DE69332688T2

DE69332688T2 - Verwendung von modifiziertem c-reaktiven protein zur herstellung eines medikaments zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE69332688T2
Application number: DE69332688T
Authority: DE
Inventors: E. Anderson; John J. Kresl; A. Potempa
Original assignee: Immtech International Inc; Northwestern University
Current assignee: Immtech International Inc; Northwestern University
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-22
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2013-04-23
Also published as: AU4110993A; US5474904A; EP0637246A4; AU668168B2; US5283238A; CA2132001A1; DE69332688D1; CA2132001C; ATE232394T1; JP2003267894A; EP0637246B1; EP0637246A1; WO1993021944A1; JP3810741B2; JPH07505905A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung von modifiziertem C-reaktiven Protein ("mCRP") zur Herstellung eines Medikaments. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von mCRP als Abbildungsmittel zur Identifizierung von Krebszellen in Säugetieren.

Hintergrund der Erfindung

In den Vereinigten Staaten sind nach Schätzungen etwa 400.000 Tote pro Jahr einer Krebserkrankung zuzuordnen. Dabei scheint es keine einzelne Determinante des Wachstums von Krebszellen und der Bildung von Metastasen zu geben. Vielmehr ergibt sich die Neigung von Krebszellen zur Proliferation und zur Bildung von Metastasen aus der Summe vieler zellulärer Merkmale und einzelne Krebszellen können verschiedene Mechanismen benutzen, die zum gleichen Ergebnis führen [Weiss, Clinical and Experimental Metastasis, 7: 127-167 (1989)].
Während sich in den letzten Jahren therapeutische Strategien, wie chirurgische Eingriffe, Chemotherapie und Bestrahlungstherapie verbessert haben [siehe z. B. Krakoff, CA-A Cancer Journal for Clinicians, 41: 264-278 (1991)], ist eine erhebliche Zahl von Krebsarten therapieresistent und führt letztendlich zum Tod des Patienten. Daher besteht ein Bedürfnis am Auffinden neuer und anwendbarer Wege zur Krebstherapie.

1. CRP Struktur und Aktivität

Das C-reaktive Protein wurde zuerst von Tillett und Francis [J. Exo. Med., 52: 561-71 (1930)] beschrieben, die beobachtet haben, daß Seren von akut kranken Patienten mit dem C-Polysaccharid der Zellwand von Streptococcus pneumonia präzipitieren. Andere Wissenschaftler haben anschließend den reaktiven Serumfaktor als Protein identifiziert, worauf die Bezeichnungen " C-reaktives Protein" oder "CRP" beruht. Kilpatrick et al., Immunol. Res., 10: 43-53 (1991) stellt einen neueren Übersichtsartikel über CRP dar. CRP ist ein pentameres Molekül, das aus fünf identischen Untereinheiten besteht [Osmand et al., Proc. Natl. Acad. Sciences. U.S.A., 74: 739-743 (1977)]. Diese pentamere Form von CRP wird manchmal als "natives CRP" bezeichnet.
Die Gensequenz für humanes CRP ist kloniert worden [Lei et al., J. Biol. Chem., 260: 13377-13383 (1985)]. Zusätzlich sind die primären Sequenzen für Kaninchen CRP [Wang et al., J. Biol. Chem., 257: 13610-13615 (1982)] und murines CRP genannt worden [Whitehead et al., Biochem. J., 266: 283-290 (1990)], und die für Ratte, Hund, Pferd, Ziege und Schaf werden gerade untersucht. Durch klinische Untersuchungen und solche im Labor ist festgestellt worden, daß sich die akute Phase Reaktion, klassischerweise definiert durch genau definierte Änderungen des Bluts [Pepys et al., Advances in Immunology, 34: 141-212 (1983)], bei verschiedenen Erkrankungen bzw. Verletzungen entwickelt, einschließlich der malignen Neoplastie, der ischämischen Nekrose und bakterieller, viraler oder fungaler parasitärer Infektionen. Die Messung von akute Phase Reaktanten wie CRP ist in klinischen Tests zur Diagnose und klinischen Behandlung von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen eingesetzt worden, einschließlich systemischem Lupus Erythematosis (SLE) [Bravo et al., J. Rheumatology, 8: 291-294 (1981)], rheumatoider Arthritis [Dixon et al., Scand. J. Rheumatology, 13: 39-44 (1984)], der Transplantat-Wirt-Abstoßungreaktion [Walker et al., J. Clin. Path., 37: 1022-1026 (1984), sowie vielen anderen Erkrankungen.
Die Aktivitäten von CRP gegenüber Tumorzellen in vitro ist untersucht worden. Zum Beispiel offenbart Hornung, daß mit Lymphozyten zugegebenes CRP das Wachstum von humanen Melanomzellen nach 72 Stunden Kultur inhibierte [Hornung, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 139: 1166-1169 (1972)]. Hornung offenbart darüber hinaus, daß das CRP für die Lymphozyten in der Zellkultur toxisch war.
Barna et al., Cancer Research, 44: 305-310 (1984) beschreibt in vitro Studien, die die Wirkung von multilamellaren Vesikeln, die humanes CRP enthalten, auf die Aktivierung von murinen Makrophagen betreffen. Barna et al. berichten, daß murine Makrophagen die multilamellaren Vesikeln, die CRP enthielten, durch Phagozytose einverleibt haben und, nachdem sie den Vesikeln ausgesetzt waren, eine verstärkte Produktionen von Superoxid-Anion und eine verstärkte Anti-Tumor Aktivität gegen syngenetische murine T241 Fibrosarcom-Zellen, syngenetische murine B-16 Melanom Zellen und allogenetische murine Sarcom-1 Zellen zeigten. Die Antitumoraktivität wurde auch in vivo unter Verwendung eines Winn Neutralizations-Assay erzeugt. [Siehe auch Barna et al., FASEB J., 2274a (1983)]. Barna et al. haben auch beschrieben, daß nicht eingekapseltes CRP die Superoxidanion-Aktivität von Makrophagen in vitro verstärkt, aber nur in Konzentrationen, die zehn bis hundertfach größer sind, als die multilamellar eingekapselte Dosis. Gautam et al., J. Biol. Res. Modifiers, 8: 560-569 (1989), lehren, daß die Antimetastasenwirkung der multilamellaren Vesikeln, die humanes CRP enthalten, zusätzlich zu den Makrophagen Zellen involvierten kann, die T- und/oder NK-Zellmarker tragen.
Zahedi et al., Cancer Research, 46: 5077-5083 (1986) offenbart, daß gereinigtes humanes CRP in vitro zum Vermitteln einer Aktivierung von Makrophagen in einen Antitumor-Zustand fähig ist. Die Autoren lehren, daß beim Aussetzen von entnommenen Makrophagen gegenüber humanem CRP für 30 Minuten bis zwei Stunden eine Antitumoraktivität gegen die murine P 815 Mastocytom-Zellinie, die murine L-929 Fibroblasten-Karzinom-Zellinie und die humane CAK-1 Karzinom-Zellinie induziert wurde. Zahedi et al. lehren auch, daß bei einer Hitze-Aggregierung dies CRP für eine Stunde bei 85ºC vor dem Messen der Antitumoraktivität, das CRP eine wesentlich geringere Abtötungs-Aktivität aufwies, als CRP, das nicht Hitze-aggregiert worden ist. Zahedi et al. offenbaren, daß kein synergistischer Effekt auftrat, wenn CRP mit einem Lymphokin kombiniert wurde.
Barna et al., J. Biol. Resp. Mod., 7: 483-487 (1988), offenbaren, daß beim Aussetzen von humanen alveolaren Makrophagen gegenüber gereinigtem humanen CRP in vitro die Makrophagen-Cytotoxicität gegen humane SK-MEL-28 Melanomzellen und humane CRL 1718 Astrocytoma-Zellen verstärkt wird. Barna et al. lehren darüber hinaus, das die Empfindlichkeit der Makrophagen gegenüber CRP durch Rauchen Negativ beeinflusst werden kann.
Thomassen et al. FASEB J., 6: 1151a (1992), beschreiben die in vitro Modulation der Antitumoraktivität von humanen Monocyten und humanen alveolaren Makrophagen durch ein synthetisches Peptid, das von CRP abgeleitet ist. Thomassen et al. beschreiben, daß mit einem synthetischen Peptid behandelte Monocyten eine Verstärkung der Sekretion von Tumornekrosefaktor (TNF) und IL-1 um das zweifache oder um mehr als das zweifache zeigten, wohingegen alveolare Makrophagen keine verstärkte Sekretion von TNF oder IL-1 zeigten.
Barna et al., Cancer Research, 47: 3959-3963 (1987), offenbaren, daß das Aussetzen von humanen Monocyten aus peripheren Blut gegenüber humanem CRP in vitro in Mengen wie bei der akuten Phase zu einer verstärkten Produktion von Superoxid-Anionen und zu einer verstärkten Cytotoxicität gegenüber humanen Astrocytoma-Zellen führt. Barna et al. offenbaren darüber hinaus, daß die CRP indizierte Cytotoxicität durch Phosphorylcholin inhibiert wurde. Die Autoren schlagen vor, daß die CRP-Aktivierung mit einer Bindung von CRP an eine Komponente des humanen Serums assoziiert sein könnte.
Es wurden mehrere in vivo Studien durchgeführt, die die Wirkung von CRP auf das Wachstum von Tumoren betreffen. Z. B. beschreiben Rizk et al., Cancer, 58: 55-61 (1986), die Wirkungen von Kaninchen-CRP und dem Polykation Poly-L-Arginin (PLA) auf die V · 2 Karzinom-Zellinie in Kaninchen. Rizk et al. lehren, daß CRP in Abwesenheit von PLA in vivo keine Antitumor-Wirkungen aufwies.
O'Connor et al., U.S. Patent No. 4,857,314 offenbart ein Verfahren zum Behandeln eines Meth A Sarcoms in Tieren oder Menschen durch Verabreichen von Tumornekrosefaktor (TNF) in Kombination mit gereinigtem humanen C-reaktiven Protein zum Verstärken der Antitumoraktivität von TNF. O'Connor et al. lehren, daß humanes CRP, alleine verabreicht, eine lediglich minimale oder leichte Antitumoraktivität zeigte.
Deodhar et al., Cancer Research, 42: 5084-5088 (1982), beschreiben die Aktivität von multilamellaren Vesikeln, die humanes CRP enthalten, in vivo gegen Lungen-Metastasen aus murinem Fibrosarcom, T 241. Deodhar et al. berichten, daß mit intravenösen Injektionen von multilamellaren Vesikeln, die CRP enthielten, behandelte Tiere nach dem Entfernen von primären T 241 Tumoren weniger und kleinere Lungen-Metastasen zeigten. Deodhar et al. berichten darüber hinaus, daß die Einkapselung von CRP in multilamellaren Vesikeln die Anti-Metastasen Wirkungen stark verbesserte, da freies (nicht eingekapseltes) CRP, daß in einer Dosis verabreicht wurde, die 40-fach größer ist, als die mit den multilamellaren Vesikeln verabreichte, keinen vergleichbaren Effekt zeigte [Ebd., siehe auch, Deodhar et al., Cleveland Clinic Quarterly, 53: 223-234 (1986)].
Thombre et al., Cancer Immunol. Immunother., 16: 145-150 (1984), beschreibt die Antimetastasen-Wirkungen von multilamellaren Vesikeln, die humanes CRP enthalten, gegen ein murines Colon-Ardenokarzinom (MCA-38). Thombre et al. berichten, daß mit multilamellaren, CRP enthaltenden Vesikeln behandelte Tiere bei parenteraler Verabreichung nach dem Wachstum des primären Tumors weniger Lebermetastasen und eine längere Überlebenszeit zeigten, verglichen mit Kontroll-Tieren. Ebd.
Deodhar et al. beschreiben auch Antitumor-Wirkungen von multilamellaren Vesikeln, die ein synthetisches Peptid enthalten, das von CRP abgeleitet ist [Deodhar et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Research, 32: 404 (1991)]. Deodhar et al. berichten jedoch, daß die Verabreichung von vergleichbaren Dosen eines nicht eingekapselten synthetischen Peptids keine Wirkung zeigte [Ebd.]. Barna et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Research, 32: 237 (1991), schlägt vor das die Antitumor-Wirkungen, die sich in dem T 241 Lungen-Metastasen Modell zeigen, auf die verstärkte Infiltration von MAC 1 + Zellen aus dem Blut in die Lungen zurückzuführen sein könnte.
Deodhar at al., FASEB J., 3: 831a (1989), beschreibt darüber hinaus die Wirkung von gereinigtem humanen CRP oder eines Peptid-Fragments in Kombination mit IL-2 gegen murine Fibrosarcom T 241 Lungen-Metastasen. Deodhar et al. berichten, daß die Verabreichung einer Kombination aus 1 · 10&sup4; U IL-2 und CRP oder eines Peptid-Fragments wirksamer war, als die Verabreichung von 5 · 10&sup4; U IL-2. Barna et al. offenbaren cytolytische Daten aus in vitro Untersuchungen, die es nahelegen, daß die Kombination von CRP-Peptidfragment und IL-2 die Aktivität humaner Monocyten fördert, aber nicht die Aktivität natürlicher Killerzellen (NK) [FASEB J., 6: 1433a (1992)].

