CN1859905A - 多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法和由该调节方法得到的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供视黄酸的纳米颗粒的粒径的调节方法和用该调节方法得到的纳米颗粒，所述视黄酸纳米颗粒可以皮下给药和静脉内给药，也可以作为缓释制剂使用，而且皮肤透过性高，因此也可以用在涂布在皮肤上等的药品和作为准药品的外用剂和化妆品中，刺激性降低。具体地说，该调节方法可以如下进行：将视黄酸的低级醇溶液与碱性水溶液一起分散，进一步添加非离子表面活性剂，制备得到混合微胶粒，往其中以摩尔比1∶0～1.0的范围添加金属卤化物或者醋酸化物以及碱金属碳酸化物或者磷酸化物，从而在微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜，使其粒径在5～300nm的范围内。作为该多价金属无机盐，为碳酸钙、碳酸锌或者磷酸钙。

Description

多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法 和由该调节方法得到的纳米颗粒
技术领域
本发明涉及多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，特别涉及包覆了作为多价金属无机盐的碳酸钙、碳酸锌或者磷酸钙的被膜的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法和由该调节方法得到的纳米颗粒。
背景技术
近年来，脂溶性维生素A酸即视黄酸在含有ES细胞(embryo stemcell：胚胎干细胞)的各种未分化细胞中的分化诱导作用一直受到关注，另外，视黄酸作为对急性前髓细胞性白血病的治疗药的临床应用也在进行。
然而，视黄酸是分子内具有羧基的化合物，因此具有刺激性，在皮下给药的场合，可以看到发炎或者在注射部位的肿块，另外，因是脂溶性的，作为注射剂难于制剂化。因此，对于视黄酸，研究了各种缓释制剂或者应用作为定向给药疗法的药物递送系统(DDS)的制剂化[例如C.S.Cho，K.Y.Cho，I.K.Park，S.H.Kim，T.Sugawara，M.Uchiyama & T.Araike：“Receptor-mediated delivery of all trans-retinoicacid to hepatocyte using poly(L-lactic acid)nanoparticles coated withgalactose-carrying polysylene”，J.Control Release，2001 Nov.9：77(1-2)，7-15]。
另外，还提出了使用生物降解性聚合物的注射制剂[例如G.G.Giordano，M.FD.Refojo & M.H.Arroyo：“Sustained delivery ofretinoic acid from microsphers of biodegradable polymer in PVR”，Invest.Ophthalmol.Vis.，1993 Aug.34(9)：274-2745]。
进一步提出了因视黄酸的上皮细胞增殖作用，所以可以应用在化妆品中，除去皮肤的皱纹，作为皮肤的活化剂·抗老化剂等(日本专利公开No.平09-503499)，但由于其作为羧酸的性质，因此存在刺激性强，引起炎症等问题，不能在现实的化妆品中使用。
鉴于这种现状，本发明人等首先提供了既可以皮下和静脉注射，也可以用作缓释制剂的含有视黄酸的纳米颗粒，另外也提供了在涂布到皮肤上的场合，能够有效发挥视黄酸具有的效果的含有视黄酸的纳米颗粒[例如特2003-172493；药剂学，Vol.62 Mar.2002，Supplement，日本药剂学会第17次年会演讲摘要集；Drug DeliverySystem(DDS)，Vol.18，No.3 May.：221(2003)；29th Annual Meetingof the Controlled Release Society in Collaboration with the KoreanSociety for Biomaterials；Final Program July 20-25(2002)]。
首先提出的含有视黄酸的纳米颗粒，通过将视黄酸溶解在少量的极性溶剂中，用含碱的水使之分散，然后添加非离子表面活性剂，得到混合微胶粒，往其中添加2价的金属盐，进一步添加具有2价阴离子的盐从而进行制备。
这种含有视黄酸的纳米颗粒是在颗粒表面形成金属化合物的被膜而形成的，例如在使用氯化钙作为2价金属盐，使用碳酸钠作为具有2价阴离子的盐的场合，在纳米颗粒表面就会形成碳酸钙的被膜。
该本发明人等首先提供的含有视黄酸的纳米颗粒是利用视黄酸的两亲性而制备的。即，使视黄酸分散在水溶液中，一旦形成为球状微胶粒，就成为微胶粒表面被负电荷覆盖的状态。然后，添加非离子表面活性剂，进一步添加氯化钙，使钙离子(Ca2+)吸附到微胶粒表面的负电荷上，防止视黄酸的微胶粒之间聚集、沉淀，由此形成微胶粒表面被钙离子覆盖的具有球状或者椭圆形等的微胶粒。进一步添加碳酸钠，使碳酸根离子(CO3 2-)吸附(键合)到微胶粒表面的钙离子上，完全中和微胶粒表面电荷。结果，在视黄酸的微胶粒表面上形成碳酸钙被膜，制备得到碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒。
