JPH07505905A - 修飾ｃ反応性タンパク質を使用する癌の治療方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 修飾Ｃ反応性タンパク質を使用する癌の治療方法発明の分野 本発明は修飾Ｃ反応性タンパク質（“ｍＣＲＰ”）による癌の治療方法に関する 。

また、本発明は哺乳類中の癌細胞を同定するための像形成剤（ｉａｕｇｉｎｇ　 ａｇｅｎｔ）としてのにＲＰの使用に関する。

発明の背景 米国では毎年的４００．０００人の死亡が癌に原因すると推定されていた。癌細 胞の増殖及び転移の単一の決定基がないことは明らがである。むしろ、癌細胞が 増殖し、転移する傾向は、多数の細胞特性の合計であり、また個々の癌細胞は同 じ結果を得るのに異なる機構を使用し得る［ワイス（Ｗｅｉｓｓ）著、Ｃ１１ｎ ｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅ−ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、７： １２７−１６７　（１９８９）　コ　。

手術、化学療法、及び放射線療法の如き治療戦略が近年改良してきたが［例えば 、クラコツ（Ｋｒａｋｏｆｆ）著、ＣＡ−Ａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃｉａｎｓ、　４１：２６４−２７８（１９９１）］　、か なりの数の癌が治療に耐性であり、最終的には患者の死亡を生じる。

こうして、癌療法の新規かつ有益な手段を発見する必要が現れる。

Ｍｅｄ、、　５２：５６１−７１　（１９３０）］により最初に記載され、彼ら は急性の病気の患者からの血清がストレプトコッカス・：、−モ＝７（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）　ノ細胞壁のＣ多糖で沈殿すること を観察した。続いて、その他の研究者が反応性血清因子をタンパク質、ひいては 名称“Ｃ反応性タンパク質”即ちＣＲＰ″として同定した。キルパトリック（Ｋ ｉ　１ｐａｔｒｉｃｋ）ら著、Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．　Ｒｅｓ、　、　１０：４３ −５３（１９９１）はＣＲＰの最近の総説を示す。

ＣＲＰは、５つの同一のサブユニットからなる五量体分子である［オズマンド（ Ｏｓｍａｎｄ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉｅｎｃｅｓ 　、ＩＪ、　Ｓ、　Ａ、　、　７４ニア３９−７４３　（P９７７）］　。ＣＲ Ｐ のこの三量体形態はしばしば“天然ＣＲＰ”と称される。

ヒトＣＲＰの遺伝子配列がクローン化された［レイ（Ｌｅｉ）ら著、Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｕ　。

２６０：１３３７７−１３３８３　（１９８５）］　、加えて、ウサギＣＲＰの 一次配列［ワング（Ｗａｎｇ）ら著、ラット、犬、ウマ、ヤギ、及びヒツジにつ き研究中である。臨床上の観察及び実験室の観察は、血液の良く特定された変化 により古典的に定義された急性期応答［ベピイズ（Ｐｅｐｙｓ）ら著、Ａｄｖａ ｎｃｅｓ　ｉｎ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　３４：１４１−２１２　（１９８３ ）　］が、悪性腫瘍形成、虚血性壊死、並びにバクテリア、ウィルス、もしくは 菌類寄生虫の感染症を含む疾患及び障害の種々の状態中に発生することを測定し た。ＣＲＰの如き血清急性期反応体の測定が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ ）　［ブラボー（Ｂ「−々の症状だけでなく、多くのその他の疾患を有する患者 の診断及び臨床上の管理のための臨床試験に使用されていた。

腫瘍細胞に対する試験管内のＣＲＰの活性が研究されていた。例えば、ホルヌン グ（ｔｌｏｒｎｕｎｇ）は、リンパ球とともに添加されたＣＲＰが培養の７２時 間後にヒトメラにリンパ球に毒性であったことを開示している。

バーナ（［］ａｒｎａ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４４：３０ ５−３１０　（１９８４）は、マウスマクロファージ活性化に関するヒトＣＲＰ を含む多ラメラ小胞の効果に関する試験管内の研究を記載している。バーナらは 、マウスマクロファージがＣＲＰを含む多ラメラ小胞を食作用し、そして小胞へ の露出後に、スーパーオキサイドアニオンの増進された産生を示し、同系マウス Ｔ２４１繊維肉腫、同系マウスロー１６メラノーマ細胞、及び同種異系マウスサ ルコーマ−１細胞に対し抗腫瘍活性を増大したことを報告している。また、抗腫 瘍活性はウィン（Ｗｉｎｎ）中和アッセイを使用して生体内で発生された［また 、バーナら著、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　２２７４ａ　（１９８３）を参照のこと］ 。また、バーナらは、封入されていないＣＲＰが試験管内でマクロファージスー パーオキサイドアニオン活性を高めたが、多ラメラの封入された投薬の１０〜１ ００倍大きい濃度用がマクロファージに加えてＴ細胞マーカー及び／またはＮＫ ＪＢ胞マーカマ−カーる細胞を伴い得ることを教示している。

ザヘジ（Ｚａｈｅｄｉ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６：５０ ７７−５０８３　（１９８６）は、精製されたヒトＣＲＰが試験管内て殺腫瘍性 状態へのマクロファージの活性化を媒介できることを開示している。著者らは、 誘発されたマクロファージが３０分〜２時間にわたってヒトＣＲＰに露出された 場合に、殺腫瘍活性がマウスＰ８１５肥満細胞腫細胞系、マウスＬ−９２９繊維 芽細胞癌腫細胞系、及びヒトＣＡＫ−１癌腫細胞系に対し誘発されたことを教示 している。また、ザヘジらは、ＣＲＰが殺腫瘍活性を測定する前に８５℃で１時 間熱凝集された場合に、ＣＲＰが熱凝集されなかったＣＲＰよりもかなり小さい 死滅活性を有していたことを教示している。ザヘジらは、リンホカインと組み合 わされた場合に、相乗効果がＣＲＰにより示されなかったことを開示している。

バーナら著、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅ５ｐ、Ｍｏｄ、、　７：４８３−４８７　（１ ９８Ｂ）は、試験管内の精製されたヒトＣＲＰへのヒト肺胞マクロファージの露 出がヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ細胞及びヒトＣＲＬ　１７１８星状細胞 腫細胞に対するマクロファージ細胞毒性を高めたことを開示している。また、バ ーナらは、ＣＲＰに対するマクロファージ応答性が喫煙により悪影響され得るこ とを教示している。

トマセン（Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ）ら著、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　６：１１５１ａ　 （１９９２）は、ＣＲＰから誘導された合成ペプチドによるヒト単球及びヒト肺 胞マクロファージの殺腫瘍活性の試験管内の変調を開示している。トマセンらは 、合成ペプチドで処理された単球が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＩＬ−１分泌の ２倍以上の増進を示し、一方、肺胞マクロファージかＴＮＦまたはＩＬ−１の増 進された分泌を示さなかったことを報告している。

バーナら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４７二３９５９−３９６３　 （１９８７）は、試験管内のヒトＣＲＰの急性期の量へのヒト末梢血単球の露出 が高められたスーパーオキサイドアニオン産生及びヒト星状細胞腫細胞に対する 細胞毒性を生じたことを開示している。

また、バーナらは、ＣＲＰ誘発細胞毒性がホスホリルコリンにより抑制されたこ とを開示している。著者らは、ＣＲＰ活性化がヒト血清の成分へのＣＲＰ結合と 関連し得ることを示唆している。

腫瘍増殖に関するＣＲＰの効果に関する幾つかの生体内の研究が行われていた。

例えば、リズク（Ｒｉｚｋ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ、　５８：５５−６１　（１９ ８６）は、ウサギにおけるＶｘ２癌腫細胞系に関するウサギＣＲＰ及びポリカチ オン、ポリーＬ−アルギニン（ＰＬＡ）の効果を記載している。リズクらは、Ｃ ＲＰがＰＬＡの不在下で生体内で抗腫瘍効果を有していなかったことを教示して いる。

オコナー（０’　Ｃｏ１ｎｏｒ）らの米国特許第４．８５７．３１４号は、精製 されたヒトＣ反応性タンパク質と組み合わせて腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を投与し てＴＮＦの殺腫瘍活性を高めることによる動物またはヒトにおけるＭｅｔｈＡ肉 腫の治療方法を開示している。

オコナーらは、単独で投与されたヒトＣＲＰがわずかに最小または若干の抗腫瘍 活性を有していたことを教示している。

デオダー（Ｄｅｏｄｈａｒ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４２： ５０８４−５０８８　（１９８２）は、マウス繊維肉腫Ｔ２４１の肺転移に対す る生体内のヒｌ−ＣＲＰを含む多ラメラ小胞の活性を記載している。デオダーら は、Ｔ２４１原発性腫瘍が切除された後のＣＲＰを含む多ラメラ小胞の静脈内注 射で治療された動物が更に少なくかつ小さい肺転移を存していたことを報告して いる。また、デオダーらは、多ラメラ小胞中のＣＲＰの封入が抗転移効果を大い に高めたことを報告している。何となれば、多ラメラ小胞で与えられるよりも４ ０倍多い投薬量で投与された遊離（封入されていない）　ＣＲＰは匹敵する効果 を示さなかったからである［同文献、また、デオダーら著、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ は、マウス結腸腺癌（ＭＣＡ−３８）に対するヒトＣＲＰを含む多ラメラ小胞の 抗転移活性を記載している。トムバーらは、原発性腫瘍の増殖後に非経口投与さ れたＣＲＰを含む多ラメラ小胞で治療された動物が対照動物と較べて少ない肝臓 転移及び長い生存を示したことを報告している（同文献）。

また、デオダーらは、ＣＲＰから誘導された合成ペプチドを含む多ラメラ小胞の 抗腫瘍効果を記載している［デオダーら著、Ｐｒｏｃ、　Ａｎｈ　Ａｓ５ｏｃ、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

３２：４０４　（１９９１）　］。しかしながら、デオダーらは、匹敵する投薬 量の封入されていない合成ペプチドの投与が有効ではなかったことを報告してい る［同文献］。

バーナら著、Ｐｒｏｃ、ＡｕＡｓ５ｏｃ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　 ３２：２３７　（１９９１）は、π４１肺転移モデルで実証された抗腫瘍活性が 血液がら肺へのＭＡｃｌ＋細胞の増進された浸潤の結果として生じ得ることを示 唆している。

デオダーら著、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　３：８３１ａ　（１９８９）は、マウス繊 維肉腫Ｔ２４１（７）肺転移に対するＩＬ−２と組み合わせた精製されたヒトＣ ＲＰまたはペプチドフラグメントの活性を更に記載している。デオダーらは、１ 　ｘ　ｌｏ’ＵのＩＬ−２とＣＲＰまたはペプチドフラグメントの組み合わせの 投与が５　ｘ　ｌｏ’ＵのＩＬ−２の投与よりも有効であったことを報告してい る。バーナらは、ＣＲＰペプチドフラグメントとルー２の組み合わせがヒト単球 活性を増強するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性を増強しないことを示唆する 試験管内の細胞溶解データを開示している［ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　６：１４３３ ａ　（１９９２）］。

はぼ１９８３年に、ＣＲＰの別の形態（これは“修飾Ｃ反応性タンパク質”また はｍｃＲＰ”と称される）が発見された。にＲＰは天然ＣＲＰと比較してがなり 異なる電荷、サイズ、溶解性及び抗原性特性を有する［ポテンパ（Ｐｏｔｅｍｐ ａ）ら著、Ｍｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２０：１１６５−７５　（１９８３）　］　。また、ＩＤ ＣＲＰはその結合特性の点で天然ＣＲＰと異なる。例えば、にＲＰはホスホリル コリンを結合しない［同文献：チュドゥイン（Ｃｈｕｄｗｉｎ）ら著、Ｊ、ＡＩ ｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、ｌｎｗｎｕｎｏｌ、、　７７：２１６ａ　（１９８６） ］。

