JPH08511510A

JPH08511510A - 毛胞に有益な配合物を送達する方法

Info

Publication number: JPH08511510A
Application number: JP6522428A
Authority: JP
Inventors: リンニャナリ; ヴァレリイケイ．リシュコ
Original assignee: アンティキャンサーインコーポレーテド
Priority date: 1993-04-02
Filing date: 1994-04-01
Publication date: 1996-12-03
Anticipated expiration: 2014-09-20
Also published as: US5965157A; EP0692972A4; DE69429337T3; JP2950520B2; ATE209887T1; EP0692972A1; CA2159626C; DE69429337D1; US5753263A; EP0692972B2; DE69429337T2; WO1994022468A1; AU6554594A; US6224901B1; US6261596B1; CA2159626A1; US5914126A; EP0692972B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、毛髪の胞細胞に有益な配合物、例えば、染髪料、メラニン、蛋白質、遺伝質療法のための核酸などの、目標を定めた特定の送達法を提示する。特に望ましい方法は、毛髪の色または状態を改良するために、染髪料、メラニンまたはチロジンを、リポソーム中に該化合物を包みこむか、またはリポソーム中に蛋白質を発現できる核酸を包みこむことによって、毛胞に送達する方法を提示する。またこれらの方法を実施するために必要なリポソームの配合物も提示される。

Description

【発明の詳細な説明】毛胞に有益な配合物を送達する方法発明の分野この発明は毛胞からの毛髪の成長を改善するために毛胞に特に治療用またはその他の有益な配合物を送達するための方法に関するものである。発明の背景毛髪の成長、色および外観、特に人間における脱毛症の治療用に直接効果を持つ方法は、長い間その発見が望まれてきたものである。生育力のある毛胞を持つ皮膚の小片を、外科的に不活性な毛胞を持つ領域に移植することは、高価につき、労力を要し、比較的短期間しか有効でない。また、米国特許4,919,664でR.F.Oliverらが示したように胞状皮膚細胞は皮膚切開に挿入可能であり、その結果切開に沿って毛髪が成長する。しかしながら、これは複雑な技術であるうえに、既存の毛胞には何らの効果も持たない。生物学的に活性な要素を含むクリームやローションで毛髪や皮膚を処理し、これによって毛髪の成長と状態を改善する方法は一般的に効率が良くない。毛髪に対して外部的に塗布して本体、柔軟性、カールなどを改善する様々な物質もある。これらの効果は限定されており、短期間しか有効でない。様々な染料で毛髪を染める場合、頻繁に繰り返して実施する必要があり、また、多くの場合、不自然に見える。毛髪の成長を刺激し、または他の毛髪の特徴、例えば色に望ましい変化をもたらす生物学的に活性な化合物の使用は、より自然であり、魅力的な手法である。特に、毛髪の胞細胞がまだ存在しているにもかかわらず、未知の理由によって毛髪の成長が阻止されているような場合に、望ましい手法である。しかし、この手法は従来、効を奏していなかったが、その理由は多分、刺激物が毛髪の胞細胞の細胞膜を浸透してその活動が要求される細胞内部に侵入することができなかったからである。皮膚の処理を吸収可能なローションやその類のもので行なう場合、胞密度の高い皮膚部分において吸収が良く行なわれることが長いあいだ知られていた。例えば、Maigach et al.,Arch.Environ,Health,23:208-211(1971)を参照。しかしながら、吸収された物質はリポソームとは全く異なるものである。本発明以前においては、リポソームが持つ有益な配合物を毛胞に選択的に送達する方法としての能力は利用されていなかった。リポソームとは大工的なリン脂質分泌小胞で、多様な低分子量の水溶性および油溶性化合物を多様な細胞に送達するために使用されて成功してきた。例えば G.Gregoriadis,Trends in Biotechnology,3:235-241(1985)およびK.H.シュミット、ed.,Liposomeses drug carriers,Stuttgart:George Thieme Verlag(1986)参照。リポソームは、乾燥したリン脂質を水溶液と混ぜ合わせ、リン脂質分子の２分子層を発生させると、それが自然に密集した多層球状体を形成するという過程を経て作られる。その生成の過程においてリポソームは液体と、それに可溶なそこに存在する任意の溶質を内部に閉じこめるリポソームの生成の邪魔にならないものであるかぎり、可溶性、荷電状態、大きさ、およびその他の構造的特性に関係なく広範囲の物質をこの手法で利用することが可能である。ただし、これらの特性は、ある種の環境下においては、リポソームの用途を限定することもある。特定の目標に対して付加された抗体分子を含んでいるリポソームは、付加された抗体に対して免疫反応性の抗原を含む目標の細胞に内包された物質を送達する手段として提示されてきており、免疫リポソームと呼ばれている。例えば、米国特許4,755,388、4,925,661および4,957,735は免疫リポソームの提示を行なっている。さらに蛋白質を含むリポソーム配合物がほ乳類動物の皮膚に投与された場合、皮膚のケラチン合成細胞に侵入することが示されている。米国特許5,190, 762参照。さらにDNA-リポソーム配合物も提示されたが、局所投与によって毛胞に核酸を選択的に送達することは示されていなかった。米国特許5,077,211および5,223,263およびHoffman et al.,FEBS Letts.,93:365_-368(1978)参照。リポソームを使用して送達の特定化を増強するために様々な標的メカニズムが試みられたが、内包された物質の目標とされた細胞または組織への送達は必ずしも達成できない。送達すべき薬剤が、その薬剤を投与したとき、目標の組織と隣り合う組織に有害作用を及ぼす可能性があるときは、特に特定の組織への投与が重要になる。例えば、ある薬剤は毛胞においては許される効果を生じるが、隣り合う皮膚の組織には望ましくない効果を生む可能性もあり得る。例えばメラニンの送達は毛髪の色素沈着は望ましいが一般的には皮膚の色素沈着は望ましくなく、したがって皮膚全般にわたる送達は望ましくなく、胞細胞の特定化が要求される。同様にメラニンまたはチロナーゼを発現する遺伝子組み換え治療は皮膚の場合望ましくないが、毛髪の色素沈着には望ましい結果である。経皮性薬剤送達は、薬剤が真皮細胞でなく、循環系統に乗せることを目的としている場合には、もう一つの問題が生じる。特定の場合には、皮膚の細胞への薬剤の吸収を最小に留め、なるべく血液循環に乗る量を多くすることができる経皮薬剤送達方法が望ましい。一方、薬剤の送達が毛胞に限定されることが望まれる場合は、投与された薬剤が望ましくない効果を生じるおそれのある循環系統に入ったり、皮膚に吸着することは最小に留める必要がある。小分子量染料であるカルボキシフルオレセインをハムスターの鼓膜の毛胞脂腺に送達することは、LiebらがThe Journal of Investigative Dermatology,99: 108-113(1992)にごく最近述べた方法に基づき特定のリポソーム組成にそれを組み込むことによって可能である。同様にLiらはIn Vitro Cell.Dev.Biol.28A:679 -681(1992)に試験管内での皮膚組織培養システムにおいてリポソームを媒体とする小分子量染料カルセイン捨毛胞に対する送達について述べている。しかしながら、従来の研究は、大型の薬剤、例えば蛋白質や核酸、脂質の障壁を越えて移動できない嫌油性薬剤または毛胞以外の組織に望ましくない副作用を及ぼす可能性を持つ親油性薬剤などを特定的に、また選択的（優先的）に毛胞に送達する方法については述べていない。さらに特定の配合物が毛胞細胞に送達された度合、送達されて配合物の有効性、または毛胞への選択的な送達を最適化するリポソームの処方については、試験管内で正確に試験する方法については従来なんらの記述もなかった。したがって、毛胞に対して有益な化合物を選択的に送達し、かつ、その送達の有効性を測定するさらに良い方法の必要性は依然として存在する。発明の概要リポソームが有益な化合物を毛胞に選択的に送達する能力を持つことが発見された。基本的に、本発明は、有益な化合物をリポソームの生成中に、またはその後に組み込むことによるリポソームの準備方法と、そのリポソームをそのような有益物質で処理する必要性を持つ皮膚の部分に適用する方法を提示するものである。この方法によると、リポソームは有益化合物を毛胞に優先的に送達し、その結果、有益化合物は胞細胞内に入る。リポソームを媒体とする送達方法の選択性のお陰で、投与された化合物は真皮内部の循環系統に多く送達されることはなく、したがって、投与された化合物が真皮組織や循環系統に望ましくない効果を及ぼす可能性を最小に留めることができる。典型的な場合、この方法は、この方法による処理を必要とするほ乳動物、例えば人間の皮膚に適用される。すなわち、この方法は生体内で実施可能である。本発明の毛胞特定処理方法の有効性を確定するため、斬新な組織培養手法を使って特定なリポソーム薬剤を試験管内で試験する方法が開発された。上述のように、多数の化合物、例えば染料などは、皮膚に適用された場合、重度に胞状化した領域により迅速に吸収されることが知られている。ところが巨大分子または嫌油性物質はプラズマ膜やその他の脂質障壁を越えて小胞および胞細胞の中に入ることができない。一方、それらの巨大分子化合物はリポソーム内に組み込まれた場合、循環系統や、近辺の皮膚組織に入ることなく、胞細胞に送り込まれ、さらに選択的に角質層を越えて小胞に入ることができることが発見されたが、これは、有効性と安全性の面で偉大な効果をもたらす可能性を秘めている。よって、本発明の一つの実施例では有益な化合物をある有効量だけ含むリポソームから構成されるリポソーム配合物を提示する。このリポソーム配合物に使われるリポソームは有益な化合物をここにさらに詳述するように毛胞への選択的な送達が可能である。投与されるべき有益な化合物は、角質層または細胞膜を通過することが不可能でリポソームを媒体として毛胞に選択的かつ優先的に送達することを必要とする巨大分子または嫌油性分子であり、または、毛胞以外の細胞には望ましくない効果を持ち、リポソームを媒体として毛胞に選択的かつ優先的に送達することを必要とする好油性分子である。このリポソーム配合物はここに述べるように様々な用途に利用できるので、メラニン、染髪料、チロジナーゼ、または人間のチロジナーゼを発現し得る核酸などの毛髪の色を修復する薬剤、毛髪の成長を刺激し、毛髪を強化する薬剤、化学療法に対する敏感さを抑制する薬剤などを含む多様な有益な化合物を組み込むことが可能である。このリポソーム配合物は選択的に毛胞に送達するために、多種のリポソームから構成することが可能であり、それらのリポソームとしてはpHに感応するリポソーム、PC、EPC、DOPC、DPPC、PE、DOPEおよびコレステロールからなるグループから選ばれたリン脂質の一つを含むリポソーム、D282、D378、D383、D3886、D 3897およびD3899、からなるグループから選ばれた陽イオン・リン脂質の一つを含むリポソームなどの配合が可能である。本発明はまた、ほ乳動物の毛髪に、毛髪の色を復元する方法を提示し、その方法は複数の毛胞を持つ該動物の皮膚の部分に治療上有効な量のリポソーム配合物を適用することから成り、その場合、本発明のリポソーム配合物には少なくとも一種類の毛髪色復元薬剤を有効量含むリポソームが含まれている。望ましい毛髪色復元薬剤にはメラニン、染髪料、チロジナーゼ、および毛胞細胞中に人間のチロジナーゼを発現し得る核酸が含まれる。本発明はさらに、ほ乳動物の複数の毛胞を持つ皮膚の領域に局所的に本発明のリポソーム配合物を適用する段階を含む、ほ乳動物の毛胞に有益な化合物を直接的および選択的に送達する方法を提示し、そのリポソーム配合物は少なくとも一つの選択された有益な化合物を有効量含むリポソームから成り、またその有益な化合物は巨大分子であるか、嫌油性分子であるか、または毛胞細胞以外の細胞に望ましくない効果をもたらす親油分子である。望ましい実施例の場合、有益な化合物はサイクロスポリンＡまたはそれに関連する化合物のような毛髪の成長刺激剤である。また、別の実施例の場合、有益な化合物は置換療法蛋白質の有効量を発現する能力を持つ核酸である。特に望ましいのは、チロナーゼを発現し得る核酸分子、または毛髪成長刺激蛋白質、または化学療法に起因する脱毛症に対して抵抗力をもたらす多薬剤抵抗蛋白質などである。別の実施例においては、本発明は化学療法に起因する脱毛症を抑制するために本発明の方法による本リポソーム配合物を使用することを意図する。リポソーム配合物は、毛胞において化学療法の毒性を低減する化合物を含んでいる。図面の簡単な説明本発明の詳細、およびその望ましい実施例は、図面を参照することによりさらに理解しやすくなる。図1Aは、例1で述べたように、カルセインを含むリポソームで処理した皮膚の組織培養の傾向顕微鏡写真（倍率500X）で、毛胞への高度に優先的な染料の送達を示す。図1Bは、例1で述べたように、リポソームなしにカルセインで処理した皮膚を組織培養したものの蛍光顕微鏡写真（倍率500X）で、薄弱な染色効果と皮膚への無差別的な染料の送達を示す。図2は、例2で説明するように、メラニンを内包するリポソームで12時間処理した白い毛のハツカネズミの皮膚をヘマトキシリン-エオシンで染色したもののパラフィン断面（倍率500X）で、矢印で示したとおり、リポソームに内包されたメラニンは主として毛胞に送達されていることを示す。図3は、例2で述べたように、ヘマトキシリンとエオシンで染色された図2と同様な皮膚を組織培養したもののパラフィン断面の光学顕微鏡写真（倍率250X）で、矢印で示したとおり毛幹そのものにメラニンが送達されていることを示す。図4は、放射能のラベルをつけた大分子量DNAを内包するリポソームで処理した皮膚を組織培養したものの組織学的放射能写真で、例3で述べたようにDNA（矢印）が毛胞細胞膜と細胞形質に集中していることを示す。図5A-5Dは、例4bで述べたようにして作られた皮膚の組織培養の断面の光学的顕微鏡写真（図5Aと5Cは倍率125X、図5Bと5Dは倍率250X）で、図5Aと5BはLac- Zを発現する能力を持つリポソームに内包されたプラスミド（pM-MuLV-SV-Lac-Z ）を使用した結果を示し、図5Cと5Dは裸のプラスミドを使用した結果を示す。矢印は、毛胞と毛幹中に青色（黒色）の点々が均一に分布していることを指しており、毛胞に活性遺伝子が送達されたことを示している。図6A-6Cは、例5で述べたように、生体内で処理したハツカネズミの皮膚サンプル断面の蛍光顕微鏡写真（倍率150X）であり、図6Aと6Bはリポソームに内包されたカルセインを使用した結果であり、図6Cは裸のカルセインを使用した結果を示す。矢印は毛幹の中の蛍光を指しており、カルセインが毛胞に活性化した状態で送達されていることを示す。図7A-7Cは、例5で述べたように、生体内で処理したハツカネズミの皮膚サンプル断面の光学的顕微鏡写真（倍率500X）であり、図7A-7Cはリポソームに内包されたメラニンを使用した結果を示す。図8A-AFは各々陽イオン・リン脂質D282、D378、D383、D3886、D3897およびD 3899、を示す。発明の詳細な説明Ａ．