CN112553320A

CN112553320A - 一种第12907位点发生突变的msh6基因及其应用

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Publication number: CN112553320A
Application number: CN202011522706.6A
Authority: CN
Inventors: 黄志玲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112553320B

Abstract

本发明揭示了发生g.[12907inCAGC]突变的MSH6突变基因为HR的新的致病基因，MSH6突变基因的突变片段序列如SEQ ID NO：4所示。拥有SEQ ID NO：4所示序列的MSH6突变基因二倍体纯合基因型会导致人类低血磷性佝偻病的发生，拥有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：3所示序列中的任一个MSH6突变基因组成的二倍体杂合基因型也会导致人类低血磷性佝偻病的发生，且均呈常染色体隐性遗传。在此基础上，本发明提供了基于PCR捕获测序以及基于常规PCR和Sanger测序的两种突变检测试剂盒，这些对于HR的筛查、诊断、生育指导具有重要的意义，特别是有助于从源头上杜绝HR患儿的出生。此外，对于MSH6基因特定突变的揭示也有助于HR发病机制的探究以及治疗药物和方法的开发。

Description

一种第12907位点发生突变的MSH6基因及其应用

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种新的低血磷性佝偻病致病基因及其检测试剂盒。

背景技术

低血磷性佝偻病(Hypophosphatemic Rickets，HR)是抗维生素D性佝偻病的主要类型，由于HR患者肾小管对磷的回收能力减弱，将会出现低血磷及维生素D代谢障碍，轻则导致低磷酸盐血症，重则发展成佝偻病或骨软化病等，还会累及听力和牙齿等。儿童HR主要表现为生长发育迟缓、身材矮小、佝偻病、骨骼及牙齿畸形，骨质疏松，行走无力等；成人HR主要是造成软骨病和骨关节畸形。生化检查显示HR患者的血磷明显降低，碱性磷酸酶明显升高，X线检查下呈现佝偻病骨格。HR是一种单基因遗传病，之前发现的病例主要以X-性连锁显性遗传为主，目前比较明确的致病基因是X染色体上的PHEX突变基因，然而其具体的致病机制尚未被揭示。因此除临床体征和生化检查外，HR的鉴别诊断还需要结合明确的家族史及遗传分析。HR致畸、致残率高，会严重影响患者的身体健康，并会给家庭和社会造成沉重的负担。目前HR治疗以补充维生素D类似物和磷剂为主，然而治疗效果有限，因此对于HR归根结底还是应该遵循遗传学疾病以预防为主的原则，加强致病基因携带者筛查、生育指导和产前诊断，杜绝HR患儿的出生。因而揭示HR的致病基因对于HR的筛查、诊断、生育咨询、治疗药物和方法的开发具有重要的意义。

发明人前期收集6例家族性HR病例，对家系中的HR成员和相关正常成员进行了目标基因区域捕获测序，通过关联分析首次揭示了部分HR患者中存在着MSH6基因的特定突变(包括g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]共4种突变)；并通过突变片段扩增和Sanger测序以及家系遗传分析，在HR人群和非HR人群中证实了所发现的4种新的MSH6突变基因均为HR的致病基因，且均呈常染色体隐性遗传模式。MSH6基因编码蛋白属于错配修复蛋白，又称为G/T错配结合蛋白(G/T mismatch bindingprotein，GTBp)，具有参与DNA碱基错配修复的功能，能参与识别并结合到错配位点后启动修复，再在其它错配修复相关酶的作用下共同完成错配位点的修复过程，已有研究显示该基因可能在肿瘤的发生发展中发挥作用，然而尚无研究报道显示该基因与HR存在关联，也无该基因跟磷的体内吸收和代谢相关的研究报道。