にＲＰの明瞭な抗原性は“ネオＣＲＰ”と称された。ネオＣＲＰ抗原性は、ｌ） 成る条件下で酸、尿素または熱で処理されたＣＲＰ。

２）ヒト及びウサギのＣＲＰをコードするＤＮＡの一次翻訳産物；及び３）プラ スチック表面で固定化されたＣＲＰで発現されることが知られている［ポテンパ ら著、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　２０：１１６５−７５（１９８３）； 　７ントゾラニス（Ｍａ酎耐ｏｕｒａｎｉｓ）ら著、Ｐｅｄ、Ｒｅｓ、、　１８ ：２６０ａ　（１９８４）；サモルズ（Ｓａｍｏｌｓ）ら著、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ 、Ｊ、、　２２７：７５９−６５　（１９８５）；ポテンバら著、Ｍｏ１．　Ｉ ｍｍｕｎ−１ユ２４：５３１−５４１　（１９８７）］。ネオＣＲＰに特異的な ポリクローナル抗体と反応性の分子が末梢血リンパ球（主としてＮＫ細胞及びＢ 細胞）の１０〜２５％、単球の８０％、及び好中球の６０％の表面だけでなく、 組織損傷の部位で同定された［ポテンパら８：１３７−１４０　（１９８７）； 　リース（Ｒｃｅｓ）ら著、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、、４５：２６３ａ　（１９８６ ）　］。

更に、にＲＰはその生物活性の点て天然ＣＲＰと異なる。ｍｃＲＰは、単球細胞 毒性の発生に影響でき、単球のアクセサリ−細胞機能を改良でき、凝集１ｇＧ誘 発食細胞酸化的代謝を強化でき、かっ単球によるインターロイキン＝１、プロス タグランジンＥ及びリポキシゲナーゼ生産物の産生を増大できることが報告され ていた［ポＡｃａｄ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　２９：３７１ａ　（１９８８ ）］。

ｍｃＲＰを用いた生体内実験が行われて、ｍ１ＲＰがストレプトコツカル・ニュ ーモニエの致死投与型に対し保護効果を与えることができるかどうかを測定した ［チュドウィンら著、Ｊ、ＡＩｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、　１ｍ＋ｎｕｎｏ１．． ７７：２１６ａ　（１９８８）　］　、これらの研究は、ｍｃＲＰの静脈内投与 が致死性ストレプトコツカル・ニューモニアから動物を保護するだけでなく、に ＲＰ効力が天然ＣＲＰよりも３〜４倍大きいことを実証した。

また、ｍｃＲＰは、１９９０年１０月３日に出願された共同未決米国特許出願第 ０７１５８２゜８８４号に開示されているように、免疫複合体を結合するのに使 用し得る。この出願はＰＣＴ出願の国際出願ＵＳ８９１０１２４７号（１９８９ 年１０月１９日にＷＯ８９１０９６２８号として公開された）として出願され、 １９８８年４月４ＥＩｌこ出願され、現在放棄されている米国特許出願第０７／ １７６、９２３号の一部継続出願である。更に、ｍＣＲＰは、４９９１年１１月 ２７０に出願された共同未決米国特許出願第０７／７９９．４４８号に開示され ているように、ヒト免疫不全ウィルスｌ　（“ＩＩＩＶ−１”）の如きウィルス 感染症を治療するのに有益である。最後に、ｍｃＲＰは、１９９１年１１月２７ 日に出願された共同未決米国特許出願第０７／８００．５０８号に開示されてい るように、非ストレプトコッカスのバクテリア感染症及び内毒素セブシスを治療 するのに使用し得る。

試験管内の研究において、ｍｃＲＰは、抗殺腫瘍性単球を誘発するのに使用され た物質に応じて単球中の殺腫瘍機能の発生を抑制または増進することがわかった ［チュウーら著、Ｐｒｏｃ、ＡＩＴＬＡｃａｄ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　２ ９：３７１ａ　（１９８８）；チュウーら著、Ｐｒｏｃ、ＡｆｆＬＡｃａｄ、Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　３０：３３３ａ　（１９８９）］　Ｏ本件出願人の知 るところによれば、生体内のＩＩＩＣＲＰの抗癌活性に関する論文はなかった。

更に、本件出願人は、ｍＲＰが哺乳類の癌を治療するのに使用されるという論文 を知らない。

発明の要約 本発明は、医薬上杵される担体中の有効量の修飾ＣＲＰを哺乳類に投与すること を特徴とする哺乳類の癌の治療方法を提供する。

また、本発明は、有効量の修飾ＣＲＰを集合的に含む複数のリポソームを哺乳類 に投与することを特徴とする哺乳類の癌の治療方法を提供する。

また、本発明は、別の薬剤と組み合わせて修飾ＣＲＰを哺乳類に投与し、その組 み合わせが癌に対し有効であるように充分な量で両者を投与することを特徴とす る哺乳類の癌の治療方法を提供する。

更に、本発明は、修飾ＣＲＰを含む像形成剤を使用して哺乳類の癌細胞を同定す る方法を提供する。そうするために、標識された修飾ＣＲＰが投与され、哺乳類 中で検出し得る。また、修飾ＣＲＰを結合する標識成分が投与され、哺乳類中で 検出し得る。

図面の簡単な説明 図１は、研究の７日目〜１９日目中のマウスＥＭＴ６胸部腺癌原発性腫瘍容積に 関するｍｃＲＰ　Ｃルベラｌ−（ＬＵＶＥＴ）中）治療、天然ＣＲＰ（ルベット 中）の効果と、無治療の比較を示すグラフである。

図２は、研究の７日目〜２９日目中のマウスＥＭＴ６胸部腺癌原発性腫瘍容積の 変化率（％）に関するｍｃＲＰ　（ルベット中）治療、天然ＣＲＰ（ルベット中 ）治療の効果と、無治療の比較を示すグラフである。

図３は、研究の７日目〜２９日目中のＥＭＴ６胸部腺癌原発性腫瘍容積に関する ｍＣＲＰの効果と、無治療の比較を示すグラフである。

図４は、マウスＥＭＴ６胸部腺癌原発性腫瘍の腫瘍容積の変化率（％）に関する にＲＰ、ルベット中のｍｃＲＰ、及びルベット中の天然ＣＲＰの効果の比較を示 すグラフである。

図５は、２３８日腫瘍を有する動物の体重及び寿命に関する５−フルオロウラシ ルの効果とｍ１ＲＰ治療の効果の比較を示す。

現在好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、修飾Ｃ反応性タンパク質（“ｄＳＲＰ″）を使用する癌の治療方法を 提供する。本発明の実施に有益なｆｆＩＣＲＰは、あらゆる種からのものであっ てもよい。

異なる種からのＣ反応性タンパク質（“ＣＲＰ”）のアミノ酸配列の間にかなり の相同性がある。例えば、種々の哺乳類種からのＣＲＰの間に約５０％〜約８０ ％の配列相同性がある［ヒュ（Ｈｕ）ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２５ニア８３ ４−３９　（１９８６）；ホワイトへ・ラドら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　２ ６６：２８３−９０　（１９９０）；キルパトリックら著、Ｉｌｍｕｎｏｌ、　 Ｒｅｓ、　、　１０：４３−５３　（１９９１）］。それ故、あらゆる種からの ｍ１ＲＰが癌を治療するのに有効であろうと予想される。こうして、癌を有する 哺乳類が異種からのｍｃＲＰで治療し得る（例えば、マウスがヒトｍｃＲＰで治 療し得る）。また、好ましくは、哺乳類力＜ｍｃＲＰに対する免疫反応を避ける ために同種ｍｃＲＰで治療される（例えば、ヒトがヒトｍ１ＲＰで治療される） 。

ＩＩｃＲＰは、出発物質として天然ＣＲＰを使用してつくられることが好ましい 。天然源からのＣＲＰの単離方法が当業界で知られており、例えば、ポラナキス （Ｖｏｌａｎａ−記載されている。ＣＲＰはホスホリルコリン置換バイオゲル（ ［Ｉｉｏｇｅｌ）Ａ　０．５ｍ（カリフォルニア州、リッチモンドにあるバイオ ラド・ラボラトリイズ（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒ−ａｌｏｒｉｅｓ）から得ら れたアガロース系樹脂）を使用するカルシウム依存性アフィニティークロマトグ ラフィーしボテンバら著、Ｍｏ１．１ｍｕｎｏ１．、２４：５３１−５４１　（ １９８７）を参照のこと］により胸膜液または腹水から単離されることが好まし い。このＣＲＰ単離方法が下記の実施例１に更に記載される。この単離方法を使 用して、約９９％の純度であるＣＲＰを得ることができる。

ヒト、マウス、及びウサギのＣＲＰをコードするゲノムクローン及びｃＤＮＡク ローンが単離されていた［レイ（Ｌｅｉ）ら著、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　 ２６０：１３３７７−８３　（１９８５）；ウドヘッドら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ− Ｊ、　２６６：２８３−９０　（１９９０）コ。異種からのＣＲＰの間の実質的 な相同性を仮定すると、別の種からのＣＲＰをコードするゲノムクローン及びｃ ＤＮＡクローンが単離し得るようにプローブを容易に調製し得る。このようなプ ローブを調製し、ゲノムクローン及びｃＤＮＡクローンを単離する方法が当業界 で公知であ離されたクローンを使用して、通常の公知の組換えＤＮＡ技術並びに 細胞培養条件ＣＲＰを得るために、真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳類宿主細 胞が使用されるまた、ＣＲＰか９ｍＣＲＰをつくる方法が当業界で知られている ［例えば、ポテンパら著、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２０：１１６５−１ １７５　（１９８３）を参照のこと］。例えば、Ｉｌ＋ＣＲＰはＣＲＰを変性す ることにより調製し得る。ＣＲＰは通常のキレート剤（好ましくはエチレンジア ミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはクエン酸）の存在下で有効量の尿素（好まし くは８Ｍ）による処理により変性し得る。更に、ＣＲＰは、そのタンパク質のｐ ｌを約３以下または約１１−１２以上に調節することにより処理されてｍｃＲＰ を生成し得る。

最後に、ｍｃＲＰはカルシウムの不在下または上記の如きキレート剤の存在下で 変性を生じるのに充分な時間にわたって５０℃以上（好ましくは６３℃で２分間 ）にＣＲＰを加熱することにより生成し得る。

また、ｍｃＲＰは組換えＤＮＡ技術を使用して調製し得る。ＣＲＩ’遺伝子の一 次翻訳産物（ｐｒｅＣＲＰ）が、ネオＣＲＰ抗原性を発現することがわかった［ マントゾウラニスら著、Ｐｅｄ、Ｒｅｓ、、　＋８：２６０ａ　（１９８４）］ 、それ故、ｍＣＲＰは、ＣＲＰサブユニットが宿主細胞中で三量体の天然ＣＲＰ に集合されないように条件を選択することにより調製し得る。これは、原核生物 宿主中で所望のゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンを発（１９８（ｉ）を参 照のこと。このようにして生成されたｍｃＲＰは、ＣＲＰサブユニット及び／ま たはｐｒｅＣＲＰそしておそらくその他のＣＲＰペプチドの集合体からなること が明らかである。同文献を参照のこと。ｍＣＲＰのこの形態は不溶性であり、更 に精製に問題がある。しかしながら、この不溶性物質を更に処理しないで懸濁液 として哺乳類に注射することは可能であるべきである。何となれば、血清精製に ＲＰの凝集形態は、下記の実施例４に更に記載されるように、有効であることが 示されたからである。

ＩｎＣＲＰは、幾つかの基準により天然ＣＲＰから区別し得る。背景部分で注目 されたように、修飾ＣＲＰはネオＣＲＰ抗原性を発現し、一方、天然ＣＲＰは発 現しない。ネオＣＲＰ抗原性は、ネオＣＲＰに特異的なポリクローナル抗血清を 使用して検出し得る［ポテンバら著、Ｍａｔ、　ｌ＋ｎｍｕｎｏ１．．２４：５ ３１−５４１　（１９８７）を参照のこと〕。しかしながら、ｍｃＲＰは、共同 未決米国特許出願箱０７／３７４．１６６号（その開示が参考として本明細書に 含まれる）に記載されたようなモノクローナル抗体を使用して天然ＣＲＰから区 別される。その共同未決米国特許出願に開示されたモノクローナル抗体を分泌す るハイブリドーマが、メリーランド、ロックビルにあるアミリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、１１８１０１７５　（鯖ｂ　１５．２Ｃ１Ｏ） 　、）ＩＢ１０１７６　（ｍＡｂ　２６．８ＣＩＯ）　、ＨＢＩＯ１７７（ｍＡ ｂ　１３．３g１２）、 及びＨＢ１０１７８　（ｍＡｂ　１５．　ＩＤ６）として登録されている。また 、これらのモノクローナル抗体がインク（Ｙｉｎｇ）ら著、Ｊ、　ｌｎｗｎｕｎ ｏｌ、、　１４３：２２１−２８　（１９８９）に記載されている。

