WO2020122741A1 - Complejo micelar ternario formado por un sialoglicoesfingolípido, una sustancia terapéuticamente activa y un anticuerpo - Google Patents

Complejo micelar ternario formado por un sialoglicoesfingolípido, una sustancia terapéuticamente activa y un anticuerpo Download PDF

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antibodies
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Ariel Gustavo GARRO
Roxana Valeria ALASINO
Victoria Leonhard
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Consejo Nacional De Investigaciones Científicas Y Técnicas (Conicet)
Centro De Excelencia En Productos Y Procesos (Ceprecor)
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Definitions

  • the present invention belongs to the field of pharmaceutical compositions soluble in water for the administration of therapeutically active substances, where said compositions are of micelles coated with polypeptides that allow to efficiently administer the therapeutically active substance to a certain desired site of action.
  • liposomes can be targeted to the lung when coated with 0-stearoyl amylopectin and polyoxyethylene or monosialogangliosides (Deol P, Khuller GK. (1997) "Lung specific stealth liposomes: stability, biodistribution and toxicity of liposomai antitubercular drugs”. Biochim Biophys Acta vol.1334: 161-72).
  • pegylated liposomes have been incorporated on pegylated liposomes to give it directionality, among which we can mention folic acid, thiamine, peptides like Arginine-Glycine-Aspartic, sugars like galactose, antibodies and fragments of antibodies like anti-HER2, nucleic acid aptamers and proteins such as transferrin. These molecules allow targeting of the liposome, to the white tumor tissue and not to healthy cells. These molecules include antibodies, especially monoclonal antibodies that have been used to treat tumors such as the colon, ovary, prostate, etc.
  • immunoliposomes with anti-GD2 antibodies containing an anti-tumor drug such as fenretidine which induces apoptosis in neuroblastoma and melanoma cell lines, possess strong antineurotblastoma activity both in vitro and in vivo (Raffaghello L, Pagnan G, Pastorino F, et al. Immunoliposomal fenretinide: a novel antitumor drug for human neuroblastoma. Cancer Lett. 2003; 197: 151-155).
  • the IgG Fab fragment has also been used in immunoliposomes with disialogangliosides for inhibit the growth and metastasis of neuroblastomas in animal model.
  • Doxorubicin (Doxil) liposomes loaded with anti-HER2 monoclonal antibodies have a greater cytotoxic effect than those liposomes without the antibodies (Park JW, Kirpotin DB, Hong K, et al. Tumor targeting using anti-her2 immunoliposomes. J Control Release 2001; 74: 95-1 13) since they produce a greater inhibition of tumors that overexpress this receptor.
  • polymer nanoparticles as drug transporters
  • they have the advantage that they accumulate in the tumor area due to the increased permeability due to vasculature defects.
  • Another advantage is that the transport of drugs through these nanoparticles often includes a sustained release system that improves bioavailability and reduces systemic effects (Krasnici, S., Werner, A., Eichhorn, ME, Schmitt-Sody, M., Pahernik, SA, Sauer, B., Schulze, B., Teifel, M., Michaelis, U., Naujoks, K., and Dellian, M., Effect of the surface charge of liposomes on their uptake by angiogenic tumor vessels, International Journal of Cancer 105 (4), 561-567, 2003., - Lucarini, M., Franchi, P., Pedulli, GF, Pengo, P., Scrimin, P., and Pasquato, L, EPR study of dialkyl
  • the 2C5 monoclonal antibody is capable of binding to various types of cancer cells, by interacting with the cell surface to bind to nucleosomes released from neighboring cells that die by apoptosis.
  • the 2C5-Doxil complex being Doxil, liposomes loaded with Doxorubicin, recognizes and destroys various types of cancer cells such as those of the lung, breast and colon, more effectively than Doxil alone (Lukyanov AN, Elbayoumi TA, Chakilam AR, Torchilin VP. Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anti-cancer antibody. J Control Release. 2004; 100: 135-144).
  • Selective or site-specific therapy is one in which the drugs used act specifically on the target tissue, organ or cell.
  • This type of site-specific therapy allows the treatment to be more effective, and reduces unwanted side effects of a nonspecific type.
  • several strategies have been developed to achieve this goal, there is still a need to develop formulations that allow site-specific therapy for the treatment of cancer, especially in the case of solid tumors, for which drugs have more impediments. on reaching the specific destination (Poste, G.