发明内容

本发明提供了MSH6基因的4种致病突变基因形式，并在此基础上提供了MSH6突变基因的检测试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的目的(1)在于提供4种MSH6突变基因形式，这4种突变基因分别是由野生型MSH6基因发生g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变而形成的，NCBI登录号NC_000002.12所示序列中的第47783145-47806954范围内的序列即为MSH6野生型基因参考序列，则这4种MSH6突变基因的突变片段序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示，其余序列参见MSH6野生型基因参考序列。拥有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示序列中的任一MSH6突变基因的二倍体纯合基因型以及SEQID NO：1-SEQ ID NO：4所示序列中的任两个MSH6突变基因组成的二倍体杂合基因型这两种类型中的任一种均会导致人类低血磷性佝偻病的发生，且所述的4种MSH6致病突变基因均呈常染色体隐性遗传。

本发明的目的(2)在于提供一种可以同时检测MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变的PCR捕获测序试剂盒，试剂盒包含如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：32所示序列的PCR捕获引物组；采用二代DNA测序解析PCR捕获测序产物以获取突变信息。

本发明的目的(3)在于提供一种扩增检测MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变的PCR试剂盒，试剂盒包含如SEQID NO：33-SEQ ID NO：36所示序列的PCR引物对；采用如SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：34所示序列引物对扩增MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]和g.[7957inAA]突变片段；采用如SEQID NO：35-SEQ ID NO：36所示序列引物对扩增MSH6基因的g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变片段；PCR扩增产物可直接通过Sanger测序进行序列解析。

本发明揭示的MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]突变、g.[7957inAA]突变、g.[12759inTTAAG]突变和g.[12907inCAGC]突变及其检测试剂盒将有助于HR的筛查、诊断和生育咨询，特别是有助于从源头上杜绝HR患儿的出生；此外，对于MSH6基因特定突变的揭示也有助于HR发病机制的探究以及治疗药物和方法的开发。

附图说明

图1是#1家系图谱，图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，II1和II2之间的双横线代表近亲结婚，黑色填充表示HR患者，字母AA、Aa、aa表示基因型，其中A代表野生型MSH6基因，a代表发生g.[7785-7788delGTGA]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体，+代表杂合子，-代表野生型MSH6基因纯合子，箭头指向成员为HR先证者。

图2是#2家系图谱，图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，黑色填充表示HR患者，字母Ac、bb、bc、Ab表示基因型，其中A代表野生型MSH6基因，b代表发生g.[7957inAA]突变的MSH6突变基因，c代表发生g.[12759inTTAAG]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体，+代表杂合子。

图3是#3家系图谱，图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，I1和I2之间的双横线代表近亲结婚，黑色填充表示HR患者，字母bb表示基因型，b代表发生g.[7957inAA]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体。

图4是#4家系图谱，图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，黑色填充表示HR患者，字母Ac、cc表示基因型，其中A代表野生型MSH6基因，c代表发生g.[12759inTTAAG]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体，+代表杂合子。

图5是#5家系图谱，图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，黑色填充表示HR患者，字母Ab、Ad、bd、dd表示基因型，其中A代表野生型MSH6基因，b代表发生g.[7957inAA]突变的MSH6突变基因，d代表发生g.[12907inCAGC]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体，+代表杂合子。

图6是#6家系图谱，图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，黑色填充表示HR患者，字母AA、dd、cc、Ad、cd、Ac表示基因型，其中A代表野生型MSH6基因，c代表发生g.[12759inTTAAG]突变的MSH6突变基因，d代表发生g.[12907inCAGC]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体，+代表杂合子，-代表野生型MSH6基因纯合子。

图7为MSH6突变基因上g.[7785-7788delGTGA]突变的Sanger测序局部图谱，箭头所示为突变起始处，横线处为发生缺失的GTGA这4个核苷酸。

图8为实施例4中#7家系图。图中方框代表男性，圆圈代表女性，罗马字母和数字组合如I1代表家系成员，黑色填充表示HR患者，字母Ad、Ac、cd表示基因型，其中A代表野生型MSH6基因，c代表发生g.[12759inTTAAG]突变的MSH6突变基因，d代表发生g.[12907inCAGC]突变的MSH6突变基因，++代表MSH6突变基因二倍体，+代表杂合子，问号表示二胎II2患病情况待定。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

