JP2009507876A - 両性リポソームにおけるまたはそれに関する改善 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)荷電した基の少なくとも1つは4〜8の間のpKを有し、
(ii)カチオン性の電荷はpH4において認められ、そして
(iii)アニオン性の電荷はpH8において認められ、
pH4〜pH8の間の正味の電荷の等電点を生じる。両性イオンは上記範囲のpKを有さないため、両性特徴は、両性イオンの特徴とは異なるこのような規定による。結果として、両性イオンは、pH値の範囲にわたって本質的に中性に荷電しており;ホスファチジルコリン類およびホスファチジルエタノールアミン類は、両性イオン特徴を伴う中性脂質である。
クロロホルム中脂質のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、PBS pH7.5において100mM CFとハイブリダイズさせた。得られた脂質濃度は20mMであった。懸濁液を、45分間、水浴において室温で水和させ、5分間、音波処理し、続いて、−70℃で3回の凍結/融解サイクルを行った。融解後、リポソーム懸濁液を、100nmのポアサイズを伴うポリカーボネート膜を介して15回押出した。カプセル化されていないCFをゲルろ過によって取り出す一方、リポソームを3倍希釈した。脂質の回収率および濃度を、有機リン酸アッセイによって分析した。粒度を、Malvern Zetasizer 3000HSA上で動的光散乱により測定した。
リポソームを、実施例1に記載のとおりに調製した。
リポソームを、実施例1に記載のとおりに調製した。
リポソームを、実施例1に記載のとおりに調製した。
リポソームを、実施例1に記載のとおりに調製した。
カルボキシフルオレセイン(CF)をモデル薬物として使用し、両性リポソームの血清安定性を決定した。オリゴヌクレオチドと同様に、CFは負に荷電している。
POPCおよびDOPEの混合物は、血清において安定である。POPC自体は、血清からの攻撃に耐えるリポソームを形成しない。さらに、DOPEはリポソームを全く形成しない。かなり驚くべきことに、両方の成分からの混合物は、極めて安定であり、血清攻撃に対して耐性であることを見出した。本実施例において、0.75〜5のDOPE/POPC比は、1.5〜5の間の広範な至適条件を伴う安定な構造を形成することを見出した(図1および2もまた参照のこと)。
クロロホルム中脂質(+/−1%14C−DPPC)のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、1.5mlのPBS、pH7.5中3H−イヌリンまたは5mlのPBS単独で水和した。得られた脂質濃度は100mMであった。懸濁液を、45分間、水浴において室温で水和させ、30分間、音波処理し、続いて、−70℃で3回の凍結/融解サイクルを行った。融解後、リポソーム懸濁液を、適切なポアサイズを伴うポリカーボネート膜を介して15回押出した。リポソームを、超遠心分離によって、カプセル化されていない3H−イヌリンから分離した(2回)。
39匹の雄性ウィスター(Wistar)系ラット(Charles River)を5つのグループに分け、尾静脈を介して静脈内注入した。特定の時間ポイントで、血液サンプル(PKについて)および/または組織サンプル(BDについて)を回収し、高温下での触媒的酸化により分析した。サンプル間のキャリーオーバーの百分率を決定し、データの組の分析に含めた。
クロロホルム中脂質のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、10mM NaAc、50mM NaCl、pH4.5中Cy5.5標識CD40アンチセンスで水和した。得られた脂質濃度は20mMであった。懸濁液を、45分間、水浴において50℃で水和させ、5分間、音波処理し、続いて、−70℃で凍結/融解サイクルを行った。融解後、200nmポリカーボネート膜を介して、リポソーム懸濁液を19回押出した。押出しプロセス後、1/10容積の1M HEPES、pH8を添加することによって、リポソーム懸濁液のpHをpH7.5に移した。カプセル化されていないCy5.5標識CD40アンチセンスを、高速沈降(2回)および上清を廃棄することによって取り出した。
200μlのCy5.5リポソームおよび41μlの空のリポソーム
DBA/1系マウスを、完全フロイントアジュバントにおいて乳化したII型コラーゲン(200μg/マウス)の皮下注入によって免疫した。マウスに、関節炎誘導の1日目(II型コラーゲンによる単回免疫後の約21日目)にリポソーム懸濁液(241μl)により静脈内注入した。1日目を、炎症が著明であった(少なくとも2のR.O.Williamsに従う臨床スコア)日として規定した。
リポソームを、10Vol%のエタノール性脂質溶液(15mol%POPC、45mol%DOPE、20mol%MoCholおよび20mol%CHEMSの混合物)を、CD40に対する60μg/mlの18bpアンチセンスを含有する10mM NaAc、50mM NaCl、pH4.5に注入することによって、生成した。
DBA/1系マウスを、完全フロイントアジュバントにおいて乳化したII型コラーゲン(200μg/マウス)の皮下注入によって免疫した。Smarticleまたはコントロールによる処置を、関節炎誘導の1日目(II型コラーゲンによる単回免疫後の約21日目)に開始し、3および5日目に反復した。1日目を、炎症が著明であった(少なくとも2のR.O.Williamsに従う臨床スコア)日として規定した。
本実施例は、CD40の発現を調整し、本発明に従う組成物の使用に適切であるオリゴヌクレオチドによって標的化され得るCD40ヌクレオチド配列の非制限的例を提供する。
本発明に従う標的化のためのヒトCD40 mRNA配列を配列番号1に提示する。関連する配列情報は、Bennettらによるpublished patent application number US2004/0186071(即ち、配列番号85)およびBennettらによるUS patent no.6197584(即ち、配列番号85)ならびにPluvinet,et al.,Blood,2004,104(12),3642−3646(それらの内容は、本明細書において参考として援用される)において見出される。
本発明に従う標的化のためのネズミCD40 mRNA配列を配列番号2に提示する。関連する配列情報は、Bennettらによるpublished patent application number US2004/0186071(即ち、配列番号132)(その内容は、本明細書において参考として援用される)において見出される。
本発明に従う標的化のためのラットCD40 mRNA配列を配列番号3に提示する(Gao,Ph.D.thesis,Goettingen2003を参照のこと)。
本発明に従う標的化のためのブタCD40 cDNA配列を配列番号4に提示する(図10)。関連する配列情報は、Rushworth,et al.,Transplantation,2002,73(4),635−642(その内容は、本明細書において参考として援用される)において見出される。
ヒトアンチセンスCD40オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。さらなる配列情報は、Bennettらによるpublished patent application number US2004/0186071およびUS Patent No.6197584(それらの内容は、本明細書において参考として提供される)において見出される。Bennettらにより言及された配列番号を右側に提供する。