リポソームを媒体とする巨大分子と核酸の毛胞に目標を定めた送達本発明は活性配合物の直接的かつ選択的（特定的）な毛胞の細胞および毛幹そのものへの投与に関するものである。本発明に基づく毛胞への特定化された送達の故に、本発明は有益な配合物を真皮や循環系に一般的に送達する代りに、毛胞へ特定的に送達するという利点があり、それによって少ない配合物の量で望ましい効果を得ることができ、その結果その配合物による皮膚全般又は循環系への悪影響を減少することができる。１．皮膚組織培養の評価分析有益配合物を内包するリポソームが選択的送達に有効であることを明示し、かつリポソームを媒体とする配合の最適化をはかるために、生体内の評価分析法が開発された。基本的に、Lietal.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,88:1908 -1912(1991);Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89;8764-8768(1992):Li et al .,InVitro Cell.Dev.Biol.,28A:479-481(1992);Li et al.,In Vitro Cell.Dev.B iol. ,28A:679-681(1992);Li et al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.,28A:695-698(199 2);Li et al.,In Vitro Cell.Dev. Biol.,29A:192-194(1993);およびLi et al., In Vitro Cell.Dev. Biol. ,29A:449-450(1993)に述べられ、ここに言及することによって本申請書の一部に組込まれるそれらの教示に従い、コラーゲンのゲルに支持されたスポンジの上に毛胞を含む皮膚に切片が組織培養された。このシステムは毛胞の中で少なくとも10-16日間にわたり毛幹の成長を許し、かつ、毛胞および周囲の組織の3次元的な様相を染料の選択使用によって共焦顕微鏡写真で評価する能力をもたらすものであり、さらにそれによって使用した治療用試薬の効果を評価するためのシステムを与えるものである。3次元的組織培養と共焦顕微鏡写真によって、候補となる有益な（治療用）製品を送達するリポソームと毛胞との相互作用を微細にわたり細胞および細胞以下のレベルで観察する能力を与えてくれる。よって、この組織培養システムはリポソーム配合物を最適化し、またリポソームの内容物を目標の細胞に送達するための最適条件を規定する能力を与える。典型的な皮膚組織培養準備法はLiらによって1992年2月28日申請され本申請の出願人に譲渡された係属中の米国特許申請番号07/662,239にも詳述されており、その教示はここに言及することによって本申請書の一部として組込まれるものである。毛胞と内外表面を持った皮膚のサンプルの自然状態における組織培養は、皮膚のサンプルを培地に浸した細胞外支持マトリックス上に置き、そのとき内表面はマトリックスに摂氏、外表面は培地の表面より露出して大気に触れており、皮膚をのせたマトリックスを培養条件下に保つことから成る。可能性としては、いかなる動物の皮膚サンプルでも、本評価分析に使用することができる。例を挙げれば、ハツカネズミ、ネズミ、モルモット、ウサギ、キヌザル、サルおよび人間などのほ乳動物がこれに含まれる。より望ましいのはその動物が人間であることである。動物から切り取られる皮膚サンプルは通常真皮層と表皮層を含む。脂肪がつき過ぎている場合は取り除く。皮膚サンプルは毛の生えた動物で、その毛髪の成長を許すような皮膚から切り取ったものでも良く、あるいは無毛の動物から切り取ったものでも良い。毛のある動物から皮膚サンプルを切り取る場合、皮膚を切り取る前に毛をそるか、刈り取ってもよい。皮膚サンプルは内表面と外表面をもつものと定義しても良い。用語「内表面」とは真皮的な表面、すなわち、動物においてそれが自然の状態で存在しているとき、露出していない表面である。用語「外表面」とは表皮的な表面、すなわち、動物においてそれが自然の状態で存在しているとき、露出している表面である。本発明において用いられる皮膚は表面積の制限はない。一般的には、皮膚サンプルは、1ないし10,000平方ミリメートル（mm2）の外表面積を持つことができる。望ましい表面積は4ないし100mm2である。さらに望ましい表面積は約10mm2である。厚さは切り取ってくる動物による。ハツカネズミの場合、望ましい厚さは約1ないし2mmである。皮膚サンプルは支持マトリックス上で培養される。本発明の支持マトリックスは、自然の状態と同様に皮膚の内表面（基定部）に培地から水溶生栄養分を送達するための毛細管作用に適した間隙を持った小柱状構造を提供する。したがってこの能力を持ついかなる支持体も、例えば、ナイロン、ほうけい酸塩ガラス・繊維またはポリプロピレンまたは、セルロースまたはコランゲンのような有機物メッシュも使用することができる。支持マトリックスは細胞外支持マトリックスであることが望ましい。この使用目的の場合、「細胞外支持マトリックス」とは、ゲルやスポンジのような固体であり、1個ないし複数個の有機分子または分子凝集体であり、その分子または凝集体は、細胞によって細胞外に生成され、分泌されたものであり、生体内において支持体、接着剤および枠構造として作用し、 3次元的組織の構造および機能を保つものである。そのような分子の例としては、高分子量の蛋白質や糖蛋白質、例えばコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど、複雑な多糖類などがある。細胞外の支持マトリックスのコラーゲンを含むゲルがある。コラーゲンを含むゲルの例としては、ゼラチン化された豚皮、例えばGELFOAMTM(The Upjohn Com pany,ミシガン州カラマズー市）およびラミニン、コラーゲン、プロテオグリカンおよびエンタクチンから成る配合物、例えばMARTIGELTM(Collaborative Resea rch,Inc.,マサチューセッツ州ベッドフォード市)などがある。 GELFORMTMは米国特許2,465,357で開示された特許製品で、それについて言及することにより、その開示内容は本申請書の一部として組み込むものとする。別の望ましい実施例の場合、細胞外支持マトリックスはホモ多糖スポンジである。LeightonJ.,J.Nat'l Cancer Instit.,12:545-561(1951)。望ましいホモ多糖はセルローズである。本発明で意図されているホモ多糖スポンジは織り目やネット・サイズは任意である。さらに別の推奨する実施例の場合、細胞外支持マトリックスはコラーゲンを含むゲルとホモ多糖スポンジの組み合わせである。さらにそのような組み合わせは上層がコラーゲンを含むゲルで、下層がホモ多糖で構成されることが望ましい。コラーゲンを含むゲルはゼラチン化された豚皮であることが望ましく、ホモ多糖はセルロースであることが望ましい。特に望ましい支持マトリックスの実施例においては、上層がGELFOAMTMで、下層がセルロース・スポンジであり、そのようなマトリックスは組織が培養される皮膚の正常な毛髪の成長を保つ上で特に有効であることことが分かっている。皮膚サンプルの大きさと細胞外支持マトリックスの大きさの間には特に決められた比率はない。マトリックスは皮膚サンプルを支持するのに十分な直径から、皮膚サンプルよりはるかに大きいものまで、任意な大きさとすることができる。一つのマトリックスの上に複数の皮膚サンプルを置くことも、実際に皮膚サンプル同志が接触しないかぎり許される。皮膚サンプル間の望ましい距離は約1ないし2mmである。皮膚サンプルは、マトリックスの上に置かれたとき、皮膚の内表面がマトリックスに接し、皮膚の外表面がマトリックスの反対側にあるようにする。望ましい実施例の場合、皮膚の内表面はマトリックスと接している。このようにした場合、本方法に従って、皮膚の外表面は毒素や他の配合物と接触することになる。皮膚のサンプルを上にのせたマトリックスは、マトリックスと十分に接触はするが、皮膚を完全に覆わない程度の量の培地、すなわち皮膚の外表面は潜ってしまうことなく、培地の表面はマトリックスの上面から0.5ないし2mmにあり、皮膚サンプルに対して毛細管作用で水溶液を供給できることが望ましい。例えば、皮膚サンプルの厚さが1ないし2mmであるときは、培地の表面が皮膚の外表面より 0.5ないし約2mm下にあることが望ましい。細胞外支持マトリックスは一般的に柔らかく、皮膚サンプルをのせたときに凹みを生じ、その結果、マトリックスのエッジが皮膚サンプルの縦方向の端面に接触することもある。細胞外支持マトリックスは皮膚サンプルを上にのせる前に、マトリックスを培地と平衡させるために、予備処理をしておく。マトリックスの予備処理はマトリックスを所定の大きさに切断し、切り取られたマトリックスを殺菌された容器に入った培地にによって浸漬して、培地によって十分に含浸され、平衡に達することから成る。望ましい浸漬時間は37℃で4時間である。本発明で意図されている培地は、皮膚サンプルの活性を促進し、保持するように作られた水溶性の栄養分である。望ましい培地はEagles最低限必須培地（ME M）に10％（v/v）の胎児ウシ結成（FBS）および抗生物質を添加したものである。抗生物質の例としては、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン、カノマイシンなどである。望ましい抗生物質はゲンタマイシンである。最終的な抗生物質の濃度は使用される特定の抗生物質による。抗生物質としてゲンタマイシンを使う場合、望ましい濃度は培地の1ml当り0.2mgとする。他の培地も使用可能であり、胎児ウシ血清か、血清なしの培地をこの分野で公知のように併用することが望ましい。皮膚サンプルをのせたマトリックスは、培地中に無期限的に保管することができる。培地は2-3日で1回交換することが望ましい。適当な組織培養期間後、選ばれた有益な巨大細胞配合物を含むリポソームのある量を、皮膚の組織培養に適用する。第二の組織培養された皮膚サンプルを比較例として、組成物だけで処理する。次に、皮膚の組織培養を処理し、処理を行なった皮膚細胞中の組織の活性を評価し、リポソームに含まれた有益配合物の特定的な送達の程度を確認する準備を行なう。一つの実施例においては、活性および/または送達は活性細胞特有の標示薬の皮膚サンプル細胞への取込みを測定することにより評価される。ここで「活性細胞特有の」とはその標示薬が、生きている、死んでいない細胞に取り上げられ、または組み込まれることを意味する。活性細胞特有の標示薬は、代謝前駆体または非代謝物質で生きている細胞に入れるものである。代謝前駆体としては、リボまたはデオキシリボ核酸前駆体、例えばプリン体、プリミジン類、ヌクレオシドおよびヌクレオチドである。代謝前駆体は検知を容易にするため、指示手段と操作的に連結されていることが望ましい。代謝前駆体の望ましい指示手段は放射性ラベル、例えば35S、32P、125I、 3Hなどが望ましい。特に望ましい放射性ラベルつきの代謝前駆体指標は3H-チミジンである。望ましい活性細胞特有の非代謝物質標示薬としては、光学的に検知できるような染料である。活性物質に特有なものとしてこの分野で認められた染料ならば、どんなものでも本発明の皮膚毒素評価に使用することができる。例えばR.P.Ha ugland編Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals出版者Molec ular Probes社、オレゴン州ユージーン市（1989-1991および1992-1993）を参照。望ましい実施例において、染料は蛍光染料である。活性細胞特有の蛍光染料の例としては、BCECF-AM（B-1150）、カルセイン-AM（C-1430）、CFDA（カルボキシフルオレセイン・ジアセテート；C-195）アクリジン・オレンジ（A-1301）、カルセイン・ブルー（H-1426）、フラ-2AM（F-1201）、フロオレセイン・ジアセテート（F-1303）またはカルボキシ・アナログ（C-1431）などがある。それらの染料はこの分野では公知のものであり、商業的に入手し得る（Molecular Prob es社、オレゴン州ユージーン市）。特に望ましいものはBCECF-AMまたはカルセイン-AMである。上記で（）内の数字はMolecular Probes社から入手し得る蛍光染料の製品番号を示す。一つの実施例においては、活性細胞に特有の蛍光染料の組み込み、または取り入れは活性細胞の代謝活動に依存する。本発明に従って、非蛍光染料は活性細胞に取り入れられて、エステラーゼのような細胞間酵素によって蛍光製品に変換される。細胞内酵素の存在が活力を示す。別の実施例の場合、活力は死亡細胞に特有な標示薬を皮膚細胞が取り入れるが組み入れることを測定することによって評価される。ここで「死亡細胞に特有な」とはその標示薬が死んだ、活性のない細胞に取り入れられ、または組み込まれることを意味する。一般的に、死亡細胞に特有な染料とは、高いイオン電位を持ち、しかも低い透過性を持つので、細胞膜を透過できないような化合物である。細胞が死ぬと、細胞膜は構造的または機能的に破壊され、死亡細胞に特有な染料が細胞間の空間に入り込むことができるようになり、そこで核膜のような細胞間成分と結合する。望ましい死亡細胞に特有な標示薬は光学的検知が可能な染料である。望ましい死亡細胞に特有な染料はヨウ化プロビジウム、臭化エチジウム、エチジウム・ホモジマー[(5,5'-ジアザデカメチレン)ビス(3.8-ジアミノ-6-フェニル-フェナントリジウム)ジクロライド、ジハイドロクロライド]などである。最も望ましいのはヨウ化プロピジウムである。ヨウ化プロピジウム（PI）およびその多の死亡細胞特有の染料はこの分野では公知のものであり、商業的に入手可能である（Mo lecular Probes社、オレゴン州ユージーン市）。さらに別な望ましい実施例の場合、活力の評価は活性細胞に特有な標示薬と死亡細胞に特有な標示薬の両方の取り入れ、または組み込みを同時に測定することによって達成される。活力は活性細胞と死亡細胞との比で評価される。もし活性細胞に特有な標示薬と、死亡細胞に特有な標示薬とが共に蛍光染料である場合に、活性細胞と死亡細胞とを区別する上で便利なように、両者の発光スペクトルが異なっていなければならない。細胞の活力を、活性細胞と死亡細胞、および培養サンプルに特有な標示薬の取り入れ方の違いから判定する様々な配合と方法は、この分野で公知である。前出Haugland。活性細胞に特有な標示薬の取り入れまたは組み込みを検知する手段は使用する標示薬に依存し、この分野に熟達した者には公知である。放射能標示された代謝前駆体を検出する望ましい手段は、その前駆体を取入れた皮膚サンプルの組織学的放射能写真である。染料の望ましい検出手段は顕微鏡検査である。顕微鏡検査は、3次元の自然状態の皮膚組織培養において様々な場所で皮膚サンプルの特定の細胞における標示薬の組み込みを選択的かつ再現可能に評価し得る任意の顕微鏡の使用を含むものである。一般的に顕微鏡検査は、光学的切断の能力を必要とする。光学的切断とは、皮膚の3次元構造の中であらかじめ選択した深さの位置を皮膚中に存在するミクロソーム、気泡、脂球、およびその他の組織成分によって、光の反射や、光学的干渉がない状態で観測する能力を言う。さらに、光学的切断によって、3次元的皮膚組織培養内の各種断面を観測することができる。皮膚を順次に切断して観測することにより、皮膚と毛胞の全体像、別な言い方をすれば、目標である特定の細胞が存在する皮膚と毛胞の領域の像を作成することができる。かくして、皮膚の様々な深さと部分の比較研究が可能となる。このように表面細胞、真皮層の下の細胞、表皮層の細胞、また、その他の特定な細胞、例えば神経細胞、油脂分泌細胞、毛胞細胞などの活力を評価することができる。