2. Strukturen und Aktivität von modifiziertem CRP

Etwa 1983 wurde eine andere Form von CRP entdeckt, die man als "modifiziertes C-reaktives Protein" oder "mCRP" bezeichnet. mCRP weist hinsichtlich Ladung, Größe, Löslichkeit und Antigen-Eigenschaften deutlich unterschiedliche Merkmale auf, wenn man es mit nativem CRP vergleicht [Potempa et al., Mol. Immunol., 20: 1165-75 (1983)]. mCRP unterscheidet sich von nativem CRP auch durch seine Bindungs-Eigenschaften. Z. B. bindet mCRP nicht an Phosphorylcholin [Ebd.; Chudwin et al., J. Allergy Clin. Immunol., 77: 216a (1986)].
Die besondere Antigenität von mCRP ist als "Neu-CRP" bezeichnet worden. Neu-CRP wird bekannterweise in folgenden Systemen ausgeprägt:
1) CRP, behandelt mit Säure, Harnstoff oder Hitze unter bestimmten Bedingungen;
2) das primäre Translationsprodukt von DNA, die für humanes und Kaninchen-CRP codiert; und
3) CRP, immobilisiert auf Plastik-Oberflächen [Potempa et al., Mol. Immunol., 20: 1165- 75 (1983); Mantzouranis et al., Ped. Res., 18: 260a (1984); Samols et al., Biochem. J., 227: 759-65 (1985); Potempa et al., Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987)]. Es wurde ein Molekül, das mit polyklonalen Antikörpern reagiert, die für Neu-CRP spezifisch sind, auf der Oberfläche von 10-25% der peripheren Blut-Lymphozyten (hauptsächlich NK- und B-Zellen), auf 80% der Monocyten und auf 60% der Neutrophilen sowie auf verletztem Gewebe identifiziert [Potempa et al., FASEB J., 2: 731a (1988); Bray et al., Clin. Immunol. Newsletter, 8: 137-140 (1987); Rees et al., Fed. Proc., 45: 263a (1986)].
Darüber hinaus unterscheidet sich mCRP von nativem CRP durch seine biologische Aktivität. Es ist berichtet worden, daß mCRP die Entwicklung der Cytotoxicität von Monocyten beeinflussen kann, die akzessorische Zellfunktion von Monocyten verbessern kann, den durch aggregiertes IgG induzierten phagozytischen Zell-oxidativen Metabolismus verstärken kann und die Produktion von Interleukin-1, Prostaglandin E und die Lipoxygenase-Produkten durch Monocyten erhöhen kann [Potempa et al., Protides Biol. Fluids, 34: 287-290 (1987); Potempa et al., Inflammation, 12: 391-405 (1988); Chu et al., Proc. Amer. Acad. Cancer Res., 28: 344a (1987); Potempa et al., Proc. Amer. Acad. Cancer Res., 28: 344a (1987); Zeller et al., Fed. Proc., 46: 1033a (1987); Chu et al., Proc. Amer. Acad. Cancer Res., 29: 371a (1988)].
Es wurden in vivo Experimente mit mCRP durchgeführt, um zu bestimmen, ob mCRP fähig war, eine Schutzwirkung gegen tödliche Dosen von Streptococcus pneumonia zu bieten [Chudwin et al., J. Allergy Clin. Immunol., 77: 216a (1986)]. Diese Studien demonstrierten, daß die intravenösen Verabreichung von mCRP die Tiere nicht nur vor letalen Dosen von S. pneumonia schützte, sondern daß die Wirksamkeit des mCRP auch drei bis vierfach höher war, als die von nativem CRP.
mCRP kann auch verwendet werden, um Immunkomplexe zu binden, wie in der ebenfalls anhängigen US Anmeldungen mit der Nummer 07/582 884, eingereicht am 3. Oktober 1990, offenbart wird. Diese Anmeldung wurde als nationale Anmeldung der PCT-Anmeldung US 89/01247 (veröffentlicht als WO 89/09628 am 19. Oktober 1989) hinterlegt und ist eine continuation-in-part der US Anmeldung 07/176 923, eingereicht am 4. April 1988, inzwischen fallen gelassen. Darüber hinaus ist mCRP verwendbar bei der Behandlung von viralen Infektionen wie dem humanen Immundefiziens-Virus 1 ("HIV-1"), wie in der ebenfalls anhängigen US Anmeldung mit der Nummer 07/799 448, eingereicht am 27. November 1991, offenbart wird. Schließlich kann mCRP auch zu Behandlung von nicht-Streptococcus bakteriellen Infektionen und der Endotoxin-Sepsis verwendet werden, wie in der ebenfalls anhängigen US Anmeldung der Nummer 07/800 508, eingereicht am 27. November 1991, offenbart wird.
Durch in vitro Studien wurde gefunden, daß mCRP die Entwicklung von Antitumorfunktionen in Monocyten unterdrückt oder verstärkt, abhängig von dem Material, daß zur Erzeugung der Antitumor-Monocyten verwendet wurde [Chu et al., Proc. Am. Acad. Cancer Res., 29: 371a (1988); Chu et al., Proc. Am. Acad. Cancer Res., 30: 333a (1989)]. Soweit den Anmeldern bekannt ist, gab es keine Berichte über eine Anti-Krebs Wirkung von mCRP in vivo. Darüber hinaus sind den Anmeldern keine Berichte bekannt, daß mCRP zu Behandlung von Krebs in Säugetieren verwendet wurde.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von modifiziertem CRP als einzigem aktiven Bestandteil zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, wobei das modifizierte CRP eine neue CRP-Antigenität ausprägt.
Vorzugsweise ist das modifizierte CRP in einer Vielzahl von Liposomen enthalten, die kollektiv eine wirksame Menge an modifiziertem CRP enthalten.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Identifizierung von Krebszellen in einem Säugetier unter Verwendung eines Abbildungsmittels, das modifiziertes CRP enthält. Demgemäß umfasst die Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung eines modifizierten CRP als einzigem aktiven Bestandteil für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für den Nachweis von Krebszellen, wobei das modifizierte CRP eine neue CRP-Antigenität ausprägt. Alternativ kann eine markierte Komponente verwendet werden, die modifiziertes CRP bindet, um bei deren Bindung an modifiziertes CRP den Nachweis zu ermöglichen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Graph, der einen Vergleich der Wirkungen der Behandlung mit mCRP (in LUVETs), der Behandlung mit nativem CRP (in LUVETs) und keiner Therapie auf das Volumen von murinen EMT6 primären Brust-Ardenokarzinom-Tumoren während der Tage 7 bis 19 der Studie zeigt.
Fig. 2 ist ein Graph, der einen Vergleich der Wirkungen der Behandlung mit mCRP (in LUVETs), mit nativem CRP (in LUVETs) und ohne Therapie auf die prozentualen Änderungen des Volumens von murinen EMT6 primären Brust-Ardenokarzinom-Tumoren während der Tage 7 bis 29 der Studie zeigt.
Fig. 3 ist ein Graph, der einen Vergleich der Wirkungen von mCRP im Vergleich zu keiner Therapie auf das Volumen von EMT6 primären Brust-Ardenokarzinom-Tumoren für die Tage 7 bis 29 der Studie zeigt.
Fig. 4 ist ein Graph, der einen Vergleich der Wirkungen von mCRP, mCRP in LUVETs, und von nativem CRP in LUVETs auf die prozentualen Änderungen der Tumorvolumen eines murinen EMT6 primären Brust-Ardenokarzinom-Tumors zeigt.
Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Wirkungen der Behandlung mit 5-Fluoruracil und mit mCRP auf das Körpergewicht und die Lebensspanne von P388-Tumoren tragenden Tieren.