发明人前期在一个结直肠癌患者癌灶石蜡样本的全外显子组测序数据中发现了多种MSH6基因突变，同时该结直肠患者为HR患者，且家系中也存在HR患者，深入测序分析发现该家系HR成员中均含有特定的MSH6基因突变，进一步的采用捕获测序结合家系遗传分析在6个HR家系中首次揭示了4种特定MSH6突变基因为HR的致病基因，并在群体样本中进行验证。

实施例1发现特定MSH6突变基因为HR的致病基因

图1为最早检出MSH6基因突变的HR家系(家系#1)，II1和II2为近亲婚配(II1为独子且父母已亡故)。其中III1和III2兄妹俩均呈现身体矮小和佝偻病症状，并有低磷血症和尿磷增高等特点，经临床确诊为HR。除HR外，III1(先证者，用箭头标识)在2018年24岁时被确诊为结直肠癌III期，行手术切除癌灶，然而术后半年即出现复发。家族史调查得知#1家系中的III1和III2均为HR患者，且III1又被确诊为结直肠癌，具备一定的致病遗传指征和倾向。为了指导结直肠癌患者III1的后续治疗以及分析潜在的遗传致病因素和评估家族内再生育HR患儿的风险(主要是指II2的儿子III1和女儿III2的婚育以及II2的妹妹II3的再生育)，在患者家庭知情同意的情况下首先采集II1、II2、III1和III2的血液样本和III1的术后癌灶石蜡组织样本(1cm×1cm的病理FFPE切片10片)，送上海吉凯基因有限公司进行全外显子组测序分析。基本流程为：采用德国Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit和QIAamp DNA FFPE Tissue Kit分别从血液和石蜡样本中提取基因组DNA，利用美国罗氏公司的SeqCap EZ Exome Kit V3试剂盒进行全外显子组捕获，并在HiSeq 4000二代测序仪(美国Illumina公司)上进行测序，对比人类参考基因组hg19获取基因突变信息。要求血液样本的测序深度>50×，石蜡样本的测序深度>250×。

最终测序结果显示目标捕获区域的覆盖度>99.5％，血液样本平均测序深度为64×，石蜡切片样本的平均测序深度为281×。对于III1，以其血液样本测出的基因组DNA信息(即其自身的基因组)和人类参考基因组hg19为参照，分析其手术切除癌灶样本DNA测序信息，结果发现了十几种主要基因突变(突变比例>1％)，其中包括了MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]突变，该基因突变也同时存在于其基因组DNA中(血液样本同时测出了野生型MSH6基因和g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因且这两者约各占50％，实质上两者互为等位基因)。综合II1、II2和III2经血液样本测得的基因组结果发现，MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]突变也存在于这三者的基因组中，有所区别的是III1和III2均只检出g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因，而II1和II2均同时检出野生型MSH6基因和g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因(且野生型和突变型基因约各占50％)。所有全外显子组捕获测序检出MSH6基因g.[7785-7788delGTGA]突变的样本，均进行Sanger测序以验证g.[7785-7788delGTGA]突变的检测结果。除和III1共有的g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因之外，II1、II2和III2基因组并未测出其它显著突变，即g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因存在于该HR家庭两代所有成员中，因此推测g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因为HR的致病基因，进一步检测该基因在家系#1中的分布情况。

收集家系#1的I1、I2、II3、II4和III3成员的血液样本，检测MSH6基因的突变情况。为了节约费用，进一步检测采用的是针对MSH6基因的PCR捕获测序。NCBI登录号NC_000002.12的DNA片段中第47783145-47806954范围内的序列(第47783145位点为MSH6基因的第1位点，含起点和终点共23810bp)为人MSH6基因参考序列(截止2020.11.1信息)，在此基础上结合家系#1成员前期全外显子组测序结果，设计表1所示的PCR捕获探针以对MSH6基因进行基于多重PCR的捕获测序分析。表1所示PCR捕获引物组捕获的MSH6基因目标区域不仅限于发生所述4种突变的区域，而是涵盖了MSH6基因的所有外显子区域以及外显子和内含子的交界区，以利于能够充分发现MSH6基因的其它突变。多重PCR扩增体系(美国Lifetech公司试剂，参照说明书体系方法操作)和条件如表2所示，多重PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行二代测序分析，所测出的突变均需进行Sanger测序验证(g.[7785-7788delGTGA]突变位点处的Sanger测序图谱参见图7)。家系#1中各成员MSH6基因突变情况如表3所示。