可是，一般用沉淀法或者均匀沉淀法形成的碳酸钙结晶通常是称为方解石的对水几乎没有溶解性的结晶。但是，用上述方法在微胶粒表面形成的碳酸钙形成于具有球状或者椭圆形等带曲率的微胶粒表面上，从而难于获得硬的结晶结构。因此，所形成的碳酸钙层具有：有所谓玻璃结构的非晶形结构或者作为亚稳态相的球霰石结构。碳酸钙被膜为非晶形的场合，由于不是硬的结晶结构，因此在水中的溶解性高，生物降解性提高，容易分解。而形成球霰石的场合，一般地，与作为碳酸钙之外的结晶结构的方解石或者文石相比，在水中的溶解度高，因此容易生物降解。
结果，在生物体内施用上述得到的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒等场合，微胶粒表面的碳酸钙被膜层容易分解，含有的视黄酸被释放出，结果可以缓释地发挥药效。
在用金属化合物包覆视黄酸的微胶粒表面的场合，不只是上述碳酸钙，而且具有生物适应性的例如碳酸锌、磷酸钙等多价金属无机盐也发挥同样的效果。
但是，以如上所述形成的碳酸钙为首的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒具有约5～1000nm的粒径(直径)，不能充分有效地制备具有所希望的粒径的纳米颗粒。特别在视黄酸皮下或者静脉内给药的场合，或者皮肤给药(涂布给药等)，经皮吸收的场合，希望其粒径是约5～300nm的极其微小的纳米颗粒。
因此，本发明的课题在于提供使以碳酸钙为首的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒是粒径为约5～300nm的极其微小的纳米颗粒的粒径调节方法。
为了解决该课题，本发明人等悉心地进行了研究，结果新发现：在视黄酸的微胶粒表面上形成多价金属无机盐的被膜的阶段，通过适当调节往该微胶粒中添加的金属卤化物或者醋酸化物与碱金属碳酸化物或者磷酸化物的摩尔比，可以制备平均粒径为约5～300nm的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒，从而完成了本发明。
发明内容
因此本发明的基本方式为：
(1)一种多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其是用多价金属无机盐的被膜包覆视黄酸的微胶粒表面形成的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其特征在于：将视黄酸的低级醇溶液与碱性水溶液一起分散，进一步添加非离子表面活性剂，制备得到混合微胶粒，往其中以摩尔比1∶0～1.0的范围添加2价金属卤化物或者醋酸化物以及碱金属碳酸化物或者磷酸化物，从而在微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜，使其平均粒径在5～300nm的范围内；
(2)上述(1)所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，在微胶粒表面包覆的多价金属无机盐的被膜为碳酸钙、碳酸锌或者磷酸钙；
(3)上述(1)所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，2价金属卤化物或者醋酸化物为钙卤化物、锌卤化物、醋酸钙或者醋酸锌；
(4)上述(3)所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，钙卤化物或者锌卤化物选自氯化钙、溴化钙、氟化钙、碘化钙、氯化锌、溴化锌、氟化锌和碘化锌；
(5)上述(1)所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，碱金属碳酸化物或者磷酸化物选自碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠和磷酸钾；
(6)上述(1)所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，低级醇是甲醇或者乙醇；
(7)上述(1)所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，非离子表面活性剂是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚、聚氧乙烯(20)胆甾醇酯、聚氧乙烯(30)胆甾醇酯或者聚氧乙烯硬化蓖麻油。
本发明进一步的具体方式为：
(8)权利要求1所述的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其是用碳酸钙的被膜包覆视黄酸的微胶粒表面形成的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其特征在于：将视黄酸的低级醇溶液与碱性水溶液一起分散，进一步添加非离子表面活性剂，制备得到混合微胶粒，往其中以摩尔比1∶0～1.0的范围添加氯化钙和碳酸钠，从而在微胶粒表面形成碳酸钙的被膜，使其平均粒径在5～300nm的范围内；
(9)上述(8)所述的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，低级醇是甲醇或者乙醇；