Detaillierte Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zu Behandlung von Krebs unter Verwendung von modifiziertem C-reaktiven Protein ("mCRP") bereit. Das in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendbare mCRP kann aus jeder Spezies stammen. Es besteht eine substanzielle Homologie zwischen den Aminosäure-Sequenzen des C-reaktiven Proteins ("CRP") aus verschiedenen Spezies. Zum Beispiel besteht etwa 50% bis etwa 80% Sequenzhomologie zwischen den CRP aus verschiedenen Säugetier-Spezies. Hu et al., Biochem.; 25: 7834-39 (1986); Whitehead et al., Biochem. J., 266: 283-90 (1990); Kilpatrick et al., Immunol. Res.: 10: 43-53 (1991). Es wird daher erwartet, daß mCRP aus jeder Spezies bei der Behandlung von Krebs wirksam ist. Daher kann ein Säugetier, daß an Krebs leidet, mit mCRP aus einer anderen Spezies behandelt werden (z. B. kann eine Maus mit humanem mCRP behandelt werden). Alternativ und vorzugsweise wird ein Säugetier mit homologem mCRP behandelt (z. B. wird ein Mensch mit humanem mCRP behandelt), um Immunreaktionen auf das mCRP zu verhindern.
mCRP wird vorzugsweise unter Verwendung von nativem CRP als Ausgangsmaterial hergestellt. Verfahren zur Isolierung von CRP aus natürlichen Quellen sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden z. B. von Volanakis et al., J Immunol.: 113: 9- 17 (1978); de Beer et al., J. Immunol. Meth., 50: 17-31 (1982); Potempa et al., Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987) beschrieben. Das CRP wird vorzugsweise aus pleuraler oder Aszites-Flüssigkeit durch Calcium-abhängige Affinitäts-Chromatografie unter Verwendung von Phosphorylcholin-substituiertem BioGel A 0,5 m isoliert (einem Agarose basierten Harz, bezogen von BioRad Laboratorys, Richmond, CA) [See, Potempa et al., Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987)]. Dieses Verfahren zur CRP-Isolierung wird in Beispiel 1 unten näher beschriebenen. Unter Verwendung dieses Isolierungsverfahrens kann CRP erhalten werden, das etwa 99% rein ist.
Es wurden genomische Klone und cDNA-Klone isoliert, die für humanes, Maus- und Kaninchen-CRP kodieren. Lei et al., J. Biol. Chem., 260: 13377-83 (1985); Woo et al., J. Biol. Chem., 260: 13384-88 (1985); Hu et al., Biochem., 25: 7834-39 (1986); Hu et al., J. Biol. Chem., 263 : 1500-1504 (1988); Whitehead et al., Biochem. J., 266: 283-90 (1990). Angesichts der deutlichen Homologie zwischen den CRP aus verschiedenen Spezies können in einfacher Weise Sonden hergestellt werden, so daß genomische Klone und cDNA-Klone isoliert werden können, die für CRP aus anderen Spezies kodieren. Verfahren zur Herstellung solcher Sonden und zum Isolieren von genomische Klonen und CDA-Klonen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Lei et al., J. Biol. Chem. 260: 13377-83 (1985); Woo et al., J. Biol. Chem., 260: 13384-88 (1985); Hu et al., Biochem., 25: 7834-39 (1986); Hu et al., J. Biol. Chem., 263: 1500-1504 (1988); Whitehead et al., Biochem. J., 266: 283-90 (1990). Unter Verwendung eines bekannten Klons oder eines neu isolierten Klons kann CRP unter Anwendung von üblichen und gut bekannten rekombinanten DNA Techniken und Zellkultur- sowie Fermentations-Bedingungen hergestellt werden. Siehe z. B. Hu et al., J. Biol. Chem., 263: 1500-1504 (1988). Um jedoch das pentamere native CRP zu erhalten, sollten eukaryotische Wirtszellen, vorzugsweise Wirtszellen aus einem Säugetier, verwendet werden. Siehe Samols et al., Protides Biol. Fluids, 34: 263-66 (1986); Hu et al., J. Biol. Chem., 263: 1500-1504 (1988).
Verfahren zur Herstellung von mCRP aus CRP sind aus dem Stand der Technik ebenfalls bekannt [Siehe z. B., Potempa et al., Mol. Immunol 20: 1165-1175 (1983)]. Z. B. kann mCRP durch Denaturierung von CRP hergestellt werden. CRP kann durch Behandlung mit einer wirksamen Menge von Harnstoff (vorzugsweise 8 M) in Gegenwart eines übli¬ chen chelatisierenden Mittels (vorzugsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Zitronensäure) denaturiert werden. Darüber hinaus kann CRP durch Einstellung des pH- Werts des Proteins auf unter etwa 3 oder über etwa 11-12 so behandelt werden, daß mCRP erzeugt wird. Schließlich kann mCRP auch hergestellt werden, indem CRP auf über 50ºC für eine Zeitdauer, die hinreichend ist, um die Denaturierung hervorzurufen (vorzugsweise bei 63ºC für zwei Minuten) in Abwesenheit von Calcium oder in Anwesenheit eines chelatisierenden Mittels, wie den oben aufgezählten, erhitzt wird.
mCRP kann auch unter Verwendung von rekombinanten DNA Techniken hergestellt werden. Über das primäre Translationsprodukt des CRP Gens (präCRP) wurde herausgefunden, daß es eine neue CRP-Antigenität ausprägt [Mantzouranis et al., Ped. Res., 18: 260a (1984)]. Dementsprechend kann mCRP hergestellt werden, indem Bedingungen so ausgewählt werden, daß die CRP Untereinheiten in den Wirtszellen nicht zu pentamerem nativen CRP zusammengesetzt werden. Dies kann dadurch erreicht werden, das die gewünschten genomischen oder cDNA-Klone in einem prokaryotischen Wirt exprimiert werden. Siehe Samols et al., Prot. Biol. Fluids, 34: 263-66 (1986). Auf diese Art erzeugtes mCRP scheint aus Aggregaten von CRP Untereinheiten und/oder präCRP und möglicherweise aus anderen CRP-Peptiden zu bestehen. Siehe Ebd.. Diese Art von mCRP ist unlöslich und die weitere Reinigung ist problematisch. Es sollte jedoch möglich seien, dieses unlösliche Material ohne weitere Verarbeitung als eine Suspension in Säugetiere zu injizieren, da gezeigt wurde, daß eine aggregierte Form des von Serumgereinigten mCRP wirksam ist, wie in Beispiel 4 unten näher beschrieben.
mCRP kann von nativem CRP nach verschiedenen Kriterien unterschieden werden. Wie im Abschnitt zum Stand der Technik dargestellt, wird durch modifiziertes CRP eine neue CRP-Antigenität ausgeprägt, während dies bei nativem CRP nicht der Fall ist. Die neue CRP-Antigenität kann unter Verwendung von polyklonalen Antiseren nachgewiesen werden, die für neues CRP spezifisch sind [siehe Potempa et al., Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987)]. Vorzugsweise wird mCRP jedoch von nativem CRP unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern unterschieden, wie den in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Nummer 07/374 166, deren Offenbarung hierin als Referenz einbezogen ist, beschriebenen. Hybridoma-Zellen, die die in der ebenfalls anhängigen Anmeldung offenbarten monoklonalen Antikörper sekretieren, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt als HB 10175 (mAb 15.2C10), HB 10176 (mAb 26.8C10), HB 10177 (mAb 13.3H12) und HB 10178 (mAb 15.1D6). Diese monoklonalen Antikörper werden auch in Ying et al., J. Immunol., 143: 221-28 (1989) beschrieben. Die Antiseren und Antikörper können zum Beispiel in ELISA Assays und vorzugsweise in Tupf-ELISA Assays verwendet werden, wie in Beispiel 1, Teil C unten, beschrieben, um mCRP von nativem CRP zu unterscheiden.
Eine andere Basis, auf der mCRP von nativem CRP unterschieden werden kann, besteht darin, daß mCRP Immunkomplexe und aggregiertes Immunglobulin bindet, während natives CRP dies nicht tut, wie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Nummer 07/582 884 und der veröffentlichten PCT Anmeldung WO 89/09628 beschrieben. Zusätzlich kann mCRP von nativem CRP auf Grundlage der Ladung, der Löslichkeit, der Bindungseigenschaften und der biologischen Aktivität unterschieden werden, wie im Abschnitt zum Stand der Technik durch Referenzen gezeigt. Um jedoch zu zeigen, daß eine Zusammensetzung mCRP enthält, ist es normalerweise hinreichend, festzustellen, das die Zusammensetzung 1) positiv mit einem Antikörper reagiert, der für ein Epitop spezifisch ist, das nur auf mCRP zu finden ist oder 2) aggregiertes Immunglobulin bindet (z. B. aggregiertes IgG).
Obwohl man nicht an irgendeine besondere Theorie gebunden sein möchte, wird angenommen, daß mCRP durch die Dissoziation der 5 CRP-Untereinheiten gebildet wird, wobei jede von diesen dann einer spontanen Konformationsänderung unter Bildung von mCRP unterliegt. Siehe Bray et al., Clin. Immunol. Newsletter, 8: 137-140 (1987). Dementsprechend ist es möglich, daß Fragmente der CRP Untereinheiten die gleichen Aktivitäten aufweisen können, die hierin für mCRP beschrieben sind, und daß die Verwendung solcher Fragmente als im Bereich der vorliegende Erfindung liegend aufgefasst wird.
Es wird darüber hinaus angenommen, daß im wesentlichen zu CRP homologe Proteine die hierin für mCRP beschriebenen Aktivitäten aufweisen, und solche Proteine werden auch als in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallend aufgefasst. Zum Beispiel würden CRP Untereinheiten, bei denen bestimmte Aminosäuren zugefügt, deletiert oder substituiert sind, z. B. durch seitengerichtete Mutagenese des CRP Gens, wahrscheinlich bei der Behandlung von Krebs wirksam sein und diese könnten mCRP ersetzen. Insbesondere wird mCRP hierin so definiert, daß es das primäre Translationsprodukt des CRP Gens einschließt.
Gemäß einem ersten Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem Säugetier wird dem Säugetier eine wirksame Menge mCRP verabreicht. Der Begriff "Krebs" wird in der vorliegenden Erfindung in einem breiten Sinne verwendet und betrifft den physiologischen Zustand in Säugetieren, der üblicherweise durch ungeregeltes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Es wird überlegt, daß mCRP zur Behandlung einer Vielzahl von Krebserkrankungen verwendet werden kann, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Adenocarcinom, Lymphom, Fibrosarcom und Leukämie. Das mCRP kann dem Säugetier verabreicht werden, wenn die Gegenwart von Krebszellen in dem Säugetier erstmals entdeckt wird oder bevor die Krebserkrankung zu ernst wird. Alternativ kann das mCRP nach dem Fortschreiten des Krebs verabreicht werden, um die Metastasenbildung der Krebszellen zu reduzieren, die Tumormetastasen zu reduzieren oder den Befall durch den primären Tumor zu reduzieren.
mCRP kann dem Säugetier in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel schließen geeignete Träger für des Verabreichen von mCRP Flüssigkeiten wie Wasser, Saline und Puffer ein. Stärker bevorzugt wird eine Tris- oder Phosphatgepufferte Saline als Träger verwendet. Es ist dem Fachmann klar, daß bestimmte Träger stärker bevorzugt sind, abhängig von z. B. der Art der Verabreichung und der Konzentration des verabreichten Proteins.
Alternativ kann dem Säugetier eine Vielzahl von Liposomen verabreicht werden, die gemeinsam eine wirksame Menge mCRP enthalten. Der Begriff "Liposom" betrifft in der vorliegenden Erfindung jede Sackähnliche oder hohle Vesikel-ähnliche Struktur, die zur Einkapselung von mCRP fähig ist, und sie schließt, ohne darauf beschränkt zu sein, multilamellare Vesikel, unilamellare Vesikel und Membranen von roten Blutkörperchen ein. Verfahren zur Herstellung von Liposomen und zum Einkapseln von Molekülen in Liposomen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Vorzugsweise sind die mCRP enthaltenden Liposomen unilamellare Vesikel, die durch Extrusion gebildet werden und sie werden hierin als "LUVETs" bezeichnet. Verfahren zur Herstellung von LUVETs werden von MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta, 1061: 297-301 (1991) beschrieben und werden darüber hinaus in Beispiel 1, Teil C, unten beschrieben. Man glaubt, daß LUVETs für die Einkapselung von mCRP besonders gut verwendbar sind, da die Vesikel unter physikalisch milden Bedingungen gebildet werden, die ein Extrusionsverfahren einschließen, das die Proteinstruktur physikalisch oder chemisch nicht wesentlich beeinflußt. Man glaubt auch, daß LUVETs für die Verabreichung von mCRP besonders gut verwendbar sind, da LUVETs keine Spuren von organischen Lösungsmitteln oder Detergentien enthalten, die bei der Herstellung von Liposomen üblicherweise verwendet werden. Darüber hinaus sind LUVETs durch eine einzelne Lipiddoppelschicht definiert, weisen relativ große interne Volumina auf und weisen typischerweise im Vergleich zu multilamellaren Vesikeln eine größere Effizienz der Einkapselung auf. Obwohl der exakte Mechanismus bzw. die exakten Mechanismen, nach denen mCRP-haltige Liposomen wirken, noch nicht vollständig verstanden ist bzw. sind, wird angenommen, daß die Liposomen als Vehikel zur wirksamen Verabreichung von mCRP gegenüber Krebszellen dienen können.
Das mCRP wird dem Säugetier vorzugsweise durch Injektion verabreicht (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär). Wirksame Dosen und Verabreichungspläne zum Verabreichen von mCRP können empirisch bestimmt werden, und deren Bestimmung liegt innerhalb des Fachwissens. Die Anmelder haben gefunden, daß eine Dosis von etwa 0,10 mg bis etwa 20 mg mCRP pro Kilogramm Körpergewicht des Säugetiers und vorzugsweise von etwa 2 mg bis etwa 10 mg pro Kilogramm zur Behandlung von Krebs wirksam ist, sowohl bei Verabreichung von mCRP in einem pharmazeutisch verträglichen Träger als auch wenn es in Liposomen enthalten ist. Es wird daher vom Fachmann verstanden, daß die Dosis des mCRP, die verabreicht werden muß, variiert, abhängig von z. B. dem Säugetier, das das mCRP erhält, der Art des Krebs, dem Ausmaß des Wachstums der Krebszellen oder der Metastasenbildung, der biologischen Stelle oder dem Körperteil, die bzw. das von dem Tumor bzw. den Tumoren befallen ist, der Art der Verabreichung und der Art der anderen Medikamente oder der Behandlung, die dem Säugetier zuteil wird, wie eine Bestrahlung oder eine chirurgische Behandlung. Es ist auch klar, daß es notwendig sein kann, mehr als eine Dosis mCRP zu verabreichen. Im allgemeinen müssen dem Säugetier mehrere Dosen mCRP verabreicht werden. Das Intervall zwischen den Dosen liegt vorzugsweise bei etwa 1 bis etwa 3 Tage. Die Verabreichung von mCRP sollte fortgesetzt werden, bis die Gesundheit des Lebewesens wiederhergestellt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von Krebszellen in einem Säugetier unter Verwendung von mCRP als Abbildungsmittel. Zur Identifizierung von Krebszellen muß das mCRP dem Säugetier durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) verabreicht werden. mCRP lokalisiert sich dann an Stellen, an denen sich Krebszellen befinden und bindet an die Krebszellen, wie in den Beispielen 2 und 3 unten näher beschrieben.
In einer Ausführungsform muß dem Säugetier markiertes mCRP verabreicht werden. In dem Verfahren verwendbare Markierungsstoffe sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Enzyme, Fluorophore, Radiosotope und Biotin-Avidin ein. Die Markierungsstoffe können dann nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren schnell nachgewiesen werden.
Alternativ kann eine markierte Komponente, die an das mCRP bindet, dem Säugetier verabreicht werden. Z. B. können Enzym-markierte oder Fluorescein-markierte Antikörper, die eine spezifische Reaktivität für mCRP Epitope aufweisen, dem Säugetier verabreicht werden, um das Vorliegen und die Lokalisierung von Krebszellen, an die das mCRP gebunden hat, zu identifizieren und nachzuweisen.