表1 MSH6基因的PCR捕获测序引物组

扩增子编号	引物上游序列(5’-3’)	上游序列标识	引物下游序列(5’-3’)	下游序列标识
					Amplicon1	AGATTTCCCGCCAGCAGGAG	SEQ ID NO：5	CTGCACTCATTCAAGCCAACTC	SEQ ID NO：6
Amplicon2	CTTTTGGAGGGAGGAGACGC	SEQ ID NO：7	CTACCTACCGAAGGACCCAG	SEQ ID NO：8
					Amplicon3	TGTAGGTAACTGCCTTTAAGGA	SEQ ID NO：9	GTCTGCCTGTCTGTCTGTTTC	SEQ ID NO：10
Amplicon4	CTTGAACTGCTGGGATTACAG	SEQ ID NO：11	CAGGGAACTACAGAAGTATGC	SEQ ID NO：12
					Amplicon5	AGTTGAACTGTCTTACATTATGG	SEQ ID NO：13	CTAACGTGGGCTTGGGATTCA	SEQ ID NO：14
Amplicon6	TGGAGGTGGTGATGACAGTAG	SEQ ID NO：15	TTCTCAGAGGGATCACCTTCCA	SEQ ID NO：16
					Amplicon7	CTACAGTAAGTATCTTCTTAGCC	SEQ ID NO：17	GACTGTGTCAGAATCCAAGGGA	SEQ ID NO：18
Amplicon8	AGCACTACAAGATCTGGTGCTA	SEQ ID NO：19	ATCAGGAAAACGACCTTCAGGA	SEQ ID NO：20
					Amplicon9	TTGACTGTAGAATTGAACCGATG	SEQ ID NO：21	ACAAGCTTGTTCAAAGTCTTACC	SEQ ID NO：22
Amplicon10	ATGAAGCCTCACTTTTACCCTC	SEQ ID NO：23	ACTGTGTTTGGAAAATGATCACC	SEQ ID NO：24
					Amplicon11	GACCTTTTCCTCCCTCATTCAC	SEQ ID NO：25	AATTATTGGCCGGGCACGGTT	SEQ ID NO：26
Amplicon12	GCTCATGATAGCTATATAACCTA	SEQ ID NO：27	TCCAACTATCGGTCTGTGCCA	SEQ ID NO：28
					Amplicon13	CTTTAACAGGAAGAGGTACTGC	SEQ ID NO：29	GTTAGTTAGTTACCGAAATAATCG	SEQ ID NO：30
Amplicon14	CTAACTGACCTTAAGTTTCAAAG	SEQ ID NO：31	CCACCTTTGTCAGAAGTCAAC	SEQ ID NO：32

表2 PCR捕获扩增体系和条件

表3家系#1中各成员MSH6基因突变情况

由表3可知，在#1家系中只在含有MSH6纯合突变基因(g.[7785-7788delGTGA]突变)才致病(III1和III2)，同时携带MSH6突变基因和野生型MSH6基因并不致病(I1、II1、II2、II3和III3)，只含野生型MSH6基因也不致病(I2和II4)，并且致病突变基因均是由父母遗传给子女，符合常染色体隐性遗传模式(和性别无关，且MSH6基因位于2号常染色体上)，即MSH6突变基因为隐性致病基因且MSH6突变基因和MSH6野生型基因互为等位基因。假设MSH6野生型基因为A，MSH6突变基因为a，则根据基因检测结果，家系#1中各成员的基因型如图1和表3所示。由图1家系的基因传递规律可直观看出其为典型的常染色体隐性遗传，表型和基因型是一致的即基因型决定表型，并且表型是随基因型共分离的。综上可知，g.[7785-7788delGTGA]型MSH6突变基因为HR的一种新的常染色体隐性致病基因(未见报道)。在此基础上，进一步收集HR家系进行验证。