  • the fact that the over-expression of antigens associated with different tumors, or of receptors that selectively capture specific molecules related to tumor growth, is highly advantageous.
  • This allows the targeting of drugs by nanoparticles with specific ligands, which recognize said antigens or receptors overexpressed in tumor cells.
  • the two properties of immunoglobulin are often combined, by specific recognition, and on the other, its biological activity per se, as is the case, for example, of Trastazumab (Herceptin®). It is a humanized monoclonal antibody that specifically binds to the HER2 / neu membrane region with very high affinity, inhibiting signal translation mechanisms as well as cell proliferation, which appears to be an excellent strategy for targeting drugs. due to the accessibility of the HER2.
  • Trastazumab was the first PDA-approved targeted therapy for the treatment of metastatic breast cancer, as first-line therapy in combination with Ptx, or as monotherapy for patients who have received at least one prior chemotherapy treatment (Vogel, CL , Cobleigh, MA, Tripathy, D., Gutheil, JC, Harris, LN, Fehrenbacher, L., Slamon, DJ, Murphy, M., Novotny, WF, Burchmore, M., Shak, S., Stewart, SJ, and Press, M. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2- overexpressing metastatic breas! Cancer, Journal of Clinical Oncology 20 (3), 719-726, 2002).
  • nanotransporters have been described in the state of the art, in the form of liposomes or micelles, which can be associated with antibodies to achieve a targeted delivery of active ingredients, such as the case of Ahn J et al, Antibody fragment-conjugated polymeric micelles incorporating platinum drugs for targeted therapy of pancreatic cancer; Biomaterials. 2015 Jan; 39: 23-30., Or Vladimir P. Torchilin et al, Immunomicelles: Targeted pharmaceutical carriers for poorly soluble e drugs. Proc Nati Acad Sel US A. 2003 May 13; 100 (10): 6039-6044.). While in These documents teach strategies to modify iiposomal or micellar structures to direct the delivery of a drug.
  • Cetuximab is a humanized monoclonal antibody directed against the epidermal growth factor receptor (EGFR) that was approved by the United States Food a nd Drug Administration (FDA) in 2004 for the treatment of colorectal cancer (Wong SF. Cetuximab: an epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of colorectal cancer. Clin Ther 2005; 27: 684-94). More recently Karin L.
  • ASM human serum albumin
  • cetuximab monoclonal antibodies
  • the particles obtained in this case show a size ranging between 200 and 250 nanometers
  • Talated human serum albumin nanoparticles for specific uptake in EGFR- Expressing colon carcinoma cells - Karin Lów, Matthias Wacker, Sylvia Wagner, Klaus Langer, Hagen von Briesen, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine (2011)
  • Theneted human serum albumin nanopart ⁇ cles for specific uptake in EGFR-Expressing colon carcinoma cells Karin Lów, Dipl.-Biol.a, Matthias Wacker, PhDb, Sylvia Wagner, PhDa, Klaus Langer, PhDc, Hagen von Briesen, PhDa, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine (2011).
  • both the transporters used liposomes or micelles functionalized with antibodies
  • the procedures used to incorporate the antibodies all have several different steps to reach the Ac-nanoparticle or Antibody-liposome or antibody-micelle complex, but The most important of these procedures is that, in all cases, the use of different chemical crosslinking agents to covalently or chemically conjugate the antibody to different parts of the nanoparticles used is mentioned.
  • crosslinking agents are an undesired condition in this type of coupling, since it is well known that these reagents can bind to specific groups such as amines (NH2) or carboxyls (COOH) in different places of the therapeutically active proteins or of the nanoparticles, and from here bind the antibodies, causing changes in the biological activity of antibodies (decreased activity) as well as in other proteins with biological activity such as enzymes.
  • NH2 amines
  • COOH carboxyls
  • micellar structures Although attempts have been detected to incorporate on the surface of micellar structures, loaded with therapeutically active substances, antibodies or fragments or variants thereof that allow targeting to a particular diseased tissue or organ, functionalization processes of the compounds are still required. structures of the micelles or the use of linkers that make the antibody / micelle interaction efficient.