Beispiele

Beispiel 1: Antitumor Aktivität von mCRP gegen EMT6 Brust-Adenokarzinom

Es wurden in vivo Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob mCRP Antitumoaktivität gegen EMT6, einem murinen Brust-Adenokarzinom, zeigt. Die Aktivität des mCRP wurde durch Untersuchung des primären Tumorwachstums und der Metastasenbildung untersucht.

A. Herstellung und Reinigung von CRP

Es wurden humane Aszitesflüssigkeiten von der Cytologie-Abteilung des Department of Pathology, Northwestern Memorial Hospital, Chicago, IL und vom Evanston Hospital, Evanston, IL bezogen. Unter Verwendung von Steriltechniken wurden die Flüssigkeiten durch einen Filterflaum gefiltert und dann wurde CaCl&sub2; auf eine Endkonzentration von 2-5 mM zugesetzt. Die Flüssigkeits-CaCl&sub2;Mischungen wurden bei 4ºC gelagert.
Jede Flüssigkeit wurde in einem radialen Immundiffusionsassay auf CRP getestet, und zwar gemäß einer Modifikation des von Crowle beschriebenen Verfahrens, Immunodiffusion, Academic Press, New York, Kapitel 3 (1973). Aszitesflüssigkeiten mit CRP Konzentrationen > 25 ug/ml wurden durch sequentielle Calcium-abhängige Affinitätschromatographie mit Modifikationen der von Volanakis et al. [J. Immunol., 126: 1820-1825 (1981)] and de Beer et al. [J. Immuno. Methods, 50: 17-31 (1982)] beschriebenen Verfahrens gereinigt. Etwa 3-4 Liter Flüssigkeit wurden auf eine Phosphorylcholin substituierte Bio-Gel A 0,5 m (BioRad, Richmond, CA) Affinitätssäule mit einem Säulenvolumen von 325 ml über 36-48 Stunden aufgetragen. Die Säule wurde ausgiebig mit Äquilibrierungspuffer (75 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl&sub2;, pH 7,3) gewaschen, bis die Extinktion des Eluats bei 280 mm < 0,05 war. CRP enthaltende Fraktionen mit einer Extinktion bei 280 nm ≥ 0,25 wurden dann durch Tris- Zitrat Chelationspuffer (75 mM Tris-HCl, 7,5 mM Zitrat, 150 mM NaCl, pH 7,3) eluiert.
Die CRP-Fraktionen wurden vereinigt und 3-fach mit entionisiertem destilliertem Wasser gewaschen und auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt. Die verdünnten Fraktionen wurden dann auf eine DE-52 Anionentauscher Säule (Whatman Biochemicals, Kent, England) bei einem Verhältnis von 50 g Harz auf jeweils 500 ml verdünntes CRP aufgetragen. Als nächstes wurden die CRP enthaltenden Fraktionen mit einem linearen 0,05-0,5 M NaCl Gradienten in 10 mM Tris-HCl pH 7,3 eluiert. Um restliches SAP zu entfernen, wurden die Fraktionen auf eine unsubstituierte BioGel A 0,5 m Säule (BioRad) aufgetragen und mit dem obigen Äquilibrierungspuffer eluiert. Das CRP wurde getestet und es wurde durch radiale Immundiffusion (RID) bestätigt, daß es negativ auf IgG und SAP war, und durch einen doppelten Diffusionsassay, daß es negativ auf IgM, IgE und die Complementkomponenten C1q und C3 war.
Die Proteinkonzentration wurde durch Modifizierung des Bicinchoninsäure (BCA) Proteinassays (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wie von Sorensen et al. [Experientia, 42: 161-162 (1986)], beschrieben, und durch spektrophotometrischen Extinktionsassay bei 215 nm und 225 nm, wie von Waddell [J. Lab. Clin. Med., 48: 311-314 (1956)] beschrieben durchgeführt. Der Gesamt-CRP Gehalt wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von 1,95 cm&supmin;¹ (mg/ml) für CRP bei 280 nm berechnet [Wood et al., J. Clin. Invest.; 30: 616-622 (1951). Die Reinheit des CRP wurde berechnet, indem die Gesamtmenge des CRP durch die Gesamtmenge des Proteins in der gleichen Probe geteilt und mit 100 multipliziert wurde. Die Proteinreinheit des CRP wurde aus diesen berechneten Werten zu ≥98,5% bestimmt.
Die Reinheit des CRP wurde auch durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung eines 4,0% Sammelgels und eines 12% Trenngels und den von Laemmli (Nature, 227: 680-685 (1970)) beschriebenen Puffersystemen bestätigt. Man ließ die Gele bei 4ºC mit einer konstanten Spannung von 100 V laufen, bis die Farbfront komplett in das Sammelgel eingedrungen war. Man ließ das Gel anschließend bei 200 V zu Ende laufen. Das gesamte CRP-Protein wanderte als einzelne Bande von etwa 22,5 Kd und wurde durch Laserdensiometrie auf einem Ultrascan XL Densiometer (LKB Instruments) auf eine Reinheit von größer 99% bestimmt.
Das gereinigte CRP wurde durch Ultrafiltration unter Stickstoff unter Verwendung einer Amicon PM-30 Membran (Amicon, Danvers, MA) auf 1 mg/ml konzentriert und gegen Tris gepufferte Saline-Calcium (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl&sub2;, pH 7,3) dialysiert. Das CRP wurde dann sequentiell durch eine 0,45 Micron und 0,2 Micron Acrodisc Filteranordnung (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) filtriert und bei 4ºC in sterilen Glasfläschchen gelagert.

B. Herstellung von mCRP

Modifiziertes CRP ("mCRP") wurde unter Anwendung des vorhergehend durch Potempa et al.. [Mol. Immunol., 20: 1165-1175 (1983); Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987)] beschriebenen Verfahrens hergestellt. Gereinigtes natives CRP, wie oben beschrieben hergestellt, wurde bei 1 mg/ml in Tris-gepuffertem Saline-Calcium Puffer, mit 5 mM EDTA chelatisiert und für 2 h bei 37ºC in 8 M Harnstoff inkubiert. Der Harnstoff wurde dann durch Dialyse gegen eine Tris gepufferte Saline niedriger Ionenstärke (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,3) entfernt. Es ist bevorzugt, mCRP in einem Puffer niedriger Ionenstärke herzustellen, um die Aggregation des mCRP zu minimieren. Die mCRP Konzentrationen wurden dann unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,95 cm&supmin;¹ (mg/ml) bei 280 nm und dem BCA Proteinassay wie oben beschrieben bestimmt. Das mCRP wurde wie oben beschrieben sterilfiltriert und in einer Tris gepufferten Saline bei 4ºC in sterilen Glasfläschchen gelagert.