实施例2扩大家系验证

进一步收集了5个HR家系(编号#2-#6)，满足家系中有2个以上的HR成员，且家系图显示具备常染色体隐性遗传的可能性。按照实施例1中的PCR捕获测序方法(表1和表2)对家系中HR患者和相关成员的血液样本进行MSH6基因突变检测，结果如表4所示(为了方便汇总分析，将实施例1中的家系#1结果也列入)。

表4 6个HR家系MSH6基因突变情况

从家系#2-#6的MSH6基因检测中又发现了3种新的突变类型，分别是g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC](经Sanger测序验证)，分析发现这3种MSH6突变基因均是HR的致病基因(参见表4和图2-图6)。结合实施例1的家系#1标识，野生型MSH6基因用A标识，g.[7785-7788delGTGA]突变型MSH6基因用a标识，再分别用字母b、c和d标识g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变型MSH6基因，野生型MSH6基因以及g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]这4种突变型MSH6基因之间互为等位基因。具体分析如下：

对于家系#2，HR患者II1同时检出MSH6基因的g.[7957inAA]和g.[12759inTTAAG]突变，属于复合杂合突变基因型(bc)，分别遗传自其父亲I1(MSH6基因的g.[12759inTTAAG]突变，基因型Ac)和母亲II2(MSH6基因的g.[7957inAA]突变，基因型bb)，其母亲II2为纯合突变基因型(bb)，也是HR患者。因此家系#2的HR符合基因型决定表型，且表型随基因型实现了共分离，HR致病基因的遗传模式为常染色体隐性遗传。由此可知，g.[7957inAA]和g.[12759inTTAAG]突变型MSH6基因均为HR的常染色体隐性致病基因。

家系#3同家系#2分析类似，家系#3中I1和I2为近亲结婚，I1、I2和II1均检测出含有MSH6基因的g.[7957inAA]突变，这3者均为纯合突变基因型(基因型bb)，HR患者II1的父亲I1和母亲I2均各自将致病基因突变遗传给II1导致其致病。因此家系#3的HR符合基因型决定表型，且表型随基因型实现了共分离，HR致病基因的遗传模式为常染色体隐性遗传。由此可知，g.[7957inAA]突变型MSH6基因为HR的常染色体隐性致病基因。

家系#4同家系#2分析类似，HR患者II1和II2均检出MSH6基因的g.[12759inTTAAG]纯合突变(基因型cc)，致病基因突变分别遗传自其父亲(基因型Ac)和母亲(基因型Ac)。因此家系#4的HR符合基因型决定表型，且表型随基因型实现了共分离，HR致病基因的遗传模式为常染色体隐性遗传。由此可知，g.[12759inTTAAG]突变型MSH6基因为HR的常染色体隐性致病基因。

家系#5同家系#2分析类似，HR患者II1和II2均同时检出MSH6基因的g.[7957inAA]和g.[12907inCAGC]突变，属于复合杂合突变基因型(bd)，分别遗传自其父亲I1(MSH6基因的g.[12907inCAGC]突变，基因型dd)和母亲II2(MSH6基因的g.[7957inAA]突变，基因型Ab)，其父亲I1为纯合突变基因型(dd)，也是HR患者。因此家系#5的HR符合基因型决定表型，且表型随基因型实现了共分离，HR致病基因的遗传模式为常染色体隐性遗传。由此可知，g.[7957inAA]和g.[12907inCAGC]突变型MSH6基因均为HR的致病基因。