光学的切片の厚さは、観測すべき細胞の大きさ、および組織に応じて変化させ、約0.1から1000ミクロンの範囲が可能である。望ましい切片の厚さは0.5ないし10ミクロンであり、さらに望ましいのは2ないし6ミクロンである。光学的切断を行う能力のある望ましい顕微鏡は、共焦スキャニング・レーザー顕微鏡、例えば10xのPlanApoプラン対物レンズをつけたニコンOptiphotに搭載したMRC-600Confocal Imaging System（Bio-Rad社、カリフォルニア州リッチモンド市）などが望ましい。そのような共焦スキャニング顕微鏡による送達の評価分析に使用されて成果を挙げている（実施例参照）。本発明においては組織サンプルを他の光学的スキャニングまたは切断法で観察することも意図されている。活力は皮膚の中の任意の場所において、活性細胞と死亡細胞各々に対する特有な標示薬の取り込みを基礎に、全細胞に対する活性細胞または死亡細胞の比率または活性細胞の死亡に対する比率によって評価される。推定される有益な化合物との接触の前後において活力を評価するとき、推定される有益な化合物との接触の前後に評価された活性細胞と死亡細胞の比率を比較することにより、投与された化合物によりもたらされた毒性または利益を標示することができる。標示薬を皮膚の培養組織に適用する手続きは、各々の標示薬によって異なる。一般的に皮膚サンプルを培地に入れてから6時間後、望ましくは24時間後に、標示薬を加える。培地に標示薬を加えたのち、皮膚サンプルの中に標示薬が入り、その細胞の標示ができるように十分な期間、培養組織を培養条件下に保つ。培養組織は標示薬の存在下に、望ましくは5分間ないし2時間、さらに望ましくは 10ないし20分間保つ。培地に加えられた標示薬の濃度は、各々の標示薬によって異なる。蛍光染料 PIとBCECF-AMが用いられた場合、染料の濃度は約1ないし100マイクロモル、望ましくは約2ないし50マイクロモル、そしてさらに望ましくは各々約5マイクロモルであることが望ましい。試験管内の皮膚組織培養法は実施例に述べてある。ここに述べるリポソームを媒体とする送達の研究結果によれば、有益な巨大細胞化合物は毛胞に集中しており、細胞膜を越え、細胞形質を通って核に達している。リボソームに組み込まれた物質（有益化合物）は毛胞に優先的に送達されているが、それは、毛胞中に比べて、周辺の皮膚組織中の有益化合物のレベルが低いことによって明らかである。ここに開示されたリポソーム配合を使った時の毛胞への極端な選択性の故に、また送達すべき化合物に基づく選択性と利用されたリポソーム配合の故に、この選択性のことを、毛胞への送達量と周辺の皮膚組織への送達量との比率に応じて、「指向送達」、「優先送達」、また、ときには「特定送達」と呼ぶ。さらに、選択性は毛胞に対する薬学的高価を周辺の皮膚組織に対するものと比較して表現することも可能である。リポソームに組み込まれていない状態の巨大分子化合物で組織サンプルを処理した場合、胞細胞または胞細胞核に到達する量はわずかである。したがって、リポソームを使ったシステムはさもなければ毛髪には集中し得ない化合物を毛胞に特定的、選択的、そして効果的に指向させるのである。試験管内の組織培養評価分析は、様々な方法で利用することができる。その評価分析は、有益化合物の送達効率を改善する目的でリポソーム配合を評価し、最適化するために、または指向配合におけるリポソームの利用効果の他の様相を研究するために利用することができる。その評価分析は、ここにさらに述べる毛胞を襲う状態を処理するために有益な他の化合物を見つけるためのスクリーニング・システムとしても利用することができる。さらに、試験管内の組織培養評価分析法は、本発明の方法に使用される有益な化合物の有効な投与量を決定するために利用することもできる。２．有益化合物を内包するリポソームとリポソーム配合物の製法本発明の有益なリポソーム配合物は一般的に意図された用途に適した一つないし複数の配合形態で得られる。リポソーム中で使われる蛋白質、核酸または他の化合物は、各種の緩衝液や溶液中で生物学的活性を保つか、リン脂質配合の形態をもつことが望ましい。さらに望ましいのは、その配合中で有益化合物に最大の安定性と生物学的活性を提供するようなリン脂質配合である。一般的にこの分野で公知のように、そのようなリン脂質配合はリポソーム配合を形成するように配合されることが望ましい。一般的に、その配合は目的とする用途に適した生物学的に活性な有益化合物の一定量を含むものである。リポソームの製法と、その薬物療法における利用法については今までに述べられてきた。例えば、米国特許、4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388 、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,07 7,211および5,264,618を参照することができるとともに、これらの開示内容はここに言及することにより、本申請の一部として組み入れる。核酸のリポソーム中への内包については米国特許5,223.263に述べられている。有益な化合物を内包するリポソームの製法の望ましい例は、実施例に述べた。特に、有益化合物として毛胞に送達されるメラニン、蛋白質または核酸の組み込みについては、ここに述べる。本発明のリポソーム配合物は一般的に1mgのリン脂質配合物中に0.1mgないし 3mgの蛋白質、または約0.1μgから0.5mgの核酸を含んでいる。活性化合物のリン脂質に対する比率が結果として生じる試薬の感度を決める可能性がある。よって、リン脂質混合物1mg当りの蛋白質約1ないし2mgの割合が国際感度指数（「ISI」）約1.0の蛋白質試薬に対して適当であろう。ISI値約1.6ないし2.0の配合物を作るためには、リン脂質混合物1mg当り約0.25ないし0.5mgの蛋白質が適当であろう。以上の他に、約0.5ないし1.5％（w/v）のグリシンを含むことが望ましい。リポソーム配合物を貯蔵しておいて、後に再生する目的で凍結乾燥することができるようにするためには、試薬は低温保存剤、望ましくは炭水化物の保存剤、最も望ましくはトレハロースを含むことが必要である。リポソームの脂質2分子層はリン脂質、望ましくはホスホグリセリド類から成る。リポソーム配合物の例としては、ホスファチジルコリン（PC）・リポソーム、特に卵PC（EPC）およびジパルミトイルPC（DPPC）を含む。この他に、リポソーム配合物の候補としては、ここにそれを言及することによって本申請の一部として組み込む米国特許4,394,488の教示に従つて製作されるが、特にその開示内容に従う。ホスホチジルエタノールアミン（PE）、ホスホチジルセリン（PS）、スフィンゴリピド、ホスホチジルグリセロール（PG）、ホスファチジン酸（PA ）、コレステロール、スピンゴマイエリン、カルジオリピン、各種陽イオン・リン脂質、糖脂質、ガングリオシド、セレブリオシドなどを単独で、または複数で含むリプソーム類がある。「リン脂質」とはグリセロール（最も一般的）またはスフィンゴジンから作られる有機分子である。グリセロール（またはフォスフォグリセリド類）から作られるリン脂質はグリセロールの骨格、グリセロールの第1および第2炭素までエステル化した脂肪酸の二つの鎖とリン酸を第3炭素までエステル化したものから成る。また、アルコール成分の一部がエステル化してリン酸になったものでも良い。本発明のリポソーム配合物に使われる望ましいリン脂質としては、12ないし 20の炭素原子を持つ脂肪酸を含むリン脂質がある。その脂肪酸は飽和脂肪酸でも良く、また不飽和脂肪酸でも良い。リン脂質は天然の資源から得たものでも良く、その場合、様々な脂肪酸から成るものでも良い。異なる産出源からのリン脂質を混合して使用しても良い。例えば、PC、PGおよびPEは卵黄から得たものでも良い。PSは動物の脳または脊髄から得たものでも良い。これらの物質は合成された物質から作られても良い。リン脂質（PL）の混合物は各種のPLを適当な割合で混ぜても良い。しかし、各リン脂質を適当な割合で混ぜても良いが、個々のリン脂質を特定の割合で混ぜた場合、特長のある作用と安全性のある作用を持つリポソームが生まれる。したがって、広範囲の割合の個別リン脂質を使用できるが、作用上の特長と結果として生まれるリポソーム配合の安定性を得るためには、ある特定のリン脂質配合が望ましい。リン脂質は、適正な割合で容易に混合されて、本発明のリポソーム配合を作るのに使われるPL混合を提供することができる。リポソームは、（N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム）（DOTMA）、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジオレオイル-ホスファチジルコリン（DOPC）、ホスファチジルコリンエタノールアミン（PE）、卵PC（EPC）、ホスファチジルコリン（PC）、ジパルミトイルPC（DPPC）、コレステロールなどのリン脂質の一つまたは数種から作られることが望ましい。リン脂質は、公知のように、Avanti（アラバマ州バーミンガム市）、GIBCO BRL（メリーランド州ゲイザースバーグ市）、Aldrich（ウィスコンシン州ミルウォーキー市）などの各社から入手できる。望ましいリポソームはPC、EPCまたはDPPCを均質に含んでいる。さらに望ましいリポソームの配合物は、PC型リン脂質（例えば、PC、EPC、DOPC、DPPCなど）とPB型リン脂質（PE、DOPEなど）をモル比で2:5から5:2で含み、その比が5:2P C:PEであることが最も望ましい。望ましいリポソーム配合はPC:PE:Cholをモル比で5:2:3に持つことが望ましい。本発明に使われる望ましいリポソームはさらに、陽イオン・リン脂質を含んでも良い。一つの望ましい陽イオン・リン脂質は単一陽イオン・リン脂質で二つの同一アルキル側鎖を持つものである。望ましい陽イオン・リン脂質はまた、上述の業者を含む様々の業者から入手することができる。特に望ましい陽イオン・リン脂質はMolecular Probes（オレゴン州ユージーン市）から入手可能な、D282、D378、D383、D3886、D3897および D3899のような用イオン・リン脂質を含み、その構造と合成方法は公知であり、R .P.Haugland編Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,出版者Molecular Probes社、オレゴン州ユージーン市（1989-1991および1992-1993）に述べられている。陽イオン・リン脂質D282、D378、D383、D3886、D3897および D3899の構造は図8に示してある。 D282のまたの名は、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩である。D378のまたの名は3,3'-ジヘプチルオクサカルボシアニン・ヨージドである。D383のまたの名は1,1'-ジドデシル-3,3,3',3',- テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩である。D3866のまたの名は1,1'-ジオレイル-3 ,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン・メタンスルフォネートである。D 3897のまたの名はN-4-(4-ジリノレイルアミノスチリル)-N-メチルピリジニウム・ヨージドである。D3899のまたの名は1,1-ジリノレイル-3,3.3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩である。一つの実施例においては、本発明のリポソーム配合は上記の一つまたは数種の陽イオン・リン脂質を含んでいる。本発明のリポソーム配合物は、（a）PC、E PC、DOPC、DPPC、PE、DOPE、コレステロールなどのリン脂質から一つあるいは複数のリン脂質、および（b）D282、D378、D383、D3886、D3897、D3899などの陽イオン・リン脂質を混合したリン脂質の構成を持つことが望ましい。特に望ましいリポソーム配合物は、リン脂質（a）と陽イオン・リン脂質（b）を約0.5ないし2 .0モルのリン脂質（a）対約0.5ないし1.5モルの陽イオン・リン脂質（b）の割合で混合した構成であり、さらに約1.0ないし1.2のモルのリン脂質（a）対0.8モルの陽イオン・リン脂質で混合したものであればさらに望ましい。本実施例の望ましいリン脂質配合物は、DOPCまたはDOPEと上記の陽イオン・リン脂質を約0.8モル対約1.0ないし1.2モルの割合で混合したものである。別な実施例の場合、本発明は、PC、EPC、DOPC、DPPC、PE、DOPEおよびコレステロールから成るグループから選ばれた一つまたは数種のリン脂質をさらに一つまたは複数のリン脂質と組み合わせることにより、pHに感応するリポソームを形成したものから成るリポソーム配合物である。pHに感応するリポソームは一般的に公知であり、それらの製造法はStraubingerらによってFEBS Letts.,179:148 -154(1985)に説明されている。望ましいpH感応型リポソームはオレイン酸（OA）とPEをモル比で3:7の割合で含んでいる。OAはSigma（ミズーリ州セントルイス市）社のほか、多数の業者から入手できる。本発明のリポソーム配合物の毛脂に対する優先的な目標づけは、リポソーム配合物中のリン脂質の選択により最適化が可能であり、またさらに、内包された有益化合物に依存することもある。最適化はここに説明された試験管内の組織培養評価分析法を使い、ここに説明されたリン脂質パラメータに基づくあらかじめ選択された一連のリポソーム配合物を作成し、試験することによって容易に行い得る。有益な化合物を毛胞に目標づける上で特に望ましいパラメータは両陽イオン脂質を持ち、pHに感応性のあるものである。リポソーム配合物が後の使用のために貯蔵される前に、凍結乾燥される場合、一種類または複数種類の炭水化物を保存剤として加え、凍結乾燥およびその後の再水化の際にリポソーム配合物中のリポソームの完全性を保護することが望ましい。冷凍保存とは、デリケートな物質の完全性を、それらが含んでいる液体が凍結されて乾燥される際に保護することを意味する。リポソームを冷凍し、その後凍結乾燥する際に、その完全性を保つための保存剤として使用することは報告されている。Racker,E.,Membrane Biol.,10:221-235(1972);Sreter，F.ctal.,Bioc him.Biophys.Acta.,203:254-257(1970);Crowe et al.,Biochem.J.,242:1-10(198 7);Croew et al.,Biochim.Biophys.Acta.,987:367-384(1988)。炭水化物冷凍保存剤として好適なものはトレハロース、マルトース、ラクトース、グルコースおよびマンニトールなどが挙げられる。本発明の望ましい様相の一つによれば、トレハロースは約50mMから約250mMの範囲の濃度で本発明のリポソーム配合物の作成に用いる水溶性緩衝液に含ませる（凍結乾燥前）ことが望ましい。リン脂質は、例えば製造業者から有機溶剤に含ませた形で入手後、適当な割合で混合して特定の配合を得る。この際、リン脂質の脂肪酸蛋白質のアルキル鎖過酸化反応を抑制するために酸化防止剤を加えても良いし、また有機溶剤が存在していれば、蒸発によって除去する。酸化防止剤の好例はヒドロキシ・トルエン酪酸塩である。酸化防止剤は約0.1％（重量比）使用される。乾燥した（蒸発により）リン脂質混合物は次に水溶性洗剤に再溶解される。好適な洗剤としては比較的高い臨界ミセル濃度（CMC）を持つものが用いられる。Womack et al.,Biochim.Biophys.Acta,733:210(1983)。