ネズミアンチセンスCD40オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。さらなる配列情報は、Bennettらによるpublished patent application number US2004/0186071(その内容は、本明細書において参考として援用される)において見出される。Bennettらにより言及された配列番号を右側に提供する。
ラットアンチセンスCD40オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する(Gao,Ph.D.thesis,2003,University of Goettingen,Germanyを参照のこと)。
ブタアンチセンスCD40オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。Rushworth,et al.,Transplantation,2002,73(4),635−642を参照のこと(その内容は、本明細書において参考として援用される)。
Claims (55)
- 活性因子をカプセル化して、リポソームを形成することが可能な脂質の混合物であって、約0.5〜約8の範囲のホスファチジルエタノールアミン対ホスファチジルコリンの比でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、混合物。
- 前記比が約0.75〜約5の範囲にある、請求項1に記載の混合物。
- 前記比が約1〜約4の範囲にある、請求項1に記載の混合物。
- 前記ホスファチジルコリンが、DMPC、DPPC、DSPC、POPC、DOPC、ダイズPCまたは卵PCから選択される、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記ホスファチジルエタノールアミンは、DOPEまたはDMPEまたはDPPEから選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記混合物が中性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の混合物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の混合物を含んでなる中性リポソーム。
- 1つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質をさらに含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記1つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質が両性であって、pH7.4では負に荷電するかまたは中性であり、そしてpH4では正に荷電する、請求項8に記載の混合物。
- 前記混合物は、互いに組合わせることで両性の特徴を有する、複数の荷電した両親媒性物質を含んでなる、請求項9に記載の混合物。
- 前記1つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質が少なくとも1つのpH感受性アニオン性脂質および少なくとも1つのpH感受性カチオン性脂質を含んでなる、請求項10に記載の混合物。
- 前記アニオン性脂質が、DOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSuccおよびCHEMSから選択される、請求項11に記載の混合物。
- 前記カチオン性脂質が、MoChol、HisCholおよびCHIMから選択される、請求項11または12に記載の混合物。
- カチオン性およびアニオン性脂質の間の比(電荷比)が4:1〜1:4の範囲にある、請求項11、12または13のいずれか一項に記載の混合物。
- カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が3:1〜2:1の範囲にあり、そして前記混合物が、5〜95mol%の荷電した脂質ならびに95〜5mol%のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項11〜14のいずれか一項に記載の混合物。
- カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が約1:1であり、そして前記混合物が、5〜75mol%の荷電した脂質ならびに95〜25mol%のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項11〜14のいずれか一項に記載の混合物。
- カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が1:3〜1:2の範囲にあり、そして前記混合物が、40〜75mol%の荷電した脂質ならびに60〜25mol%のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項11〜14のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記混合物が、
1:1〜1:4の範囲の比の70〜20mol%のPOPCおよびDOPE;ならびに
30および80mol%の両性対の荷電した脂質(前記対は、MoCholおよびCHEMS、MoCholおよびDMGSucc、MoCholおよびDOGSucc、CHIMおよびCHEMSまたはCHIMおよびDMGSuccから選択され、カチオン性対アニオン性脂質の比は3:1〜1:1の範囲にある)、
を含んでなる、請求項10〜14のいずれか一項に記載の混合物。 - 前記混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 15:45:20:20 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 10:30:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 16:24:30:30 (mol.%)
から選択される処方よりなる、請求項18に記載の混合物。 - 前記混合物が、
1:1〜1:4の範囲の比の70〜20mol%のPOPCおよびDOPE;ならびに
30および80mol%のMoCholおよびDMGSuccまたはDOGSucc(ここで、DMGSuccまたはDOGSuccのモル量はMoCholのモル量を超える)、
を含んでなる、請求項11〜14または17のいずれか一項に記載の混合物。 - カチオン性対アニオン性脂質の比が1:3〜1:2の範囲にあり、そして前記混合物が、30〜50mol%のPOPCおよびDOPEならびに70〜50mol%の荷電した脂質を含んでなる、請求項20に記載の混合物。
- 前記混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:23:47(mol%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 10:30:20:40(mol%)
から選択される処方よりなる、請求項21に記載の混合物。 - 請求項9〜22のいずれか一項に記載の脂質の混合物を含んでなる両性リポソーム。
- 前記リポソームが50〜500nmの範囲のサイズを有する、請求項23に記載の両性リポソーム。
- 前記リポソームが少なくとも1つの活性因子をカプセル化する、請求項23または24に記載の両性リポソーム。
- 前記活性因子が、脊椎動物細胞において1つもしくはそれ以上のRNAに転写されることが可能である核酸を含んでなり、前記RNAが、mRNA、shRNA、miRNAまたはリボザイムであり、前記mRNAが1つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項25に記載の両性リポソーム。