C. Herstellung von LUVET

LUVETs, die entweder natives CRP oder mCRP (hergestellt wie oben beschrieben) oder Kontrollpuffer enthielten, wurden gemäß einer Modifikation des Verfahrens hergestellt, das von MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta, 1061: 297-301 (1991) beschrieben wurde. Genauer gesagt war das eingesetzte Verfahren eine Kombination aus zwei vorhergehend beschriebenen Verfahren - einem ersten Verfahren, das milde Bedingungen zum Einschließen von biologisch aktiven Makromolekülen einsetzt [Kirby et al., Liposome Technology, Volume I. Preparation of Liposomes, CRC Press, pp. 19-27 (1984)] und einem zweiten Verfahren zum Bilden von Vesikeln gut definierter Größe und Homogenität [Olson et al., Biochim. Biophys. Acta, 557: 9-23 (1979)].
Eine Mischung aus L-α-Lecithin (Phosphatidylcholin), Sphingomyelin, (Avanti Polar Lipids, Inc., Pelham, AL) und Cholesterin (Sigma) wurde in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 : 1 in einen Rundkolben eingefüllt und in Chloroform von HPLC-Reinheit (Sigma) gelöst. Insgesamt 35,5 mg dieser Lipidkomponenten wurden in 6,75 ml Chloroform gelöst und unter Hochvakuum in einem 50ºC Wasserbad unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (Buchi Roto-vac, Bern, Schweitz) für mindestens 1 Stunde getrocknet, um an den Wänden des Kolbens einen dünnen Film zu bilden. Der getrocknete Lipidgehalt wurde dann mit 3,5 ml der einzukapselnden Medien aus wäßriger Phase (z. B. natives CRP, mCRP oder Kontrollpuffer) hydratisiert, um eine Lipidkonzentration von 15,9 mM zu bilden.
Die spontan gebildeten Vesikel wurden unter Druck durch eine einzelne 0,1 Micron Polycarbonatmembran (Nucleopore, Pleasanton, CA), die auf einen handgetriebenen Extrusionsapparat [entwickelt in den Laboren von R. C. MacDonald und beschrieben in MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta, 1061: 297-301 (1991)] aufgebracht war und mit zwei 0,5 ml Hamiltonspritzen (Hamilton, Reno, NV) ausgestattet, 9 Extrusionen unterzogen. Es wurde eine ungerade Anzahl an Extrusionspassagen durchgeführt, um eine mögliche Kontamination während der Hydration der Probe durch große Vesikel, die möglicherweise in der ersten Passage das Filter nicht passiert haben, zu verhindern. Die LUVETs aus dem Extrusionsverfahren wiesen eine homogene und gut definierte Größenverteilung von etwa 0,1 Micron auf. Die LUVETS wurde bei 4ºC für eine Zeitraum von 1 bis 2 Stunden gelagert.
Die Menge an Protein, entweder natives CRP oder mCRP, das in den LUVETs eingekapselt ist, wurde durch eine Adaption des Verfahrens bestimmt, das von Kaplan et al. beschrieben ist, Meth. Enzymol., 172: 393-399 (1989). Bei Raumtemperatur wurden 20 ul jeder LUVET-Probe mit 2,0 ml destilliertem entionisiertem Wasser gewaschen. Zu der verdünnten Probe wurde hintereinander folgendes zugesetzt: 200 ul 10% (Gew/Vol) SDS, 300 ul Tris-SDS (1 M Tris-HCl, 1% (Gew/Vol) SDS, pH 7,5) und 600 ul 10% Trichloressigsäure (TCA). Nach jeder Zugabe wurde die Mischung kontinuierlich für 10 Sekunden gevortext. Man ließ die Mischung nach dem TCA-Schritt für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Jede Probe wurde durch einen Millipore HAWP 090 00 Filter (Millipore Corporation, Bedford, MA) filtriert und mit 2,0 ml 6% (Gew/Vol) TCA gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Filter in 200 ml Amidoschwarz Färbelösung [0,1% (Gew./Vol) Amidoschwarz 10B (Bio-Rad), gelöst in Methanol/Eisessig/Wasser in einem Verhältnis von 45 : 10 : 45] für 3 Minuten auf einem Schütteltisch gefärbt. Das Filter wurde entfernt und mit etwa 200 ml destilliertem entionisiertem Wasser für 2 Minuten auf einem Schütteltisch gewaschen. Das Filter wurde dann entfeuchtet und mit einer sauberen Rasierklinge zerkleinert, bevor es in 700 ul Amidoschwarz-Elutionspuffer (25 mM NaOH, 0,05 mM EDTA, 50% Ethanol) gegeben wurde. Die Farbe wurde durch gelegentliches Vortexen während einer 30 Minuten andauernden Inkubation bei Raumtemperatur eluiert und die Extinktion des Eluats bei 630 nm wurde gemessen. Die Extinktionswerte wurden verwendet, um die Proteinkonzentration aus linearen Standardkurven zu berechnen, die mit Proben von 2-24 ug BSA erzeugt wurden.
Die Wirksamkeit der LUVET-Einkapselung wurde durch Calcein-Volumenphasenassay (zur Bestimmung der internalisierten Volumens) und Amidoschwarz Proteinassay (zur Bestimmung der Menge des Proteins) bestimmt. Die Wirksamkeit der Einkapselung wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmarkers für das wäßrige Phasenvolumen bestimmt, wie von Oku et al., Biochim. Biophys. Acta, 691332-340 (1982) beschrieben. Die Menge des gemessenen nativen CRP, ausgedrückt als Lipidverhältnis, betrug 2,0 ug CRP/umol Lipid. Das Vesikel-Internalisierungsvolumen, ebenfalls als Lipidverhältnis ausgedrückt, betrug 2,02 ul/umol Lipid. Die berechnete LUVET Einkapselungs-Effizienz betrug 990 ug CRP/ml ± 20 ug/ml internes Volumen.
Die LUVETs wurden auch auf ihre Merkmale hinsichtlich Antigen-Determinanten für natives CRP und mCRP untersucht, um zu bestimmen, ob die LUVETs homogene CRP- oder native CRP-Zusammensetzungen enthielten oder ob eine Umwandlung dieser CRP- Formen ineinander auftrat. Um das Vorliegen von spezifischen Antigen-Determinanten für natives CRP oder mCRP zu bestimmen und dieses zu quantifizieren, wurden LUVETs, die entweder natives CRP, mCRP oder Kontrollpuffer enthielten, durch einen enzymverbundenen Tupf-Immunofiltrationsassay ("Tupf-ELISA") analysiert. Der Tupf-ELISA [beschrieben von Clark et al., J. Biotechniques, in press (1992)] wurde durch eine Adaption von vorher beschriebenen Protokollen [Hawkes et al., Analyt. Biochem., 119: 142-147 (1982); Pappas et al., J. Immunol. Meth., 64: 205-214 (1983)] entwickelt. Dieser Assay verwendet Nitrozellulosemembranen an Stelle von Plastikmicrotiterplatten, und daher ist er bei Proteinen wie CRP besonders verwendbar, von denen bekannt ist, daß sie bei Absorption an Plastikoberflächen konformationellen Änderungen unterliegen [siehe Potempa et al., Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987)].
In Kürze wurden Serienverdünnungen von nativem CRP, mCRP und LUVETs, enthaltend entweder natives CRP, mCRP oder Kontrollpuffer auf 0,45 Micron Nitrozellulosemembranen durch eine Easy-Titer -Einheit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) aufgebracht. Alle Näpfe wurden mit 100 ul Probenpuffer gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen. Die verbleibenden ungebundenen Stellen wurden mit einer Beschichtung aus bovinem Serumalbumin (BSA) geblockt. Die Nitrozellulosemembran wurde dann in eine Fast Blot Developer Einheit (Pierce Chemical Co.) gestellt.
Als nächstes wurde die Membran mit primärem Antikörper inkubiert, der für natives CRP oder mCRP spezifisch war. Die folgenden monoklonalen Antikörper ("mAbs"), erhalten von Dr. Lawrence Potempa, Immtech International, Inc., Evanston, IL, wurden getestet: 15.1D6 (Reaktivität spezifisch für natives CRP); 13.3H12, 26.7A8 und 26.8C10 (Reaktivität spezifisch für mCRP); und 15.2C10 (Reaktivität für natives CRP und mCRP). Diese Antikörper wurden in den ebenfalls anhängigen Anmeldungen mit der Seriennummer 07/374 166 und in Ying et al., J. Immunol., 143: 221-228 (1989), beschrieben.
Nach dem Waschen zum Entfernen von ungebundenem primären Antikörper wurde die Membran mit einem Konjugat von Ziege- oder Pferd-anti-Maus-IgG und Meerrettiehperoxidase (HRP) inkubiert. Die Membran wurde dann gewaschen, um ungebundenen sekundären Antikörper zu entfernen und mit einem HRP Substrat entwickelt.
Die Ergebnisse des Tupf-ELISA Tests bestätigten, daß der mAb 13.3H12 für mCRP- Epitope spezifisch ist und der mAb 15.1D6 für native CRP-Epitope spezifisch ist. Die Ergebnisse zeigten auch, daß < 1% des nativen CRP, das in LUVETs eingekapselt war, mCRP Epitope zeigte, die von mAb 13.3H12 erkannt wurden. Demgemäß wurden < 1% des nativen CRP auf dem Wege des LUVET-Extrusionsverfahrens in mCRP umgewandelt. Obwohl es für unwahrscheinlich gehalten wurde, daß mCRP, das in LUVETs eingekapselt ist, einer Umwandlung zu der nativen CRP Form unterliegen würde, wurden die mCRP enthaltenden LUVETs mit den 13.3H12 und 15.1D6 Antikörpern auf Reaktivität untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß bei den mCRP enthaltenden LUVETs im wesentlichen keine nativen CRP Epitope ausgeprägt wurden.
Zum Vergleich wurden multilamellare Vesikel ("MLVs"), die natives CRP enthielten, gemäß dem von Deodhar et al., J. Biol. Resp. Modifiers, 1: 27-34 (1982) offenbarten Verfahren hergestellt. Die MLVs, die natives CRP enthielten, wurden dann auf CRP und mCRP-Epitope untersucht, unter Anwendung der Tupf-ELISA Analyse, wie oben beschrieben.
Dosisabhängig zeigten die MLV-Zusammensetzungen Antigen-Determinanten, die sowohl von mAb 13.3H12 als auch von mAb 15.1D6 erkannt wurden. Die von 15.1D6 nachgewiesene Menge war an allen Titrationspunkten größer als die von 13.3H12, beobachtet bis zu einem MLV Aliquot, das 2048 ng natives CRP enthielt. Insgesamt zeigten die Daten, daß etwa 40% des nativen CRP, eingekapselt in MLVs nach den von Deodhar et al. beschriebenen Verfahren, in mCRP umgewandelt wurde.
Die Einkapselungseffizienz dieser MLVs wurde auch unter Verwendung des Calcein Volumenphasenassays und des Amidoschwarz Proteinassays bestimmt. In diesen MLV- Zusammensetzungen betrug die Menge des CRP, dargestellt im Verhältnis zum Lipid, 0,28 ug CRP/umol Lipid. Das internalisierte MLV Volumen, dargestellt als Volumen- Lipid-Verhältnis, betrug 0,82 ul/umol Lipid. Unter Verwendung des CRP Protein/Lipid Verhältnisses aus dem Amidoschwarz-Proteinassay und dem Volumen/Lipid Verhältnis aus dem Calcein Volumenphasenassay wurde die MLV Einkapselungseffizienz zu 341,5 ug CRP/ml ± 53 ug/ml internes Volumen bestimmt.
Einige der Eigenschaften der MLVs im Vergleich zu den LUVETs sind in Tabelle 1 unten gezeigt. Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, ergaben die LUVETs größere Mengen an eingekapseltem Protein pro Menge Lipid sowie größere Internalisierungsvolumina und eine höhere Einkapselungseffizienz. Darüber hinaus führte die Einkapselung von nativem CRP in LUVETs zu keiner nachweisbaren Umwandlung von nativem CRP in mCRP. Es wurde daher der Schluß gezogen, daß LUVETs gegenüber MLVs überlegen waren.

D. In vivo Toxizitätsstudien mit mCRP

Bevor Versuchstieren natives CRP, mCRP oder LUVETs, die entweder natives CRP, mCRP oder Kontrollpuffer enthielten, verabreicht wurde, wurde eine in vivo Toxizitätsstudie durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Verabreichung von mCRP von schädlichen Nebenwirkungen begleitet wird.
Insgesamt 80 weibliche BALB/c Mäuse (erhalten von Harlan Laboratories, Madison, WI), 10-12 Wochen alt, wurden zufällig in Kontroll- und Testgruppen von je 5 Mäusen eingeteilt. Versuchsgruppen wurden mit mCRP Dosen injiziert, die im Bereich von 1 ug/Maus bis 100 ug/Maus lagen, während Kontrollgruppen mit Phosphat gepufferter Saline injiziert wurden. Die Injektionen erfolgten entweder intravenös, intraperitoneal oder subkutan und wurden an den Tagen 4, 11 und 18 verabreicht.
Vor der ersten Injektion wurden für alle Tiere aus der Versuchs- und der Kontrollgruppe die Daten für die Hintergrundwerte aufgenommen. Die Tiere wurden durch Messungen des Körpergewichts und Urinanalyse auf Blut, Protein, Glucose und pH (Ames Co., Hema-combistix Reagenzstreifen) alle 3 Wochen untersucht. Die Mehrzahl der Tiere, 75 von 80 (> 93%) erhöhte ihr Körpergewicht oder hielt es innerhalb allgemein akzeptierter Grenzen der Abweichung aufrecht, was so definiert ist, daß kein Verlust des Körpergewichts von mehr als 10% des originalen Körpergewichts auftrat. Insgesamt 5 von 80 Tieren nahmen Körpergewicht mit Werten von > 10% des Originalkörpergewichts ab. Von dieser Gruppe zeigte keine Maus eine Abnahme des Körpergewichts von mehr als 24%.
Um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der prozentualen Änderung im Körpergewicht der Kontrollgruppe im Vergleich zu jeder Testgruppe zu bestimmen, wurde der zweiseitige Student t-Test verwendet, wobei p < 0,05 als signifikant angesehen wurde. Die Testergebnisse zeigten, daß bei allen Gruppen kein statistisch signifikanter Unterschied in der prozentualen Änderung des Körpergewichts bestand.
Ein Urinanalyse-Test zeigte, daß für die gemessenen Parameter bei allen getesteten Gruppen nur eine minimale Abweichung vorlag. Zu keiner Zeit wurde Glukose oder Blut im Urin entdeckt. Der Proteingehalt des Urins wurde für alle Tiere durchgehend ohne Ausnahme mit 30 ug/ml gemessen. Die Urin-pH-Werte variierten innerhalb normaler Grenzen minimal und die Abweichung überstieg nie eine einzelne pH-Einheit für ein einzelnes Tier.
Zusätzlich wurde die allgemeine Erscheinung und Aktivität aller Gruppen fotografiert und aufgezeichnet. Alle Tiere innerhalb dreier separater Käfige zeigten eine erkennbare Aktivität und ein Putzen in normalem Ausmaß, einschließlich einer Tendenz zum Phänomen der Fellpflege. Alle diese Ergebnisse zeigen, daß mit verschiedenen Dosen und auf den verschiedenen beschriebenen Wegen verabreichtes mCRP keinerlei schädliche Nebenwirkungen zeigt, wie durch die beschriebenen Parameter gemessen wird.