家系#6同家系#2分析类似，HR患者III1检出同时含有MSH6基因的g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变，属于复合杂合突变基因型(cd)，分别遗传自其母亲II1(MSH6基因的g.[12759inTTAAG]突变，基因型cc，HR患者)和父亲II2(MSH6基因的g.[12907inCAGC]突变，基因型Ad)；进一步的，III1父亲II2的致病基因突变(MSH6基因的g.[12907inCAGC]突变)则是遗传自I2(基因型dd，HR患者)。因此家系#6的HR符合基因型决定表型，且表型随基因型实现了共分离，HR致病基因的遗传模式为常染色体隐性遗传。由此可知，g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变型MSH6基因均为HR的致病基因。

通过靶向MSH6基因的PCR捕获测序发现了3种新的突变即g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变，可以对家系#2-#6的HR进行遗传解析。为了严密起见，选择这5个家系中的所有HR患者进行全外显子组测序验证，结果发现突变基因的类型和比例同PCR捕获测序的结果是一致的。以家系#2的HR患者II1为例，全外显子组测序也只发现了MSH6基因的g.[7957inAA]和g.[12759inTTAAG]突变(除此之外未发现其它明显的基因突变)，且这两者约各占50％，这和针对MSH6基因的PCR捕获测序的结果一致。由此进一步确证了特定突变类型的MSH6基因为HR的致病基因。

综上可知，发生g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变的MSH6突变基因均为HR的致病基因，任一纯合突变或任一复合杂合突变基因型均可导致HR的发生，且均呈常染色体隐性遗传。查阅文献发现，MSH6基因编码错配修复蛋白，具有参与DNA碱基错配修复的功能，能参与识别并结合到错配位点后启动修复，再在其它错配修复相关酶的作用下共同完成错配位点的修复过程。已有研究显示MSH6基因可能在肿瘤的发生发展中发挥作用，然而尚无研究报道显示该基因与HR存在关联，也无该基因跟磷的体内吸收和代谢相关的研究报道。值得注意的是，在发明人收集的含有MSH6基因突变的HR家系及群体中，肿瘤的整体发病率明显高于正常群体的平均水平。

实施例3 HR群体样本验证

在实施例1和2的基础上，进一步的在HR群体中检测MSH6基因突变情况。收集了临床确诊的HR患者27例(编号S1-S27)，男性患者16例女性患者11例，年龄26.3岁(4岁-57岁)。按照实施例1中的PCR捕获测序方法(表1和表2)在这些HR患者充分知情同意的情况下，采集其血液样本(外周静脉抗凝血2ml)进行MSH6基因突变检测，结果如表5所示。其中，只有S1-S17的HR患者检出含有MSH6基因的特定突变，而S18-S27的HR患者均未检出含有任何MSH6基因突变，表明还存在其它已知或未知的基因突变能够导致HR的发生(如X染色体上的PHEX突变基因)。在S1-S17的HR患者中只检出MSH6基因的g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]突变，未检出MSH6基因其它位点的突变。其中，5个HR患者含有3种MSH6基因的纯合突变(S1，S9，S13-S15),涉及的基因型包括aa、bb和cc；余下12个HR患者含有所有6种MSH6基因的复合杂合突变组合，涉及的基因型包括ab、ac、ad、bc、bd和cd，具体参见表5。

表5 HR患者群体MSH6基因突变情况

注：表5中的+号表示检出对应的突变，空或—表示未检出突变。

针对表5中S1-S17的HR患者检出的4种MSH6基因特定突变，设计PCR引物扩增突变基因片段，扩增引物和条件如表6所示(扩增体系参照常规PCR体系)，其中g.[7785-7788delGTGA]突变和g.[7957inAA]突变位于同一外显子内，g.[12759inTTAAG]突变和g.[12907inCAGC]突变同位于另一外显子内，因此采用同一引物对扩增g.[7785-7788delGTGA]突变和g.[7957inAA]突变所在片段，采用另一引物对扩增g.[12759inTTAAG]突变和g.[12907inCAGC]突变所在片段。突变基因片段的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，送上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序验证。(实施例1和实施例2中涉及到的对全外显子组捕获测序和PCR捕获测序检出突变结果的Sanger测序验证，其PCR扩增和检测方法同此处)。同时收集250例正常人群(非HR患者)血液样本做为参照，在其充分知情同意的情况下采集2ml外周静脉抗凝血，采用表6所示的PCR体系和条件进行MSH6特定基因片段的扩增和Sanger测序。Sanger测序结果显示，S1-S17的HR患者检出的MSH6基因4种特定突变和PCR捕获测序测序结果完全一致(包括突变类型和比例均完全一致，表5)，而在250例正常人群中均未发现MSH6基因的4种特定突变。由此可知，MSH6基因的4种特定突变只存在于HR患者及其相关家系成员中，而不存在于非HR的正常人群中。