その抗血清及び抗体が、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、好ましくは下記の実施例 １、パートＣに記載されたＤｏｔ−ＥＬＩＦＡアッセイに使用されてｍＣＲＰを 天然ＣＲＰから区別し得る。

ｆｆ１ｃＲＰを天然ＣＲＰから区別する別の基準は、共同未決米国特許出願箱０ ７１５８２．８８４号及び公開されたＰＣＴ出ｊ［０８９１０９６２８号に記載 されているように、ＷｉＳＲＰが免疫複合体及び凝集免疫グロブリンを結合し、 一方、天然ＣＲＰがそれらを結合しないことである。加えて、ｍ１ＲＰは、背景 部分に記載されているように電荷、溶解性、結合特性及び生物活性に基いて天然 ＣＲＰから区別し得る。しかしながら、製剤がにＲＰを含むことを示すためには 、その製剤がＩ）ｍＣＲＰのみに見られるエピトープに特異的な抗体と積極的に 反応し、または２）凝集免疫グロブリン（例えば、凝集ＩｇＧ）を結合すること を確かめることが通常充分である。

特別な理論により束縛されることを願わないが、ｍＣＲＰは５つのＣＲＰサブユ ニットの解離により生成され、これらの夫々が、その後、自然な配座変化を受け てｍｃＲＰを生成すると考えられる。ブライら著、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、　８：１３７−１４０　（１９８７）を参照のこと。そ れ故、ＣＲＰサブユニットのフラグメントがｉＲＰにつき本明細書に記載された のと同じ活性を有し得ることは可能であり、このようなフラグメントの使用は本 発明の範囲内に入ると考えられる。

また、ＣＲＰと実質的に相同のタンパク質はａｃＲＰにつき本明細書に記載され た活性を有するであろうと考えられ、このようなタンパク質がまた本発明の範囲 内に入ると考えられる。例えば、ＣＲＰ遺伝子の部位誘導突然変異誘発により付 加、欠失または置換された成る種のアミノ酸を有するＣＲＰサブユニットが、お そらく、癌の治療に有効であり、ｍＣＲＰを置換し得るであろう。特に、にＲＰ は、本明細書中でＣＲＰ遺伝子の一次翻訳産物を含むものと定義される。

哺乳類の癌の第一の治療方法によれば、有効量のｍｃＲＰが哺乳類に投与される 。

本発明における“癌”という用語は広い意味で使用され、通常、調節されない細 胞増殖を特徴とする哺乳類の生理学的症状を表す。ｍＣＲＰは種々の癌（腺癌、 リンパ腫、繊維肉腫、及び白血病を含むが、これらに限定されない）を治療する のに使用し得ることが意図されている。哺乳類中の癌細胞の存在が最初に検出さ れる時、または癌があまりにひどくなる前に、ｍｃＲＰが哺乳類に投与し得る。

また、ｍｃＲＰは、癌細胞の転移を低下し、転移性腫瘍を減少し、または原発性 腫瘍の苦しみを軽減するように癌の進行後に投与し得る。

にＲＰは、医薬上許される担体中で哺乳類に投与し得る。医薬上許される担体は 当業者に公知である。例えば、にＲＰを投与するのに適した担体として、液体、 例えば、水、塩類液、及び緩衝液が挙げられる。トリス（Ｔｒｉｓ）または食塩 加リン酸緩衝液が担体として使用されることが更に好ましい。成る種の担体が、 例えば、投与の経路及び投与されるタンパク質の濃度に応じて更に好ましいこと は、当業者に明らかであろう。

また、有効量のｍＣＲＰを集合的に含む複数のリポソームが哺乳類に投与し得る 。

本発明における“リポソーム”という用語は、ｍｃＲＰを封入できる包状または 中空の小胞状の構造に関するものであり、多ラメラ小胞、単一ラメラ小胞、及び 赤血球細胞形骸が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを調製し、 分子をリポソーム中に封入する方法は当業界で公知である。

＜ＲＰを含むリポソームは、本明細書中で“ルベット”と称される押出により形 成された単一ラメラ小胞であることが好ましい。ルベットの調製方法が、マクド ナルド（ＭａｃＤｏｎａ　Ｉｄ）ら著、ＢｉｏｃｈｉｕＢｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ ａ、　１０６１：２９７−３０１　（１９９１）に記載されており、更に下記の 実施例１、パートＣに記載される。ルベットはｍｃＲＰを封入するのに特に有益 であると考えられる。何となれば、小胞が、タンパク質構造に化学的または物理 的に殆ど影響しない押出方法を伴う物理的に温和な条件下で形成されるからであ る。また、ルベットはにＲＰを投与するのに特に有益であると考えられる。何と なれば、ルベットはリポソームを調製するのに普通使用される有機溶媒及び洗剤 の痕跡量を含まないからである。また、ルベットは単一の脂質二層により形成さ れ、比較的大きい内容積を含み、また典型的には多ラメラ小胞と比較して大きな 封入効率を有する。ＤＩＣＲＰを含むリポソームが機能するーっ以上の機構は充 分に理解されていないが、リポソームは癌細胞へのｍｃＲＰの有効な送出のため のビヒクルとして作用し得ると考えられる。

ｆｆ＋ｃＲＰは注射（例えば、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射 ）により哺乳類に投与されることが好ましい。ｍｃＲＰを投与するのに有効な投 薬量及びスケジュールは実験により決められてもよく、このような決定をするこ とは当業者の技量内にある。本件出願人は、哺乳類の体重１ｋｇ当たり約０．１ ０ｎ＋ｇ〜約２０ｍｇ、好ましくはＩｋｇ当たり約２ｍｇ〜約１０ｍｇのｍＣＲ Ｐ　（ｍＣＲＰが医薬上許される担体中で投与され、またはリポソーム中に含ま れるかを問わない）が癌を治療するのに有効であることを見出した。投与される 必要があるｍｃＲＰの投薬量は、例えば、ｍｃＲＰを受け取る哺乳類、癌の種類 、癌細胞の増殖または転移の程度、一つ以上の腫瘍の生物学的部位または生体区 画、投与の経路、及び哺乳類に投与されるその他の薬剤または治療、例えば、放 射線治療または手術治療の同一性に応して変化するでろうことは、当業者により 理解される。また、１回より多いｍｃＲＰの投与を施すことが必要であり得るこ とが理解される。一般に、多回数のｍｃＲＰの投与が哺乳類に与えられる必要が ある。投与の間隔は約１日〜約３日であることが好ましい。ｍＣＲＰの投与は、 健康が哺乳類につき回復されるまで続けられるべきである。

哺乳類の癌の別の治療方法によれば、を動量のｌ１１ＣＲＰが別の薬剤と組み合 わせて哺乳類に投与される。ＩＩＩＣＲＰは、上記のように、医薬上許される担 体またはリポソーム中て哺乳類に投与し得る。ａｃＲＰと組み合わせて投与され る薬剤は、天然産または合成の物質であってもよく、抗癌活性を有することが好 ましい。

その方法の一実施態様において、薬剤は細胞毒性薬剤である。細胞毒性薬剤は当 業界で知られている化学療法の化合物であることが好ましい。本発明により意図 されている化学療法の化合物として、チオテバ、ブスルファン、シクロホスファ ミド、メトトレキセート、シタラビン、プレオマイシン、シスプラチン、ドキソ ルビシン、メルフアラン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、及び５−フルオ ロウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。その他の化学療法の化合物 が、本明細書に参考として含まれるクラコツ（Ｋｒａｋｏｆｆ）著、ＣＡ−Ａ　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｊｏｕ−ｒｎａｌ　Ｆｏｒ　Ｃｌ１ｎｉｃｉａｎｓ、　４１：２ ６４−２７８　（１９９１）に列記されている。典型的には、細胞毒性薬剤は細 胞を破壊し、かっ／またはそれらの増殖を妨げるように機能し、こうして癌を治 療するのに有益である。充分には理解されていないが、ＩｃＲＰはこのような化 学療法の化合物と関連する毒性副作用または宿主防御を刺激することによりこの ような化学療法の化合物から生じる毒性副作用に対し保護し得ると考えられる。

その方法の別の実施態様において、薬剤は免疫アジュバントまたはサイトカイン である。′生物応答変更因子”とも称される免疫アジュバント及びサイトカイン は、当業界で知られている。一般に、このような分子は宿主防御機構を刺激また は増進するのに有益であり、それ故、抗癌治療に有益である。投与し得る免疫ア ジュバントまたはサイトカインの例として、一種以上のインターフェロン、コロ ニー刺激因子（Ｃ５Ｆ）　、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、ステロイドの如きホル モン、並びにインターロイキン、例えば、ＩＬ−１，ＩＬ−２、及び［Ｌ−６が 挙げられる。

薬剤は、医薬上許される担体、例えば、水、塩類液、または緩衝液中で投与され ることが好ましい。薬剤は哺乳類に経口投与されてもよく、また注射（例えば、 静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射）により投与されてもよい。許 される担体及び薬剤を投与する適当な手段を決めることは、当業者の技量内にあ る。ｍｃＲＰ及び薬剤は同し手段または異なる手段により投与し得る。例えば、 ＩＩＩＣＲＩ’は静脈内注射により哺乳類に投与されてもよく、一方、薬剤は哺 乳類に経口投与される。

威ＲＰを投与するのに有効な投薬量及びスケジュールは上記されている。薬剤を ｍＣＲＰと組み合わせて投与するのに有効な投薬量及びスケジュールは実験によ り決められてもよく、このような決定をすることは当業者の技量内にある。薬剤 及びｍＲＰを投与する前に、有害な作用を避けるように一種以上の薬剤の毒性レ ベルを測定することが好ましい。投与される薬剤に応じて、薬剤及びｍｃＲＰは 累積的活性または相乗活性を有し得る。例えば、ｍｃＲＰの投与は、投与される 薬剤の有効投薬量を減少し得る。投与される薬剤の投薬量は、例えば、治療され る哺乳類、癌の種類、癌の全身の位置、哺乳類に投与されるｍＣＲＰの量に応じ て変化することは、当業者により理解されるであろう。一般に、薬剤の多重投薬 量がＩＩＩｃＲＰと組み合わせて投与される必要がある。また、薬剤はにＲＰ投 与と異なる時間間隔で投与されることが好ましい。薬剤はｍｃＲＰを投与する約 ４時間〜約８時間前または後に投与されることが好ましい。薬剤及びｍＣＲＰの 投与は、健康が哺乳類につき回復されるまで続けられるべきである。

また、本発明は、ｍｃＲＰを像形成剤として使用して哺乳類の癌細胞を同定する 方法に関する。癌細胞を同定するために、ｍＣＲＰが注射（例えば、静脈内注射 、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射）により哺乳類に投与される。次いで、ｍ ｃＲＰが、下記の実施例２及び３に更に記載されるように、癌細胞部位に局在化 し、癌細胞に結合する。

一実施態様において、標識ｍＣＲＰが哺乳類に投与し得る。その方法に有益な標 識は当業界で公知であり、酵素、蛍光体、放射性同位元素、及びビオチン−アビ ジンが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、標識が、当業界で知られ ている技術により容易に検出し得る。

また、にＲＰに結合する標識成分が哺乳類に投与し得る。例えば、ｍＣＲＰエピ トープに特異的な反応性を有する酵素標識抗体またはフルオレセイン標識抗体が 哺乳類に投与されて、ｍＲＩ’が結合した癌細胞の存在及び位置を同定し、検出 し得る。

実施例 生体内実験を行って、〆ＲＰがマウス胸部腺癌であるＥＭＴ６に対する抗腫瘍活 性を示すか否かを測定した。にＲＰの活性を、原発性腫瘍増殖及び転移を調べる ことにより評価した。

Ａ、　ＣＲＰの調製及び精製 ヒト腹水を、イリノイ州、シカゴにあるノースウェスタン・メモリアル病院（Ｎ ｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　）ＩｏｓｐｉＬａｌ）の病因学部 の細胞学部門、及びイリノイ州、エバンストンにあるエバンストン病院（Ｅｖａ ｎｓｔｏｎ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）から入手した。滅菌技術を使用して、これらの 液体をフィルター・フラッフ（ｆｌｕｒＤにより濾過し、次いでＣａＣｌ□を２ 〜５蘭の最終濃度まで添加した。その液体−ＣａＣＩｔ混合物を４℃で貯蔵した 。