  • the novelty and relevance of the incorporation of the antibodies on the ganglioside micelles described in this invention resides in that it is the first drug nanotransporter that can be coated non-covalently, without the need to derivatize or modify the components of the micelles to achieve interaction between the micelle and the antigen recognition polypeptide, such as antibodies
  • the aqueous solution soluble pharmaceutical composition comprises sialoglycosphingolipids; polypeptides selected from the set consisting of antibodies, fragments and variants thereof; at least one therapeutically active substance; forming a ternary micellar complex, sialoglycosphingolipid-Therapeutically active substance-Polypeptide, where said polypeptides are associated non-covalently with the micelles formed by said sialoglycosphingolipid and said therapeutically active substance. Where preferably said polypeptides coat said micelles.
  • sialoglycosphingolipids are selected from the group comprised of monosialogangliosides, disialogangliosides, trisialoganglioside, GM1, LIGA-GM1, GM2, GD1a, GD1 b GT1 and their mixtures.
  • said polypeptides are selected from the set comprised of polyclonal human antibodies, polyclonal humanized antibodies, monoclonal humanized antibodies, polyclonal antibodies of animal origin, monoclonal antibodies of animal origin, chimeric antibodies, fragments thereof and mixtures thereof.
  • said therapeutically active substance is selected from the group comprised of antitumor drugs, antifungal drugs, hydrophobic drugs, hydrophilic drugs, taxanes, paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, amphotericin, prostaglandins, isosorbide dinitrite, prostaglandins, propofol, isosorbide dinitrate, estradiol, vitamin E, cortisone, dexamethasone and its esters, and betamethasone valerate, preferably paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, and amphotericin; in a molar ratio of therapeutically active substance / sialoglycosphingolipid ranging from 1: 2 to 1: 100. And it comprises a molar ratio of therapeutically active substance / sialoglycosphingolipid ranging from 1: 2 to 1: 100.
  • the composition of the invention is sterile and translucent injectable, where said micellar complex has an average size of less than 100 nm, more preferably an average size of between 10 nm and 60 nm.
  • the pharmaceutical composition of the invention directs the administration of the therapeutically active substance towards the target of said antibody.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises said micellar complex in the absence of albumin, linkers, crosslinking agents and derivatized molecules.
  • said polypeptides which are antibodies, fragments or antibody variants, when they already form part of the ternary micellar complex, retain the ability to bind to their ligand. In other words, they maintain their natural biological activity.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition, soluble in aqueous solution comprising sialoglycosphingolipids and a therapeutically active substance, which form micelles with the ability to non-covalently bind antibodies on their surfaces, to form a ternary micellar complex, Sialoglycosphingolipid-Therapeutically Substance Active-Antibody.
  • Another object of the present invention is a process for obtaining the pharmaceutical composition soluble in aqueous solution, of the ternary micellar complex, Sialoglycosphingolipid-Therapeutically active substance-Antibody of the present invention, comprising the following steps:
  • a solvent solution preferably selected from the set comprising an organic solvent, dimethyl sulfoxide and ethanol, containing a therapeutically active substance
  • step (c) incubating the mixture of step (b) for the incorporation of said therapeutically active substance in the micelles;
  • step (d) dialyzing the micellar solution containing the therapeutically active substance from step (c) against a distilled water solution or a pharmaceutically acceptable solution having a pH of between 4 and 7, in order to remove the solvent;
  • step (e) incubating the micelles resulting from step (d) in the presence of said polypeptide at a pH of between 4 and 7.6, in order to allow the formation of the ternary complex Sialoglycosphingolipids-Therapeutically active substance-Polypeptide, where, preferably, the mass ratio between sialoglycosphingolipids and polypeptide is between 2: 1 and 6: 1 (w / w), and said incubation is carried out for a time between 1 and 2 hours at a temperature of at least 45 ° C; more preferably the pH of the micelles is in range comprised between pH 4 and 7 in which said micelles are heated at a temperature comprised between 45 and 65 ° C for 1 hour.
  • step (g) is performed to lyophilize the sterilized ternary micellar complex obtained in step (f).
  • step (h) is carried out, which consists of resuspending the lyophilisate from step (g) in a pharmaceutically acceptable solution at the time of use.
  • said polypeptides are selected from the set comprising polyclonal human antibodies, polyclonal humanized antibodies, humanized monoclonal antibodies, polyclonal antibodies of animal origin, monoclonal antibodies of animal origin, chimeric antibodies, fragments of them and their mixtures.