(10)上述(8)所述的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，非离子表面活性剂是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚、聚氧乙烯(20)胆甾醇酯、聚氧乙烯(30)胆甾醇酯或者聚氧乙烯硬化蓖麻油。
另外，本发明其它的方式为：
(11)由上述(1)～(7)任一项所述的调节方法得到的平均粒径为5～300nm的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒；
(12)由上述(8)～(10)任一项所述的调节方法得到的平均粒径为5～300nm的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒；
(13)视黄酸的微胶粒表面用碳酸钙被膜包覆形成的平均粒径为5～300nm的碳酸钙包覆的纳米颗粒；
(14)视黄酸的微胶粒表面用碳酸锌被膜包覆形成的平均粒径为5～300nm的碳酸锌包覆的视黄酸纳米颗粒；
(15)视黄酸的微胶粒表面用磷酸钙被膜包覆形成的平均粒径为5～300nm的磷酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒。
本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒，如果其平均粒径在5～300nm的范围内，则可以调节至所希望的极其微小粒径的颗粒。
视黄酸在皮下给药的场合，因其高刺激性和脂溶性，在给药部位可以看到炎症或者肿块。另外，由于在水中不溶，因而作为注射剂不合适。本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒在溶解于水时，保持透明溶液的形态，因此可以作为皮下和静脉内注射制剂给药。另外，视黄酸被生物适应性的多价金属无机盐的被膜包覆，因此刺激性低，具有在给药部位没有看到炎症的产生、肿块化等的特性。
而且，在皮肤上涂布施用本发明的纳米颗粒作为外用剂的场合，良好地经皮吸收，没有刺激性，因此不会引起炎症，视黄酸从纳米颗粒缓释出，可以发挥除去皮肤的皱纹、活性化等效果，也可以用在外用剂或者化妆品中。
特别是在皮肤上涂布视黄酸的场合，造成上皮细胞增殖，对新的皮肤再生是极其有效的，是对美白、除皱有效的化合物，但到目前为止，因皮肤刺激性，而不能使用。但是，通过将其制成包覆了多价金属无机盐的纳米颗粒，刺激性降低，而且平均粒径微小，为5～300nm，因此具有下述优点：皮肤渗透性提高，视黄酸在血中动态上升，在短时间内视黄酸存在于血中，长时间缓慢释放，能够维持血中浓度。
结果，上皮细胞的增殖因子HB-EGF(HB-Epidermal GrowthFactor)的产生量上升，再者，诱导产生在表皮内通常短时间内不会产生的透明质酸，因此皮肤再生加速，具有可以显著看到表皮肥厚的特性。因此，作为在再生医疗中的应用是极其有用的。
附图说明
图1是表示试验例1的(1)中添加碳酸钠时溶液的透过度变化的图。
图2是表示试验例1的(2)中的改变碳酸钠对氯化钙的添加摩尔比，与视黄酸微胶粒混合制备视黄酸-CaCO3纳米颗粒时的电动电势的变化的图。
图3是表示试验例5中的黑素瘤细胞因视黄酸刺激引起的3H-胸腺嘧啶核甙吸收量的图。
图4是表示试验例6的(1)中的对大鼠皮下施用视黄酸-CaCO3纳米颗粒和视黄酸微胶粒时血中放出的视黄酸浓度的变化的图。
图5是比较例6的(1)中的对大鼠皮下施用作为比较例的没有纳米颗粒化的视黄酸微胶粒，给药10天后皮下给药部位的照片。
图6是试验例6的(1)中的对大鼠皮下施用视黄酸-CaCO3纳米颗粒，给药10天后皮下给药部位的照片。
图7是表示试验例6的(2)中的将视黄酸-CaCO3纳米颗粒、视黄酸-ZnCO3纳米颗粒和视黄酸与凡士林基质混合，对小鼠的皮肤涂布给药时血中释放出的视黄酸浓度变化的图。
图8是表示试验例7中的各制剂给药时的表皮厚度的结果的图。
图9是表示试验例8中的HB-EGF mRNA产生量比较的图。
另外，在图中，RA表示视黄酸，RA-CaCO3表示视黄酸-CaCO3纳米颗粒，RA-ZnCO3表示视黄酸-ZnCO3纳米颗粒，RA-Ca表示视黄酸-Ca纳米颗粒，RA-Zn表示视黄酸-Zn纳米颗粒。
具体实施方式
在本发明中使用的视黄酸在生理学上具有保持视觉、听觉、生殖等功能、促进成长、保持皮肤和粘膜等正常、抑制癌症等作用，是作为急性前髓细胞性白血病(APL：acute promyelocytic leukemia)的治疗药在临床中使用的全反式视黄酸(all-trans retinoic acid)
该包覆了多价金属无机盐的视黄酸纳米颗粒的制备详细地如下进行。
视黄酸是脂溶性化合物，还因其在分子内具有羧酸，因此通过添加碱性水溶液例如氢氧化钠水溶液和少量的低级醇，可以在水溶液中形成球状的微胶粒。该微胶粒的表面呈被负电荷覆盖的状态，因此容易吸附(键合)2价金属离子，例如钙离子(Ca2+)，产生与钠离子的交换反应。此时，2价金属离子的吸附力(键合力)比钠离子高，因此吸附了2价金属离子的微胶粒其表面的电荷变得难于解离，在水中不溶解，因而微胶粒沉淀。一产生沉淀，则颗粒之间产生聚集，就会形成非常大的颗粒。