- 前記核酸が環状DNAプラスミド、線状DNA構築物またはmRNAである、請求項26に記載の両性リポソーム。
- 前記活性因子がオリゴヌクレオチドである、請求項25に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、転写に影響を及ぼす因子、スプライシングに影響を及ぼす因子、リボザイム、DNAザイムまたはアプタマーである、請求項28に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが、それらのホスフェートまたはホスホチオエート型においてDNA、RNA、ロックト核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2’O−メチルRNA(2’Ome)、2’O−メトキシエチルRNA(2’MOE)などの修飾ヌクレオシドを含んでなる、請求項28または29に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが15〜30塩基対長のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが15〜30塩基対長のsiRNAである、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが15〜30塩基対長のデコイオリゴヌクレオチドである、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが15〜30塩基対長の転写に影響を及ぼす因子である、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが25〜50塩基対長のDNAザイムである、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが25〜50塩基対長のリボザイムである、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが15〜60塩基対長のアプタマーである、請求項28、29または30のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドが、CD40遺伝子、そのセンスもしくはアンチセンス鎖、その任意のエキソンもしくはイントロンまたは非翻訳領域をコードする核酸を標的化するために適合され、それによって、哺乳動物細胞におけるCD40の発現を調節する、請求項28〜37のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記オリゴヌクレオチドがCD40の任意のmRNAに対して指向され、かかるmRNAがプレmRNAおよびそれらのその後の成熟した形態を含む、請求項38に記載の両性リポソーム。
- 前記脂質の混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 15:45:20:20 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 10:30:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 16:24:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:23:47 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 10:30:20:40 (mol.%)
から選択される処方よりなる、請求項38または39に記載の両性リポソーム。 - 少なくとも80wt%の前記オリゴヌクレオチドが前記リポソームの内部に配置される、請求項28〜40のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 前記リポソームがカプセル化されていないオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項28〜41のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
- 請求項25〜42のいずれか一項に記載の活性因子充填両性リポソームおよびその薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる薬学的組成物。
- 前記リポソームが約150nmを超えるサイズを有する、請求項43に記載の薬学的組成物。
- 前記リポソームが約150nm未満のサイズを有する、請求項43に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物が、前記活性因子充填両性リポソームに類似の組成およびサイズを有する空のリポソームをさらに含んでなる、請求項43、44または45のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害の防止あるいは処置のための請求項38、または請求項38に従属する場合の請求項39〜42のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用。
- 移植片拒絶、移植片対宿主病、I型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬もしくは甲状腺炎の防止または処置のための請求項38、または請求項38に従属する場合の請求項39〜42のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用であって、前記両性リポソームは全身投与のために処方される、使用。
- 移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、喘息、クローン病または大腸炎の防止または処置のための防止または処置のための請求項38、または請求項38に従属する場合の請求項39〜42のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用であって、前記両性リポソームは局所投与のために処方される、使用。
- 低脂質用量で請求項43〜46のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが150nmを超えるサイズを有し、それによって、前記活性因子を肝臓に標的化する、方法。
- 高脂質用量で請求項43〜46のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが150nmを超えるサイズを有し、それによって、前記活性因子を脾臓、感染および炎症の部位もしくは固形腫瘍に標的化する、方法。
- 低脂質用量で請求項43〜46のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが150nm未満のサイズを有し、それによって、活性因子を肝臓に標的化する、方法。
- 高脂質用量で請求項43〜46のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが150nm未満のサイズを有し、それによって、前記活性因子を脾臓を含まない感染および炎症の部位もしくは固形腫瘍に標的化する、方法。
- 薬物/脂質比を所望の脂質濃度に低下させることをさらに含んでなる、請求項51または53に記載の方法。
- 前記組成物において、前記活性因子充填リポソームに類似のサイズおよび組成を有する空のリポソームを封入することをさらに含んでなる、請求項51または53に記載の方法。
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