  • sialoglycosphingolipids are selected from the group comprised of monosialogangliosides, disialogangliosides, trisialoganglioside, GM1, LIGA-GM1, GM2, GD1a, GD1 b GT1 and their mixtures.
  • said therapeutically active substance is selected from the group comprised of antitumor drugs, antifungal drugs, hydrophobic drugs, hydrophilic drugs, taxanes, paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, amphotericin, prostaglandins, isosorbide dinitrite, prostaglandins, propofol, isosorbide dinitrate, estradiol, vitamin E, cortisone, dexamethasone and their esters, and betamethasone time in a molar ratio of therapeutically active substance / sialoglycosphingolipids ranging from 1: 2 to 1: 100.
  • the present invention comprises as therapeutically active substance docetaxel and as sialoglycosphingolipids: GM1, present in a docetaxel / GM1 molar ratio comprised between 1: 10 and 1: 100.
  • the method of the invention comprises as a therapeutically active substance between 0.1 mg / ml to 6 mg / ml of paclitaxel or docetaxel and between 200 and 300 mg / ml of sialoglycosphingolipids.
  • said therapeutically active substance comprises doxorubicin in a doxorubicin / sialoglycosphingolipid molar ratio comprised between 1: 2.5 and 1: 20.
  • Another object of the present invention is an aqueous solution soluble pharmaceutical composition, which is obtainable by said process of the present invention.
  • Another object of the present invention is an aqueous solution soluble pharmaceutical composition, characterized in that it is obtainable in step d) of said process of the present invention.
  • Another object of the present invention is a process for obtaining the aqueous solution soluble pharmaceutical composition of the present invention, comprising the following steps:
  • GM1 in acetic-acetate buffer solution or in a saline solution of pH 4.5, always above the critical micellar concentration, and let the solution stand for 24 hours;
  • Figure 1.A Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 and GM1 / Ptx micelles.
  • Figure 1.B Elution profile obtained by IgG size exclusion chromatography.
  • Figure 1.C Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 and GM1 / Ptx micelles incubated with IgG.
  • Figure 2 Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 micelles incubated with IgG at different pH.
  • Figure 3 Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 micelles incubated with IgG at different temperatures.
  • Figure 4 Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 micelles incubated with IgG at different times.
  • Figure 7 Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 micelles incubated with anti-Rub IgG antibodies.
  • Figure 7.B Native SDS-PAGE electrophoresis of elution aliquots 1 to 7 of the GM1-IgG anti-Rub sample (lane 2-8). Lane 1 corresponds to the IgG anti-Rub standard.
  • Figure 7.C Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 micelles incubated with anti-HBS IgG antibodies.
  • Figure 7.D Native SDS-PAGE electrophoresis of elution aliquots 1 to 7 of anti-HBS sample GM1-lgG (lane 2-8). Lane 1 corresponds to the IgG anti-HBS standard.
  • Figure 8.A Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1-IgG micelles incubated with different amounts of Albumin.
  • Figure 8.B SDS-PAGE electrophoresis (without 2-mercaptoethanol) of GM1 / IgG micelles incubated with different amounts of albumin (Alb.) At pH 4.5. Lanes 1 -2-for IgG and Alb standards; Lanes 3-10 for the fractions eluted from the size exclusion column a): GM1-IgG micelles with 2.2 mg.ml- 1 from Alb. B): GM1-IgG micelles with 4.4 mg.ml- 1 of Alb .. c): GM1-lgG micelles with 8.8 mg.ml-1 of Alb.
  • Figure 9.A Elution profiles obtained by size exclusion chromatography of GM1 and GM1 / Doxo micelles.
  • Figure 9.B Elution profile obtained by IgG size exclusion chromatography.
  • Figure 9.C Elution profiles obtained by micellar size exclusion chromatography of GM / lgG and GM1 / lgG / Doxo.
  • Figure 10.A Elution profiles obtained by micelle size exclusion chromatography of GM1 / lgG / Doxo (A) and GM1 / Doxo / lgG (B). Absorbance 280nm.
  • FIG. 10 Elution profiles obtained by micelle size exclusion chromatography of GM1 / IgG / Doxo (A) and GM1 / Doxo / IgG (B). Absorbance 490 nm.
  • Figure 1 1 Incorporation of IgG in GM1 micelles.
  • polypeptide refers to poiipeptides or proteins capable of directing the micelles specifically to a target tissue, organ or cell, for example, by recognizing a surface molecule present in said target tissue, organ or cell.
