorescencyjnej obecnej w każdym z wielu pojemników, przy czym w etapie (a3):

(i) wzbudza się światłem wymienioną cząsteczkę sondy fluorescencyjnej w każdym z wielu pojemników; i (ii) mierzy się fluorescencję z każdego z pojemników.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (a3) (ii) dodatkowo mierzy się fluorescencję z każdego z pojemników, po jednym pojemniku na raz.

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (a3) (ii) dodatkowo mierzy się fluorescencję z podgrupy wymienionych wielu pojemników jednocześnie.

11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (a3) (ii) dodatkowo mierzy się fluorescencję z każdego z wymienionych wielu pojemników jednocześnie.

12. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (a3):

13. Sposób według zastrz. 2 albo 7, albo 8, albo 12, znamienny tym, że wspomnianych wiele pojemników w etapie (a1) obejmuje wiele studzienek w mikropłytce.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że prowadzi się go w urządzeniu obejmującym:

PL 194 483 B1 pierwszy przewodzący blok grzewczy w kontakcie z pierwszą wielością próbek umieszczonych w osobnych studzienkach płytki do mikromiareczkowania, przy czym każda z próbek zawiera docelowe białko i jeden lub więcej indywidualnych związków z biblioteki sond funkcjonalnych, kontroler temperatury sprzężony z pierwszym blokiem grzewczym, źródło światła umieszczone obok pierwszego przewodzącego bloku grzewczego, czujnik emisji fluorescencji umieszczony obok pierwszego przewodzącego bloku grzewczego, oraz urządzenie do przetwarzania sygnału emisji spektralnej uzyskanego z czujnika emisji fluorescencji, przy czym wielość indywidualnych związków z biblioteki sond funkcjonalnych stanowi wielość witamin, wielość koenzymów, wielość związków posiadających grupy funkcyjne reszt aminokwasowych lub ich analogów, wielość chelatorów metali, wielość jonów metali, wielość węglowodanów, wielość kwasów nukleinowych, wielość lipidów, wielość enzymów, wielość steroidów, wielość hormonów aminowych, wielość alkaloidów, wielość cząsteczek leków generycznych i wielość produktów naturalnych, oraz biblioteka sond funkcjonalnych zawiera wystarczającą różnorodność związków, by wyznaczyć co najmniej jedną funkcję biologiczną docelowego białka podczas badania wielości związków z biblioteki sond funkcjonalnych przy pomocy wymienionego urządzenia pod względem zdolności do przesunięcia krzywej odfałdowania termicznego docelowego białka w porównaniu z listą związków znanych jako modyfikujące stabilność grupy białek o tej samej funkcji biologicznej.