そのような洗剤には約 2mM以上のCMCを持つ洗剤を含む。望ましい洗剤は約2ないし25mMの範囲のCMCを持つものである。そのような望ましい洗剤としては3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）およびオクチル・ベータ-D-グルコピラノシド、オクチル・ベータ-D-チオグルコピレノシドなどが挙げられる。また、洗剤には他の成分を含んでも良い。それらの成分としては、HEPE S、トリス、ホスフェートなどの緩衝塩；その他の各種の塩、例えば、NaCl、KCl など；トレバース、マルトース、グリコースなどの炭水化物冷凍保存剤などの一つ；およびグリシンなどが挙げられる。本発明の望ましい実施例の一つによれば、洗剤溶液は20mMトリス、pH7.5、1 50mM NaCl、（TBS）を含んでいる100mMのCHAPS、150mMのトレハロースおよび0.8 ％のグリシンを含む。この好ましい実施例によれば、リン脂質は再びこの溶液に溶解されて約20mg/mlの最終的な濃度となる。リポソーム中に用いられる逆化された蛋白質は担体蛋白質と共に、再溶解されたりン脂質と結合され、その結果としての混合液の容積は上述のような、望ましくは冷凍保存剤（最も望ましいのはトレハロース）とグリシンを含み、洗剤を含まない緩衝液によって調整される。蛋白質はウシのガンマ・グロブリンのような担体蛋白質と混合され、十分な緩衝液を加えて、最終的な各濃度が、活性蛋白質10mg/ml、ウシのガンマ・グロブリン1mg/ml、リン脂質4mg/ml、洗剤20mMとなるようにする。好適な緩衝液は150mMトレハロースと0.8％グリシンを含むものである。その結果得られる、無色透明の溶液は、共可溶性を保守する上で、なんらの渦流生成や音波破砕を必要としない。リン脂質添加物における洗剤は様々な方法で除去することが可能であり、それによって蛋白質や核酸を2分子層を経由して挿入し、組み込んだ安定したリポソーム配合物を得ることができる。洗剤除去の好適な方法としては、透析、接線流ダイアろ過、クロス・フロー中空繊維ろ過、疎水性クロマトグラフィック樹脂による処理、および単純な希釈などがある。リン脂質添加物からの洗剤の望ましい方法は、透析を少なくとも30時間、室温で、150mMトレハロース、0.8％グリシンおよび0.05％NaNo3を含むTBSのような緩衝液に対して透析膜チューブの中で行う。もう一つの望ましい洗剤除去法は樹脂処理を行う方法である。好適な樹脂としてはAmberlite XAD-2（Rhom and Haas Co.,ペンシルベニア州リッチモンド市）またはBio-Beads SM-2（BioRad,カリフォルニア州リッチモンド市）などの疎水性クロマトグラフィック樹脂が挙げられる。これらの樹脂は洗剤を直接リン脂質溶液添加物と接触して、または透析膜によってそれから分離した後に除去するのに使われる。洗剤のリン脂質添加物からの除去の割合は、溶液中の洗剤とクロマトグラフィック樹脂ビーズとの重量比に比例する。洗剤除去を終ったリポソーム溶液は次に5mM CaCl2に希釈する。一つの望ましい実施例の場合、完全に活性化合物の使用前に50mM Tris、pH7.5、75mMトレハロース、0.8％グリシンおよび10ないし15mM CaCl2の濃度に希釈する。また、別の方法としては希釈された試薬は凍結乾燥して、その生物学的特性を長期にわたり保存し、後に使用前に水に浮遊させて再形成できるようにする。洗剤を除去する別の望ましい方法では、透析や樹脂処理を使わないが、それでも活性試薬の作成を可能にする。この方法によると、蛋白質または核酸を含んでいるリン脂質配合物は洗剤を可溶化されたのちに、洗剤が無い状態で緩衝液に希釈され、CaCl2で完全に活性化され得る状態に保たれる有益化合物を含む混合ミセルを生成する。本発明のこの様相においては、リン脂質は洗剤、望ましくはアルキルグルコピラノシドを含む緩衝液に20mg/mlの割合で溶解される。望ましい緩衝液-洗剤溶液は50mMオクチル・ベータ-D-チオグルコピラノシド（OTG）と1 50mM CaClを含む20mM HEPES（pH6）より成る。次に担体蛋白質、活性蛋白質または核酸、とCaCl2が加えられ、その混合液は洗剤を含まない緩衝液、例えば150mM NaClを含む20mM HEPES（pH6）、でさらに希釈され、活性蛋白質または核酸が10 mg/ml、CaCl2が5mM、リン脂質が4mg/ml、そしてOTGが10mMの最終濃度を得る。この試薬は、上述のように貯蔵のために凍結乾燥しても良いし、使用前には上述のように希釈しても良い。本発明の別の様相においては、この試薬は、リン脂質から洗剤-リン脂質混合ミセルと分泌小包の作成のための機械的手段による方法により、有機溶剤の除去により、洗剤の除去により、そしてサイズの変換により作成される。それらの方法はLichtenberg,D.およびBarenholz,Y.によるMethods of Biochemical Agaly sis,33:337-462(1988)に詳述されており、その開示内よはここに言及することにより、この申請の一部として組み込むものである。有益化合物のリポソームへの組み込みは、リポソームの形成中に、あるいは形成後にリポソームをその化合物と組み合わせることによって行なわれる。リポソーム中にその化合物を導入する方法は様々であり、ここではその方法を制限しない。望ましい方法は実施例で示す。既に述べたように、核酸がリン脂質に閉じこめられるときは、核酸体リン脂質の割合は広範囲にわたる。しかしながら、核酸（プラスミドDNAのような二重線状DNAの形態のもの）約100マイクログラム（μg）をリン脂質約0.1ないし10ミリグラム（mg）と組み合わせることが望ましい。陽イオン・リン脂質がリン脂質配合物に用いられる場合は、特に核酸100μgをリン脂質0.2ないし1.2マイクロモル（μmole）、さらに核酸100μgをリン脂質0.8μmoleと組み合わせることが望ましい。本発明の望ましいリポソーム配合は、本発明の有益化合物の有効量を含むリポソームから構成される。望ましい有益化合物は、ここでさらに説明するようなリポソーム配合物の用途によって決まるものであり、メラニン、染髪料、チロジナーゼ、核酸、毛髪の色の修復剤、毛髪の生長促進剤、および目標とされる毛胞に化学療法抵抗性を与える薬剤などが挙げられる。３．毛胞に目標を定めた薬物療法一つの実施例において、本発明はほ乳動物の毛胞に治療化合物および配合物を選択的および有益的に目標づける方法を述べる。この開示に基づき、化合物および配合物、特にポリマー、染料、蛋白質、核酸および巨大細胞は、それらがリポソームに内包されている限り、毛胞組織に特定的に送達することができる。本発明は、広範囲の有益な、また治療に役立つ化合物を毛胞に送達すること、特に周囲の皮膚組織よりも毛胞そのものに送達することと、本発明の方法により得られる基本的な結果を意図している。治療的化合物とは、核酸、ホルモン、蛋白質、酵素、ビタミンおよび毛胞細胞の成長、条件、色などに治療効果を持つその他の生化学共因子を指す。よって、本発明の方法に用いられる有益な化合物は、大きすぎて角質層や細胞膜のような脂質の障壁を通過できないような巨大細胞やポリマー、化学的性質のために脂質の障壁を通過できない嫌油性分子のような通常では毛胞に到達できない分子など、各種の分子を含む。本発明において使用される他の有益な化合物としては、脂質の障壁と作用し合い、通過する好油性の化合物であるが、他の組織の障壁、例えば真皮を通過できて、毛胞以外の細胞に対して望ましくない効果を及ぼすようなものも含む。したがって、有益な化合物は巨大細胞、ポリマー、嫌油性分子、毛胞以外の細胞に望ましくない効果を及ぼす好油性分子などを含む。特に望ましいものは、毛幹の成長を改善する薬剤（有益な化合物）、胞細胞や毛幹中の色素を除くか、または毛幹の色をつける（染める）薬剤、毛髪の成長を刺激する薬剤、そして毛髪の損失を抑止する薬剤である。毛髪の色を修復したり、染めたりすることに有益な薬剤は、メラニンや染髪料のように色素として直接毛髪に色をつけるものと、蛋白質チロジナーゼのように酵素でメラニン色素前駆体の生産に触媒作用をもたらして、毛胞細胞中の色素の生産を増加するものと、核酸のようにチロジナーゼをエンコードし、発現するものと、毛髪の成長を刺激したり、毛髪の損失を抑止するその他の蛋白質がある。公知のように、メラニンは様々な形態や、ポリマーの長さを持ち得る、チロジンのポリマーである。したがって、「メラニン」という単語を使った場合、ここでは本発明に使われる様々の形態のものを指すものとする。また、本発明に使用されることが意図されているものとしては誘導メラニン、抽出メラニン、修正メラニン、および毛髪色素を提供する望ましい性質を持つその他のメラニンの変種がある。染髪料も非常に良く知られており、広範囲の形態をとり得るが、それによって本発明が制限を受けるものではない。一般的に、染髪料は芳香性化合物で、しばしば突然変異誘導性を有し、また、毛幹または毛胞以外の細胞、例えば真皮や循環系の細胞に望ましくない影響を及ぼす。したがって、本発明は毛胞に選択的に送達し、投与された染髪料が毛胞以外の真皮やその他の組織に接触する程度を低減するという利点を提供することが協調されるべきである。毛髪が失われる状態（脱毛症）で有効な薬剤としては、毛髪の成長を刺激するもの、毛髪の損失を抑止するもの、毛髪の損失を発生する状態、例えば化学療法を抑止するものなどが挙げられる。毛髪の成長刺激剤は一般的に公知であり、ミノクジジル、物質-P、サイクロスポーリンなどの毛髪刺激剤である。望ましい実施例の一つは、化学療法中の毛髪の損失（脱毛症）の防止であり、化学療法の薬剤が、毛胞およびその周囲の組織に及ぼす影響が原因で、患者が化学療法に起因する脱毛を経験する場合である。この場合、本発明は化学療法薬剤の有害作用に対する抑止剤の使用を意図する。本発明のリポソームを媒体とする送達方法によって抑止剤を毛胞に選択的に投与することによって、化学療法薬剤の目的とする全身的な作用には影響を及ぼさない。この実施例の場合、化学療法に起因する脱毛症の望ましい抑止剤は、複数薬剤抵抗（MDR）遺伝因子、望ましくはヒトのMDR-1遺伝子によって発現されたp-糖蛋白質である。毛胞に、リポソーム経由で、ヒトのp-糖蛋白質を発現する能力を持つ発現ベクターから成る核酸を投与することにより、細胞間のヒトp-糖蛋白質を提供し、毛胞に対する化学療法の毒性作用を減少し、それによって化学療法に起因する脱毛症を抑制する。べつの実施例では、ヒトの形質転換成長因子-α（TGF-α）遺伝子を”ウェーブした”毛髪の表現型を逆行させるために使用することが考えられている。例えばMannほか、Cell,73:249-261(1993)およびLuettekeほか、Cell,73:263-278(1 993)を参照。すなわち、本発明はTGF-α遺伝子を発現するcDNA発現ベクターを、 TGF-α遺伝子がウェーブした毛髪の表現型の原因と考えられる場合にウェーブした毛髪の発生を減少するための有益化合物として使用することも意図する。発明はさらに毛胞に有益な任意の遺伝子の投与を意図する。遺伝子は本発明の方法によって毛胞に選択的に送達されて毛胞に有益な効果を与える場合に、毛胞に有益な遺伝子は正常にかつ優先的に毛胞に発現され、したがって正常な遺伝子機能にとって重要である。有益な遺伝子は様々な分子生物学的手法によって確認することができる。例えば、発現された遺伝子のcDNAライブラリーは健康な毛髪を支持する毛胞組織から生成することが可能であり、また毛髪を生成しないまたは細毛を生成する毛胞組織から誘導されたcDNAライブラリーに対して減法交雑することにより濃縮することが可能であり、それによって毛髪に特有な発現のcD NA分子のライブラリーを生成することができる。特に望ましいのは毛髪の成長を刺激することができる遺伝子であり、ここでは毛髪成長刺激遺伝子と呼ぶ。毛髪成長刺激遺伝子は、このリポソームを媒体とする送達方法よって皮膚の毛胞に投与した場合、毛髪の成長を刺激するような任意の核酸を指す。毛髪成長刺激遺伝子は上述のような毛髪に特有なcDNAライブラリーから生成することができる。毛髪成長刺激遺伝子は毛髪に特有なcDNAライブラリーから様々な方法で選択することができる。この遺伝子は強力な毛幹生成力を持つ皮膚組織から得たcDNAライブラリーを、強力な毛幹生成力の無い皮膚組織、例えば毛髪が無かったり、薄くなっている皮膚の部分から得たcDNAライブラリーに対して使用して減法交雑することにより確認することができる。皮膚のそれらの部分には毛胞は存在するが胞細胞が遺伝子発現に変化を起しつつあり、それによって毛髪の状態、特に毛幹の成長率が影響を受けているのである。毛髪の成長に欠陥を持つcDNAライブラリーに対する減法交雑の結果生じるcDNAライブラリーは、さらに毛髪成長刺激遺伝子を見つけるために、毛髪成長を刺激する能力を持っているcDNAを求めて試験管内皮膚組織培養評価でスクリーニングされる。cD NAライブラリーを分離する方法と減法交雑を実施する方法はこの分野においては公知であり、本発明を限定するものと考えられてはならない。治療薬剤は、色素沈着蛋白質または酵素そのもののような、活性配合の形態で毛胞に送達するか、または遺伝子置換療法によって提供され、それによって送達すべき蛋白質が発現されるように核酸が導入される。この遺伝子療法と呼ばれるモードにおいては、置換療法蛋白質が提供され、それが有益な効果を発起する。この蛋白質は、この療法が蛋白質をベースとする、今まで存在していなかった機能を組織内に再形成する（置換える）という意味を表すために置換療法蛋白質と呼ばれる。それは遺伝子または蛋白質がまず最初に意図的に取り除かれ、次に置換えられるという意味ではない。再びくりかえすが、ある種の化合物は毛胞以外の組織または細胞、例えば真皮や、循環系によって到達し得る他の組織に望ましくない効果をもたらす可能性がある。したがって、本発明がもたらす選択性によって、ある種の有益な化合物がもたらす毒性または望ましくない効果を低減するという長所が得られる。これは毛髪の成長刺激剤としては有用であるが、循環系に接した場合、免疫システムを抑圧する可能性を持つサイクロスポリンや、循環系のように化学抵抗性を与えることは望ましくない組織に化学抵抗性を与える薬剤などの場合、特に重要な特性である。本発明のリポソーム配合において治療蛋白質の治療適量は、望ましい結果を生むのに十分な量であり、病気の状態と治療化合物の効力によって変化する。よって、一つの実施例においては、本発明は有益な化合物をほ乳動物の毛胞に次のようなステップを経て直接的かつ選択的に送達することを意図する： a）少なくとも一種類の有益な化合物の有効量をリポソームに組み込み、 b）該リポソームをそのほ乳動物の毛胞を複数個持つ皮膚部分に適用し、それによって該有益化合物が該毛胞に優先的に伝達され、該毛胞に入る。関連する一つの実施例において、本発明は、ほ乳動物の毛胞に有益な化合物を直接的かつ選択的に送達する目的をもって、複数の毛胞を持つほ乳動物の皮膚部分に本発明のリポソーム配合物を局所的に適用するステップからなる送達方法について述べる。そのリポソーム配合物は、少なくとも一種類の選ばれた有益化合物を内包するリポソームからなり、その場合、そのリポソームは選択的に有益化合物を毛胞に送達し、それによって有益化合物は優先的に毛胞に伝達され、毛胞に入る。上述のように、その有益化合物は蛋白質、核酸または毛胞細胞に送達されたときに望ましい性質を持っているその他の分子である。その化合物がメラニンや染髪料のような色素であれ、蛋白質であれ、またチロジナーゼであっても、目的はここに示したように毛髪の色を修復することにある。または、化合物がアロミターゼや、サイクロスポリンである場合、目的は毛髪の成長を刺激することにある。