表6 PCR引物和扩增条件

实施例4特定MSH6突变基因的应用

如图8所示家庭(家系#7)，夫妻双方均为正常人员，已生育一个HR患儿，现拟再生育，进行生育遗传咨询。采集夫妻双方和HR患儿血液样本进行全外显子组捕获测序，发现父亲I1存在MSH6基因的g.[12907inCAGC]突变(杂合子，基因型为Ad)，而母亲I2存在MSH6基因的g.[12759inTTAAG]突变(杂合子，基因型为Ac)，而HR患儿II1同时存在MSH6基因的g.[12759inTTAAG]突变和g.[12907inCAGC]突变(复合杂合突变，基因型为cd)，可知这两种MSH6基因突变分别遗传自其母亲和父亲；除MSH6基因这2种特定突变外，未在该家系成员中检出其它明显的基因突变。该家系符合基因型决定表型且表型随基因型实现了共分离，结合实施例1-3结果可知该MSH6突变基因为HR的致病基因，且呈常染色体隐性遗传。

根据基因分离和自由组合定律，可知该夫妻再生育HR患儿的概率为1/4(基因型cd)，生育携带者的概率为1/2(基因型为Ac或Ad，不表现HR表型)，生育健康者的概率为1/4(基因型为AA)。因此夫妻决定再次生育，在母亲二胎孕14周时采集其外周血(10ml)，提取细胞外游离DNA(德国QIAgen公司试剂盒)，参照实施例1采用全外显子组捕获测序检测，结果未发现MSH6基因的任何突变(只检出野生型MSH6基因)，因此继续妊娠至活产，最终活检一女婴。采集婴儿足跟血，采用PCR捕获测序方法(参照实施例1)检测该女婴MSH6基因突变情况，结果未检出任何MSH6基因突变。随访观察至约2岁未发现HR症状。由此可知MSH6基因做为新揭示的HR致病基因，对于HR的筛查、诊断以及HR家庭的生育指导具有重大的意义。

综上所述，本发明揭示的发生g.[7785-7788delGTGA]、g.[7957inAA]、g.[12759inTTAAG]和g.[12907inCAGC]这4种特定突变的MSH6突变基因均为HR的新的致病基因，其中任意一种纯合突变基因型或任意一种复合杂合突变基因型均会导致HR的发生，且均呈常染色体隐性遗传；在此基础上，提供了基于PCR捕获测序以及基于常规PCR和Sanger测序的两种突变检测试剂盒，这些对于HR的筛查、诊断、生育指导具有重要的意义，特别是有助于从源头上杜绝HR患儿的出生。此外，对于MSH6基因特定突变的揭示也有助于HR发病机制的探究以及治疗药物和方法的开发。