因此，为了防止在该阶段的颗粒间的聚集，将非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween80)与视黄酸一起添加。即，Tween80和视黄酸一起形成混合微胶粒，使聚氧乙烯链突出在微胶粒表面上，因此即使多价金属离子吸附(键合)于微胶粒表面，由于在微胶粒表面上突出的作为亲水基团的聚氧乙烯链的存在，也不会产生微胶粒的沉淀。
接着，添加2价金属卤化物或者醋酸化物例如氯化钙。此时的2价金属卤化物或者醋酸化物的添加量只要是使2价金属离子充分吸附在视黄酸的微胶粒表面上的量即可。2价金属离子的吸附力(键合力)比钠离子强，由此与钠离子产生交换。结果，2价金属离子优先吸附(键合)，形成微胶粒表面被2价金属离子覆盖的球状或者椭圆形等的微胶粒。其中，如果进一步添加碱金属碳酸化物或者碱金属磷酸化物，由于微胶粒表面电荷没有完全被中和，因此碳酸根离子(CO3 2-)或者磷酸根离子(PO4 2-)与位于表面的2价金属离子吸附(键合)。结果，在视黄酸的微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜，制备得到多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒。
作为这种多价金属无机盐包覆的纳米颗粒中的多价金属无机盐，可以举出具有生物适应性的碳酸钙、碳酸锌或者磷酸钙。
因此，作为2价金属卤化物或者醋酸化物，是钙卤化物、锌卤化物、醋酸钙或者醋酸锌，作为钙卤化物和锌卤化物，具体可以举出氯化钙、溴化钙、氟化钙、碘化钙、氯化锌、溴化锌、氟化锌和碘化锌。
另外，作为碱金属碳酸化物或者碱金属磷酸化物，可以举出碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠和磷酸钾。
另一方面，作为在制备纳米颗粒中使用的低级醇，可以举出甲醇或者乙醇。
另外，作为非离子表面活性剂，可以举出例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween80)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Tween60)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Tween40)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯(Tween85)、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚、聚氧乙烯(20)胆甾醇酯和聚氧乙烯硬化蓖麻油。
用以上方法制备的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒是微小的纳米颗粒，其粒度分布宽，具有约10～3000nm的粒径(直径)。
可是，多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒在皮下给药或者静脉内给药的场合，或者在皮肤给药从而使视黄酸经皮吸收的场合，优选其粒径为约5～300nm的极其微小的纳米颗粒。因此，对于所需的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒，有必要调节到其粒径为约5～300nm的极其微小的纳米颗粒。
判明这种粒径的调节可以通过改变为了在视黄酸的微胶粒表面形成而添加的2价金属卤化物或者醋酸化物与碱金属碳酸化物或者磷酸化物的摩尔比而进行。
即，在视黄酸的微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜可以如下进行：将在碱性(具体地为钠)水溶液中形成的微胶粒表面的负电荷与2价金属卤化物或者醋酸化物的2价金属离子例如钙离子(Ca2+)进行交换反应，以及其与碱金属碳酸化物或者磷酸化物的碳酸根离子(CO32-)或者磷酸根离子(PO42-)进行中和。
具体地说，添加的2价金属卤化物或者醋酸化物与碱金属碳酸化物或者磷酸化物两者的比率以摩尔比计，在1∶0～1.0的范围内添加，从而在微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜，根据需要，施加超声波处理等机械振动，就可以使其平均粒径在5～300nm的范围内。
相对于1摩尔2价金属卤化物或者醋酸化物添加超过1.0摩尔的碱金属碳酸化物或者磷酸化物的场合，在微胶粒表面虽然形成多价金属无机盐的被膜，但是，粒径变大，颗粒间产生了聚集，即使施加超声波处理等机械振动，也不能得到具有所希望的平均粒径的纳米颗粒，是不优选的。
然而，添加的2价金属卤化物或者醋酸化物与碱金属碳酸化物或者磷酸化物的两者的比率在摩尔比1∶0～1.0的范围内添加的场合，在微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜，而且可以使平均粒径在5～300nm的范围内。
另外，还有所得纳米颗粒以聚集体存在的情形，此时，通过给这种聚集体施加超声波处理等机械振动，可以制成具有极其均匀的平均粒径的纳米颗粒。因此，本发明的纳米颗粒也包括这样的聚集体，且也可以是在用上述方法制备纳米颗粒之后，进一步施加超声波处理等机械振动，进行平均粒径调节的方法。
如上制备的本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒溶解于水的场合，保持透明溶液的形态，由于视黄酸被多价金属无机盐的被膜包覆，因此刺激性低，可以作为皮下和静脉内注射制剂给药。另外，没有看到给药部位产生炎症、肿块化等。