また化合物がチロジナーゼ、アロミターゼ、p-糖蛋白質、TGF-αをエンコードする核酸、毛髪生育刺激遺伝子または他の有益な蛋白質であるか、またはアンチセンスまたはリボザイム核酸を上記のようにエンコードし、発現することができる。よって、関連する一つの実施例においては、本発明は、毛胞が群生しているほ乳動物の皮膚部分に治療上有効な量のリポソーム配合物を適用することによってほ乳動物の毛髪の色を修復する方法を意図する。リポソーム配合物は毛髪の色を修復する能力のある有益な化合物（毛髪修復薬剤）の有効量を含む。毛髪修復修復は各種の染髪料、メラニン色素、蛋白質チロジナーゼ、またはここに述べたように、チロジナーゼcDNAを発現する能力を持った核酸でも良い。関連した一つの実施例において、本発明は、毛胞が群生するほ乳動物の皮膚に治療上有効な量のリポソーム配合物を適用することによって、化学療法を施されているほ乳動物の化学療法に起因する脱毛症を抑止する方法を意図する。そのリポソーム配合物は化学療法の毒性効果を胞細胞の環境において抑止し得る有益な化合物、例えば、毛胞細胞と毛胞に対して化学抵抗を与える蛋白質の有効量を含んでいる。化学療法の毒性を抑止するあらゆる化合物はこの意図に含まれるが MDR-1遺伝子製品（p-糖蛋白質）は特に望ましい。本方法は、牛、羊、馬、ヤギ、豚などの牧畜用動物、猫、犬などのペット、人間などのほ乳動物において実施することができる。一般的にほ乳動物の皮膚には毛胞が存在しており、本方法は生きているほ乳動物の生体内で、そのほ乳動物の毛胞や毛幹の状態を改善するために実施される。一つの実施例においては、選ばれた有益な化合物は毛髪の成長、脱毛症、毛髪の色または毛髪の状態に影響を及ぼす蛋白質である。望ましい例としては蛋白質チロナーゼまたはアロミターゼおよび毛髪を改変する蛋白質をコーディングする核酸である。実施例の一つにおいては、選ばれた有益な化合物はメラニンのような色素である。メラニン、染髪料およびチロジナーゼは毛髪を染色するために望ましい材料である。アロミターゼ、ミノクシジルおよびシクロスポリン-Aは毛髪の成長を刺激するために望ましい材料である。脱毛症の状態において毛髪の成長を刺激するために好適な治療用の化合物はシクロスポリン・アナログ、物質-P、エストローゲン・アナログアンチアンドロゲンである。例えば顔面の毛や陰毛などの毛髪の成長を抑止するために好適な治療用の化合物は、脱毛誘起剤、カタゲン抑制剤、表皮生長因子およびその他の毛髪生長抑止剤などは好適である。別の実施例においては選ばれた有益化合物は、毛髪の生長、脱毛症、毛髪の色または毛髪の条件に影響を及ぼす有益な蛋白を発現する能力を持つ核酸である。望ましいのは蛋白質チロジナーゼ、アロミターゼ、またはその他の毛髪刺激剤、化学療法に起因する脱毛症を抑止するMDR-1遺伝子（例えばp-糖蛋白質）の蛋白質製品、またはそれらの蛋白を合成する酵素である。望ましい実施例の一つにおいては、この発明は年齢を含む様々な理由の基づき毛の色が灰色になったほ乳動物、特に人間の毛髪の色を修復する方法は意図している。この方法は、色が薄弱になったり、灰色になっている複数の毛胞を持っているほ乳動物の皮膚部分に本発明のリポソーム配合物の治療上の有効な量を適用することからなる。リポソーム配合は染髪料、メラニン、チロジナーゼまたは毛胞の細胞にヒトのチロジナーゼの発現できる核酸の有効量を含むことが望ましい。その核酸は、SEQ ID No.1に示されたチロジナーゼ遺伝子連鎖のヌクレチオド連鎖の特性を含むヒトのチロジナーゼ遺伝子をエンコードする。実施例の一つにおいては、リポソーム配合の適用は、長期にわたる毛髪の色の修復の、または長期にわたる化学抵抗のように、処理の目的に応じて長期にわたる効果を提供するために所定の間隔で繰り返すことができる。本発明のリポソーム配合が治療に使用されるかぎりにおいては、リポソーム配合そのものは、治療用の配合であり、その他の成分を含むこともある。本発明の治療用配合には、ここに述べたように少なくとも一種類の本発明のリポソームを生理学的に許容できる担体とともに含んでおり、リポソームはその中に活性成分として分散されて存在している。望ましい実施例の一つにおいては、治療用配合は人間の患者に投与された場合免疫性がない。ここで「薬学的に許容できる」と「生理学的に許容できる」という用語とそれらの文法上の変形が、配合、担体、希釈体および試薬について使われる場合、それらは全く互換的に用いられ、それらはほ乳動物または人間に投与した場合に、吐き気、めまい、胃の調子を崩すなどの望ましくない生理学的効果を起さないような物質を指すものとする。活性内容物を分散した状態を含む薬学的配合を作る方法はこの分野においては公知である。一般的にそのような配合は、水溶性または非水溶性の無菌溶液またはけん濁液として作られるが、使用直前に液体にけん濁することも可能である。この活性内容物は薬学的に許容でき、活性内容物と適合性のある付形剤をここに述べたような治療法に適応した量だけ混合することができる。好適な付形剤は、例えば、水、塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノールなどとそれらの組み合わせである。さらにもし必要であれば、わずかな量の湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などの活性成分の効果を強化する補助剤を含んでいてもよい。本発明の治療用配合物は、薬学的に許容できるそれら内容物の塩（例えば、蛋白質、核酸または他の化合物）を含むことができる。薬学的に許容できる塩は、無機酸、例えば、塩酸、リン酸、または有機酸、例えば、酢酸、主席酸、マンデル酸などによって生成された酸付加塩（ポリペプチドの自由アミノ基から生成された）を含む。自由カルボキシ基から生成される塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウムまたは水酸化鉄、などの無機ベースからも得ることが可能であり、そのような有機ベースにはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノ・エタノール、ヒスチジン、プロケインなどが含まれる。生理学的に許容できる担体はこの分野において公知である。液状担体の例は無菌水溶液で、活性成分と水以外には何も含んでいないか、または生理学的pH値のリン酸ナトリウム、生理学的塩水またはその両方を含む。例えばリン酸塩緩衝塩水のような緩衝液を含んでいる。さらに、水溶液担体は、一種類以上の緩衝液塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、デキストローズ、プロプレン・グリコール、ポリエチレン・グリコールおよびその他の溶質を含むことができる。液状配合物はまた、水に加え、または水以外の液を含むことができる。そのような追加の液相としては、グリセリン、植物油、例えば、綿実油、有機エステル例えばオレイン酸エチル、水-油乳濁液などが挙げられる。治療用配合物には、本発明のリポソーム配合物、典型的なものとしては、治療用配合物の全重量に対する比率で、少なくとも0.1重量パーセントのリポソーム配合物を含む。重量パーセントは全配合物に対するリポソームの重量の比率である。したがって、0.1重量パーセントは全配合物の100グラムに対して、配合物が0.1グラムあることを意味する。リポソーム配合物またはその中の有益化合物の治療上有効な量は、望ましい効果を与えるべく、すなわち、与えるべき利益に応じて、目標となる毛胞に有効に利益を与えるべく、計算された所定の量である。したがって、有効な量は患者の毛胞または毛幹の状態に関連する一つまたは複数の症状の改善によって測定することができる。よって、本発明のリポソーム配合物の投与量は処理すべき毛胞の状態が改善されるような望ましい効果をもたらすに十分な範囲とする。投与量は、有害な副作用を生じるほど大きくてはならない。一般的に、投与量は年齢、状態、性別および患者の症状の程度に従って変化し、この分野の一つの技能によって決定しても良い。投与量は、合併症が生じた場合は、個々の医師の判断によって調節することができる。配合物の投与の処方に適した方法で、かつ、治療上有効な量だけ投与しなければならない。投与量は患者、活性成分を利用する患者のシステムの容量、望ましい治療効果による。投与されるべき活性成分の精密な分量は実施者の判断により、各個人によって異なる。しかしながら全身に適用するために好適な投与量はここに開示され、投与の状態による。投与のために好適な方法は様々であるが、典型的な例としては、最初の投与のあと、1-2時間の間隔でその後の投与を行う。４．遺伝子のための核酸発現ベクター特に望ましい一つの実施例においては、本発明は本発明のリポソームを媒体とする目標づけ方法によって有益な蛋白を発現するための発現ベクターとして機能し得る組み換え型DNA分子の使用を意図する。「組み換え型DNA（rDNA）分子」は二つのDNAセグメントを効果的にリンクすることによって生成される。従って、組み換え型DNA分子は、一般的には天然では一緒に発見されることのない、少なくとも二種類のヌクレオチド配列から構成される雑種DNA分子である。共通のオリジンを持っていない、すなわち、発生的に異なるrDNAは「異種」と言われる。生体においては蛋白質またはポリペプチドの酸残基配列は遺伝子コードを介して直接的に蛋白質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（DNA）配列に関連する。従って、構造遺伝子またはDNAセグメントはアミノ酸残基配列、すなわち蛋白質またはポリペプチドによって定義され、そのためにコードする。遺伝子コードの重要で、公知の特長はその重複性である。すなわち、蛋白質を作るのに用いられたアミノ酸の大半にとって、1種類以上のヌクレオチド・トリプレット（コードン）は、特定のアミノ酸残基をコードし、指定する。したがって、各種のヌクレオチド配列が特定のアミノ酸残基配列に対してコードすることもある。それらのヌクレオチド配列はすべての生体において、同じアミノ酸残基配列を生成するので機能的に同等であると考えられる。時によると、メチルアルコールと混合したプリン体またはピリミジンの変種は与えられたヌクレオチド配列に組み込まれる。しかしながら、そのようなメチルアルコールとの混合はいずれにしてもコーディングの関係に影響を及ぼすことはない。本発明において使われるDNAセグメントは、ここに述べられたような有益な蛋白質をエンコードするDNA配列を含むことを特徴としている。特に望ましいセグメントはチロジナーゼ、アロミターゼ、他の毛髪生長刺激蛋白質、メラニン、 p-糖蛋白質、TGF-α、またはそれらの蛋白質を合成する酵素をエンコードする。すなわち、本発明のDNAセグメントは、有益な蛋白質の1種または数種をエンコードする構造遺伝子の存在によって特徴づけられている。望ましくは、その遺伝子はコードンの連続的な直線配列として存在し、そこでは各コードンが有益な蛋白質に見出されるアミノ酸残基に対してコードするようなもの、すなわちイントロンのない遺伝子である。望ましい実施例の一つは、チロジナーゼ蛋白質に連鎖的に対応するチロジナーゼを定義するアミノ酸残基配列をコードするDNAセグメントであり、そのDNAセグメントはチロジナーゼを発現することができる。望ましいDNAセグメント・コードは、実質的にチロジナーゼをエンコードする核酸配列によって構成されるアミノ酸残基配列のためにコードする。ヒトのチロジナーゼ遺伝子とそのヌクレオチド配列は、ヒトのチロジナーゼを発現するためのcDNA配列を含み、公知であり、下記文献に詳述されている。Tamateら,J.Exp.Zool.,250:304-311,(1980);柴原ら,J.ExD.Med.,156:403-414(1989);竹田ら,Biochem.BioDhv.Res.Comm.,162:984- 990(1989);Bouchardら,J.Exp.Med.,169:2029-2042(1989);および Brichard,J.Exp.Med.,178:489-495(1993)。遺伝子コードに重複性が存在するかぎり、各種のヌクレオチド配列が特定のアミノ酸残基配列を発現するために利用されることがあるということが了解されている。それゆえ、1実施例では、本発明はむしろ、SEQ ID NO 1.に示されるアミノ酸残基配列のアミノ酸残基配列特性をもつヒト・チロシナーゼ蛋白質を暗号化するヌクレオチド配列の使用を意図している。本発明によれば、ヒト・チロシナーゼを発現するのに特に好適なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO 1.に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列特性をもつ。ヒト・チロシナーゼ遺伝子の発現には、ベクターが哺乳動物、特にヒト細胞に対して拒絶反応を起さないかぎり多様な発現ベクターのいずれも利用できる。適切なベクターはよく知られている。好適なベクターは例で説明するpRHOHT2ベクターであるが、他の哺乳動物の発現ベクターも適切である。他の好適な実施例は、多重薬剤耐性（MDR）遺伝子製品を定義するアミノ酸残基配列を暗号化するDNA斬片であるが、より好適なのは、p-糖蛋白質と呼ばれるMDR-1遺伝子製品で、配列が野性型のp-糖蛋白質と一致するものであり、かつD NA断片がp-糖蛋白質を発現できるものである。好適なDNA断片は、主としてp-糖蛋白質暗号化核酸配列から成るアミノ酸残基配列のために暗号化を行う。ヒトp- 糖蛋白質、MDR-1遺伝子およびMDR-1ヌクレオチド配列は、ヒトp-糖蛋白質を発現するためのcDNA配列とともによく知られており、かつ、Chen et al.,Cell,47:38 1-389(1986)、Ueda et al.,J.Boil.Chem.,262:505-508(1987)およびKioka et al .,Biochem.Biophvs.Res.Comm.,162:224-231(1989)にも記述されている。遺伝子コードに反復がある限りにおいて、本発明はヒトp-糖蛋白質を暗号化するヌクレオチド配列で、好適なのはSEQ ID NO.2に示されるアミノ酸残基配列のアミノ酸残基配列特性をもつヌクレオチド配列の使用を意図することを理解している。本発明によれば、ヒトp-糖蛋白質の発現のため特に好適なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.2で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列特性を有する。他の好適な実施例は、配列が野性型のTGF-αと一致する形質転換中の成長因子アルファ（TGF-α）蛋白質を定義するアミノ酸残基配列を暗号化するDNA 断片であり、かつDNA断片がチロシナーゼを発現できるものである。好適なDNA断片は、主としてTGF-α暗号化核酸配列からなるアミノ酸残基配列のために暗号化を行う。ヒトTGF-α遺伝子およびそのヌクレオチド配列は、ヒトTGF-αを発現するためのcDNA配列とともによく知られており、Jakowlcw et al.,Mol.Endocrinol . ,2:1056-1063(1988)にも記述されている。遺伝子コードに重複がある限りにおいて、本発明はヒトTGF-α蛋白質を暗号化するヌクレオチド配列で、好適にはSEQ ID NO.3で示されるアミノ酸残基配列のアミノ酸残基配列特性をもつヌクレオチド配列の使用を意図することを理解している。本発明によれば、ヒトTGF-αを発現するため特に好適なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO 3に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列特性をもつ。また、前述の有益な蛋白質を暗号化する相同性DNAおよびRNA配列も意図している。