  • said polypeptide can be an immunoglobulin, an antibody or fragments thereof.
  • immunoglobulin antibody, Ac. and ig are used interchangeably and have the same meaning that is normally in the state of the art.
  • polypeptide of the present invention may be an immunoglobulin or fragments or variants thereof.
  • micellar structures made up of sialoglycosphingolipids and where said sialoglycosphingolipids can be selected from the group consisting of monosialogangliosides, disialogangliosides, trisiaiogangliosides and mixtures of these; where said micellar structure can contain a therapeutically active substance.
  • the present invention highlights four differences between the ternary micellar complex, the main object of the present invention, from other attempts taught in the state of the art, related to the incorporation of mono or polyclonal antibodies on ganglioside micelles and other structures (liposomes or nanoparticles) that may contain drugs inside.
  • the first difference to be highlighted is compared to those ganglioside micelles that are coated with serum proteins, for example, albumin, since the latter do not have the specific targeting capacity to the different types of tissues, as can be obtained by applying Mono or polyclonal specific antibodies to these ganglioside micelles as mentioned in the present invention.
  • serum proteins for example, albumin
  • a second difference is that the antibodies incorporated in the micelle are not covalently bound as in the other procedures where antibodies are incorporated on different nanoparticles using crosslinking agents that can affect both the antibody used and the nanoparticle.
  • crosslinking agents that can affect both the antibody used and the nanoparticle.
  • the use of these crosslinking agents is an undesired condition in this type of coupling, since they can produce changes in the biological activity of antibodies as well as in other proteins with biological activity, as previously mentioned.
  • a fourth difference lies in the size of the nanoparticles on which the antibodies are incorporated, generating complexes of a size between 10 and 60 nm.
  • the inventors of the present invention have developed a new formulation based on stable micellar structures of sialoglycosphigolipids that It overcomes the aforementioned problems, since they allow to incorporate non-covalently on its surface antibodies with the capacity to specifically retain these micelles in specific sites or tissues where they can release those drugs that can be incorporated into these micelles.
  • the present invention is related to a pharmaceutical composition, soluble in water, based on sialoglycosphingolipids, and a therapeutically active substance, which have the ability to non-covalently incorporate mono or polyclonal antibodies to perform a site-specific targeting of the micelle.
  • This combination of sialoglycosphingolipids, therapeutically active substance and antibody is ternary micellar complex.
  • the sialoglycosphingolipids comprised in the ternary micellar complex are selected from the group consisting of monosialogangliosides, disialogangliosides, trisialogangliosides, and mixtures thereof.
  • the monosialoganglioside is selected from the group consisting of GM1, GM1 called LIGA (GM1 in which a classical fatty acid of GM1 has been replaced by an acetyl group), and GM2 or a mixture thereof
  • disialogangliosides is selected from the group consisting of between GD1 a and GD1 b or a mixture thereof
  • the trisialoganglioside is selected from the group consisting of GT1 or a mixture thereof.
  • the therapeutically active substance comprised in the ternary micellar complex, sialoglycosphingolipids-therapeutically active substance-polypeptide is selected from the group consisting of antitumor drugs, antifungal drugs, hydrophobic drugs, hydrophilic drugs, taxanes, paclitaxel , docetaxel, doxorubicin, amphotericin, prostaglandins, isosorbide dinitrite, prostaglandins, propofol, isosorbide dinitrate, testosterone, nitroglycerin, estradiol, vitamin E, cortisone, dexamethasone, and their beta betamethasone drug
  • the antibodies comprised in the ternary micellar complex, which coat non-covalently associated are selected from the complex comprised of polyclonal human antibodies, polyclonal humanized antibodies, humanized monoclonal antibodies, polyclonal antibodies of animal origin, monoclonal antibodies of animal origin, chimeric antibodies, fragments of them and their mixtures.
  • the pharmaceutical composition soluble in aqueous solution, composed of water soluble gangliosides, comprising at least one compound selected from the sialoglycosphingolipids (mono-, di-, and tri-sialo gangliosides, GM, GD, or GT respectively), which form a micellar structure that has the ability to be coated with at least one biologically active mono or polyclonal antibody, or fragments or variants thereof, non-covalently linked to said micellar structure, and that may also contain a or various therapeutically active substances inside.