夫々の液体をサンプリングし、クロウル（Ｃｒｏｗｌｅ）著、Ｉｗｗｎｕｎｏｄ ｉｆｆｕｓｉｏｎ、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、 ニューヨーク、３章（１９７３）により記載された方法の改良に従ってＣＲＰに つき放射状免疫拡散アッセイで分析した。２５μｇ／ｍｌより大きいＣＲＰ濃度 を有する腹水を、ポラナキスら［Ｊ、　ｌｆｆｌｌ１ｕｎｏ１．、１２６：１８ ２０−１８２５（１９８１）コ及びデ・ビール［Ｊ、　１ｎｎｕｎｏ、Ｍｅｔｈ ｏｄｓ、　５０：１７−３１　（１９８２）　］により記載された方法の改良に より、連続のカルシウム依存性アフィニティークロマトグラフィーにより精製し た。液体約３〜４リツトルを、３２５ｍ１のカラム容積を有するホスホリルコリ ン置換パイオーゲルＡ０．５ｍ’（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）アフィニ ティーカラムに３６〜４８時間にわたって適用した。２８０ｎｍにおける溶離液 の吸光度が０．０５未満になるまで、カラムを平衡緩衝液（７５鯛のトリス−Ｈ Ｃｌ、　１５０　ｍＭのＮａＣｌ、２ＩＩＩＭのＣａＣＬ　、ｐＨ７，３）で徹 底的に洗浄した。次いで、０．２５以上の２８０ｎｍにおける吸光度を有するＣ ＲＰを含む画分をトリス−クエン酸塩キレート化緩衝液（７５ｍＭのトリス−１ １Ｃ１，７，５ｍＭのクエン酸塩、１５０　ｄのＮａＣｌ５ｐ８７．３）により 溶離した。

ＣＲＰ画分を溜め、脱イオン蒸留水で３倍に希釈し、ｐＨ７，３に調節した。次 いで希釈画分を、希釈ＣＲＰ各５００ｍ１に対し５０ｇの樹脂の比でＤＥ−５２ 陰イオン交換カラム（ワットマン・バイオケミカルズ（Ｔｈａｔ越ｎ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ）、ケント、英国）に適用した。次に、ＣＲＰを含む両分をｌ Ｏ關のトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，３中の線形の０．０５〜０．５Ｍ　のＮａＣ Ｉ勾配で溶離した。残留ＳＡＰを除去するために、これらの両分を未置換バイオ −ゲルＡ０．５＋ｎカラム（バイオラド）に適用し、上記の平衡緩衝液で溶離し た。ＣＲＰを放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）により試験し、ＩｇＧ及びＳＡＰにつ き陰性と確認し、二重拡散アッセイによりＩｇＭ　、　Ｉｇ［！　、並びに補体 成分Ｃ１ｑ及びＣ３につき陰性と確認した。

タンパク質濃度を、ソレンソン（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ）ら［Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ ａ、　４２：１６１−１６２（１９８６）］により記載されたビシンコニン酸（ ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、）　、ｏ　ツクフォード、［Ｌ）の改良、またワッブル（Ｗａｄ ｄｅｌｌ）　［Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、、　４８：３１１−３１４　（ １９５６）］により記載されたような２１５Ｍｍ及び２２５Ｍｍにおける分光吸 光度アッセイにより測定した。全ＣＲＰ含量を、２８０ＭｍにおけるＣＲＰの１ ．９５ｃｒ’　（ｎ＋ｇ／ｎｌ）の吸光率を使用することにより計算した［ウッ ド（Ｗｏｏｄ）ら著、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　３０：６１６−６２ ２　（１９５１）　］　。ＣＲＰの純度を、ＣＲＰのの合計量を同一試料中のタ ンパク質の合計量で割り、１００を掛けることにより計算した。ＣＲＰのタンパ ク質純度はこれらの計算値から９８．５％以上であることが決定された。

また、ＣＲＰ純度を、４．０％のスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲル、１２ ．０％の分割ゲル、及びラエムリ（Ｌａｅｍｎ＋ｌｉ）著、Ｎａｔｕｒｅ、　２ ２７：６８０−６８５　（１９７０）に記載された緩衝系を使用して還元条件下 でナトリウムドデシルスルフェート−ポリアクリルアミドゲルにより確認した。

色素前部がスタッキングゲルに完全に入るまでゲルを１００Ｖの一定電圧設定で ４℃で運転した。その後ゲルを完結まで２００ｖで運転した。全てのＣＲＰタン パク質が約２２．５Ｋｄの単一バンドとして移動し、ウルトロスキャン（Ｕｌ− ｔｒｏＳｃａｎ）ＸＬデンントメーター（ＬＫＢインストルメンツ（ｌｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔｓ））によるレーザーデンントメトリーにより測定したところ、９９ ％より大きい純度であった。

精製ＣＲＩ’を、アミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ）ＰＭ−３０膜（アミコン、デンバ ー、ＭＡ）を使用して窒素雰囲気下で限外濾過により１　ｍｇ／ｍｌに濃縮し、 トリス緩衝塩類液−カルシウム（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　１５０　ｍＭの ＮａＣＩ、２ｆｆ１ＭのＣａＣ１＋　、ｐＨ７，３）に対し透析した。次いてＣ ＲＰを０．４５ミクロン及び０．２　ミクロンのアクロディスク（Ａｃｒｏｄ　 ｉ　ｓｃ）フィルター集成装置（ゲルマン・サイエンシイズ（Ｇｅｌｍａｎ　５ ｃｉｅｎｃｅｓ）　、アン・アーバー、Ｍｌ）により連続して濾過し、滅菌ガラ スバイアル中で４℃で貯蔵した。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　２４・５３１−５４１　（１９８７）　］により先に記 載された方法を使用して調製した。

トリス緩衝塩類液−カルシウム緩衝液中でｌ　ｍｇ／ｍｌで上記のようにして調 製した精製された天然ＣＲＰを５ｍＭのＥＤＴＡでキレート化し、８Ｍの尿素中 で３７℃で２時間インキュベートした。次いで尿素を低イオン濃度のトリス緩衝 塩類液（１０ｕｍのトリス−１４Ｃ１，５０１１１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７，３） に対し透析することにより除去した。ｍＣＲＰの凝集を最小にするように、ＩＩ ）ＣＲＰを低イオン濃度の緩衝液中で調製することが好ましい。次いでｍＣＲＰ 濃度を、上記のように、２８０Ｍｍにおける１、９５ｃｒ’　（ｍｇ／ｍｌ）の 吸光率及びＢＣＡタンパク質アッセイを使用して測定した。ｍＲＰを上記のよう に滅菌濾過し、滅菌ガラスバイアル中で低イオン濃度のトリス緩衝塩類液中に４ ℃で貯蔵した。

Ｃ，ルベット調製 天然ＣＲＰもしくはｍｃＲＰ　（上記のようにして調製した）、または対照緩衝 液を含むルベットを、マクドナルドら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃｔａ、　１０６１：２９７−３０１　（１９９１）により報告された方法の改 良に従って調製した。更に詳しくは、使用した方法は二つの先に記載された方法 −生物活性巨大分子の取り込みに温和な条件を使用する第一の方法［キルビイ（ Ｋｉｒｂｙ）ら著、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１巻、　Ｐｒ ｅｐａｒａｔｉｏｎｏｒ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　１９− ２７頁（１９８４）］と、良く規定されたサイズ及び均一性の小胞を形成する第 二の方法［オルマン（Ｏｌｓｏｎ）ら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 　Ａｃｔａ。

５５７：９−２３　（１９７９）　］の組み合わせであった。

Ｌ−α−レシチン（ホスファチジルコリン）、スフィンゴミエリン（アバンチ・ ポーラ−・リピッズ社（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　ｌ、１ｐｉｄｓ、Ｉｎｃ、 ）　、ペルハム、ＡＬ）及びコレステロール（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の混合物 を１：１：１のモル比で丸底フラスコに入れ、ＨＰＬＣ銘柄クロロホルム（シグ マ）に溶解した。これらの脂質成分合計３５．５ｍｇをクロロホルム６、７５ｍ １に！濁させ、ロータリー・エバポレーター（プツチ・ロート−バック（Ｂｕｃ ｈｉ　Ｒｏｔｏ−ｖａｃ）、ベルン、スイス）を使用して５０℃の水浴中で高真 空下で少なくとも１時間乾燥させてフラスコの壁部に薄いフィルムを形成した。

次いで、乾燥した脂質内容物を封入すべき水相媒体（即ち、天然ＣＲＰ　、　ｍ ＲＰ、または対照緩衝液）３．５ｍｌで水和して１５．９ｍＭの脂質濃度を生じ た。

自然に形成した小胞を、二つの０．５ｍｌのハミルトン・シリンジ（ハミルトン 、レノ、ＮＹ）がはめ込まれた手動押出装置［Ｒ，Ｃ，マクドナルドの研究所で 開発され、マクドナルドら著、ＢｉｏｃｈｉｕＢｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　１ ０６１：２９７−３０１　（１９９１）に記載されている］中に取り付けた単一 の０．１　ミクロンのポリカーボネート膜（ヌクレオポアー（Ｎｕｃｌｅｏｐｏ ｒｅ）、ブリーサントン、ＣＡ）を通して加圧下で９回の押出にかけた。

押出の奇数回の通過を行って試料の水和中の大きな小胞（これらは第一回の通過 の際にフィルターを通過していなかったかもしれない）からの可能な汚染を避け た。押出方法からのルベットは約０．１ミクロンの均一かつ良く規定されたサイ ズ分布を有していた。ルベットを１〜２時間の期間にわたって４℃で貯蔵した。

ルベットに封入されたタンパク質、天然ＣＲＰまたはｍＣＲＰの量を、カブラン （Ｋａ−ｐｌａｎ）ら著、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１７２：３９３−３ ９９　（１９８９）により記載された操作の適用により測定した。室温で、夫々 のルベソト試料２０μｌを蒸留脱イオン水２．０ｍｌで希釈した。その希釈試料 に、下記の物質を順に添加した＝ｌθ％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ　２００７１１、） リス−３ＤＳ　（Ｉ　Ｍのトリス−ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ）のＳＯ３、ｐＨ７， ５）　３００μｌ及び１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）　６００μ１０夫々の 添加後に、その混合物を１０秒間連続的に攪拌した。その混合物をＴＣＡ工程後 に室温で５分間インキュベートした。

夫々の試料をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ＩＩＡＷＰ　０９０００フイルタ ー（ミリポア・コーポレーション、ベッドフォード、ＭＡ）で濾過し、６％（ｗ ／ｖ）のＴＣＡ　２．　Ｏｍｌて洗浄した。洗浄後、フィルターを、シェーカー テーブル上でアミドブラック染色液［４５：１０：４５の比のメタノール／氷酢 酸／水に溶解した０、１％（Ｗ／Ｖ）のアミドブラック１０Ｂ（／＜イオーラド ）　３２００　ｍｌ中に３分間入れた。フィルターを除去し、シェーカーテーブ ル上で蒸留脱イオン水約２００　ｍｌで２分間洗浄した。次いてフィルターをふ き、きれいなレーザーブレードで細断し、その後、それをアミドブラック溶離緩 衝液（２５ＩＩＩＭのＮａＯＨ１０，０５嘘のＥＤＴＡ、５０％のエタノール） ７００μｌに入れた。

室温で３０分間のインキュベーンコン中に時々攪拌して色素をフィルターから溶 離し、溶離液の吸光度を６３０Ｍｍで測定した。吸光度値を使用して、２〜２４ μｇのＢＳＡを含む試料で作成した線形標準曲線からタンパク質濃度を計算した 。

ルベット封入効率を、カルセイン容積相アッセイ（内在化容積を測定するため） 及びアミドブラックタンパク質アッセイ（タンパク質の量を測定するため）によ り測定した。また、封入効率を、オフ（Ｏｋｕ）ら著、ＢｉｏｃｈｉｕＢｉｏｐ ｈｙｓ、Ａｃｔａ、　６９１：３３２−３４０　（１９８２）により記載された ような蛍光水相容積マーカーを使用して測定した。脂質比として表される、測定 された天然ＣＲＰの量は、脂質１μモル当たり２．０ＭｇのＣＲＰであった。ま た脂質比として表される、小胞内在化容積は、脂質１μモル当たり２．０２μｌ であった。計算されたルペット封入効率は、９９０ＭｇのＣＲＰ／ｍ！±２０μ ｇ／ｍ　ｌ内部容積であった。