他の実施例では、毛胞細胞遺伝子の発現を選択的に抑制するため、本発明はアンチセンスまたはリポソーム核酸の毛胞細胞への送達、および毛胞細胞機能面の抑制を意図している。アンチセンス核酸は本分野では一般によく知られており、メッセンジャーRN A（mRNA）のセンス鎖とハイブリダイゼーションする機能を有し、その結果ハイブリダイゼーションされたmRNA分子の通常の発現を阻止する。アンチセンス核酸の配列は、公知のように、ハイブリダイゼーションが行われるmRNAのヌクレオチド配列に左右される。例えば、Stein et al.,Science,261:1004-1012(1993)を参照。またリポゾーム核酸も、毛胞細胞内のssRNAおよびssDNAを選択的に分割できる1本鎖（ss）RNA分子として、本分野では一般によく知られている。リポソームは、毛胞細胞内で、標的ssRNAまたはssDNA分子の分割により、遺伝子発現を選択的に抑制するのに有用である。アンチセンスまたはリポソーム核酸の典型的な標的は、脱毛症、抜け毛、毛髪の色素、強度、状態の欠落など、毛胞および毛幹の望ましくない特徴の原因となる遺伝子のような毛胞細胞内の有害な遺伝子である。好適な実施例では、本発明はリポソームを媒介物として、アンドロゲン受容体を生成する遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスまたはリポソーム核酸を送達することで、受容体の毛胞細胞生成を抑制し、その結果毛髪の脱落を阻止できることを意図している。アンチセンスまたはリポソーム核酸の試料および使用は本分野ではよく知られており、特定のアンチセンスまたはリポソーム核酸のデザインそれ自体は、本発明の一部とは考えられない。しかし、送達核酸により発揮される効果の送達および選択性を改善するため、本発明がリポソームを媒介物としてアンチセンスまたはリポソーム核酸を毛胞へ送達する方法を意図する限りにおいて、本発明は特定の種類に限るものではなく、むしろ有益な化合物としてその送達の一般的方法を説明するものである。有益な蛋白質を暗号化するより大きなDNA断片の生成に用いられるDNA新片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例えば、Matteucci,etal.,（J.Am.Chem.Soc. ,103:3185-3191）のホスホトリエステル方法、あるいは自動合成法を用いる化学的技法により容易に合成できる。さらに、より大きなDNA断片はより小型のD NA断片から、DNN断片を定義づけるオリゴヌクレオチド・グループの合成、続いて完全な断片を形成するためのオリゴヌクレチドのハイブリダイゼーションおよび結紮など、公知の方法で容易に生成することができる。さらに、本来有益な蛋白質を暗号化する構造遺伝子から成るDNA断片は、自然源から単離された有益な蛋白質を定義する遺伝子を含有する組換えDNA分子から得られる。自然源の例は本文で指摘した参考文献にそのcDNA配列が記述されている。そのほか、本発明は本発明のDNA断片を含有する組換えDNA分子（rDNA）の使用を意図している。rDNAは、ベクターを本発明のDNA断片に作動的に結合することにより生成することができる。本文中で使用されているように、「ベクター」とは、細胞内で自律的な複製が可能なDNA分子で、そのDNA分子に他のDNA断片を作動的に結合することにより、つながれた断片の複製を誘発することができるDNA分子を意味する。有益な蛋白質を暗号化する遺伝子の発現を指令できるベクターは、本文中では「発現ベクター」と呼ばれている。従って、組換えDNA分子とは、自然界では通常共には存在しない少なくとも2つのヌクレオチド配列から成るハイブリッドDNA分子である。本発明のDNA断片が作動的に結合するベクターの選択は、本分野でよく知られているように、蛋白質の発現や形質変換される宿主細胞などのような好ましい機能的特性に直接依存しており、この事実は組換えDNA分子の構造の分野に特有の限界である。しかし、本発明が意図するベクターは、少なくとも、DNA断片に作動的に結合されて含まれている有益な蛋白質構造遺伝子の複製の指令、そして好適には発現も指令することが可能である。好適な実施例では、本発明が意図するベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、形質転換された細菌宿主細胞などの原核生物の宿主細胞内で、組換え DNA分子の自律的な複製および維持を指令する能力をもつDNA配列を含む。かかるレプリコンは本分野ではよく知られている。さらに、原核生物のレプリコンを含めたそれらの実施例には、遺伝子の発現が細菌宿主に薬剤耐性を起すものも含まれる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンビシリンまたはテトラサイクリンに対して耐性を与える遺伝子である。原核生物のレプリコンを含むベクターには、細菌宿主細胞内の有益な蛋白質の遺伝子の発現（転写および翻訳）を指令する形質転換された大腸菌などの原核生物のプロモータを含めることができる。プロモータはDNA配列により作られた発現制御要素であり、RNAポリメラーゼの結合と転写の開始を指令する。細菌宿主と適合するプロモータ配列は、一般に、本発明のDNA新片の挿入に便利な制限部位を含むプラスミド・ベクターのなかで準備される。かかるベクター・プラスミドの典型的な例には、Biorad Laboratories（Richmond,CA）より入手できるpU C8,pUC9,pBR322,およびpBR329ならびに、Pharmacia,Piscataway,N.J.より入手できるpPL,およびpKK223がある。本発明で使用の組換えDNA分子を形成するため、真核生物細胞と適合し、好適には哺乳動物の細胞、特に毛胞細胞と適合する発現ベクターを用いることができる。哺乳動物の細胞を発現するベクターは、本分野ではよく知られており、数社より入手が可能である。一般に、かかるベクターは、適切なDNA断片の挿入に都合のよい制限部位を含めて用意されており、また哺乳動物の細胞内の遺伝子発現に必要な標識も提供している。かかるベクターの典型的な例には、In vitrogen（San Diego,CA）より入手できるpREPシリーズ・ベクターおよびpEBVhi s、American Type Culture Collection（ATCC）より入手できるベクターpTDT1（ ATCC＃31255）,pCP1（ATCC＃37351）およびpJ4W（ATCC＃37720）、ならびに類似の哺乳動物の発現ベクターなどがある。特に好適なベクターは、この場合毛胞細胞内における遺伝子の発現を制限する調節プロモーターの作用により、組織を特定する方法で遺伝子の発現ができる哺乳動物の発現ベクターである。首尾よく形質転換された毛胞細胞、すなわち本発明のrDNA分子を含む毛胞は、公知の手法で同定することが可能である。例えば、本発明のrDNAの導入により形成される細胞は、Southern,J.Mol.Biol.,98:503(1975)またはBerent et al.,B iotech. ,3:208(1985)に記述されているような核酸ハイブリダイセーション法を用いて、特定のrDNAの存在を検出するためのアッセイを行うことが可能である。形質転換の成功を確認するには、rDNAの存在を検出するアッセイを直接行うほか、発現蛋白質を検出するための公知の免疫学的方法も可能である。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された胞細胞は、有益な蛋白質を示す蛋白質を生成するので、生成に続いて免疫学的方法で直接効力検定を行うことが可能である。標的組織が首尾よく形質転換されたことを確認する別の方法として、有益な化合物の投与により機能が発揮されたかどうかを調べる標的組織の評価がある。例えば、化合物がチロシナーゼを発現している核酸である場合、発揮される色素機能や、チロシナーゼ活動の存在、あるいはL-ドパの酵素の変換は、標的組織で直接検出することができる。Ｂ．毛胞に有益な蛋白質を暗号化する遺伝子を同定する方法他の実施例では、本発明は毛胞に対して有益な効果を発揮する蛋白質を暗号化する遺伝子を同定する方法を提供する。その方法は次の幾つかのステップで構成されている。（1）興味の対象である遺伝子を含む核酸分子を、本発明のリポソーム組成の中へ取り入れること。（2）核酸含有（核酸を包み込んだ）リポソームを、本文中に記述されている、少なくとも1つの毛胞をもつ皮膚標本の組織培養と接触させることにより、核酸を毛胞に送達すること。（3）暗号化されたいかなる蛋白質の発現の時点で、送達された核酸が毛胞に有益な効果を発揮しているかどうかを観察すること。観察された結果は、毛髪の色、状態、成長率、活力等の変化や、関連する毛胞の細胞構造の条件の変化、細胞反応の現われなどの変化であり得る。 1実施例では、本方法は、毛胞に有益な効果をもたらす蛋白質を発現できる遺伝子の存在を検出するための遺伝子ライブラリーのスクリーニングによく適合している。遺伝子ライブラリーは、公知のようにcDNAライブラリーまたはゲノム DNAライブラリーの形でもよい。有益な効果が発揮されるかどうかは、本文中でさらに説明するように、効果を検出するためのスクリーニング法に依存される。以下の例は、本発明の特定の実施例の説明を提供するものであり、明細書および特許請求範囲をいかなる方法にても限るものではない。本例は毛胞と毛髪の成長問題に対するリポソームを基にした治療法の適用と試験について詳しく説明している。分数およびパーセントはその旨の表示がないかぎり重量を表わす。例１．リポソームを媒介物とする色素の毛胞への送達リポソームを媒介物とする有益な薬剤の毛胞への送達は、毛胞を含む皮膚標本が培養される自然状態の皮膚サンプルの組織培養法、ならびに、治療学的リポソームで治療中の毛胞の成長および毛胞細胞の詳細な観察を行うことにより立証される。皮膚の組織培養のため、異系交配の白毛マウスまたはヌードマウスの剃毛された皮膚片約2×5×2□が、解剖顕微鏡の下で数片採取され、つづいて、Li et a l., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,88:1908-1912,(1991)に記述されているコラーゲン・ゲルで支持されたスポンジ上で組織培養された。組織培養が約24時間続けられたあと、皮膚の組織培養をリポソーム試料と接触させた。リポソームは約15mgのフォスファチジルコリン（PC）乳剤を、1ml当たり約2 0mgの蛍光染料カルセインを含有するリン酸塩緩衝食塩水（PBS）の中で超音波をかけることにより準備された。また、リポソームは1ml当たり約20mgのNBD化合物を含有する乳剤を使用したNBDフォスファチジルコリン蛍光染料を包み込むことにより準備された。リポソームは、リン酸塩緩衝食塩水で薄められたセファローズ4B柱上のゲル濾過により、包み込まれなかった染料から分離された。包み込まれた染料の量は分光蛍光計で測定された。2種類のPC、すなわちエッグPC（EPC）およびジパルミトイルPC（DPPC）が用いられた。相変化温度の理由により、DPPC から作られたリポソームは37℃でゲル相であり、一方EPCから作られたリポソームは37℃で液体-結晶相である。マウス皮膚の組織培養のサンプルは、各リポソームならびにリポソームの準備で用いたものと同濃度の（包み込まれなかった）「フリー」カルセイン染料の溶液により、約20分間培養された。余分のリポソーム組成を除去するため、組織サンプルをリポソーム無含有の培地で十分洗浄したあと、標本をBioRad社のBHS フィルター・ブロック付きMRC600型レーザー共焦顕微鏡で分析した。この顕微鏡は488nmの波長で組織を刺激し、520nmの波長で放射される光を通すものである。これらのパラメータは、Haugland,（Ed.）Molecular probes,Handbook of Fluor escent Probes and Research Chemicals ,Molecular Probes,Inc.,Eugene,（1989 -1991および1992-1993）により報告されているカルセインのための刺激と放射の最大値に近い。これらの放射および刺激波長が使用されるとき、組織の自己蛍光は見られない。MRC-600型共焦映像装置（Bio-Rad社、Richmond,CA）をPlanApo社の口径10Xの対物レンズを備えたニコンのOptiphotに装着した。図1Aはカルセインを包み込んたEPCリポソームで培養された皮膚の組織培養を示す。蛍光染料が高い効率で毛胞へ優先的に送達されていることに注意。図2B は「フリー」カルセイン溶液で培養された皮膚の組織培養を示す。いずれの特定皮膚構造にも優先的な着色が見られない比較的低い蛍光に注意。図2Bの写真は図 1Aとおなじレンズ口径および利得調節のパラメーターで作成された。使用されるリポソームの型に依存するリポソーム媒介の送達における相違の実験には、リポソームにDPPCを用いたほかは上記と同様に準備した。カルセインまたはNBDフォスファチジルエサノラミンのいずれかを蛍光標識として用いて得られた結果は、EPCが使用されたとき毛胞内よりもむしろ毛胞の表面において毛胞の選択的標識を示した。従って、異なるリポソーム組成により、あらかじめ選択された毛胞の部位へ選択的に送達される可能性が増すことがわかる。上述の結果は、DPPCまたはEPCリポソームに包み込まれた染料による毛胞への特に優先的な着色と、「フリー」染料による毛胞への優先的な着色の欠如とを比較した場合の差異を示している。従って「フリー」染料に比べ、リポソームに包み込まれた染料は毛胞と特異的に結びつき、リポソームが特に毛胞を標的にすることを示している。２．リポソームを媒介物とするメラニンの毛胞への送達毛胞を標的にした有益な化合物の送達は、メラニンをモデルに使用して立証されている。それはメラニンが色素沈着という利益を供するからである。この目的で、超音波処理によりリポソームを準備した。5mlの丸底フラスコの表面に薄膜を形成するため、クロロフォルム溶液から約20mgのエッグ・フォスファチジルコリンを真空ドライヤーで約1時間回転蒸発させた。乾燥したリン脂質の薄膜は渦動ミキサー上の約0.5mlのリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）の中で懸濁され、つづいて、マイクロチップを備えたBranson社のプローブ型の超音波処理器で、パワーレベル3で約8分間超音波処理が行われた。つづいて、間超音波をさらに約4分かけることにより、0.5mlのメラニン溶液（10mg/ml）が上記の懸濁物に包み込まれた。リポソームは包み込まれなかったメラニンから、リン酸塩緩衝食塩水で均衡が保たれたセファローズ4B柱上のゲル濾過により分離された。異系交配された生後1、2週間の白毛マウスの皮膚の一部を数片（各サイズは約2×5×2□）解剖顕微鏡の下で採取した。つづいて、これらのサンプルを、例1 に記述するように、コラーゲン・ゲルで支持されたスポンジ上で組織培養した。約24時間組織培養が続けられたあと、リポソームとこの皮膚標本との接触が開始された。マウス皮膚の組織培養はリポソームで約12時間培養された。対照として、組織培養された皮膚の一部が、リポソームの標本で用いられたものと同濃度の「フリー」メラニン溶液で、同じく約12時間培養された。皮膚の組織培養は、生きた細胞だけに存在する非特異性のエステラーゼの作用により蛍光を放つ染料2',7'-bis(2-カルボキシエチル)-5で対比染色された。組織が十分洗浄されたあと、フルオレセイン・キューブを備えたニコンの蛍光顕微鏡で標本を分析した。顕微鏡下では、生きた組織および細胞は緑色の蛍光を放ち、組織に局在する黒くて濃いメラニンの沈着が、緑の蛍光色をバックに鮮明に観察できる。