E. Wirkungen von nativem CRP und mCRP auf das Wachstum und die Metastasenbildung von EMT6 primärem Tumor

Ein in vivo Tumorwachstumsassay wurde durchgeführt, um die Wirkungen von mCRP und LUVETs, enthaltend entweder natives CRP, mCRP oder Kontrollpuffer, auf das Wachstum von murinen EMT6 Brust-Adenokarzinomtumoren zu messen. Die murine Brust-Adenokarzinomzellinie, EMT6, wurde von Dr. John Wilson, Medical College of Virginia, Richmond, Virginia, erhalten und in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum, 11,25 ug/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2,5 ug/ml Amphotericin B supplementiert war. Die Zellinie wurde getestet und sie war frei von Mycoplasmen und anderen mikrobiellen Kontaminationen.
An Tag 1 der Studie wurden etwa 3 · 10&sup6; lebende EMT6-Zellen/0,1 ml RPMI-1640 in BALB/c-Mäuse injiziert, die von Harlan Laboratories, Madison, WI, erhalten wurden. Die Zellen wurden proximal zum Calcaneus des rechten Hinterlaufes aller Tiere subkutan injiziert und die Tiere wurden willkürlich in sieben Gruppen aufgeteilt, wie in Tabelle 2 unten gezeigt. An Tag 7 war eine Tumormasse in allen Tieren gewachsen. TABELLE 2
¹) zusätzliche Anzahl an Tieren, die eine nekrotische Läsion von zweifelhafter Art zeigen
²) Tiere mit durchgehendem Anstieg des Tumorvolumens/Tiere mit fluktuierendem Tumorvolumen
Die in Tabelle 2 für jede Gruppe beschriebenen Behandlungen wurden durch intravenöse Injektion an jedem zweiten Tag für 13 Tage, beginnend mit Tag 7, verabreicht. Vor der Injektion wurden die LUVETs, die natives CRP, mCRP oder Kontrollpuffer enthielten, einer Trennchromatographie auf einer Einweg- 2,5 ml Bio-Gel A 0,5 m-Säule unterworfen (etwa 1-2 ml Bettvolumen/mg Protein), um das nicht-LUVET assoziierte native CRP oder mCRP zu entfernen. Die LUVETs passierten die Säule mit dem Leervolumen und erschienen trüb. Das Protein, das nicht eingelkapselt war, wurde als sich langsam bewegende Fraktion mit einer Extinktion bei 280 nm gemessen, das nach einem 2-3-Säulenvolumen Intervall, im Vergleich zur LUVET-Fraktion, eluierte.
Wie von McIntosh et al., Cancer Research, 49: 1408-1414 (1989) beschrieben, wurde das Wachstum des Tumors an der primären Stelle der Initiation bestimmt, indem die kürzesten und die längsten Dimensionen der gewachsenen Tumormasse unter Verwendung eines Meßschiebers auf 0,05 mm genau vermessen wurden. Es wurde der kleinere Radius (a) und der größere Radius (b) verwendet, um das Tumorvolumen in mm³ zu berechnen, unter Verwendung der Formel eines gestreckten Ellipsoids:
Volumen = 4/3πa²b.
Das berechnete Tumorvolumen steht für die Tumorbelastung. Jede Testgruppe enthielt 15-16 Tiere. Es wurden die mittleren Tumorbelastungen pro Behandlungsgruppe berechnet und unter Verwendung des zweiseitigen Student t-Tests verglichen, wobei p Werte < 0,05 als statistisch signifikant aufgefaßt wurden.
Das Wachstum der primären Tumoren in Tieren, die mCRP in LUVETs erhielten (Gruppe 5), im Vergleich zu Tieren, die keine Therapie erhielten (Gruppe 1) und zu Tieren, die natives CRP in LUVETs erhielten (Gruppe 4) ist in Fig. 1 mit Bezug auf die Tage gezeigt, an denen die Therapie angewendet wurde. Die intravenösen Therapieinjektionen wurden an den Tagen vorgenommen, die durch die in Fig. 1 gezeigten Pfeile angezeigt sind.
Sieben Tage nach der Tumorimplantation variierte die mittlere Tumormasse in den verschiedenen Gruppen zwischen 459 mm³ und 863 mm³. Die Wachstumsrate des Tumors wird als mittleres Tumorvolumen in mm³ ± Standardabweichung des Mittelwertes aufgetragen. Die Tumoren in Tieren, die natives CRP in LUVETs erhielten, setzten ihr Wachstum mit hoher Geschwindigkeit fort, die im Vergleich zu der Geschwindigkeit, die bei Tieren der Gruppe ohne Therapie beobachtet wurde, parallel verlief und keine signifikanten Unterschiede zeigte. Im Gegensatz dazu war die Wachstumsgeschwindigkeit des Tumors in Tieren, die mCRP in LUVETs erhielten, über die gesamte Zeitdauer minimal. Unter Anwendung des Student t-Tests war das Tumorwachstum in Tieren, die mit mCRP in LUVETs behandelt wurden, signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Tumorwachstum in Kontrolltieren, die keine Therapie erhielten, und zwar mit p < 0,025 an Tag 9 und p < 0,001 an den Tagen 11-19.
Sobald die Therapie beendet war (nach Tag 19) und bis zu Tag 29 war das Tumorwachstum bei den mit nativen CRP in LUVETs behandelten Tieren unbeeinflußt und setzte sich mit hoher Geschwindigkeit fort. Wie in Fig. 2 gezeigt, in der das Tumorwachstum als prozentuale Änderung im Vergleich zur an Tag 7 gemessenen Tumorgröße aufgetragen ist, waren die Tumoren sowohl in der Kontrollgruppe ohne Therapie als auch in der Gruppe, die mit nativem CRP in LUVETs behandelt war, mehr als 10-fach größer (1000%), als die an Tag 7 gemessenen Tumoren. Das Tumorwachstum in der mCRP in LUVETs Gruppe stieg nach Ende der Therapie an, wobei es mit einer Geschwindigkeit wuchs, die mit der Geschwindigkeit vergleichbar war, die bei Tumoren ähnlicher Größe in der Kontrollgruppe ohne Therapie beobachtet wurde.
Unter Annahme einer linearen Wachstumsgeschwindigkeit und unter Verwendung der linearen Regressionsanalyse der kleinsten Fehlerquadrate für das Tumorwachstum an den Therapietagen im Vergleich zu den Tagen nach der Therapie (zusammengefaßt in Tabelle 3 unten) betrug die Tumorwachstumsgeschwindigkeit in den Tieren der Kontrollgruppe ohne Therapie 203,5 ± 12,7 mm³/Tag während der Tage 7-19 und 366,9 ± 34,1 mm³/Tag während der Tage 19-29. Die Tumorwachstumsgeschwindigkeit in den Tieren der Gruppe mit nativem CRP-LUVETs betrug 186,8 ± 24,4 mm³/Tag während der Therapie und 367,0 ± 33,7 mm³/Tag an den Tagen 19-29. Die Tiere der mCRP in LUVETs Gruppe wiesen ein vernachlässigbares durchschnittliches Tumorwachstum von 44,7 ± 12,0 mm³/Tag während der Therapietage, Tage 7-19, auf und die Wachstumsrate stieg auf 327,6 ± 18,1 für die Tage 19-29 an. TABELLE 3 ÄNDERUNG IM TUMORVOLUMEN (mm³/Tag)*
*) durch lineare Regression nach der Methode der kleinsten Quadrate berechnet
Das Tumorwachstum stieg mit dem Ende der CRP in LUVETs Therapie auf eine Geschwindigkeit an, die ähnlich zu der in den Tieren der Kontrollgruppe war. Dennoch wiesen Tiere, die mit mCRP in LUVETs behandelt waren, weiterhin Tumoren auf, die statistisch kleiner waren, als die Tumoren, die entweder in der Kontrollgruppe ohne Therapie oder in der Therapiegruppe mit nativem CRP in LUVETs gemessen wurden, und zwar mit p < 0,01 zu allen Zeitpunkten der Tage 21-29.
In Fig. 3 wird die mCRP-behandelte Gruppe (Gruppe 3, die mCRP in Puffer erhält) mit der Gruppe ohne Therapie (Gruppe 1) in bezug auf das Tumorwachstum (mittleres Tumorvolumen) über den 29-tägigen Verlauf der Studie verglichen. Die Resultate zeigen, daß mCRP auch beim Verhindern des Wachstums des murinen Brustadenokarzinomtumors wirksam war, mCRP zeigte keine sofortige Schutzwirkung, beginnend mit der ersten therapeutischen Dosis, wie sie bei der Therapie mit mCRP in LUVETs (Gruppe 5) beobachtet wurde. An den Tagen 9 und 11 stieg das gemessene mittlere Tumorvolumen in den Tieren der Therapiegruppe mit mCRP parallel mit den Tieren der Kontrollgruppe ohne Therapie (und der Gruppe mit nativem CRP in LUVETs) an. Nach Verabreichung der dritten mCRP-Pufferdosis und zu dem Zeitpunkt, zu dem das mittlere Tumorvolumen etwa 1.500 mm³ erreicht hatte, wurde die mCRP-Therapie wirksam, was dazu führte, daß in den behandelten Tieren für die verbleibende Therapieperiode (bis Tag 19) kein weiters Tumorwachstum auftrat. Die Geschwindigkeit des Tumorwachstums betrug für alle Therapietage (7-19) 67,3 ± 22,9 mm³/Tag, was eine 50% höhere Geschwindigkeit bedeutet, im Vergleich zu der Therapiegruppe mit mCRP in LUVETs (Tabelle 3). Falls jedoch eine lineare Regression bezüglich der Geschwindigkeit des Tumorwachstums lediglich für die Tage durchgeführt wird, an denen die mCRP-Puffertherapie das Wachstum des Tumors zu beeinflussen schien (Tage 11-19), reduzierte sich die Wachstumsgeschwindigkeit auf 15,0 ± 24,2 mm³/Tag. Unter Verwendung des zweiseitigen Student t-Tests auf Signifikanz ist die Geschwindigkeit des Tumorwachstums gegenüber einer Null-Wachstumsgeschwindigkeit nicht signifikant unterschiedlich.
Nach Tag 19 stieg das Wachstum des Tumors mit einer Geschwindigkeit an, die vergleichbar war zu der in den Gruppen gemessenen, die keine wirksame Anti- Tumoraktivität zeigten. Wenn die mittleren Tumorvolumen als prozentuale Änderung im Vergleich zu der Tumorgröße, die an Tag 7 gemessen wurde (Fig. 4) aufgetragen wird, zeigten die Tiere, die eine mCRP-Therapie erhielten, eine leichte Retardierung des Tumorwachstums während der ersten drei Tage der Therapie, im Vergleich zu der Therapie mit nativem CRP in LUVETs (und zu der Kontrolle ohne Therapie). Von Tag 11 bis Tag 19 trat im wesentlich kein Wachstum der mittleren Tumorgröße auf. An Tag 13 war die mCRP-Therapie im Vergleich zur Kontrolle ohne Therapie oder zur Therapie mit nativem CRP in LUVETs signifikant unterschiedlich, mit einem p-Wert von < 0,025. An den Tagen 15-19 zeigten sich die gemessenen Differenzen weiterhin signifikant, mit p < 0,001, verglichen mit beiden Gruppen. Nachdem die Therapie beendet war und die Tumoren wieder zu wachsen begannen (Tage 21-29) waren die mittleren Tumorvolumen in der mCRP-Therapiegruppe weiterhin signifikant unterschiedlich, verglichen mit der Therapiegruppe mit nativen CRP- LUVETs, und zwar mit p < 0,001 bis Tag 23, abfallend auf p < 0,02 an Tag 29.
Diese Daten legen es nahe, daß mCRP, und nicht natives CRP, eine wirksame Therapie darstellt, um das Wachstum von murinem Brust-Adenokarzinom zu verhindern. Darüber hinaus ist mCRP sowohl bei Injektion in Liposomen als auch alleine in Puffer wirksam.
Um die Antitumorwirkungen von mCRP vollständiger zu charakterisieren, wurden in jeder Gruppe Daten bestimmt, die die Anzahl der Tiere mit nekrotischen Läsionen, progressiven gegenüber fluktuierenden Tumorwachstumsgeschwindigkeiten, die Anzahl der Lungenmetastasen und die Anzahl der im einzelnen gestorbenen Tiere betrafen. Diese Daten sind in Tabelle 2 oben gezeigt.
Die Stellen, an denen Tumoren auftraten, wurden während der gesamten Studie visuell auf nekrotische Läsionen untersucht. Die visuelle Untersuchung von Tumoren an Tag 7 zeigte das Vorliegen einer gewachsenen, subdermalen soliden Tumormasse mit gut definierten Abgrenzungen an, die über die gesamte Oberfläche des Tumors eine einheitliche Farbe und Textur aufwies. Eine nekrotische Läsion wurde als Schwarzfärbung der Hautoberfläche möglicherweise mit Involution durch Gewebe definiert. In keiner der Kontrollgruppen (insgesamt 30 Tiere - Gruppen 1, 2A, 2B und 2C) zeigte irgendeines der Tiere Zeichen von Nekrose. Im Gegensatz dazu zeigten 12 (möglicherweise 14) der 16 Tiere, die mit mCRP in LUVETs behandelt waren und 7 (möglicherweise 8) der 15 Tiere, die mit mCRP behandelt waren, Nekrose, während 1 (möglicherweise 2) von 15 Tieren, die eine Therapie mit nativem CRP in LUVETs erhielten, Nekrose zeigte. 6 von 15 Tieren, die eine Therapie mit mCIRP in LUVETs erhielten, entwickelten nekrotische Stellen an Tag 9, 48 Stunden nach der ersten Behandlung. An Tag 19 zeigten einige der Tiere in dieser Therapiegruppe zwei oder drei separate Läsionen. Die nekrotischen Läsionen waren weich und durch Palpierung formbar, und sie traten als gut definierte subdermale Erscheinungen auf, die bis zu einem Drittel der gesamten Tumoroberfläche abdeckten. Eine Biopsie durch Aspiration mit einer feinen Nadel wurde an einer nekrotischen Stelle durchgeführt, wodurch verifiziert wurde, daß an der Stelle tote Tumorzellen sowie ein Vorherrschen von polymorphonuklearen Leukozyten und Makrophagen auftrat. Darüber hinaus zeigte die Analyse der Biopsie an, daß die beobachtete Nekrose nicht das Ergebnis eines infektiösen Prozesses war.
Die nekrotischen Läsionen waren von unterschiedlicher Größe und Form und sie überstiegen an der größten gemessenen Dimension nicht 15 mm. Während die anfänglich beobachteten Läsionen durch Palpieren formbar waren, waren sie nach einer gewissen Zeit durch Berührung nicht mehr formbar und stark behaart mit Retraktion und mit leicht gesenkten Abgrenzungen. Wenn die Tumoren bei der Autopsie resektiert wurden, wurden weitere diskrete fokale nekrotische Läsionen innerhalb der Tumormasse beobachtet, die durch die Untersuchung an der Oberfläche nicht sichtbar waren. Man fand keine anderen Organe oder Gewebe, die ungewöhnlich durch die mCRP-Therapie (mCRP in Puffer oder mCRP in LUVETs) beeinflußt waren, was anzeigt, daß mCRP eine direkte Anti-Tumorwirkung aufweist und dabei nicht toxisch ist.
Die Wachstumseigenschaften der Tumoren in den einzelnen Tieren zeigten auch wichtige Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen, die in Tabelle 2 aufgelistet sind. Z. B. wurde bei 6 von 15 Tieren in Gruppe 5 dokumentiert, daß Reduktionen in der Tumorgröße mit einer bis zu 60%-igen Abnahme auftraten, wenn mit dem Tumorvolumen vor der Therapie an Tag 7 verglichen wurde (Abnahme der Tumorgröße um mehr als die Hälfte). Darüber hinaus zeigte das Tumorwachstum in 44% der Tiere (7/16) in Gruppe 5 eine fluktuierende Progression im Tumorwachstum.
Im Gegensatz dazu zeigte die Messung des Wachstums von primärem Tumor in beiden Kontrollgruppen (Gruppen 1, 2A, 2B und 2C, die kein natives CRP oder mCRP erhielten) ein durchgängiges Tumorwachstum mit nur geringfügiger Variation zwischen den Tieren (nur ein tumortragendes Tier in Gruppe 2A zeigte einen fluktuierenden Anstieg in der Tumorgröße). Das Tumorwachstum in Tieren, die Kontrollpuffer enthaltende LUVETs erhielten (Gruppen 2B und 2C) zeigte, daß die LUVETs selbst keine inhibitorische Wirkung auf das Wachstum des primären Tumors hatten. Die Geschwindigkeit des Tumorwachstums war auch in beiden Kontrollgruppen vergleichbar. Die Anzahl der Tiere, die einen durchgängigen Anstieg im Tumorvolumen oder fluktuierende Anstiege zeigten, waren in den beiden anderen Gruppen: Gruppe 3 (mCRP in Pufferbehandlung) (10/5); und Gruppe 4 (Behandlung mit nativen CRP-LUVETs) (9/6).
Es wurden auch die Lungengewebe aller sezierten Tiere auf Metastasen untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigten die Gruppen 1 und 2 eine hohe Inzidenz von Metastasen - 20 von 30 Tieren (67%) der Gruppen 1 und 2 wiesen Wachstum von Tumormetastasen in den Lungen auf. Genauer gesagt wiesen von den 15 Tieren, die die Gruppen 2A, 2B und 2C ausmachen, 12 Tiere (80%) beobachtbare Lungentumormetastasen auf. Die Tiere aus Gruppe 4 (die natives CRP in LUVETs erhielten) zeigten auch eine relativ hohe Inzidenz von Metastasen. In der Gruppe 4 wiesen 10 von 15 (67%) der Tiere Lungenmetastasen auf.
Im Gegensatz dazu zeigten die Tiere aus Gruppe 3 und Gruppe 5, die mCRP bzw. mCRP in LUVETs erhielten, eine reduzierte Inzidenz von Metastasen. In Gruppe 3 wiesen 6 von 15 (40%) der Tiere Lungenmetastasen auf, während Lungenmetastasentumoren lediglich in einem (6,25%) von 16 Tieren in Gruppe 5 beobachtet wurde.
Die Daten aus dieser in vivo Studie zeigten daher, daß mit mCRP und mCRP in LUVETs behandelte Tiere eine höhere Inzidenz der Tumornekrose und einen stärkeren Abfall oder eine Fluktuation der Tumorgröße zeigten. Die Ergebnisse legen es auch nahe, daß mCRP die Metastasenbildung des Tumors reduziert, zusätzlich zu den Wirkungen auf das Wachstum des primären Tumors.