また、ルベットを天然ＣＲＰ及びにＲＰにつき抗原決定基特性に関して評価して 、ルベットが均一な天然ＣＲＰ製剤またはｍｃＲＰ製剤のいずれを含むかを測定 し、またこれらのＣＲＰ形態の相互変換があるか否かを測定した。特定の天然Ｃ ＲＰまたは＋＋１ＣＲＰ抗原決定基の存在を測定し、定性化するために、天然Ｃ ＲＰ　、　ＩＩＩＣＲＰ、または対照緩衝液を含むルベットを、ドツト−酵素結 合免疫濾過アッセイ（“Ｄｏｔ−ＥＬＩＦＡ″）により分析した。Ｄｏｔ−ＥＬ ＩＦＡ　［クラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 印刷中（１９９２）により記載されている］を、先に記載されたプロトコル［ホ ークス（Ｈａｗｋｅｓ）クマイクロタイタ・プレートに代えてニトロセルロース 膜を使用し、こうしてプラスチック表面に吸収された時に配座変化を受けること が知られているＣＲＰの如きタンパク質て特に有益である［ポテンバら著、Ｍｏ １．ｌｏｗｎｕｎｏｌ、、　２４：５３１−５４１（１９８７）を参照のこと］ 。

簡単に言えば、天然ＣＲＰ　、　ｍＣＲＰ、及び天然ＣＲＰ　、　ｆｆ１ｃＲＰ 、または対照緩衝液を含むルベノトの系列希釈液をイージーータイタ（Ｅａｓｙ −Ｔｉ　ｔｅｒ、商標）ユニット（ピアス・ケミカル社、ロックフォード、ＩＬ ）により０．４５ミクロンのニトロセルロース膜に適用した。全てのウェルを試 料緩衝液１００μｌで洗浄して未結合タンパク質を除去した。残っている未結合 部位をウシ血清アルブミン（ＵＳＡ）のバックコートでブロックした。次いでニ トロセルロース膜をファースト・プロット・ディベロツバ−（Ｆａｓｔ　Ｂｌｏ ｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、商標）ユニット（ピアス・ケミカル社）に入れた。

次に、その膜を天然ＣＲＰまたはｍＲＰに特異的な一次抗体でインキュベートし た。

イリノイ州、エバンストンにあるイムチク・インターナショナル社（ｌｎｎｔｅ ｃｈ　１ｎ−ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、）のローレンス・ポテンパ博士 から入手した下記のモノクローナル抗体（’ｍｏｂｓ″）を試験した：　１５． １０６　＜天然ＣＲＰに特異的な反応性）、１３．３ＨＩ２．２６．７Ａ８、及 び２６．８Ｃ１０（献ＲＰに特異的な反応性）：並びに１５．２Ｃ１０（天然Ｃ ＲＰ及びにＲＰに特異的な反応性）。これらの抗体は、共同未決米国特許出願第 ０７／３７４゜１６０号明細書、及びインク（Ｙｉｎｇ）ら著、Ｊ、　１ｍｍｕ ｎｏ１．、１４３：２２１−２２８　（１９８９）に記載されている。

洗浄して未結合の一次抗体を除去した後、その膜をヤギまたはウマ抗マウスＩｇ Ｇホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰ）接合体でインキュベートし た。

次いでその膜を洗浄して未結合二次抗体を除去し、ＨＲＰ基質で展開した。

Ｄｏｔ−ＥＬＩＦＡ試験の結果は、ｍＡｂ　１３．３＋（１２が１１（Ｒｐエピ トープに特異的であり、またｍＡｂ　１５．１０６が天然ＣＲＰエピトープに特 異的であることを確かめた。また、これらの結果は、ルベットに封入された天然 ＣＲＰの１％未満が’ｍＡｂ　１３．３Ｈ１２により認識されたｍｃＲＰエピト ープを示すことを示した。それ故、天然ＣＲＰの１％未満がルベット押出操作に よりｍｃＲＰに変換されていた。ルベットに封入されたにＲＰは天然ＣＲＰ形態 への変換を生じそうにないと考えられたが、ｍｃＲＰを含むルベットを１３．３ Ｈ１２抗体及び１５．　ＩＤ６抗体との反応性につき調べた。これらの結果は、 天然ＣＲＰエピトープがにＲＰを含むルベットにつき実質的に発現されないこと を示した。

比較のために、天然ＣＲＰを含む多ラメラ小胞（“Ｍｌ、Ｖｓ”）をデオダーら 著、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、　１：２７−３４　（１９８２）によ り記載された方法に従って調製した。

次いて、天然ＣＲＰを含むＩＪＬＶｓを、上記のように、Ｄｏｔ−ＥＬＩＦＡ分 析を使用してＣＲｒ’エピトープ及びｍＣＲＰエピトープにつき試験した。

投薬量依存様式で、ＭＬＶ製剤＋；ｔｍＡｂ　１３．３＋１１２及びｍＡｂ　１ ５．１０６ノ両方により認識された抗原決定基を示した。検出された１５．ＩＤ ６の量は、天然ＣＲＰ　２２Ｏ４８ｎを含むＭＬＶアリコートまで試験した全て の滴定点て１３．３１１１２よりも大きかった。総合して、そのデータは、デオ ダーらにより報告された方法によりＭＬＶｓに封入された天然ＣＲＰの約４０％ がｍｃＲＰに変換されることを示した。

また、これらのＭＬＶｓの封入効率を、カルセイン容積相アッセイ及びアミドブ ラックタンパク質アッセイを使用して評価した。これらのＭＬＶ製剤中、脂質に 対する比として報告されるＣＲＰの量は、脂質１μモル当たり０．２８μｇのＣ ＲＰであった。

脂質に対する容積比として報告されるＭＬＶ内在化容積は、脂質１μモル当たり ０．８２μｍであった。アミドブラックタンパク質アッセイからのＣＲＰタンパ ク質／脂質比及びカルセイン容積相アッセイからの容積／脂質比を使用して、Ｍ ＬＶ封入効率は３４１．５μｇのＣＲＰ／ｍｌ±５３μｇ／＋ｎｌ内部容積であ った。

ルベットと比較してＭＬｖｓの性質の幾つかを、下記の表１に示す。

表１ 多ラメラ小胞　大きい単一ラメラ小胞 （ＭＬＶｓ）　（ルベット） 量、タンパク質／脂質　０．２８μｇ／μモル脂質　２．０μｇ／μモル脂質内 在化容積　０，８２μｍ７μモル脂質　２．０２μｍ／μモル脂質封入効率　３ ４１．５±５３μｇ　ＣＲＰ／ｎｌ　９９０±２０μｇ　ＣＲＰ／ｎ１表１に示 されるように、ルベットは脂質の量適たりに封入された多員のタンパク質を生じ ただけでなく、更に大きい内在化容積及び封入効率を生じた。また、ルベットに 封入された天然ＣＲＰはｍｃＲＰへの天然ＣＲＰの検出可能な変換を生じなかっ た。こうして、ルベットはＭＬＶｓよりも優れていることが結論された。

Ｄ、　ｍｃＲＰの生体内の毒性の研究 天然ＣＲＰ　、　ｍＣＲＰ、または天然ＣＲＰ　、　ｍＣＲＰ、もしくは対照緩 衝液を含むルベットを試験動物に投与する前に、生体内の毒性の研究を行って、 ｍＣＲＰの投与が有害な副作用により伴われるか否かを測定した。

生後１０〜１２週の合計８０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（バーラン・ラボラト リイズ（Ｈａ−ｒｌａｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マジソン、Ｗｌから入 手した）を、夫々５匹のマウスの対照群及び実験群にランダムに分けた。実験群 に１μｇ／マウス〜１００μｇツマウスの範囲のｎｆＲｌ”投薬量を注射し、一 方、対照群に食塩加リン酸緩衝液を注射した。注射は静脈内、腹腔内または皮下 であり、４日目、１１１日目及び１８８日目投与した。

最初の注射の前に、全ての実験群動物及び対照群動物の基準データを記録した。

動物を体重並びに血液、タンパク質、グルコース、及びｐＨに関する尿検査（ア メス社（Ａｍｅｓ　Ｃｏ、　）、ヘマーコンビステイクス・リージエント・スト リップス（Ｈｅ＋ｎａ−ｃｏｍｂｉｓｔｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔ　５ｔｒｉｐｓ） ）の３週毎の測定により監視した。動物の大半、８０匹のうちの７５匹（９３％ より大きい）が体重値を普通に許容される変化限度（これらは最初の体重の１０ ％より大きくない体重損失と定義される）内で増加または維持した。８０匹の動 物のうちの合計５匹が最初の体重の１０％より大きい値だけ全体重を減少した。

この群のマウスは、２４％を越える体重の減少を経験しなかった。

夫々の実験群と比較して対照群の体重の変化率（％）の平均値の差の有意差を測 定するために、ツー・テールド（ｔｗｏ−１ａｉ　１ｅｄ）スチューデントを一 検定を使用し、０．０５未満のｐが有意差があると考えられる。試験結果は、全 ての群につき体重の変化率（％）に統計上有意差がないことを示した。

尿検査試験は、試験した全ての群につき測定パラメーターの最小の変化を明らか にした。いずれの時点でも、グルコースまたは血液が尿中に検出されなかった。

全ての動物に関する尿のタンパク質含量は例外なしに３０μｇ／ｍｌで一貫して 測定された。尿ｐＨ値は正常な限度内で最小に変化し、いずれの個々の動物につ いても変化の単一のｐｌ＋単位を決して越えなかった。

その他に、全ての群の全般の外観及び活動を写真に撮り、記録した。観察し得る 活動及びブルーミング（３個の別個のケージ内で動物により示された／く−ベリ ング（ｂａｒｂｅｒｉｎｇ）の現象の傾向を含む）は正常の限度内であった。全 てのこれらの結果は、種々の投薬量で、記載された種々の投与の経路により投与 されたｍｃＲＰが、記載されたパラメーターにより測定して有害な副作用を誘発 しないことを実証する。

Ｅ、　ＥＭＴ６原発性腫瘍増殖及び転移に関する天然ＣＲＰ及びｍＣＲＰの効果 生体内の腫瘍増殖アッセイを行って、マウスＥＭＴ６胸部腺癌腫瘍の増殖に関す るｎｙｃＲＰ及び天然ＣＲＰ　、　ｍＣＲＰ、または対照緩衝液を含むルベソト の効果を測定した。

マウスＥＭＴ６胸部腺癌細胞系、即ち、ＥＭＴ６を、バージニア州、リッチモン ドにあるバージニア医科大学のジョン・ウィルソン（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｓｏｎ） 博士から入手し、１０％の加熱不活化ウシ胎児血清、１１．２５μｇ／ｎｌのＬ −グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのベニンジン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマ イシン、及び２．５μｇ／ｍｌのアンプオテリシンＢを補給したＲＰＭＩ−１６ ４０培地中で培養した。細胞系を試験し、測定したところ、マイコプラスマ及び その他の微生物汚染を含まなかった。

研究の１日目に、約３　ｘ　１０’の生存可能な［ｉＭＴ６細胞１０．１０ｍ１ のＲＰＭＩ−１６４０を、バーラン・ラボラトリイズ、マジソン、Ｗｌから入手 したＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。

これらの細胞を、全ての動物の右後肢の踵骨の近位に皮下注射し、動物を下記の 表２に列記されたような７つの群にランダムに分けた。７日目に、腫瘍塊が全て の動物で成長した。

７、９．　］　１．１３．１５．　動物の　２９日目に　研究中に　２９日目に 　研究期間１７．１９日目に　合計数　壊死を有　腫瘍容積　転移性肺　中の動 物ｉ、ｖ、注射で治療　する動物　の増加／　腫瘍を有　の死亡数の合計数　減 少を示し　する動物 ２Ａ　低イオン濃度の　５０５１０５０緩衝液　（４／１）２ ２Ｂ　標準イオン濃度　５　０　５１０　５　０の緩衝液中の ルベント ２Ｃ低イオン濃度の　５０５１０２２ 緩衝液中の ルベソト ３　１００μｇノｍＣＲＰ　１５　７　１５１０　６　０（低イオン濃度の　（ １）’　（１０１５）”緩衝液中） ４１００μｇの天然　１５　１　１５１０　１０　３ＣＲＰ（ルベット中）　（ １）’　（９／６）”５１００μｇのにＲＰ　１６　１２　９／７　１　１１疑 わしい性質の壊死性病変を示す動物の追加数２−貫した腫瘍容積増加を有する動 物／変動する腫瘍容積を有する動物夫々の群につき表２に記載された治療を、７ 日目に開始して１３日にわたって２日毎に静脈内注射により投与した。注射の前 に、天然ＣＲＰ　、　ｍｃＲＰ、または対照緩衝液を含むルベットを使い捨ての ２．５ｍｌのバイオ−ゲルＡ０．５ｍカラム（約１〜２ｍ１の床容積／ｍｇタン パク質）による分離クロマトグラフィーにかけてルベットと会合していない天然 ＣＲＰまたはｍＣＲＰを除去した。ルベットは空隙容積でカラムを通過し、濁っ た外観てあった。封入されなかったタンパク質を、ルベット画分から２〜３力ラ ム容積間隔てカラムから溶離する２８０μｍで吸光度を有する遅く移動する画分 として測定した。