而且，作为外用剂在皮肤上涂布给药的场合，良好地经皮吸收，没有刺激性，所以没有引起炎症，视黄酸从纳米颗粒缓慢释放，可以发挥除去皮肤的皱纹、活性化等效果。
包括这些方面在内，通过下面的试验例，详细地说明本发明。
另外，在本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒中，有时也将碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒描述为“视黄酸-CaCO3纳米颗粒”，将碳酸锌包覆的视黄酸纳米颗粒描述为“视黄酸-ZnCO3纳米颗粒”，将磷酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒描述为“视黄酸-CaPO4纳米颗粒”。
试验例1：视黄酸-CaCO3纳米颗粒的制备
将视黄酸13.6mg溶解于900μl的乙醇(或者甲醇)中，往该溶液中加入100μL 0.5N NaOH水溶液。此时的pH为7～7.5。把该溶液作为母液收集100μL，将其加入到含有Tween80的蒸馏水100μL中，充分搅拌。
约30分钟后，加入5M含有氯化钙的水溶液并搅拌，进一步在30分钟后，加入1M含有碳酸钠的水溶液，进一步搅拌。继续搅拌一昼夜后，将所得溶液冷冻干燥一夜，制备得到所需的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒。
另外，对于试验中使用的视黄酸-CaCO3纳米颗粒，将冷冻干燥后的纳米颗粒用注射用蒸馏水再分散至规定的浓度后进行使用。
(1)添加碳酸钠时溶液透过度的变化
添加上述5M含有氯化钙的水溶液和1M含有碳酸钠的水溶液时，添加5M含有氯化钙的水溶液15μL，与此相对应，通过改变1M含有碳酸钠的水溶液的添加量，改变碳酸钠对氯化钙的摩尔比，观察溶液的透过度的变化。
透过度以280nm处的透过性(数值越大，透明性越高)进行评价，其结果示于图1中。
从图中所示的结果可知，随着添加碳酸钠，溶液慢慢开始混浊，最终观察到沉淀。在观察到沉淀的区域，溶液从添加碳酸钠一开始一直到30分钟是透明或者稍稍混浊的状态，进一步搅拌，开始产生沉淀，因此上清液的浊度上升。
以上事实暗示通过改变氯化钙和碳酸钠对视黄酸微胶粒的添加摩尔比率，可以调节所得纳米颗粒的粒径。
(2)通过改变碳酸钠对氯化钙的摩尔比，测定电动电势的变化
改变碳酸钠对氯化钙的添加摩尔比率，测定与视黄酸微胶粒混合制备视黄酸-CaCO3纳米颗粒时电动电势的变化。
其结果示于图2中。
另外，对视黄酸微胶粒只添加氯化钙的场合，电动电势为+1.66mV，作为视黄酸微胶粒的电动电势为-68.5mV。因此显而易见，钙离子吸附到微胶粒表面上。
从图2的结果可知，通过改变碳酸钠对氯化钙的摩尔比，电动电位发生改变。碳酸钠的添加摩尔比相对于氯化钙1摩尔，为0.2摩尔或低于0.2摩尔时，显示出电动电势平稳地减少，但如果超过0.2摩尔，则急剧降低，因此暗示了碳酸根离子的吸附达到饱和，或者颗粒间开始聚集。
试验例2：碳酸钠对氯化钙的添加摩尔比率等对视黄酸-CaCO3纳米颗粒的粒径调节的影响的研究
(1)添加摩尔比的研究
从上述试验例1的结果可知，通过改变氯化钙和碳酸钠的摩尔比并添加到视黄酸微胶粒中，可以调节视黄酸-CaCO3纳米颗粒的粒径。
因此，接着就通过改变氯化钙和碳酸钠的摩尔比，并添加到视黄酸微胶粒中而得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒的粒径的变化进行研究。
结果，在相对于氯化钙1摩尔，在小于或等于0.2摩尔的范围内添加碳酸钠的场合，所得视黄酸-CaCO3纳米颗粒的粒径具有10～50nm的值。
另外，在相对于氯化钙1摩尔，碳酸钠的添加量超过0.2摩尔的范围的场合，所得视黄酸-CaCO3纳米颗粒的粒径为350nm以上，这表示微小的纳米颗粒聚集，成为聚集块，具有大的平均粒径的值。
这些事实与上述试验例1的(2)的电动电势的变化一致。
因此，下面研究通过超声波处理，该聚集块是否能够分散成为微小的纳米颗粒。
(2)进行超声波处理的视黄酸-CaCO3纳米颗粒的流体力学直径的测定
就上述得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒，制备后施行5分钟超声波处理，之后测定粒径。
结果，相对于氯化钙1摩尔，在小于或等于1.0摩尔的范围内添加碳酸钠的场合，所得视黄酸-CaCO3纳米颗粒的聚集块通过超声波处理分散，分别分散成粒径小于或等于300nm的纳米颗粒。但是，相对于氯化钙1摩尔添加2.0摩尔和3.0摩尔碳酸钠得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒的聚集块(平均粒径：约2700nm和2200nm)，即使进行超声波处理，也不能使该聚集块分散。
归纳这些结果，并示于表1中。
表1：氯化钙和碳酸钠的比率对纳米颗粒粒径的影响
  视黄酸-CaCO3纳米颗粒的平均粒径(直径：nm)
  CaCl2/NaCO3的摩尔比   1/0     1/0.01    1/0.1   1/0.2    1/0.3
  刚制备后的平均粒径(nm)   20.2     23    17.3   30.3    356.3