Beispiel 2: Bindung von nativem CRP und mCRP auf EMT6 Brustadenokarzinomzellen

Um zu bestimmen, ob natives CRP oder mCRP EMT6 Gewebekulturzellen bindet, würden Cytospin-Träger unter Verwendung einer Cytozentrifuge hergestellt. Kultivierte EMT6- Zellen, beschrieben in Beispiel 1, Teil E, wurden in phosphatgepufferter Sahne (PBS) gewaschen und auf etwa 1-2 · 10&sup6;/ml resuspendiert. Mikroskopobjektträger aus Glas mit Pappabdeckungen wurden in einer Cytozentrifuge montiert und 0,2-0,3 ml der EMT6-Zellsuspension wurde in das Reservoir eingefüllt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation für 15 Minuten auf den Objektträgern fixiert. Die resultierende Zellmonoschicht wurde für 30 Minuten an der Luft getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Objektträger wurden dann mit 200 ul nativem CRP oder mCRP in Puffer, beschrieben in Beispiel 1, Teile A und B, auf 100 ug/ml verdünnt, überschichtet und für 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit zwei Waschungen aus PBS gespült und mit einer Blocklösung (1% bovines Serum Albumin (BSA), 0,5% normales Pferdeserum in PBS) für 15 Minuten präinkubiert. Nach zwei Waschungen mit PBS wurde eine Lösung von biotinyliertem primärem Antikörper mAb15.d6 (beschrieben in Beispiel 1) bei 4 ug/ml oder biotinyliertem polyklonalem Antikörper LP5 [erhalten von Dr. Lawrence Potempa, Immtech International, Inc., Evanston, IL., und beschrieben in Potempa et al., Mol. Immunol., 24: 531-541 (1987)] bei 10 ug/ml für eine 30-minütige Inkubation in einer befeuchteten Kammer bei 37ºC zugesetzt. Die Antikörper waren unter Verwendung einer Modifikation des von Kendall et al., J. Immunol. Meth., 56: 329-339 (1983) and Hsu et al., J. Histochem. Cytochem., 27: 1131-1145 (1981) beschriebenen Protokolls biotinylliert worden.
Die Objektträger wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann wurden die sekundären Reagenzien mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase aufgebracht. Als nächstes wurde Diaminobenzidin Substratpuffer [6 mg DAB Tetrahydrochlorid (Sigma) in 10 ml PBS, plus 0.1 ml 3% H&sub2;O&sub2;] hergestellt und filtriert, um Präzipitat zu entfernen. Die Objektträger wurden dann für 15 Minuten in den Puffer eingetaucht. Die Reaktion wurde durch Waschen für 10 Minuten unter laufendem Wasser gestoppt. Nach dem Waschen wurden die Objektträger durch Eintauchen in Mayer's Hematoxylin (Sigma) für 3 Minuten gegengefärbt und 3 Minuten mit Wasser gespült, um überschüssige Färbelösung vor Zugabe von 30 mM NH&sub4;OH für 20 Sekunden zu entfernen. Die Objektträger wurden dann erneut in Wasser gewaschen und unter Verwendung von Permount mit einem Glasplättchen abgedeckt.
Die Inkubation von EMT6 Cytospin Objektträgern mit entweder nativem CRP oder mCRP zeigte ein direktes Binden von sowohl nativem CRP als auch mCRP an EMT6 Zellen. Nach der Inkubation mit 10 ug/ml nativem CRP haben die EMT6 Zellen 15.1D6 mAb (5.5 ug/ml) gegenüber 13.3H12 mAb (5.5 ug/ml) bevorzugt gebunden. Das Färbemuster für gebundenen 15.1D6 schien Membran-assoziiert zu sein, insbesondere in Bezug auf die Zellmembran und zu einem geringeren Ausmaß in Bezug auf die Kernmembran. Dieses Färbemuster wurde durch Untersuchungen mit kompetitiver Inhibierung durch natives CRP in Konzentrationen von 10 ug/ml aufgehoben und es war anscheinend durch mCRP mit 10 ug/ml unbeeinflußt.
Mit 10 ug/ml mCRP, gefolgt von entweder 13.3H12 oder 15.1D6 mAbs inkubierte Cytospin-Objektträger zeigten Bindung an 13.3H12, und nicht an 15.1D6. Das Färbemuster mit 13.3H12 war membranassoziiert und schien eine gewisse diffuse Spezifität für den Kern zu zeigen.

Beispiel 3: In Vivo Lokalisierung des nativen CRP und mCRP an Stellen mit humanem Lungenadenokarzinomtumor

Es wurde eine in vivo Studie durchgeführt, um zu bestimmen, ob natives CRP und mCRP die Tumorstellen in Tieren lokalisieren, die Lungenadenocarcinomtumoren tragen.
Die humane Lungenadenokarzinomzellinie A549 (bezogen von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) wurden in RPMI-1640 Medium, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum, 11,25 um/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2,5 ug/ml Amphotericin B, kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen zweimal mit RPMI-1640 gewaschen und mit einer Konzentration von 3 · 10&sup6; lebendigen Tumorzellen/0.1 ml resuspendiert. Dann wurden 0.10 ml der Zellsuspension in 6 bis 8 Wochen alte BALB/c (athymische) Nacktmäuse (bezogen von Harlan-Sprague-Dawley Laboratories, Madison, WI) subkutan proximal zum Fußballen des rechten Hinterlaufs injiziert.
An Tag 7 konnte ein tastbares Tumorwachstum gemessen werden. Die Tiere wurden dann willkürlich in vier Gruppen von Tieren aufgeteilt, mit einem Tier pro Gruppe, wie unten in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
An Tag 7 wurde der monoklonale Antikörper 443A6 injiziert. mAb 443A6, der spezifisch an A549 Lungenadenokarzinomzellen bindet, wurde von Dr. James A. Radosevich, Northwestern University Medical Center, Chicago, IL, erhalten. Der Antikörper ist auch von Affinity BioReagents, Inc., Neshanic Station, N. J., kommerziell erhältlich. Die Herstellung von mAb 443A6 und seine Aktivität werden in dem US-Patent Nr. 4 816 402 und Radosevich et al., Cancer Research, 46: 5808-5812 (1985) beschrieben. Für die Gruppen 2, 3 und 4, die eine Antikörperbehandlung erhielten, wurden 500 ug mAb 443A6 in 1.0 ml Aszitesflüssigkeit verdünnt und 100 ul wurden intravenös injiziert, während 900 ul intraperitoneal injiziert wurden.
Am folgenden Tag, Tag 8, wurden entweder 100 ug natives CRP oder mCRP (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, Teile A und B) intravenös in die Tiere injiziert. Etwa 90 Minuten bis 2 Stunden später wurden die Tiere getötet. Die Tumoren wurden dann resektiert und die contralaterale Skelettmuskulatur des Beines, die Leber, die Milz und Proben des Lungengewebes wurden aus den getöteten Tieren entnommen.
Es wurden Sektionen aus gefrorenen Gewebe hergestellt, indem eine kleine Probe des Gewebes, etwa 0,5 cm³, präpariert und sofort in eine Gelatine-Mischung aus Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol und Dimethylbenzylammoniumchlorid, gemischt in einem Würfel aus Aluminiumfolie, eingetaucht wurde. Die so gebildete Kapsel wurde graduell auf Trockeneis gefroren, bevor mit der Folie eingewickelt und bei -80ºC gelagert wurde.
Vor dem Schneiden wurden saubere Objektträger aus Glas mit 0,005% Poly-L-Lysin (verdünnt in 500 ml entionisiertem Wasser und filtriert) beschichtet. Die Objektträger wurden für 15 Minuten in die gefilterte Lösung eingetaucht und vor Verwendung oder Lagerung entfernt und für 30 Minuten luftgetrocknet. Gewebesektionen von etwa 8 Mikron wurden auf die beschichteten Objektträger aufgebracht, bei Raumtemperatur für 30 Minuten luftgetrocknet und dann bei -70ºC gelagert.
Zum Färben ließ man die Glasobjektträger mit den fixierten Gewebesektionen auf Raumtemperatur erwärmen und tauchte sie dann für 2 Minuten in Leitungswasser ein. Um die endogene Peroxidaseaktivität zu maskieren, erfolgte nach der Inkubation mit Leitungswasser eine Inkubation für 15 Minuten mit 0,03% H&sub2;O&sub2;-PBS-Lösung. Die Gewebesektionen wurden dann mit biotinyliertem mAbs zur Reaktion gebracht, die für natives CRP spezifisch waren, oder mit biotinylierten polyklonalen Antikörpern, die für mCRP spezifisch waren, und anschließend geblockt und gefärbt, wie in Beispiel 2 oben beschrieben.
Die Färbemuster zeigten, daß der für natives CRP spezifische mAB mit entnommenem Tumorgewebesektionen aus BALB/c Nacktmäusen, die A549 Tumor trugen, und die Injektionen mit nativem CRP erhielten, reagierte. In ähnlicher Weise reagierte polyklonaler Antikörper, der für mCRP spezifische war, mit dem Tumorgawebe, das den Mäusen entnommen war, die eine mCRP Injektion erhielten. Die Tumorgewebe aus den Mäusen, die natives CRP erhielten, zeigten keine mCRP Reaktivität, wenn sie mit dem für mCRP spezifischen polyklonalen Antikörper getestet wurden. Darüber hinaus wurde keine native CRP Reaktivität in dem Tumorgewebe nachgewiesen, das aus Mäusen stammt, die mCRP erhielten. Die biotinylierten Antikörper reagierten nicht mit anderen entnommenen Geweben der Tiere (Lunge, Milz, Skelettmuskulatur), mit Ausnahme des Lebergewebes. Die Reaktivität mit dem Lebergewebe war jedoch nicht unerwartet, da sich in der Leber endogenes Biotin befindet. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß spezifische antigene Determinanten, entsprechend der jeweiligen Form des CRP (entweder natives CRP oder mCRP), die intravenös verabreicht wurden, an dem Parenchyma der vorhergehend etablierten A549 primären Tumoren in Konzentrationen lokalisiert sind, die durch übliche immunohistochemische Techniken leicht nachweisbar sind.
Zusätzlich zur Auswertung durch Tumorgewebesektionen wurden die A549 Gewebekulturzellen durch Herstellen von Cytospin-Objektträgern, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgewertet. Die Inkubation von A549 Cytospin-Objektträgern entweder mit nativem CRP oder mit mCRP, beide konjugiert mit Fluoresceinisothicyanat, zeigte eine direkte Bindung von sowohl nativem CRP als auch mCRP an die Zellen. Darüber hinaus zeigten A549 Zellen, inkubiert mit entweder nativem CRP oder mit mCRP, eine Antikörperreaktivität mit mAb 15.1D6 bzw. mAb 13.3H12.