序列表

<110> 黄志玲

<120> 一种第12907位点发生突变的MSH6基因及其应用

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

taactaagtt atgtatttcc ttttggcaac agttcttctc accaggagat ttggtttggg 60

ccaagatgga gggttacccc tggtggcctt gtctggttta caaccacccc tttgatggaa 120

cattcatccg cgagaaaggg aaatcagtcc gtgttcatgt acagtttttt gatgacagcc 180

caacaagggg ctgggttagc aaaaggcttt taaagccata tacaggtaag agtcactact 240

gcca 244

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

taactaagtt atgtatttcc ttttggcaac agttgtgact tctcaccagg agatttggtt 60

tgggccaaga tggagggtta cccctggtgg ccttgtctgg tttacaacca cccctttgat 120

ggaacattca tccgcgagaa agggaaatca gtccgtgttc atgtacagtt ttttgatgac 180

agcccaacaa ggggctgggt tagcaaaaaa ggcttttaaa gccatataca ggtaagagtc 240

actactgcca 250

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

attacaggcg tgagcctctg cacccggccc ttattgttta taaatacatt tctttctagg 60

ttcaaaattt aagcaaagga agcccagaag ggaggtcatt tttacagtgc aaagcctgaa 120

atactgagag caatgcaacg tgcagatgaa gccttaaata aagacaagat taagaggctt 180

gaattggcag tttgtgatga gccctcagag ccagaagagg aagaagagat ggaggtggga 240

cacggcaagc attcagttgt tatttat 267

<210> 4

<211> 266

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

attacaggcg tgagcctctg cacccggccc ttattgttta taaatacatt tctttctagg 60

ttcaaaatca aaggaagccc agaagggagg tcatttttac agtgcaaagc ctgaaatact 120

gagagcaatg caacgtgcag atgaagcctt aaataaagac aagattaaga ggcttgaatt 180

ggcagtttgt gatgagccct cagagccaga agaggaacag cgaagagatg gaggtgggac 240

acggcaagca ttcagttgtt atttat 266

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

agatttcccg ccagcaggag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

ctgcactcat tcaagccaac tc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

cttttggagg gaggagacgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

ctacctaccg aaggacccag 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

tgtaggtaac tgcctttaag ga 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

gtctgcctgt ctgtctgttt c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

cttgaactgc tgggattaca g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

cagggaacta cagaagtatg c 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

agttgaactg tcttacatta tgg 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

ctaacgtggg cttgggattc a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

tggaggtggt gatgacagta g 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

ttctcagagg gatcaccttc ca 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

ctacagtaag tatcttctta gcc 23

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

gactgtgtca gaatccaagg ga 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

agcactacaa gatctggtgc ta 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

atcaggaaaa cgaccttcag ga 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 21

ttgactgtag aattgaaccg atg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

acaagcttgt tcaaagtctt acc 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

atgaagcctc acttttaccc tc 22

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 24

actgtgtttg gaaaatgatc acc 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

gaccttttcc tccctcattc ac 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

aattattggc cgggcacggt t 21

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

gctcatgata gctatataac cta 23

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 28

tccaactatc ggtctgtgcc a 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 29

ctttaacagg aagaggtact gc 22

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 30

gttagttagt taccgaaata atcg 24

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 31

ctaactgacc ttaagtttca aag 23

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 32

ccacctttgt cagaagtcaa c 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 33

taactaagtt atgtatttcc 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 34

tggcagtagt gactctta 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

attacaggcg tgagcctc 18

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

ataaataaca actgaatgct t 21

Claims

1.一种MSH6突变基因，其特征在于所述MSH6突变基因为低血磷性佝偻病的致病基因，该MSH6突变基因的突变片段序列如SEQ ID NO：4所示，它是由野生型MSH6基因发生g.[12907inCAGC]突变而形成的；拥有SEQ ID NO：4所示序列的MSH6突变基因二倍体纯合基因型会导致人类低血磷性佝偻病的发生，拥有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示序列中的任一个MSH6突变基因组成的二倍体杂合基因型也会导致人类低血磷性佝偻病的发生，且均呈常染色体隐性遗传。

2.如权利要求1中所述的低血磷性佝偻病致病基因的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：32所示序列的PCR捕获引物组，该试剂盒是PCR捕获测序试剂盒，需要采用二代DNA测序解析PCR捕获测序产物以获取突变信息。

3.如权利要求1中所述的低血磷性佝偻病致病基因的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含如SEQ ID NO：35-SEQ ID NO：36所示序列的PCR引物对；采用如SEQ ID NO：35-SEQID NO：36所示序列引物对扩增MSH6基因的g.[12907inCAGC]突变片段；PCR扩增产物可直接通过Sanger测序进行序列解析。