つぎに、すべての皮膚サンプルをフォルマリンで固定し、脱水、パラフィン化、パラフィン埋込み、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）染色などにより処理された。図２は、リポソームを媒介物として、メラニンがH&Eで染色された皮膚の組織培養の毛胞へ標的送達されたことを示している。メラニンを包み込んだリポソームで12時間処置が行われた白毛マウスの皮膚のパラフィン切片標本では、大多数のメラニンが毛胞の周囲に局在しているのが観察される。図３はH&E染色の毛胞の断面である。リポソームに包め込まれたメラニンが、毛幹そのものに送達され、典型的な通常色をもつ毛幹の末端が区別されたケラシノサイトにおいて、バンド様メラニン分布模様が形成されていることを示している。図３で観察さたリポソームに送達されたメラニンが、自然のメラニン色素をもつ毛幹を模倣して、毛幹に自然な模様を描き出していることに注意。皮膚の組織培養が「フリー」メラニンで培養された対照では（ここには図示されていない）、毛幹にも毛胞細胞にも「フリー」メラニンは観察することができない。従って、リポソームは特異的に重要で大きなポリマーを毛胞へ送達するだけでなく、通常模様の毛幹そのものに入ることが可能である。３．リポソームを媒介物とする核酸の毛胞への送達 a．核酸の培養細胞系への送達核酸の毛胞への標的送達は、DNA発現ベクターの典型的なサイズおよび、典型的な構造遺伝子のサイズの理由から蛋白質を発現できる核酸のモデルとして、約1キロベース（kb）の長さに分割されたマウスのゲノムDNAを使用して証明された。約1kbのDNAをマウスのゲノムDNAライブラリーから単離し、低沸騰点をもつアガローズからMagic DNA Purification Kit(Promega社、Madison，WI)で精製された。約50ngのDNAに、Random Primer DNA Labeling Kit(BioRad社、Richmond,C A)で[³⁵S]dATP(DuPont)の標識を付された。35S-dATP標識のDNAの比放射能は、2. 6x10¹⁰cpm/μgだった。リポソームは凍結および解凍により準備された。5mlの丸底フラスコの表面に薄膜を形成するため、クロロフォルム溶液から約20mgのエッグ・フォスファチジルコリン（EPC）を真空ドライヤーで約1時間回転蒸発させた。乾燥したリン脂質の薄膜が渦動ミキサー上の約0.5mlのリン酸塩緩衝食塩水（p H7.4）の中に懸濁し、つづいて、マイクロチップを備えたBranson社のプローブ型の超音波処理器で、パワーレベル3で約8分間超音波処理を行った。つづいて激しい渦動を約1分間行い、その後凍結および解凍を行うことにより、上記の懸濁物にさらに0.5mlの[³⁵S]dATP標識のDNA溶液が加えられた。リポソームは包み込まれなかった[³⁵S]dATPから、PBSで均衡を保たれたセファローズ4B柱上のゲル濾過により分離された。分離が行われる間リポソームに標識を付すため、約50μl のカルセイン（約10mg/ml）が溶液のなかに加えられた。[³⁵S]dATP標識をもつ包み込まれたDNAの比放射能は、液体シンチレーション・カウントで測定して、2.5 x10¹⁰cpm/μlだった。異系交配された生後1〜5週間の白毛マウスの皮膚の一部を数片（各サイズは約2×5×2□）解剖顕微鏡の下で採取した。つづいて、これらの標本は、例１で説明するように、コラーゲン・ゲルで支持されたスポンジ上で組織培養された。約24時間組織培養が続けられたあと、リポソームとこの皮膚標本との接触が開始された。つづいてマウス皮膚の組織培養はリポソームで約44時間培養された。対照として、同濃度の裸の[³⁵S]dATPの溶液がリポソーム標本で用いられ、皮膚の組織培養で同じく約12時間培養された。皮膚の組織培養は、pH7.0のリン酸塩緩衝食塩水で洗浄され、組織学的カプセルに入れ、10％のフォルマリン（v/v）で固定した。固定した皮膚の培養はつづいて脱水、パラフィンへの埋込み、切片が行われ、組織学の分野で熟練を積む者に公知の標準的な方法でスライド上に置かれた。スライドからパラフィンを取り除いて、コダックNTB乳剤で被膜され、５日露出して現像した。例えば、Freeman etal.,Proc.Soc.Natl.Acad.Sci.USA,83:2694-2698(1986);Hoffman et al.,Proc .Soc.Acad,Sci.USA ,88:2013-2017(1989)およびLietal.,Proc.Soc.Acad.Sci.USA, 88:1908-1912(1991)を参照。現像を終えたスライドはすすがれ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色され、エピ・イルミネーション偏光フィルターを付けたニコンまたはオリンパスの写真用顕微鏡を用いて観察した。図４の組織学的オートラジオグラフは、皮膚がDNAリポソームで44時間培養された後の、[³⁵S]DNA標識の組織培養皮膚の毛髪および胞細胞を示している。図４の矢印が示すように、細胞膜、細胞質、および細胞核内の[³⁵S]DNAによる高い放射性の標識が見られる。これはリポソームが細胞膜を通してDNAを送達し、D NAが細胞質を通して核へ送達されたことを表わしている。組織培養皮膚が裸の[³⁵S]DNAで処理されたとき、放射能標識の細胞はわずかしか見られなかった。視野20X当たりの標識毛胞のパーセントおよび、最大標識部位の毛胞当たりの標識細胞のパーセントは、図４のオートラジオグラムから計算可能である。視野20X当たりの標識毛胞のパーセントは、リポソーム送達の標識DNAの場合、裸の標識DNAに比べて7倍も高く、また、1毛胞当たりの標識細胞は、リポソーム送達の標識DNAの場合、裸の標識DNAに比べて少なくとも4倍も高いことが判明した。この例は、リポソームが特異的かつ有効的にDNAを毛胞へ導くことを立証し、それゆえ、核酸を包み込んたリポソームが、毛髪成長プロセスを標的にした遺伝子療法にとり有効な試薬であることを確証している。ｂ．リポソームに包み込まれたヒト・チロシナーゼ遺伝子を発現している核酸の培養細胞系への送達リポソームを媒介物とする送達およびチロシナーゼ遺伝子の有効性を立証するため、リポソームを用いてクローンされたヒト・チロシナーゼ遺伝子を組織培養細胞系へ移植した。この目的で、公知の凍結および解凍方法でリポソームが準備された。5mlの丸底フラスコの表面に薄膜を形成するため、フォスファチジルコリン（PC）、コレステロール（Chol）、フォスファチジルエサノラミン（PE）を各々５：３：２の比率で含有する約20mgのリン脂質を、クロロフォルム溶液から真空ドライヤーで約1時間回転蒸発させた。乾燥したリン脂質の薄膜を渦動ミキサー上のpH7.4のリン酸塩緩衝食塩水（PBS）2mlの中に懸濁し、つづいて、マイクロチップを備えた Branson社のプローブ型超音波処理器で、パワーレベル3で約8分間超音波処理を行った。つぎに、超音波処理した懸濁物にプラスミドを加え、その混合物を水浴で2分間超音波処理し、凍結および解凍を3回繰り返して、核酸を含むリポソーム組成を生成することにより、200μgのプラスミドpRHOHT2がリポソームに包み込まれた。プラスミドpRHOHT2は、Dr.S.Shibaharaより入手し、Shibahara et al.,J.Bi ol.Chem. ,262:12889-12892(1987)および、Takeda et al.,Biochem.Biophvs.Res. Comm. ,162:984-990(1989)に記述されており、哺乳動物細胞内のチロシナーゼ発現のためのプロモーターを含む、ヒト・チロシナーゼcDNAの全長を含んでいる。ヒト繊維芽細胞系FS-3およびマウス無メラニン性のK1735細胞系は、10％のウシ胎児血漿（FBS）を含有するイーグルMEM培地入りの60mmの培養基、ならびに 10％のFBSを含有するDulbeccoの改良イーグル培地で、それぞれ24時間培養された。その後、1.5mlの培地をそれぞれ含む各培養基で、培養細胞を0.5mlのチロシナーゼ遺伝子を包み込んだリポソーム組成と接触させ、接触細胞は培養条件下で 48時間培養された。つづいてリポソーム含有培地の吸引のあと、細胞は普通の培地でさらに7日間（FS-3）または3日間（K1735）培養された。つぎに細胞がトリプシン消化で採集され、細胞をサイトスピン・スライドに付着させるため、800 ×gで5分間遠心分離器にかけられた。対照として、0.5mlのリポソーム試料の代わりに、培地0.5mlの中の裸プラスミド50マイクログラム（μg）が2種類の細胞に加えられた。チロシナーゼの発現は、ドパ酸化酵素反応および処理細胞内のチロシナーゼのための免疫組織化学的染色を測定して評価された。ドパ酸化酵素の活性を検出するため、Kugelman et al.,J.Invest.Dermatol. ,37:73-76(1961)に記述されているように、サイトスピン・スライドはPBS内の1m g/mのL-ドパで37℃で12時間培養された。つづいて、サイトスピン・スライドは確立された手順でヘマトキシリンおよびエオシンにより対比染色され、ドパ酸化酵素に陽性反応を示す細胞が同定され、顕微鏡下で細胞数が数えられた。チロシナーゼを免疫組織化学的に検出するため、チロシナーゼ含有細胞の染色にDako LSAB（Streptavidin-biotinのラベル付きの）キットが用いられた。サイトスピン・スライドはアセトンで10分間固定され、その後空気で乾燥された。つづいて、キット・メーカー（Dako社,Carpinteria,CA）の説明に従い、過酸化水素、遮断血漿、一次抗体（抗チロシナーゼ）の希釈（１：400）、連鎖抗体、ペルオキシダーゼ複合ストレプタヴィディン、および、3-アミノ-9-エチルカルバゾル基質溶液の中で、培養が各10分間連続的に行われた。一次抗体は、Tomita et al.,J.Invest.Dermatol.,85:426-430(1985)およびJimenezetal.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA ,85:3830-3834(1988)に記述されているラット抗ヒトチロシナーゼ・モノクロナル抗体TMH1であった。連鎖抗体は、抗マウスおよび抗ラットIgGの混合からビオチンに複合されたもので、メーカー（Dako社）より入手した。つぎに、処理されたサイトスピン・スライドをマイヤーのヘマトキシリンで軽く対比染色し、液体グリセロール・ゼラチン（Dako社）でスライドに固定した。陽性対照がヒト黒色腫組織の冷凍切片を使用して同様に準備された。陰性対照は一次抗体をPBSと置き換えることで準備された。結果は、ドパ酸化酵素反応法または免疫組織化学染色法により検出された時、リポソームで処理されたPS-3およびK1735両細胞内でのチロシナーゼ発現を示している。チロシナーゼを発現している細胞のパーセントは、いずれの効力検定でも全細胞の約52％であった。陰性対照細胞は酸化酵素法および免疫組織化学染色法のいずれの効力検定によっても陰性反応を示した。核酸の培養細胞へのトランスフェクションを行うリン酸カルシウム法に比べた時、チロシナーゼ遺伝子発現プラスミドの細胞への移植の有効性は、リン酸カルシウムの代わりにリポソームが用いられたとき、約50％大きいことが観察された。これらの結果は、リポソームが核酸発現ベクターを細胞へ送達するのに効果的で効率がよいこと、さらにリポソームが発現ベクター・プラスミドを送達でき、その結果暗号化遺伝子を発現しうることを立証している。最後に、結果はチロキシナーゼ遺伝子が哺乳動物の細胞に効果的に導入でき発現できることを立証している。 c．組織培養皮膚の毛胞内におけるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の送達と表現選択的送達および毛胞内での発現を立証するため、細菌遺伝子lac -Zを暗号化するβ-ガラクトシダーゼが、リポソーム試料中の組織培養皮膚標本へ送達された。プラスミドpM-MuLV-SV-Lac-Zは、モロニーのネズミ白血病ウイルス（M-MuLV）および、哺乳動物細胞内でβ-ガラクトシダーゼを発現できるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（Lac-Z）の発現を制御するSV40ウイルス（SV）から得られた哺乳動物のプロモーターを含んでいる。リポソームは例3bで説明するように準備された。ただし、リン脂質はPC,PE およびコレステロールを5:2:3の比率で包含し、またプラスミドDNAのリン脂質に対する割合は、全リン脂質の200μgに対しDNAが20mgである。例１で説明されるように白毛マウス皮膚の組織培養を行った。ただしリポソーム組成は培地で4日間培養された。つづいて皮膚組織培養培地は、おなじ培地でリポソームを含有ぜず、かわりにLac-Z基質X-galを含有する培地へ取り替えられ、このX-galを含有する培地を組織培養条件下で18時間培養した。これは組織培養皮膚標本に存在するβ-ガラクトシダーゼが、X-galを典型的な可視青色染料に変換できるようにするためである。リポソームに包み込まれたプラスミド組成と同量のDNAを用いて、制御されたリポソームの送達が裸のプラスミドDNA（pM-M uLV-SV-Lac-Z）で行われた。つぎに組織培養サンプルは、組織化学的検査のため切片され、拡大率が125X および250Xの顕微鏡で検査された。結果は図5A〜5Dに示される通りである。暗青色の点で示される発現Lac-Z遺伝子の存在は、リポソームに取り入れられたプラスミドを受けた図5Aおよび図5Bだけに見られ、図5Cおよび図5Dには暗青色の点は見られない。さらに、暗青色の点は毛胞には見られるが、毛胞に隣接する組織にはあまり見られない。結果は、Lac-2遺伝子が毛胞で発現されたのに、組織培養皮膚標本の他の部位では発現されなかったことを示しており、リポソーム送達方法の選択性を示唆している。４．マウスの生体内でリポソーム媒介により有効な化合物を毛胞へ送達する方法生体内で有効な化合物を毛胞へ送達するため、本方法を用いて、メラニンまたはカルセインのいずれかを含む本発明のリポソーム組成をマウスに投与した。リポソームは主として図１に説明する方法で準備された。図に示されるように20ミリグラム（mg）のPCが回転蒸発され、0.5mlのPBSの中で超音波処理により再懸濁が行われた。つづいて0.5mlのカルセイン（10mg/ml）またはメラニン（10 mg/ml）溶液が、超音波処理されたPCリポソーム組成にそれぞれ加えられて、さらに6分間超音波処理された。その結果得られたリポソーム組成は、0.6〜1.0μM のフィルターを通じて押し出され、かつ、リポソーム組成が包み込まれなかったカルセインまたはメラニンからセファローズ4B柱上のゲル濾過で分離された。これはリポソームに包み込まれた有益な化合物の組成（カルセインまたはメラニン）を作り出すためである。リポソームに包み込まれた有益な化合物を生体内で局所的に毛胞に送達する実験には、生後2〜4週間のあらかじめ剃毛された異系交配白毛マウスが使用された。リポソーム組成を皮膚に固定しその蒸発を防ぐためのバンドエイド・パッチを用いて、カルセインまたはメラニンを包み込んだ約250マイクロリットルのリポソーム組成が、マウスの背面の皮膚の部位約1.5cm²に直接塗布された。リポソーム組成の塗布は1時間ごとに6時間繰り返され、最後の塗布は24時間放置され、その間に分析のため皮膚標本がパンチ・バイオプシーで採取された。経時的な実験として、各時間ごとにマウスが1匹ずつ使用され、各マウスから合計6つのパンチ・バイオプシーが0.5時間後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、6時間後、16時間後そして24時間後に採取された。