Vergleichsbeispiel 4: Verwendung von mCRP und 5-Fluoruracil zur Behandlung von P388 Leukämie in vivo

Es wurde eine in vivo Studie durchgeführt, um die Wirkungen der Behandlung von P388 Tumor tragenden Tieren mit mCRP in Kombination mit 5-Fluoruracil zu bestimmen.
Weibliche CD2-F&sub1; Mäuse (ein BALB/c · DBA/2 F&sub1; Hybrid, bezogen von Taconic Farms, Germantown, NY) wurden unter Standardlaborbedingungen gehalten und mit handelsüblichem Labornagerfutter (Purina) gefüttert. Die Unterbringung erfolgte bei 64 bis 72ºF mit einem 12 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus. Alle anderen Bedingungen wurden wie im Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 86-23, überarbeitet 1985) beschrieben eingehalten. Zum Zwecke der Untersuchung wurden die Tiere in 10 Gruppen aufgeteilt, wie in Tabelle 5 unten gezeigt. Tabelle 5
P388 Leukämiezellen (erhalten von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) wurden zweimal als intraperitoneales Implantat von 1 · 10&sup6; Zellen in DBA/2 Mäusen passagiert. Nach der zweiten Passage wurden die Zellen auf 1 · 10&sup6;/0,1 ml verdünnter Aszitesflüssigkeit konzentriert und an Tag 1 der Studie wurden die CD2-F&sub1; Mäuse damit intraperitoneal injiziert.
Es wurden zwei Dosen 5-Fluoruracil ("5-FU") (Sigma) durch Lösen von 5-FU in sterilem destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 1,0 mg/ml und 2,0 mg/ml hergestellt. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurden entweder 10 mg oder 20 mg 5-FU/kg Körpergewicht an den Tagen 2 bis 6 morgens intraperitoneal injiziert. Das Volumen des injizierten 5-FU für jedes Tier basierte auf dem jeweiligen Körpergewicht an Tag 2.
An den Tagen 2 bis 6 wurde nachmittags mCRP intravenös in die Tiere der Gruppen 5 bis 10 injiziert, wie in Tabelle 5 gezeigt. mCRP wurde von Dr. Lawrence Potempa, Immtech International, Inc., Evanston, IL, erhalten und wie folgt hergestellt. CRP wurde wie in Beispiel 1, Teil A beschrieben hergestellt. Um mCRP herzustellen, wurde CRP mit 1 mg/ml in 8 M ultra-reinem Harnstoff (Schwartz-Mann, Spring Valley, NY) in Gegenwart von 10 mM EDTA für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Der Harnstoff wurde durch Dialyse gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,015 M Natriumchlorid, entfernt.
Das mCRP wurde durch einen 0,20 Micron Filter (Gelman) steril filtriert. Die Konzentration wurde dann mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,015 Natriumchlorid, auf 0,5 mg/ml eingestellt, um eine Lösung von mCRP für die niedrige Dosierung (50 ug) der mCRP Verabreichungen in einem 0,1 ml Volumen herzustellen.
Ein Teil des steril filtrierten löslichen mCRPs wurde durch Zugabe von Natriumchlorid bis auf eine Endkonzentration von 0,15 M NaCl auf eine physiologische Ionenstärke eingestellt, und dann in einem Eisbad für 15 Minuten inkubiert. Ein Großteil dieser mCRP Präparation unterlag einer Selbstaggregation unter Bildung einer trüben Lösung, die für 10 Minuten mit etwa 5000 · g zentrifugiert wurde, um das Protein zu sedimentieren. Das sedimentierte Protein wurde in sterilem 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl resuspendiert, um eine Endkonzentration von 2 mg/ml zu ergeben. Dieses mCRP wurde als hochdosierte (200 ug) mCRP Behandlung in einem 0,1 ml Volumen verabreicht.
Die Körpergewichte aller Tiere wurden an den Tagen 2 und 6 unter Verwendung einer AND elektronischen Waage (AND Company Ltd., Tokyo, Japan) gemessen, die vor der Verwendung kalibriert wurde. Alle Tiere wogen an Tag 2 der Studie zwischen 12,1 g und 19.0 g.
Wie in Fig. 5 gezeigt, betrug das mittlere Körpergewicht für Gruppe 1, die keine Therapie erhielt, 16,8 g an Tag 6 der Studie. Das mittlere Körpergewicht von Gruppe 2 (15,2 g) und Gruppe 3 (16,6 g) Tieren, die niedrig dosierten und hochdosierten Puffer erhielten, wurde als nicht unterschiedlich im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrolltieren aufgefasst. Die Verabreichung von 50 ug mCRP (Gruppe 5) änderte das mittlere Körpergewicht der Tiere an Tag 6 nicht. In ähnlicher Weise zeigte die Verabreichung von 200 ug mCRP (Gruppe 6) keine Toxizität, wie durch Änderung des Körpergewichts an Tag 6 bestimmt.
Die Verabreichung von 20 mg 5-FU (Gruppe 4) führte zu einer Abnahme des Körpergewichts um 20% an Tag 6. Die Kombination eines chemotherapeutischen Medikaments in einer theoretisch optimalen Dosis mit der Verabreichung von mCRP in niedriger Dosis (Gruppe 7) führte zu einer Verringerung des Körpergewichts um 10% an Tag 6. Die Kombinationstherapie mit der hohen Dosis mCRP (Gruppe 8) war für die Tiere nicht toxisch, wie durch ein 10%-igen Anstieg im Körpergewicht gezeigt. Die Kombinationstherapie mit suboptimalen Dosen von 5-FU zusammen mit entweder hohen Dosen (Gruppe 9) oder niedrigen Dosen (Gruppe 10) mCRP zeigte in ähnlicher Weise keine Toxizität, in Bezug auf die Analyse des Körpergewichts.
Die mittlere Lebensspanne der Tiere aus der Kontrollgruppe 1 betrug 20 Tage. Die Lebensspanne der Tiere, denen niedrigdosierter (Gruppe 2) oder hochdosierter (Gruppe 3) Puffer verabreicht wurde, war im Vergleich zu den tumortragenden Mäusen aus der Kontrollgruppe 1 nicht unterschiedlich. Die Verabreichung von 5-FU mit 20 mg/kg Körpergewicht (Gruppe 4) veränderte die Lebensspanne der tumortragenden Tiere nicht drastisch. Die Verabreichung von mCRP mit entweder 50 ug (Gruppe 5) oder 200 ug (Gruppe 6) führte ebenfalls nicht zu einer Veränderung der Lebensspanne der tumortragenden Tiere.
Eine Kombinationstherapie von 20 mg/kg 5-FU mit 50 ug mCRP (Gruppe 7) senkte die Lebensspanne der Tiere um 40% ab. Im Gegensatz dazu verändert die Kombination mit 200 ug mCRP (Gruppe 8) die Lebensspanne der Tiere im Vergleich zu den Kontrollgruppen nicht. Eine Kombinationstherapie von 10 mg 5-FU/kg Körpergewicht mit 50 ug oder 200 ug mCRP (Gruppen 9 und 10) erhöhte die Lebensspanne um 128% bzw. 133%.
5 Tiere von den 18 Tieren aus dem mCRP Kombinationstherapiegruppen (Gruppen 8, 9 und 10) überlebten bis zum Ende der Studie. Ein Tier aus der 5-FU-Behandlungsgruppe (Gruppe 4) überlebte auch bis zum Ende der Studie. Das Vorliegen von Leukämiezellen in den überlebenden Tieren wurde durch Durchführung einer peritonealen Waschung an den anästhesierten Tieren an Tag 31 untersucht. Zunächst wurde Saline in die peritoneale Höhle injiziert, wieder herausgezogen und verarbeitet. Es wurde eine Zellzählung durchgeführt und dann wurden Cytospin-Objektträger hergestellt. Die Cytospin-Objektträger wurden mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und ausgewertet. Die überlebenden Tiere wurden dann gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association getötet.
Das Ergebnis der Zellzählungen aus den peritonealen Waschungen und die Auswertung der Cytospins sind unten in Tabelle 6 gezeigt. Eine Untersuchung von Peritonealzellen aus Tieren, die bis zu Tag 31 überlebten, zeigte, daß das überlebende Tier in Gruppe 4 ein Ausreißer war. Dies beruhte auf der Abwesenheit von Leukämiezellen in der peritonealen Höhle. Es waren immer noch Leukämiezellen in der peritonealen Höhle der überlebenden Tiere aus den Gruppe 8, 9 und 10 anwesend. Die Anzahl der Leukämiezellen zeigte jedoch an, daß die Verabreichung von mCRP in Kombination mit 5-FU die Proliferation der Tumorzellen inhibierte. Zusätzlich wurde eine normale Ansammlung an endogenen nukleierten Zellen gefunden, was anzeigt, daß das mCRP die Art der normalerweise im Peritoneum gefundenen Zellen nicht verändert. Tabelle 6 Untersuchung der Cytospinpräparationen aus den peritonealen Waschungen

Claims

1. Verwendung von modifiziertem CRP als einzigem Wirkstoff für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs, wobei das modifizierte CRP eine neue CRP-Antigenität ausprägt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament einen pharmazeutisch verträglichen Träger für das modifizierte CRP aufweist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das modifizierte CRP insgesamt in einer Anzahl von Liposomen enthalten ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Liposomen unilamellare Vesikel sind.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die unilamellaren Vesikel LUVETs sind.

6. Verwendung von modifiziertem CRP als einzigem Wirkstoff für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für den Nachweis von Krebszellen, wobei das modifizierte CRP eine neue CRP-Antigenität ausprägt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das modifizierte CRP markiert ist, um dessen Nachweis zu ermöglichen, wenn es an Krebszellen gebunden ist.