  超声波处理后的平均粒径(nm)   -     -    -   22.4    33.3
  CaCl2/NaCO3的摩尔比   1/0.5     1/1.0    1/2.0   1/3.0
  刚制备后的平均粒径(nm)   1316.2     1450    2687.3   2240.5
  超声波处理后的平均粒径(nm)   41.1     106.4    2197.3   1349.4
从以上事实看可以理解，在本发明中，以摩尔比计，在1∶0～1.0的范围内添加氯化钙和碳酸钠，使之在视黄酸微胶粒的表面形成碳酸钙被膜，进一步施行超声波处理，视黄酸-CaCO3纳米颗粒的平均粒径的调节是极其有效的。
另外，通过以摩尔比1∶0.2添加氯化钙和碳酸钠，使之在视黄酸微胶粒的表面形成碳酸钙被膜，观察调节其粒径得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒的冷冻破裂透过型电子显微镜照片(freeze-fractureTransmittance Electron Microscopy：ff-TEM)，结果，观察到横向破裂的视黄酸-CaCO3纳米颗粒具有所谓的芯-壳(core-shell)结构。
因此，认为形成了以视黄酸为芯，以碳酸钙膜为壳的结构。
试验例3：视黄酸-ZnCO3纳米颗粒的制备
将视黄酸13.6mg溶解于900μL的乙醇中，往该溶液中加入100μL0.5N NaOH水溶液。此时的pH为7～7.5。把该溶液作为母液收集100μL，将其加入到含有Tween80的蒸馏水100μL中，充分搅拌。
约30分钟后，加入5M含有醋酸锌的水溶液并搅拌，进一步在30分钟后，加入1M含有碳酸钠的水溶液，进一步搅拌。持续搅拌1昼夜后，将所得溶液冷冻干燥一夜，制得所需的碳酸锌包覆的视黄酸纳米颗粒(视黄酸-ZnCO3纳米颗粒)。
制得的视黄酸-ZnCO3纳米颗粒的粒径显示出和上述试验例1和2同样的行为。
另外，对于用于试验的视黄酸-ZnCO3纳米颗粒，用注射用蒸馏水将冷冻干燥后的纳米颗粒再分散成规定的浓度后进行使用。
试验例4：视黄酸-CaPO4纳米颗粒的制备
将视黄酸13.6mg溶解于900μL的乙醇中，往该溶液中加入100μL0.5N NaOH水溶液。此时的pH为7～7.5。把该溶液作为母液收集100μL，将其加入到含有Tween80的蒸馏水100μL中，充分搅拌。
约30分钟后，加入5M含有氯化钙的水溶液并搅拌，进一步在30分钟后，加入1M含有磷酸钠的水溶液，进一步搅拌。持续搅拌1昼夜后，将所得溶液冷冻干燥一夜，制得所需的磷酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒(视黄酸-CaPO4纳米颗粒)。
制得的视黄酸-CaPO4纳米颗粒的粒径也显示出与上述试验例1和2同样的行为。
为了确认如上制备的本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的药理作用和确认其粒径带来的药理效果，进行以下的生物学试验
首先，作为多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒，通过以摩尔比1∶1.0添加氯化钙和碳酸钠，在视黄酸微胶粒表面形成碳酸钙被膜，研究所得视黄酸-CaCO3纳米颗粒对黑素瘤细胞的增殖抑制效果。
试验例5：体外实验-视黄酸-CaCO3纳米颗粒向B16黑素瘤细胞添加的实验
视黄酸对B16黑素瘤细胞具有增殖抑制效果是公知的。通过本试验例研究，对于本发明提供的视黄酸-CaCO3纳米颗粒，其对B16黑素瘤细胞是否具有增殖抑制效果，还有该效果与没有纳米颗粒化的视黄酸单独进行比较，效果怎样，为了进行这些研究，进行以下的试验。
(方法)
培养B16黑素瘤细胞(2×104)24小时。之后，将视黄酸和上述视黄酸-CaCO3纳米颗粒添加到培养基中。之后进一步培养48小时，测定3H-胸腺嘧啶核甙(3H-thymidine)的吸收量，比较B16黑素瘤细胞的DNA合成能力。
(结果)
其结果示于图3中。从图中所示的结果可知，本发明的视黄酸-CaCO3纳米颗粒随着其添加量的增加，与单独添加没有纳米颗粒化的视黄酸相比，显示出高的增殖抑制效果。
因此，可知将视黄酸纳米颗粒化的本发明的视黄酸-CaCO3纳米颗粒对B16黑素瘤细胞也发挥极其有效的增殖抑制效果。
试验例6：体内实验-对大鼠皮下给药时血中的动态试验
(1)皮下给药的场合
(方法)
使用Wistar系大鼠(7周龄/雄性)，对大鼠的皮下施用氚(3H)标记的视黄酸和从氚(3H)标记的视黄酸微胶粒得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒。之后，每一时间间隔采集血液，用闪烁计数器测定血中的视黄酸的量。
另外，在试验中使用视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：150nm)。
另外，作为比较例的视黄酸以没有纳米颗粒化的视黄酸微胶粒给药。
(结果)
在图4中，将皮下给药视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：约150nm)时的结果与作为比较例的没有纳米颗粒化的视黄酸微胶粒的情形相比较并给出。