パンチ・バイオプシーに先立ち、マウス皮膚の表面に残っている物質を除くため、マウスの皮膚はアルコールを浸した綿棒できれいに拭われた。対照には、リポソームに包み込まれた有益な化合物を含むサンプルのようなリポソームを含まない同量のカルセインまたはメラニンが塗布された。リポソーム処置のあと、皮膚標本が採取され、それを毛胞の垂直方向にきわめて薄くスライスして（5mm）組織片を得た。つづいて、それを光学または蛍光顕微鏡のいずれかで観察して撮影した。メラニン処置標本の場合、組織標本は蛍光顕微鏡検査用にはBCECF-AMおよびプロビジウム沃化物（PI）でまず対比染色され、また光顕微鏡検査用には、組織学的に標本が準備されたあと、パラフィン切片にしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。カルセイン処置標本の場合、組織標本は蛍光顕微鏡検査用にまずプロピジウム沃化物（PI）で染色された。また、カルセインを含む皮膚標本は、送達された有益な化合物の選択組織への効果的な集中を決定するため、分光蛍光測光法により分析された。この目的で、各経過時間点からの皮膚の2mmパンチ・バイオプシー2個を1枚のサンプルに置いたものをそれぞれ3組ずつ用意し、それを2mlのPBSに入れ、水浴超音波処理機で超音波処理を行った。つぎに、超音波処理された標本を、マイクロ遠心分離機で10分間14,000×gで遠心分離した。その結果得られた表面浮遊物は、カルセイン検出のため496nmの興奮波長および517nmの放射波長で分光蛍光測光法により測定された。皮膚組織へ送達されたカルセインの濃度は、分光蛍光測光計による測定値を標準カーブと比較して測定された。図6A〜6Cは、リポソームに包み込まれたカルセインおよび裸のカルセイン（図6C）を使用したカルセイン送達の20時間後の結果を示している。リポソームに閉じ込められた送達により、カルセインが毛胞および毛幹に深く浸透できたのに対し、対照カルセインが角質層に閉じ込められており、毛幹または毛胞には浸透しなかったことに注意。リポソームに閉じ込められたカルセインを媒介物とする送達の有効性の経過時間の分析では、24時間後にカルセイン1mm²当たり22.15ナノグラム（ng）が毛胞に送達されるのが見られたのに対し、裸のカルセインでは24時間後にはわずか 1.4ng/mm²の送達が見られただけで、この量は時間の経過にもかかわらず増加しなかったことがわかった。図7Aおよび7Cは、処置の24時間後にリポソームに包み込まれた化合物により、メラニンが送達された結果を示している。図7Aおよび7Bは、送達されたメラニンが、自然にメラニン化された毛幹と同じ模様を作っていることを表わすパターンにより、メラニンが毛幹へ送達されたことを示している。図7Cは毛胞細胞に送達されたメラニンを示している。従って、これらの結果は、メラニンがリポソームの生体への局所的投与により、毛胞および毛幹の両方へ送達されたことを立証している。また、送達された有益な化合物の選択組織への集中を検査するため、メラニンを含む皮膚標本は分光光度測定法により分析された。この目的で、各経過時間点からの皮膚の2mmパンチ・バイオプシー2個を1枚のサンプルに置いたものをそれぞれ3組ずつ用意し、それを2mlのPBSに入れ、水浴超音波処理機で超音波処理を行った。つぎに、超音波処理された標本を、マイクロ遠心分離機で10分間14,0 00×gで遠心分離した。その結果得られた表面浮遊物は、メラニンによる吸収を検出のため、300nmの吸収波長で分光蛍光測光法により測定された。皮膚組織へ送達されたメラニンの濃度は、分光蛍光測光計による測定値を標準カーブと比較して決定された。時間経過実験での皮膚標本からの数値は、リポソームに閉じ込められたメラニン約19μg/mm²が、16時間後に特異的に毛胞へ送達されたことを示している。しかし包み込まれなかったメラニンを用いた経過時間実験では、2.0μg/mm²以下のメラニンが送達されたのみであった。上記の結果は、リポソーム標的メラニンまたはカルセインが毛胞および毛胞内の毛幹へ選択的に送達されたが、包み込まれなかった化合物は毛胞へは送達されず、かわりに皮膚表面、特に角質に限られていることを示している。従って、リポソームを媒介物とする有益な化合物の送達は、生きた動物の毛胞および毛幹への特異的な送達に効果的であることがわかり、本文中に説明される生体内でのリポソームを媒介物とする送達方法の有効性を実証している。また対象実験の追加として血漿カルセインの濃度の測定が行われた。それにはまず、リポソームを内包したカルセインの投与過程中に、局所的投与の0.5時間後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、6時間後、16時間後そして24時間後に、マウスの尻尾の側方静脈の血液のサンプルが採取された。採取された血液は、血漿を分離するため血漿分離管（Vacutainer,Becton Dickinson）に移され、2000×gで10分間回転させた。つづいて、カルセイン検出のための分光蛍光測光法で、 496nmの興奮波長および517nmの放射波長でカルセインが測定された。血漿中のカルセインの濃度は、分光蛍光測光計による測定値を標準カーブと比較して決定された。24時間の間に血流からカルセインはまったく検出されなかった。これは重要な観察である。その理由は、有益な化合物が本発明のリポソームを媒介物とする方法で投与されるとき、体循環に入り望ましくない副作用を引き起こすことなく、化合物が毛胞および毛幹に選択的に送付され、また、完全な毛胞および（または）毛幹への送達が可能であることを示唆しているからである。本発明は、これまである種の好適な実施例によって説明され例示されてきたが、本分野に熟練を積む者ならば、本発明の核心からはずれることなく、さまざまな修正、変更、省略、そして置換が可能であることことを容易に認めるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．有益な化合物の有効量を含むリポソームで、該リポソームは有益な該化合物を選択的に毛胞へ送達でき、かつ、有益な該化合物が該毛胞の外側にある細胞に好ましくない効果を与える嫌油性の分子あるいは親油性の分子である、リポソームを含むリポソーム組成物。２．該有益な化合物がメラニンおよびその変異体を含む、請求の範囲１のリポソーム組成物。３．該有益な化合物が毛髪染色を含む、請求の範囲１のリポソーム組成物。４．該有益な化合物がチロシナーゼを含む、請求の範囲１のリポソーム組成物。５．該有益な化合物がヒト・チロシナーゼを発現できる核酸を含む、請求の範囲１のリポソーム組成物。６．特許請求の範囲５のリポソーム組成物で、当該核酸が、SEQ ID NO 1で示されたチロシナーゼ蛋白質配列のアミノ酸残基配列特性を含めたヒト・チロシナーゼを暗号化するもの。７．特許請求の範囲５のリポソーム組成物で、当該核酸がヒトp-糖蛋白質を発現できるもの。８．特許請求の範囲７のリポソーム組成物で、当該核酸がヒトMDR-1遺伝子を定義し、SEQ ID NO 2で示されたp-糖蛋白質配列のアミノ酸残基配列特性をもつp-糖蛋白質を発現できるもの。９．特許請求の範囲５のリポソーム組成物で、当該リポソーム組成が、0.2 〜1.2マイクロモルのリン脂質につき、約100マイクログラムの当該核酸を含有するもの。 10．特許請求の範囲１のリポソーム組成物で、当該リポソーム組成がpHに対して感応するリポソームを含むもの。 11．特許請求の範囲10のリポソーム組成物で、pHに感応する当該リポソームがPEおよびOEをモル比率7:3で含むもの。 12．特許請求の範囲１のリポソーム組成物で、当該リポソーム組成がPC,EPC , DOPC,DPPC,PE,DOPEおよびコレステロールから成るグループから選ばれた第一リン脂質を含むもの。 13．特許請求の範囲12のリポソーム組成物で、当該リポソーム組成のPC:PE ：コレステロールの比率が5:2:3であるもの。 14．特許請求の範囲12のリポソーム組成物で、当該リポソーム組成がさらに D282,D378,D383.D3886,D3897およびD3899から成るグループから選ばれた陽イオン・リン脂質を含むもの。 15．特許請求の範囲14のリポソーム組成物で、当該リポソーム組成が、当該第一リン脂質および当該陽イオン・リン脂質を0.8:1.0-1.2のモル比率で含むもの。 16．哺乳動物の毛髪の色を修復する方法で、当該方法が、治療学的に有効な量のリポソーム組成物を多数の毛胞をもつ当該哺乳動物の皮膚部位に塗布すること、当該リポソームの組成が少なくとも１種類の選択された毛髪色修復薬剤の有効量を含むリポソームを含むこと、ならびに、当該リポソームが毛髪色修復薬剤を当該毛胞へ選択的に送達できることを特徴とする方法。 17．特許請求の範囲16の方法で、長期にわたる毛髪色の修復のため、当該塗布が一定の間隔で繰り返し行われる方法。 18．特許請求の範囲16の方法で、当該毛髪色修復薬剤がメラニンおよびその変異体を含む方法。 19．特許請求の範囲16の方法で、当該毛髪色修復薬剤が毛髪染料で構成される方法 20．特許請求の範囲16の方法で、当該毛髪色修復薬剤がチロシナーゼで構成される方法。 21．特許請求の範囲16の方法で、当該毛髪色修復薬剤が当該毛胞の細胞内でヒト・チロシナーゼを発現できる核酸を含む方法。 22．特許請求の範囲21の方法で、当該核酸がSEQ ID NO 1で示されたチロシナーゼ蛋白質配列の特性をもつアミノ酸残基配列を含めたヒト・チロシナーゼを暗号化する方法。 23．特許請求の範囲21の方法で、当該リポソーム組成物がリン脂質0.2〜1.2 マイクロモルにつき当該核酸100グラムを含有する方法。 24．特許請求の範囲16の方法で、当該リポソーム組成物がpHに感応するリポソームを含む方法。 25．特許請求の範囲24の方法で、pHに感応する当該リポソームが、PEおよび OEを7:3の比率で含有する方法 26．特許請求の範囲16の方法で、当該リポソーム組成物、PC,EPC,DOPC,DPPC ,PE,DOPEおよびコレステロールから成るグループから選ばれた第一リン脂質を含む方法。 27．特許請求の範囲26の方法で、当該リポソーム組成物がPC:PE:コレステロールを5:2:3の比率で含む方法。 28．特許請求の範囲26の方法で、当該リポソーム組成物がさらに、D282,D37 8,D383,D3886,D3897およびD3899からなるグループから選ばれた陽イオン・リン脂質を含む方法。 29．特許請求の範囲28の方法で、当該リポソーム組成物が当該第一リン脂質および当該陽イオン・リン脂質を0.8:1.0-1.2のモル比率で含む方法。 30．有益な配合物を哺乳動物の毛胞へ直接的かつ選択的に送達する方法で、当該方法が多数の毛胞をもつ哺乳動物の皮膚部位にリポソーム組成物を局所的に塗布するステップから構成され、当該リポソーム組成物が少なくとも１種類の効果的で有効量の選択化合物を含有するリポソームを含み、当該リポソームが当該有効成分を当該毛胞へ選択的に送達でき、かつ、当該有効成分が当該毛胞の外部細胞に好ましくない効果を与える嫌油性分子または親油性分子であるため、当該有効成分が当該毛胞へ優先的に伝達され当該毛胞へ浸透する方法。 31．特許請求の範囲30の方法で、当該化合物がメラニンおよびその変異体を含む方法。 32．特許請求の範囲30の方法で、当該化合物が毛髪染料を含む方法。 33．特許請求の範囲30の方法で、当該化合物が蛋白質を含む方法。 34．特許請求の範囲33の方法で、当該蛋白質がチロシナーゼである方法。 35．特許請求の範囲33の方法で、当該蛋白質がp-糖蛋白質である方法。 36．特許請求の範囲33の方法で、当該蛋白質がヒト腫瘍成長因子アルファである方法。 37．特許請求の範囲30の方法で、当該化合物が核酸を含む方法。 38．特許請求の範囲37の方法で、当該核酸が有効量の置換療法蛋白質を発現できる方法。 39．特許請求の範囲38の方法で、当該発現蛋白質がチロシナーゼである方法 40．特許請求の範囲39の方法で、当該蛋白質がSEQ ID NO 1で示された配列のアミノ酸残基配列特性を有する方法。 41．特許請求の範囲38の方法で、当該発現蛋白質がヒト遺伝子MDR-1により発現されるp-糖蛋白質である方法。 42．特許請求の範囲41の方法で、当該蛋白質がSEQ ID NO 2で示された配列のアミノ酸残基配列特性を有する方法。 43．特許請求の範囲37の方法で、当該リポソーム組成が0.2〜1.2マイクロモルのリン酸につき約100マイクログラムの当該核酸を含有する方法。 44．特許請求の範囲37の方法で、当該核酸が毛髪成長刺激遺伝子を含む方法。 45．特許請求の範囲30の方法で、毛胞を含んだ当該皮膚が哺乳動物の表面にあり、当該送達が生体内で起る方法。 46．特許請求の範囲45の方法で、当該哺乳動物がヒトである方法。 47．特許請求の範囲30の方法で、当該リポソーム組成物がpH感応性ルポソームを含む方法。 48．特許請求の範囲47の方法で、pHに感応する当該リポソームがPEおよびOE を7:3のモル比率で含有する方法。 49．特許請求の範囲30の方法で、当該リポソーム組成物がPC,EPC,DOPC,DPPC ,PE,DOPEおよびコレステロールから成るグループから選ばれた第一リン脂質を含む方法。 50．特許請求の範囲49の方法で、当該リポソーム組成物がPC:PE:コレステロールを5:2:3の比率で含む方法。 51．特許請求の範囲49の方法で、当該リポソーム組成物がさらにD282,D378, D383,D3886,D3897およびD3899から成るグループから選択された陽イオン・リン脂質を含む方法 52．特許請求の範囲51の方法で、当該リポソーム組成物が当該第一リン脂質および当該陽イオン・リン脂質を0.8:1.0-1.2のモル比率で含む方法。 53．特許請求の範囲30の方法で、当該核酸がアンチセンス分子を暗号化する方法。 54．哺乳動物において化学療法に起因する脱毛症を抑制する方法で、有効量のリポソーム組成物を当該哺乳動物の多数の毛胞をもつ皮膚部位に治療法的に塗布すること、当該リポソーム組成物が当該毛胞の細胞内で当該毛胞に化学的抵抗をを与える蛋白質を発現できる有効量の核酸を含有するリポソームを含むこと、ならびに、当該リポソームが当該核酸を当該毛胞に選択的に送達できること、を特徴とする方法 55．特許請求の範囲54の方法で、長期にわたる化学抵抗を与えるため当該塗布が一定の間隔で繰り返し行われる方法。 56．特許請求の範囲54の方法で、当該核酸が当該毛胞の細胞内でヒトp-糖蛋白質を発現できる方法。 57．特許請求の範囲54の方法で、当該核酸がヒトMDR-1遺伝子を定義し、SEQ ID NO 2で示されたp-糖蛋白質配列のアミノ酸残基配列特性をもつp-糖蛋白質を発現できる方法。 58．特許請求の範囲54の方法で、当該リポソームの組成物がリン酸0.2〜1.2 マイクロモルあたり約100マイクログラムの当該核酸を含有する方法。 59．特許請求の範囲54の方法で、当該リポソーム組成物がpHに感応するリポソームを含む方方法。 60．特許請求の範囲59の方法で、pHに感応する当該リポソームがPEおよびOE を7:3のモル比率で含む方法。 61．特許請求の範囲54の方法で、当該リポソーム組成物がPC,EPC,DOPC,DPPC ,PE,DOPEおよびコレステロールから成るグループから選択された第一リン酸を含む方法。 62．特許請求の範囲61の方法で、当該リポソーム組成物がPC:PE:コレステロールを5:2:3の比率で含むもの。 63．特許請求の範囲61の方法で、当該リポソーム組成物がさらにD282,D378, D383,D3886,D3897およびD3899から成るグループから選択された陽イオン・リン脂質を含む方法。 64．特許請求の範囲61の方法で、当該リポソーム組成物が当該第一リン脂質および当該陽イオン・リン脂質を0.8:1.0-1.2の比率で含有する方法。