マツフィントラシュ（Ｍｃｌｎｔｏｓｈ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、　４９：１４０８−１４１４　（１９８９）により記載されているようにし て、開始の一次部位における腫瘍の増殖を、副尺カリバーを使用して、最も近い ０．０５ａｍまでの隆起腫瘍塊の最短寸法及び最長寸法に沿って測定することに より評価した。小半径（ａ）及び大半径（ｂ）を使用して、長球面の式： ％式％ を使用して腫瘍容積（ａｍりを計算した。計算腫瘍容積は腫瘍の苦しみを反映す る。

夫々の試験群は１５〜１６匹の動物を含んでいた。平均の腫瘍の苦しみを治療群 につき計算し、ツー・テールド・スチューデントを一検定を使用して比較し、０ ．０５未満のｐ値が統計上有意であると考えられた。

治療を受けない動物（群ｌ）及びルベット中の天然ＣＲＰを受ける動物（群４） と比較して、ルベット中のｍＣＲＰを受ける動物（群５）中の原発性腫瘍の増殖 が、治療が施された日数にわたって図１に示される。静脈内治療注射を、図１に 示された矢印により示された日に行った。

腫瘍移植の７日後に、種々の群中の平均腫瘍塊は４５９ｍｍ’から８６３ｍｍ３ まで変化した。腫瘍増殖速度を平均腫瘍容積（立方ミリメートル）士平均の標準 偏差としてプロットする。ルベット中の天然ＣＲＰを受ける動物中の腫瘍は速い 速度で増殖し続け、治療を受けない対照群の動物で観察された速度と平行であり 、殆ど異ならない。対照的に、ルベット中のｆｆ１ｃＲＰを受ける動物の腫瘍増 殖速度はこの時間の期間にわたって最小であった。スチューデントを一検定を使 用して、ルベット中のｍｃＲＰで治療された動物の腫瘍増殖は、治療を受けない 対照動物の腫瘍増殖とは９日目でｐ＜０．０２５、また１１−１９日目にｐ＜０ ．００１とがなり異なっていた。

治療を（１９日目の後に）２９日目まで一旦停止すると、ルベット中の天然ＣＲ Ｐで治療された動物の腫瘍増殖は影響されず、速い速度で続いた。図２（腫瘍増 殖が７日目に測定されたその腫瘍サイズからの変化率（％）としてプロットされ る）に見られるように、治療を受けない対照群及びルベット中の天然ＣＲＰ群の 両方における腫瘍は、７日目に測定された腫瘍よりも１０倍（１０００％）より も大きかった。

ルベット中のｍＣＲＰ群における腫瘍増殖は、治療が停止された後に増大し、治 療を受けない対照群における同様のサイズの腫瘍で観察された増殖速度に匹敵す る速度で成長した。

線形増殖速度と仮定し、また治療後の日数と比較して治療の日における腫瘍増殖 に関して最小２乗線形回帰分析を使用して（下記の表３に要約される）、治療を 受けない対照群の動物の腫瘍増殖速度は７〜１９日目中２０３．５±１２．７ｎ ＋ｍ’７日であり、１９〜２９目中３６６、９±３４．１ｍｍ’／日であった。

天然ＣＲＰ−ルベット群の動物の腫瘍増殖速度は、治療中１８６．８±２４．４ １１１１１１”／日であり、１９〜２９目中３６７、０±３３．７＋＋＋ｎ＋” ７日であった。ルベット中のｍＲＰ群の動物は治療臼、７〜１９日目中に４４． ７±２４．４μｍ’／日のごくわずかの平均腫瘍増殖を有し、増殖速度は１９〜 ２９目中３２７．６±１８．１１ＩＩＩＴＩ’／日まで増大した。

表３ 腫瘍容積の変化（Ｍ３７日）“ 治療　７〜１９日目　１１〜１９日目　１９〜２９日目治療を受けない対照群　 ２０３５±１２．７−３６６．９±３４．１天然ＣＲＰ（ルベノト中）１８６． ８±２４．４−３６７、０　＋３３．７ｍＣＲＰ　（Ｉｌｌｌｌ中）　６７．３ ＋２２．９　１５．０＋２４．４　３６９．８±１２．０にＲＰ（ルベット中） 　４４．７±１２．０−３２７．６±１８．１°最小２乗線形回帰分析により計 算されたとおり腫瘍増殖は、ルベノト中のｍＣＲＰ治療の停止後に対照群の動物 と同様の速度まで増大した。それにもかかわらず、ルベット中のｒｎｃＲＰて治 療した動物は、治療を受けない対照群またはルベソト中の天然ＣＲＰて治療した 群で測定した腫瘍よりも２１〜２９日目の全ての時点でｐ＜ｏ、　Ｏｆと統計上 小さい腫瘍を有し続けた。

図３において、にＲＰで治療した群（群３、緩衝液中のｍＣＲＰを受ける）が、 研究の２９日の経過にわたって腫瘍増殖（平均腫瘍容積）に関して治療を受けな い群（群ｌ）と比較される。その結果は、ｍｃＲＰがまたマウス胸部腺癌腫瘍の 増殖を阻止するのに有効であったことを示す。ｍｃＲＰは、ルベット中のｍｃＲ Ｐによる治療（群５）で観察されたような、最初の治療投薬量で開始する即時の 保護効果を示さなかった。９日目及び１１日目に、ｍＣＲＰ治療群で測定された 平均腫瘍容積は、治療を受けない対照群（及びルベット中の天然ＣＲＰで治療し た群）の動物と平行して増大した。第三のｍＣＲＰ−緩衝液投薬量の投与後（そ の時点で、平均腫瘍容積は約１５００ｍｍ”に達していた）　、＜ＲＰ冶治療有 効になり、治療期間の残り（１９日目まで）にわたって治療動物で更なる平均腫 瘍増殖を生じなかった。全治療日数（７〜１９日目）の腫瘍増殖速度は６７．３ ±２２．９ｍｍ’／日であり、ルベット中のｆｆ１ｃＲＰによる治療群よりも５ ０％大きい速度であった（表３）。しかしながら、線形回帰が、＜ＲＰ　−緩衝 液治療が腫瘍増殖を行うことが明らかになった日（１１−１９日目）のみにわた る腫瘍増殖速度につき行われる場合、その増殖速度は１５．０±２４．２ｗｍ’ ／日まで低下する。有意差につきツー・テールド・スチューデントを一検定を使 用して、この腫瘍増殖はゼロ増殖速度と殆ど異ならない。

１９日目後に、腫瘍増殖は、有効な抗腫瘍活性を示さない群で測定された速度に 匹敵する速度で増大した。平均腫瘍容積が７日目に測定された腫瘍サイズからの 変化率（％）としてプロットされる場合（図４）ｌｌ：ＲＰ治療を受ける動物は 、ルベット中の天然ＣＲＰによる治療（及び治療を受けない対照）と比較して、 治療の最初の３日間中に腫瘍増殖のわずかな遅延を示した。１１日目から１９日 目まで、平均腫瘍増殖が実質的に生じなかった。１３日目に、ｍＣＲＰ冶療は治 療を受けない対照またはルベット中の天然ＣＲＰによる治療とはＯ，Ｑ２５より 小さいｐ値で有意に異なっていた。１５〜１９日目に、測定された差が両方の群 と比較して０．００１より小さいｐ値で有意であり続けた。治療を停止し、腫瘍 が再度成長し始めた（２１〜２９日目）後に、ｍｃＲＰ治療群の平均腫瘍容積は 、天然ＣＲＰ−ルベット治療群とは、２３日目まで０．００１より小さいｐ値で 、２９日目まで０．０２より小さいｐ値で有意に異なり続けた。

これらのデータは、天然ＣＲＰではないｍＣＲＰがマウス胸部腺癌の増殖を阻止 するのに有効な治療であることを示唆する。更に、ｍｃＲＰは、リポソーム中で 注射され、または緩衝液中で単独で注射されても有効である。

にＲＰの抗腫瘍効果を更に完全に特徴付けるため、壊死性病変を示す動物の数、 進行性腫瘍増殖速度対変動する腫瘍増殖速度、肺転移の数、及び夫々の群中の個 々の動物の死亡数に関するデータを測定した。これらのデータが上記の表２に示 される。

腫瘍部位を壊死性病変に関する研究中に目視で調べた。７日目の腫瘍の目視試験 は、隆起した皮下の充実性腫瘍塊の存在を示し、良く形成された境界が腫瘍の全 表面にわたって均一な色及び組織を有していた。壊死性病変を、組織の可能な退 化を伴う皮膚表面の黒化と定義した。対照群の動物（合計３０匹の動物一群１． ２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）は壊死の徴候を示さなかった。対照的に、ルベット中の ｍｃＲＰで治療された１６匹の動物のうちの１２匹（おそら＜１４匹）、及びｍ ｃＲＰで治療された１５匹の動物のうちの７匹（おそらく８匹）が壊死を示した が、一方、ルベット中の天然ＣＲＰによる治療を受ける１５匹の動物のうちの１ 匹（おそらく２匹）が壊死を示した。ルベット中のｍｃＲｒ’による治療を受け る１５匹の動物のうちの６匹が最初の治療の４８時間後の９日目に壊死性部位を 発生した。１９９日目でに、この治療群の幾つかの動物が二つまたは三つの別個 の病変を示した。壊死性病変は柔らかく、触診に対し柔軟であり、かつ全腫瘍表 面の１７３までを覆っている良く形成された皮下の兆候であった。微細なニード ル吸引バイオプシーを壊死性部位で行って、これがその部位における死亡した腫 瘍細胞並びに圧倒的多数の多形核白血球及びマクロファージを確かめた。また、 バイオプシーの分析は、観察された壊死が感染プロセスの結果ではないことを示 した。

壊死性病変は可変のサイズ及び形状のものであり、最大測定寸法で１５ｍｍを越 えなかった。最初に認識された病変は触診により展性であったが、時間がたつに つれて、それらは触れると非柔軟性になり、また退縮により毛質になり、わずか にへこんだ境界を有していた。腫瘍を剖検で切除した場合、付加的な不連続の巣 状壊死性病変が表面試験により目視できない腫瘍塊中で発見された。その他の器 官または組織はｍＣＲＰ治療（緩衝液中のｍＣＲＰまたはルベット中のｍｃＲＰ ）により異常に影響されないことがわかり、これはｍｃＲＰが非毒性であるとと もに直接の抗腫瘍効果を有することを示した。

また、個々の動物中の腫瘍の増殖特性は、表２に列記された種々の群間で重要な 差異を示した。例えば、群５中の１５匹の動物のうちの６匹が、７日目の治療の 前の腫瘍容積と比較された場合に６０％までの腫瘍サイズの減少（腫瘍サイズの 半分の減少より大きい）を有することが実証された。更に、群５中の動物の４４ ％（７／１６）の腫瘍増殖が、腫瘍増殖の変動する進行を示した。

対照的に、両方の対照群（天然ＣＲＰまたはＩＤＣＲＰを受けない群１　、２Ａ 、　２Ｂ、及び２Ｃ）の原発性腫瘍増殖の測定は、動物間で殆ど変化しないで一 貫した腫瘍増殖を示した（群２Ａ中のわずかに１匹の腫瘍を有する動物が腫瘍サ イズの変動する増大を示した）。対照緩衝液を含むルベットを受ける動物（群２ Ｂ及び２Ｃ）の腫瘍増殖は、ルベットそれ自体が原発性腫瘍増殖に対し抑制効果 を有しないことを示した。

また、両方の対照群の腫瘍増殖の速度は匹敵していた。その他の二つの群におい て一貫した腫瘍容積増大／変動する増大を示す動物の数は、群３（緩衝液中のＩ ＩＩＣＲＰによる治療）（ｌＯ１５）、及び群４（天然ＣＲＰ−ルベットによる 治療Ｘ９／６）であった。