如图中的结果所示，在比较例的没有纳米颗粒化的视黄酸微胶粒的情形下，给药后约1小时，视黄酸就释放到血中，与此相对，在视黄酸-CaCO3纳米颗粒的情形下，初期血中浓度受到抑制，而且是持续的，视黄酸从纳米颗粒中释放出持续了约7天。
从以上结果可以显著发现视黄酸-CaCO3纳米颗粒的视黄酸缓释效果，可以确认作为缓释制剂是非常有效的。
另外，图5和图6显示出给药10天后的皮下给药部位的照片。图5是施用比较例的没有纳米颗粒化的视黄酸微胶粒时的照片，图6是施用视黄酸-CaCO3纳米颗粒时的照片。施用视黄酸微胶粒时，因视黄酸的刺激性在给药部位引起炎症，但在施用视黄酸-CaCO3纳米颗粒时，视黄酸的刺激性得到缓解，结果完全没有引起炎症。
从以上结果可知，视黄酸-CaCO3纳米颗粒的皮肤刺激性低，可以作为外用制剂皮肤给药，或者可以作为化妆品应用到皮肤上。
(2)皮肤给药(涂布)的场合
使用小鼠(ddy系，5周龄/雄性)，用电推子剪去小鼠背部的毛，将上述得到的氚(3H)标记的视黄酸和从氚(3H)标记的视黄酸微胶粒得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒以及视黄酸-ZnCO3纳米颗粒与凡士林基质混合，涂布在皮肤上。之后每一间隔时间采集血液，用闪烁计数器测定血中的视黄酸的量。
供给试验的试样如下。
(a)视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(b)视黄酸-ZnCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
另外，对于作为比较例的视黄酸，将没有纳米颗粒化的视黄酸本身与凡士林基质混合使用。
(结果)
其结果示于图7中。将视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)和视黄酸-ZnCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)与凡士林基质混合皮肤涂布给药时，与没有纳米颗粒化的视黄酸相比较，视黄酸的血中浓度显著高。
因此，可以判明，本发明的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒通过调节其平均粒径，特别是使之成为微小的纳米颗粒，可以更有效地发挥视黄酸的药理效果。
试验例7：体内实验-皮肤给药时的表皮细胞的增殖效果(小鼠)
(方法)
使用小鼠(ddy系，5周龄/雄性)，用电推子剪去小鼠背部的毛，以每天10mg/cm2的量涂布含有视黄酸的凡士林基质制剂(视黄酸为0.1％的制剂)，连续涂布4天。在第5天测定涂布部位的表皮厚度。
作为使用的视黄酸，如下所示。
(a)视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(b)视黄酸-ZnCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(c)往视黄酸微胶粒中只添加氯化钙得到的用钙包覆微胶粒表面的视黄酸-Ca纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(d)往视黄酸微胶粒中只添加氯化锌得到的用锌包覆微胶粒表面的视黄酸-Zn纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(e)单独的视黄酸。
另外，作为对照，给出无处理组和只涂布作为基质的凡士林的组。
(结果)
其结果示于图8中。如图中结果所示，可以理解本发明的有效成分视黄酸-CaCO3纳米颗粒和视黄酸-ZnCO3纳米颗粒与含有视黄酸的制剂相比较，显著使表皮细胞增殖，表皮厚度显著增加。
另外，往视黄酸微胶粒中只添加氯化钙得到的用钙包覆微胶粒表面的视黄酸-Ca纳米颗粒[RA-Ca]和往视黄酸微胶粒中只添加氯化锌得到的用锌包覆微胶粒表面的视黄酸-Zn纳米颗粒[RA-Zn]与单独的视黄酸相比较，表皮的厚度增加。该事实表明，对于使视黄酸形成为微胶粒，通过金属卤化物或者醋酸化物使之稳定化的产物，与含有视黄酸的制剂相比较，也可以发现表皮细胞显著增殖的效果，其构成本发明的一部分。
试验例8：体内实验HB-EGF mRNA产生试验(小鼠)
(方法)
以1天30mg/耳廓的量，在小鼠(ddy系，5周龄/雄性)的耳廓上涂布含有视黄酸的凡士林基质制剂(视黄酸为0.1％)，连续涂布4天。在第5天切除耳朵，提取RNA，用实时PCR(real-time PCR)法，测定HB-EGF mRNA。
另外，同时合成和测定作为管家基因的GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)mRNA，作为相对值进行定量。
作为使用的视黄酸，如下。
(a)视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(b)视黄酸-ZnCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)。
(c)单独的视黄酸。
(结果)
其结果示于图9中，如图中结果所示，可以理解本发明的调节粒径得到的视黄酸-CaCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)和视黄酸-ZnCO3纳米颗粒(平均粒径：约20nm)与单独的视黄酸相比较，显著产生HB-EGF mRNA。