  • sialoglycosphingolipids mono-, di-, and tri-sialo gangliosides, GM, GD, or GT respectively
  • monosialogangliosides are selected from the group consisting of GM1, GM1 called LIGA (GM1 in which a classical fatty acid of GM1 has been replaced by an acetyl group), and GM2 or a mixture thereof
  • disialogangliosides is selected from the group consisting of between GD1a and GD1 b or a mixture thereof
  • the trisialoganglioside is selected from the group consisting of GT1 or a mixture thereof.
  • said active substance is selected from the group comprising antitumor drugs, antifungal drugs, hydrophobic drugs, hydrophilic drugs, taxanes, paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, amphotericin, prostaglandins, isosorbide dinitrite, prostaglandins, propofol, isosorbide dinitrate , testosterone, nitroglycerin, estradiol, vitamin E, cortisone, dexamethasone and their esters and betamethasone valerate
  • the antibodies that cover the surface of the micellar structure are selected from the complex comprised of polyclonal human antibodies, polyclonal humanized antibodies, monoclonal humanized antibodies, polyclonal antibodies of animal origin, monoclonal antibodies of animal origin, chimeric antibodies, fragments thereof and mixtures thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a sterile and translucent injectable composition.
  • sialoglyphosphingolipid micelles of the present invention when heated to temperatures of 55-60 ° C, undergo a change at the level of their polar head consisting of the extrusion of water molecules between the oligosaccharide chains, which leads to an increase in the hydrophobicity of the medium.
  • This increase in hydrophobicity is what allows the antibodies to be intercalated in the ganglioside micelle, by an interaction through its Fe fraction, that fraction of the immunoglobulin that does not have specific recognition, leaving the segment known as Fab presenting the biological activity of specific antigen recognition.
  • a relevant factor of this invention is that monosialo and disialoganglioside micelles or their mixtures with anticancer drugs such as Paclitaxel (Ptx) or Doxorubicin (Doxo), retain their ability to interact and incorporate mono or polyclonal immunoglobulins or antibodies on their surface by the procedure of the present invention previously mentioned. In this procedure, the hydrophobic interaction between the GM1 micelles and the immunoglobulins, occurs spontaneously and does not covalently, forming a new stable complex of micelle-antibody or micelle-drug-antibody.
  • anticancer drugs such as Paclitaxel (Ptx) or Doxorubicin (Doxo)
  • Said sialoglycosphingolipid-therapeutically active substance-polypeptide ternary complex has special properties due to the presence of said polypeptides (for example antibodies) on the surface, associated non-covalently, which allow concentrating said micelles loaded with the therapeutically active substance (for example: oncological) , specifically in the white tissue recognized by the selected antibody.
  • polypeptides for example antibodies
  • the therapeutically active substance for example: oncological
  • the monosialoganglioside, disialoganglioside and trisialoganglioside complexes or mixtures thereof, containing Ptx or Doxo can be coated with polyclonal, monoclonal antibodies or fragments thereof, which can be carried in humans directly into the bloodstream via injection , or by prior insertion into transfusion bags containing human albumin, complete human serum or complete human plasma.
  • a formulation that presents a transporter, or support, composed of micelles of sialoglycosphingolipids, more specifically by monosialo, disialos or trisialoglicoesfingol ⁇ pidos, or a mixture of them on top of their CMC, which allow incorporating non-covalent ligand binding polypeptides, such as antibodies, forming highly soluble complexes that may also contain hydrophobic drugs or highly cytotoxic.
  • the pharmaceutical composition of the invention is a composition adapted to be administered to a patient in an injectable, sterile and translucent composition.
  • the water soluble pharmaceutical composition of the invention is lyophilized.
  • the composition is reconstituted with a solvent selected from the group consisting of distilled water, saline (0.9% NaCl), saline phosphate buffer solution (PBS), distilled water containing 5% dextrose, and saline with 5% dextrose.
  • particular objects of the present invention are also a sterile, lyophilized, water-soluble pharmaceutical composition, which can be resuspended so that antitumor drugs such as Docetaxel (Dtx) or Ptx have a final concentration between 0.1 and 10 mg / ml, more preferably between 1 and 6 mg / ml; and even more preferably between 3 and 6 mg / ml.
  • antitumor drugs such as Docetaxel (Dtx) or Ptx have a final concentration between 0.1 and 10 mg / ml, more preferably between 1 and 6 mg / ml; and even more preferably between 3 and 6 mg / ml.