また、全ての解剖した動物の肺組織を転移につき評価した。表２に示されるよう に、対照群ｌ及び２は転移の高発生率を有していた。群ｌ及び２を構成する３０ 匹の動物のうちの２０匹（６７％）が肺中に転移性腫瘍増殖を有していた。更に 詳しくは、群２Ａ、　２Ｂ、及び２Ｃを構成する１５匹の動物のうちの１２匹の 動物（８０％）が、観察できる転移性肺腫瘍を有していた。また、群４の動物（ ルベット中の天然ＣＲＰを受ける）が、転移の比較的高い発生率を示した。群４ 中、１５匹の動物のうちの１０匹（６７％）が肺転移を有していた。

対照的に、ｍＣＲＰまたはルベソト中のＩＩＩＣＲＰを受ける群３及び群５の動 物は夫々転移の低下された発生率を示した。群３中、１５匹の動物のうちの６匹 （４０％）が肺転移を有し、一方、肺転移性腫瘍が群５の１６匹の動物のうちの わずかに１匹（６，２５％）で観察された。

こうして、この生体内の研究からのデータは、ｍｃＲＰで治療された動物及びル ベット中のｍＣＲＰで治療された動物が腫瘍壊死の高発生率、及び腫瘍サイズの 大きな減少、または変動を有することを明らかにした。また、これらの結果は、 にＲＰが原発性腫瘍増殖に対する効果に加えて、腫瘍の転移を減少することを示 唆する。

実施例２・ＥＩＩｒｒ６胸部腺癌細胞への天然ＣＲＰ及びｍＣＲＰの結合天然Ｃ ＲＰまたはｍｃＲＰがＥＭＴ６組織培養細胞を結合するか否かを測定するために 、細胞遠心分離を使用してサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）スライドを調製し た。実施例１、パートＥに記載された培養ＥＭＴ６細胞を洗浄し、食塩用リン酸 緩衝液（ＰＢＳ）中で約１−２　Ｘ　１０’／ｍｌまで再度懸濁させた。カード カバーを備えたガラス顕微鏡スライドを細胞遠心分離機中に取付け、ＥＭＴ６細 胞懸濁液０．２〜０．３ｍｌを溜めに入れた。次いて細胞を１５分間にわたって 遠心分離によりスライドに固着させた。得られる細胞単層を３０分間空気乾燥さ せ、室温で貯蔵した。

次いでスライドを、実施例１、パートＡ及びＢに記載され、１００μｇ／ｍｌに 希釈された緩衝液中の天然ＣＲＰまたはｍＲＰ　２００μｌでオーバーレイし、 保湿室中で３７℃で３０分間インキュベートした。次に、スライドをＰＢＳの２ 種の変化中ですすぎ、ブロッキング溶液［ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）　、０．５％の正常なウマ血清］で１５分間ブレインキュベートした。

ＰＢＳで２回洗浄した後、４μｇ／ｎ＋ｌのｒｎＡｂ　１５．　ＩＤ６　（実施 例１に記載）またはＩＯμｇ／ｎ＋１のビオチニル化ポリクローナル抗体ＬＰ５ 　［イリノイ州、エバンストンにあるイムチック・インターナショナル社のロー レンス・ポテンパ博士から入手され、ポテンバら著、Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、 、　２４：５３］−５４１（１９８７）に記載されている］を３７℃の保湿室中 の３０分間のインキュベーションのために添加した。ケンダール（Ｋｅｎｄａｌ ｌ）ら著、Ｊ、　１ｎｖｎｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ、、　５６：３２９−３３９（１ ９８３）及びフス（ｌｌｓｕ）ら著、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅ ｍ、、　２７：１１３１−１１４５　（１９８１）に記載されたプロトコルの改 良を使用して抗体をビオチニル化した。

スライドをＰＢＳで２回洗浄し、ストレプトアビジン−ホースラディツシュペル オキシダーゼ二次試薬を適用した。次に、ジアミノベンジジン基質緩衝液［ＰＢ ３１０ｍｌ中のＤＡ口四塩酸塩（ノブ７）　６ｍｇ　、＋３％の０２０２０．１ ｍ１ｌを調製し、濾過して沈殿を除去した。次いてスライドをその緩衝液中に１ ５分間浸漬した。その反応を、流水中で１０分間洗浄することにより停止した。

洗浄後、スライドをメイヤーのヘマトキシリン（）Ｉｅ＋ｎａｔｏｘｙｌ　１ｎ ）（シグマ）中の３分間の浸漬により対比染色し、水中ですすいて過剰の染色液 を除去し、その後、２０秒間て３０ｍＭのＮＨ、ＯＨを添加した。スライドを再 度水中で洗浄し、バーマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）を使用してガラスカバース リップで取り付けた。

天然ＣＲＰまたはｎｃＲＰによるＥＭＴ６サイトスピンスライドのインキュベー ションはＥｌｆｆ６細胞への天然ＣＲＰ及び’ｍＣＲＰの両方の直接結合を示し た。ＩＯμｇ／＋ｎｌの天然ＣＲＰによるインキュベーション後に、ＥＩＪｒ６ 細胞は１３．３Ｈ１２ｍＡｂ　（５，５μｇ／ｍｌ）に優先して！５．　ＩＤ６ 　ｍＡｂ　（５，５μｇ／ｍｌ）を結合した。結合された１５．１０６の染色パ ターンは膜関連されており、特に細胞膜及び少ない程度に、核膜に膜関連されて いることが明らかであった。この染色パターンは、１０μｇ／ｍｌの濃度の天然 ＣＲＰによる競合抑制研究により無効にされ、また１０μｇ／ｍｌのｍｃＲＰに より外観上影響されなかった。

１０　ｔｔ　ｇ／ｍｌの１１）ＣＲＰ、続いて１３．３１１１２　ｍＡｂまたは １５．　ＩＤ６　ＩＩＩＡｂでインキュベートされたサイトスピンスライドは、 １５．１０６ではなく　１３．３８１２への結合を示した。１３．３８１２によ る染色パターンは膜関連されており、若干の拡散核特異性を示すことが明らかで あった。

実施例３；ヒト肺腺癌腫瘍部位への天然ＣＲＰ及びｍｃＲＰの生体内局在化生体 内研究を行って、天然ＣＲＰ及び−ＲＰが肺腺癌腫瘍を有する動物中の腫瘍部位 に局在するか否かを測定した。

ヒト肺腺癌細胞系、Ａ３４９　（メリーランド、ロックビルにあるアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクションから入手した）を、１０％の加熱不活化ウシ 胎児血清、Ｉｆ、２５　μｇ／ｍｌのし一グルタミン、１００　Ｕ／ｍｌのペニ シリン、１００　μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２．５μｇ／ｍｌのア ンフォテリシンＢを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。培養後、細 胞をＲＰＭＩ−１６４０中で２回洗浄し、３　Ｘ　１０’の生存可能な腫瘍細胞 １０．１０　ｍｌの濃度で再度懸濁させた。次いで、細胞懸濁液０．　ｌＯｍ＋ を生後６〜８週のＢＡＬＤ／ｃヌード（胸腺欠損）マウス（ハーランースブラギ ューーダウレイ・ラボラトリイズ（Ｈａｒｌａｎ−３ｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅ ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マジソン、Ｗｌから入手した）に右後肢の足 跡に近位に皮下注射した。

７日目までに、触診可能の腫瘍増殖を測定できた。次いで動物を、下記の表４に 示されるように、動物の４つの群（群当たり１匹の動物）にランダムに分けた。

３５００μｇの鯖ｂ　４４３Ａ６　ｔｏｏμｇの天然ＣＲＰ４５００μｇの鯖ｂ 　４４３Ａ６　１００μｇのＩＩＩｃＲＰ７日目に、モノクローナル抗体４４３ Ａ６を注射した。ｍＡｂ　４４３Ａ６（これはＡ３４９肺腺癌細胞を特異的に結 合する）を、イリノイ州、シカゴにあるノースウェスタン大学医療センターのジ エームスんラドセビッチ（Ｊａｍｅｓ　Ａ、Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ）博士から入 手した。また、その抗体はニューシャーシー州、ネジヤニツク・ステー７ョンに あるアフィニティー・バイオリージェンッ社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ＢｉｏＲｅａ ｇｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、）から市販されている。ｍＡｂ　４４３Ａ６の調製及び その活性が米国特許第４．８１６．４０２号明細書及びラドセビッチら著、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６：５８０８−５８１２　（１９８５）に更 に記載されている。抗体治療を受ける群２．３及び４に関して、ｍＡｂ　４４３ Ａ６５００μｇを腹水ｌ、Ｏｍｌに希釈し、１００μｌを静脈内注射し、一方、 ９００μｌを腹腔内注射した。

翌日、８日目に、１００　μｇの天然ＣＲＰまたはｍｃＲＰ　（実施例１、パー トＡ及びＢに記載されたようにして調製した）を動物に静脈内注射した。約９０ 分〜２時間後に、動物を犠牲にした。次いで腫瘍を切除し、対側肢骨格筋、肝臓 、肺臓、及び肺組織試ネ４を犠牲にした動物から切除した。

凍結組織切片を、組織の小さい試料、約０．５ｃｍ’を切開し、直ちにそれを正 方形のアルミニウム箔の上に溜めたポリビニルアルコール、ポリエステルグリコ ール、及びジメチルベンジルアンモニウムクロリドのゼラチン混合物中に浸漬す ることにより調製した。こうして形成されたカプセルをドライアイスで徐々に凍 結し、その後、箔を包装し、−８０℃で貯蔵した。

切出し前に、きれいなガラススライドを０．００５％のポリーＬ−リジン（脱イ オン水５００　ｍｌ中で希釈され、濾過されたもの）で被覆した。スライドをそ の濾過溶液中に１５分間浸漬し、除去し、使用または貯蔵の前に３０分間空気乾 燥させた。約８ミクロンの組織切片を被覆スライド上で回収し、室温で３０分間 空気乾燥させ、次いで一７０℃で貯蔵した。

染色のため、固着組織切片を有するガラススライドを室温に温め、次いで水道水 に２分間浸漬した。内在性ペルオキシダーゼ活性をマスクするため、水道水イン キュベーションに続いて１５分間にわたって０．０３％のＨ２０□−ＰＢＳ溶液 インキュベーションを行った。次いで組織切片を、天然ＣＲＰに特異的なビオチ ニル化ｍＡｂまたはにＲＰに特異的なビオチニル化ポリクローナル抗体と反応さ せ、ブロックし、上記の実施例２に記載されたようにして染色した。

染色パターンは、天然ＣＲＰに特異的なｍＡｂが天然ＣＲＰ注射を受けたＡ３４ ９腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスから切除した腫瘍組織切片と反応性で あることを示した。同様に、ｍｃＲＰに特異的なポリクローナル抗体はＩｎＣＲ Ｐ注射を受けたマウスから切除した腫瘍組織切片と反応性であった。天然ＣＲＰ を受けるマウスからの腫瘍組織は、ｍｃＲＰ特異的ポリクローナル抗体で探査さ れた場合にｍｌＲＰ反応性を示さなかった。また、天然ＣＲＰ反応性は、ＩＩＩ ＣＲＰを受けるマウスからの腫瘍組織中で検出されなかった。ビオチニル化抗体 は、肝臓組織を除いて宿主動物からのその他の切除組織（肺、肺臓、骨格筋）と 反応性ではなかった。しかしながら、肝臓組織との反応性は、肝臓中の内在性ビ オチンのために予想されなかった。要約すると、静脈内投与されたＣＲＰの特定 の形態（天然ＣＲＰまたはＩＩＩＣＲＰ）に相当する特定の抗原決定基は、普通 の免疫組織化学技術により容易に検出できるレベルで、先に樹立されたＡｓ２Ｏ 原発性腫瘍の柔組織に局在化した。

腫瘍組織切片を評価することに加えて、実施例２に記載されたようにしてサイト スピンスライドを調製することによりＡ３４９組織培養細胞を評価した。天然Ｃ ＲＰまたはｍｃＲＰ　（夫々、フルオレセインイソチオシアネートと接合された ）によるＡ３４９サイトスピンスライドのインキュベーションは、細胞への天然 ＣＲＰ及びｍＣＲＰの両方の直接結合を示した。更に、天然ＣＲＰまたはｍｃＲ ＰでインキュベートされたＡ３４９細胞は、夫々、ｍＡｂ　１．５．１０６及び ｍＡｂ　１３．３１１１２との抗体反応性を示した。