HB-EGF mRNA是上皮细胞的增殖因子，其产生量增加显示出本发明的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒可以显著发挥皮肤再生能力的事实。
工业实用性
如上所述，根据本发明，可以提供用多价金属无机盐的被膜包覆视黄酸的微胶粒表面形成的粒径被调节到5～300nm的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒。对于本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒，皮肤透过性高，溶解于水时，保持透明溶液的形态，因此可以作为皮下和静脉内注射制剂给药。另外，由于视黄酸被多价金属无机盐的被膜包覆，因此刺激性低，具有在给药部位没有看到产生炎症、肿块化等的特性。
因此，本发明提供的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒可以有效地发挥视黄酸的药理效果，作为在外用剂或者化妆品中，进一步在再生医疗中的用途是极其有效的，其在医疗上的贡献非常大。

Claims (15)

1.一种多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其是用多价金属无机盐的被膜包覆视黄酸的微胶粒表面形成的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其特征在于：将视黄酸的低级醇溶液与碱性水溶液一起分散，进一步添加非离子表面活性剂，制备得到混合微胶粒，往其中以摩尔比1∶0～1.0的范围添加2价金属卤化物或者醋酸化物以及碱金属碳酸化物或者磷酸化物，从而在微胶粒表面形成多价金属无机盐的被膜，使其平均粒径在5～300nm的范围内。
2.权利要求1所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，在微胶粒表面包覆的多价金属无机盐的被膜为碳酸钙、碳酸锌或者磷酸钙。
3.权利要求1所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，2价金属卤化物或者醋酸化物为钙卤化物、锌卤化物、醋酸钙或者醋酸锌。
4.权利要求3所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，钙卤化物或者锌卤化物选自氯化钙、溴化钙、氟化钙、碘化钙、氯化锌、溴化锌、氟化锌和碘化锌。
5.权利要求1所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，碱金属碳酸化物或者磷酸化物选自碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠和磷酸钾。
6.权利要求1所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，低级醇是甲醇或者乙醇。
7.权利要求1所述的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，非离子表面活性剂是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚、聚氧乙烯(20)胆甾醇酯、聚氧乙烯(30)胆甾醇酯或者聚氧乙烯硬化蓖麻油。
8.权利要求1所述的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其是用碳酸钙的被膜包覆视黄酸的微胶粒表面形成的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，其特征在于：将视黄酸的低级醇溶液与碱性水溶液一起分散，进一步添加非离子表面活性剂，制备得到混合微胶粒，往其中以摩尔比1∶0～1.0的范围添加氯化钙和碳酸钠，从而在微胶粒表面形成碳酸钙的被膜，使其平均粒径在5～300nm的范围内。
9.权利要求8所述的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，低级醇是甲醇或者乙醇。
10.权利要求8所述的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒的粒径的调节方法，非离子表面活性剂是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚、聚氧乙烯(20)胆甾醇酯、聚氧乙烯(30)胆甾醇酯或者聚氧乙烯硬化蓖麻油。
11.由权利要求1～7任一项所述的调节方法得到的平均粒径为5～300nm的多价金属无机盐包覆的视黄酸纳米颗粒。
12.由权利要求8～10任一项所述的调节方法得到的平均粒径为5～300nm的碳酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒。
13.视黄酸的微胶粒表面用碳酸钙的被膜包覆形成的平均粒径为5～300nm的碳酸钙包覆的纳米颗粒。
14.视黄酸的微胶粒表面用碳酸锌的被膜包覆形成的平均粒径为5～300nm的碳酸锌包覆的视黄酸纳米颗粒。
15.视黄酸的微胶粒表面用磷酸钙的被膜包覆形成的平均粒径为5～300nm的磷酸钙包覆的视黄酸纳米颗粒。
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