  • the micelle formulations contain on their surface therapeutically active proteins such as non-covalently bound mono or polyclonal antibodies, in a final concentration between 0.1 and 2 mg of antibodies for every 5 mg of sialoglycosphingolipid micelles.
  • therapeutically active proteins such as non-covalently bound mono or polyclonal antibodies
  • the ligand-binding polypeptide can have the function of directing and concentrating the sialoglycosphingolipid micelle, but it can also have therapeutic action, such as the case of Trastuzumab®.
  • the pH of the micelles is in the range of between 4 and 7.
  • the pH of the nanomycels is in the range of between 4 and 6.
  • the nanomycels have an average size of less than 100nm, more particularly, less than 50nm, preferably, between about 5nm and about 40nm and, even more preferably, between about 10nm and about 30nm.
  • the water soluble pharmaceutical composition comprises ganglioside nanomycels coated non-covalently with human serum immunoglobulins, polyclonal human serum immunoglobulins G, human monoclonal human immunoglobulins G (IgG), more preferably with G-type immunoglobulins (IgG) directed against specific antigens present on the surface of tumor cells, or endothelial cells. More particularly, they are covered with polyclonal or monoclonal G-type immunoglobulins (IgG), in a GM1: IgG mass ratio of between 2: 1 and 10: 1.
  • the water soluble pharmaceutical composition comprises coated ganglioside nanomycels, non-covalently associated with polyclonal human IgG-like immunoglobulins, or with humanized monoclonal IgG-type immunoglobulins directed against surface antigens of tumor or endothelial cells.
  • the water-soluble pharmaceutical composition of antibody-coated sialoglycosphingolipid micelles contains drugs such as Ptx or Dtx.
  • drugs such as Ptx or Dtx.
  • it comprises Ptx or Dtx in a drug: ganglioside molar ratio of between 1: 10 and 1: 100.
  • it comprises between 0.1 mg / ml and 6 mg / ml of Ptx or Dtx and between 4 mg / ml and between 200 and 300 mg / ml of glycosphingolipids.
  • the water soluble pharmaceutical composition of antibody coated ganglioside micelles of the present invention contains Doxo in a Doxo: ganglioside molar ratio of between 1: 1 and 1:50.
  • Another object of the present invention comprises a process for obtaining the aqueous solution soluble pharmaceutical composition of the present invention.
  • the loading of the therapeutically active substance to the micelles to obtain the pharmaceutical composition soluble in aqueous solution object of the present invention, can be carried out as described below:
  • the micelles obtained are incubated in the presence of a tenth of their volume (1/10 vol / vol) with organic solvents capable of dissolving the hydrophobic therapeutically active substance.
  • the samples are incubated at a temperature between 4 and 8 ° C for at least 4 hours.
  • the clear aqueous micelle formulation obtained above is incubated under two different experimental conditions.
  • the present invention also relates to a process for obtaining micelles coated superficially, non-covalently, by at least one polypeptide, more specifically antibodies directed against specific antigens, which may contain at least one therapeutically substance. active.
  • the procedure can be summarized as follows: (a) solubilize sialoglycosphingolipids, in lather solution or in a pH 4.5 saline solution, in a concentration higher than the critical micellar concentration, and heat at a temperature between 45 and 60 0C, for a time greater than 15 minutes and then let the solution stand to form micelles; (b) adding a solvent solution containing a therapeutically active substance; (c) incubating the mixture of step (b) for the incorporation of said therapeutically active substance in the micelles; (d) dialyzing the micellar solution containing the therapeutically active substance from step (c) against a distilled water solution or a pharmaceutically acceptable solution having a pH of between 4 and 7, in order to remove the solvent; (e)
  • monosialoganglioside GM1 or GM2 or disialogangliosides GD1 a and GD1 b or their mixtures are dissolved in distilled water by gentle agitation and then allowed to stand for a temperature between 4 and 8 ° C for at least 24 hours, then:
  • the micelles and the antibodies are incubated at pH 4.5 in a micelle / antibody ratio by weight between 1 / 0.25 and 1 / 0.5, and they are left to rest for 30 min. It is then heated at 45 ° C for a time interval between 30 and 60 minutes, in order to ensure the interaction and incorporation of the antibody into the micelle.