ルの使用 生体内の研究を行って、５−フルオロウラシルと組み合わせたｍＣＲＰてＰ３８ ８腫瘍を有する動物を治療する効果を測定した。

雌のＣＤ２−Ｆ、マウスにューヨーク、ジャーマンタウンにあるタコニック・フ ァームズ（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ）から入手したＢＡＬＢ／ｃ　Ｘ　ＤＢ Ａ／２　Ｆ、　ハイブリッド）を通常の実験室条件下で収容し、市販の実験室用 のげっ菌類食物（ブリナ（Ｐｕｒｉｎａ））を与えた。ハウジングを１２時間の 明暗サイクルで１８〜２２℃（６４〜７２’Ｆ）に保った。

全てのその他の条件をＧｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ 　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ刊行物Ｎｏ、　８６− ２３．１９８５年に改定）に記載されたようにして維持した。研究の目的のため に、動物を、下記の表５に示されるように、１０の群に分けた。

表５ 群＃　群中の動物　化学療法薬剤　＜ＲＰ　〆ＲＰ５　６　−　５０Ｍｇ　低イ オン 濃度のＰＢＳ ６　６　−　２００Ｍｇ　標準ＰＢＳ ７　６　５−ＦＬＩ　（２０ｎ＋ｇ／ｋｇ）　５０Ｍｇ　低イオン濃度のＰＢＳ ８　６　５−ＦＵ　（２０ｍｇ／ｋｇ）　２００　ｔｔｇ　標準ＰＢＳ９　６　 ５−ＦＵ　（１０ｍｇ／ｋｇ）　５０Ｍｇ　低イオン濃度のＰＢＳ ＋０　６　５−ＦＵ　（１０ｕ＋ｇ／ｋｇ）　２００　μｇ　標準ＰＢＳＰ３８ ８白血病細胞（メリーランド、ロックビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションから入手した）をＤＢＡ／２マウスにｌ　Ｘ　１０’の細胞の 腹腔内移植片として２回通過させた。２回目の通過後に、細胞をｌ　ｘ　１０’ １０．　ｌ　ｍｌの希釈腹水まで濃縮し、研究の１日目に、ＣＤ２−Ｆｌマウス に腹腔内注射した。

２種の投薬量の５−フルオロウラシル（“５−ＦＵ”）　（シグマ）を、５−Ｆ Ｕを滅菌蒸留水に１．　Ｏｍｇ／ｍｌ及び２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解するこ とにより調製した。表５に示されるように、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇまたは２ ０ｍｇの５−ＦＵを２〜６日目の朝に腹腔内注射した。夫々の動物に注射された ５−Ｆｕの容積は、それらの夫々の２日目の体重に基いていた。

２〜６日目の午後に、にＲＰを表５に示されるように群５〜ｌＯの動物に静脈内 注射した。ｍＣＲＰをイリノイ州、エバンストンにあるイムチック・インターナ ショナル社のローレンス・ポテンバ博士から入手し、以下のようにして調製した 。ＣＲＰを実施例１、バートＡに記載されたようにして調製した。ｍｃＲＰをつ くるため、１ｍｇ／ｎｌのＣＲＰを１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で３７℃で１時 間にわたって８Ｍの超純粋な尿素（シュワルツ−マン（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｍａ ｎｎ）　、スプリング・バレイ、ＮＹ）中でインキュベートした。尿素を、０． ０１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０−のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、４ ）による透析により除去した。

にＲＰを０．２０ミクロンのフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ））により滅 菌濾過した。

次いで濃度を、０．０１５Ｍの塩化ナトリウムを含むＩＭのリン酸ナトリウム緩 衝液、ｐＨ７、４で０．５ｍｇ／ｍｌに調節して０．１ｍｌの容積中の低投薬量 （５０μｇ）ｍｃＲＰ投与のための溶液を生成した。

滅菌濾過した可溶性ｍｃＲＰの一部を、塩化ナトリウムを添加して０．１５Ｍの ＮａＣｌの最終濃度を得ることにより生理イオン濃度に調節し、次いで水浴中で １５分間インキュベートした。このｍｃＲＰ製剤の大半は自己凝集して乳光液を 生成し、これを約５０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離してタンパク質を沈降さ せた。沈降したタンパク質を０．１５ＭのＮａＣ１を含む滅菌ｌ１０ｆｆ１のリ ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４中に再度懸濁させて２ｍｇ／ｍｌの最終濃度 を得た。このｍｃＲＰを０．１ｍｌの容積中の高投薬ｆＩＬ（２００μｇ）ｍＣ ＲＰ治療として投与した。

全ての動物の体重を、ＡＮＤエレクトロニック天秤（ＡＮＤ社、東京、日本）（ これは使用前に較正されていた）を使用して２日目及び６日目に記録した。全て の動物の体重は研究の２日目に１２．１ｇ　−１９，Ｏｇであった。

図５に示されるように、治療を受けない群ｌの平均体重は研究の６日目に１６， ８ｇであった。低投薬量及び高投薬量を受ける群２　（１５，２ｇ）の動物及び 群３（１６゜６ｇ）の動物の平均体重は未治療の対照動物と異なるとは考えられ なかった。ｎｃＲＰ５０ｕｇの投与（群５）は６日目に動物の平均体重を変化さ せなかった。同様に、＋＋）ＣＲＰ２００μｇの投与（群６）は６日目に体重の 変化により測定されるように毒性を示さなかった。

５−ＦＵ　２０ｍｇの投与（群４）は６日目に体重を２０％減少した。低投薬量 のｍｃＲＰの投与と理論最適投薬量の化学療法薬剤の組み合わせ（群７）は６日 目に体重を１０％減少した。高投薬量のｍｃＲＰとの組み合わせ治療（群８）は 、体重の１０％減少により測定されるように動物に対し毒性ではなかった。同様 に、高投薬量（群９）または低投薬量（群１０）のｍｃＲＰと準最適投薬量の５ −ＦＵの組み合わせ治療は、体重分析に基いて毒性を誘発しなかった。

対照群ｌの動物の平均寿命は２０日であった。低投薬量（群２）または高投薬量 （群３）緩衝液を投与された動物の寿命は、群ｌの対照の腫瘍を有するマウスと 異ならなかった。体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵの投与（群４）は 、腫瘍を有する動物の寿命を著しく変化させなかった。また、５０μｇ（群５） または　２００μｇ（群６）のｍＣＲＰの投与は、腫瘍を有する動物の寿命を変 化させなかった。

５０μｇのｆｆＩＣＲＰと組み合わせた２０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵの組み合わせ 治療（群７）は、動物の寿命を４０％短縮した。対照的に、２００μｇのｍｃＲ Ｐとの組み合わせ（群８）は、対照群に対して動物の寿命を変化させなかった。

しかしながら、５０μｇまたは２００／ｌＺｇのｍｃＲ＋”と体重１ｋｇ当たり １０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵの組み合わせ治療（群９及び１０）は、寿命を夫々１ ２８％及び１３３％増大した。

ｍｃＲＰ治療組み合わせ群（群８．９及び１０）からの１８匹の動物のうちの５ 匹の動物は、研究の終了まで生存した。また、５−ＦＵ治療群（群４）からの１ 匹の動物が研究の終了まで生存した。生存している動物中の白血病細胞の存在を 、３１１日目麻酔された動物の腹膜洗浄を行うことにより調べた。最初に、塩類 液を腹腔に注射し、抜取り、処理した。細胞カウントを行い、次いでサイトスピ ンスライドを調製した。サイトスピンスライドをヘマトキシリン及びエオシンで 染色し、評価した。次いで、生存している動物を米国獣医学協会ガイドラインに 従って犠牲にした。

腹膜洗浄細胞カウント及びサイトスピン評価の結果を、下記の表６に示す。３１ １日目で生存した動物からの腹膜細胞の試験は、群４中で生存している動物が“ ノー・テーク（ｎｏ　ｔａｋｅ）”であることを示した。これは腹腔中の白血病 細胞の不在に基いていた。白血病細胞は群８．９、及び１０からの生存している 動物の腹腔中に依然として存在していた。しカルながら、白血病細胞の数は、５ −ＦＵと組み合わせたｎｃＲＰの投与が腫瘍細胞増殖を抑制することを示した。

更に、ｍＣＲＰが腹膜中に通常見られる細胞の型を変化させないことを示す内在 性の核形成細胞の正常な補体があった。

腹膜洗浄サイトスピン製剤の試験 非白血病細胞カウント 白血病細胞カウント　（核形成） 製剤　相対値　絶対値　相対値　絶対値＃ 群４　ｌ好酸球　３．６　ｘ　１０’ ２マスト細胞 ４５中皮細胞 １好中球 群８　ｌ好酸球　０．８５　Ｘ　１０’２０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ　１２リンパ 球２リンパ球　０．１５　ｘ　１０’ ６２Ａ　９５　２．８１　Ｋ　１０”　３７クロフア一ジ群９ １０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ　５マクロフアージ　０．７８　ｘ　１０’５０７１ ｇのｍＣＲＰ　４８Ａ　８Ｂ　５．７２　ｘ　１０’　７好中球群１０　１リン パ球　０．０７　ｘ　１０’１０ｍｇ／ｋｇ　２マクロフアージ ２００　μｇのｗｃＲＰ　６６Ａ　９４　１．０９　ｘ　１０”　３中皮細胞３ ９Ａ　０７　１．．２６　ｘ　１０”　５７クロフアージ　０．０４　ｘ　１０ ”７好中球 相対細胞カウントに関して、ｎ−製剤当たり＋００の細胞合計カウント■へへへ −−００ （±・司書） ヨＳ工（Ｉ山田）尉：酊１１噂士 （士　回置） （（％）±ル丘０９ｒ（Ｊ百日Ｉ）尉２酊暴ｉト［Ｆ］ｎ寸のへ一〇 （±・届書） ヨＳ＋（＋山田）Ｍ＃８篇！シー士 （（％）±弔五ωＱ＋ｌ１７目日Ｌ）尉３１軒ＦＩＧ、５ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、 ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　フレスル　ジョン　ジェイアメリカ合衆国　イリノイ州　６０ ２０１　工ヴアシストン　イーストウッド　アベニュー　２６０２　アパートメ ント　１エフ（７２）発明者　アンダーソン　バイロン　イーアメリカ合衆国　 イリノイ州　６００５３　モートン　グローブ　リーバ　５８０１

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．医薬上許される担体中の有効量の修飾ＣＲＰを哺乳類に投与することを特徴 とする哺乳類の癌の治療方法。
2. ２．癌が腺癌である請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．有効量の修飾ＣＲＰを集合的に含む複数のリポソームを哺乳類に投与するこ とを特徴とする哺乳類の癌の治療方法。
4. ４．リポソームが単ラメラ小胞である請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．単ラメラ小胞がルペットである請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．修飾ＣＲＰをその他の薬剤と組み合わせて哺乳類に投与し、その組み合わせ が癌に対し有効であるように両方を充分な量で投与することを特徴とする哺乳類 の癌の治療方法。
7. ７．薬剤が細胞毒性薬剤である請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．細胞毒性薬剤が化学療法化合物である請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．化学療法化合物が５−フルオロウラシルである請求の範囲第８項に記載の方 法。
10. １０．修飾ＣＲＰを哺乳類に投与し、癌細胞に結合された修飾ＣＲＰを検出する ことを特徴とする哺乳類中の癌細胞の同定方法。
11. １１．修飾ＣＲＰを標識して、癌細胞に結合された場合にその検出を可能にする 請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．修飾ＣＲＰを特異的に結合する標識成分を哺乳類に投与して、癌細胞に結 合された修飾ＣＲＰの検出を可能にする請求の範囲第１０項に記載の方法。
13. １３．癌の治療用の医薬の製造のための修飾ＣＲＰの使用。
14. １４．癌の治療に使用するための修飾ＣＲＰを含むことを特徴とする組成物。
15. １５．癌を治療するための修飾ＣＲＰの使用。
16. １６．修飾ＣＲＰを含むことを特徴とする癌の治療用医薬。
17. １７．癌細胞を検出するための診断組成物の製造のための修飾ＣＲＰの使用。
18. １８．癌細胞の検出に使用するための修飾ＣＲＰを含むことを特徴とする組成物 。
19. １９．癌細胞を検出するための修飾ＣＲＰの使用。