  • the GM1 micelle at pH 4.5 is heated at 60 ° C for 30 or 60 minutes and then the solution is allowed to cool. Then the antibodies are added in a weight ratio GM1-lgG 1 / 0.25 or 1 / 0.5 and let stand 1 hour. Finally, the material is passed through a molecular filtration column (Sephadex G200) in order to remove the immunoglobulin that has not been incorporated into the micelle.
  • a molecular filtration column Sephadex G200
  • PROCEDURE 1 Includes the following stages:
  • step (b) Incubate the product obtained in step (a) with the bioactive agent, in this case the mono or polyclonal antibodies as previously defined.
  • the bioactive agent in this case the mono or polyclonal antibodies as previously defined.
  • step (c) Filtration of the material obtained in step (b) through a molecular filtration column (Sephadex G2Q0) in order to remove IgG that has not been incorporated into the micelle.
  • a molecular filtration column Sephadex G2Q0
  • step (e) Dialyze the micellar solution obtained in step (d) against a solution of distilled water or a pharmaceutically acceptable solution that has a pH between 3 and 7, for 24 hours at a temperature between 4 and 8 ° C, to completely remove the organic solvent.
  • (i) Resuspend the lyophilized micelles in a pharmaceutically acceptable solution so that they can be administered in an intravenous injectable form for the treatment of the pathology in question.
  • the amount of the different therapeutically active substances incorporated (Ptx, Dtx, Doxo) and the concentration of the polypeptides in the ganglioside nanomycels can be determined using spectroscopic techniques or suitable chromatographic techniques, such as high pressure liquid chromatography (HPLC). or electrophoresis on polyacrylamide gels.
  • Exampleü Elution profile of SgG incorporated in GM1 micelles alone or previously loaded with Ptx per Sephadex G-200 column.
  • the samples were centrifuged at 15,000xg for 15 minutes and subjected to molecular filtration by means of a Sephadex G200 column to separate the GM1-Ptx-IgG complexes from the free IgGs.
  • the volume eluted through the column was collected in fractions of 1 ml each.
  • the elution profile of IgG incorporated in soluble form in the GM1 or GM1 / Ptx micelle was determined by absorbance at 280 nm against an IgG standard.
  • the GM1 micelle as well as GM1 / Ptx micelles do not possess absorbance at 280nm.
  • the increase in absorbance at 227nm in the collected 1-4 fractions of GM1 or GM1 / Ptx micelles coincides with the column elution volume (Vo) determined with Dextran Blue.
  • This profile shows that the Ptx elutes together with the micelle and that the complex corresponds to a MW greater than 250kDa (see Figure 1.A).
  • Figure 1 .B the increase in absorbance of fraction 5 to 9 corresponds to the MW of 150 kDa corresponding to an immunoglobulin.
  • Figure 1 .C shows a shift to the left in the 280nm elution profile of IgG incubated with GM1 or GM1 / Ptx micelles with respect to standard IgG, evidencing that there is an interaction between IgG incubated with micelles GM1 or GM1 / Ptx, as well as that the presence of charged Ptx in the micelle does not modify the interaction of IgG with it.
  • Example 2 Effect of pH on IgG incorporation on Ptx-loaded GM1 micelle.
  • the Ptx is loaded into the GM1 micelles in ratios as previously described in Example 1.
  • the incorporation of a fixed amount of IgG (10mg / ml) on the GM1 micelles loaded with Ptx is done at pHs 3.6 - 4,5 and 7, for 1 hour at 37 ° C.
  • the samples were centrifuged at 15,000xg for 15 minutes and subjected to molecular filtration on Sephadex G 200 separating the GM1-Ptx-IgG complexes from the free IgGs.
  • the pH of the medium influences the interaction between GM1 and IgG micelles.
  • the amount of IgG that appears forming the GM1-Ptx-lgG complex (fractions 1 -4) increases at acidic pH (4.5) with respect to neutral (7).
  • the formation of insoluble aggregates at pH ⁇ 4 does not allow elution through the column, demonstrating instability in the complexes formed or denaturation of IgG.
  • Fractions 1-4 correspond to column elution volume (Vo).
  • Fractions 5 to 9 correspond to the 150 kDa MW of immunoglobulin G (see Figure 2).
  • Example S Effect of temperature on IgG incorporation on Ptx-loaded monosialoganglioside micelles.
  • IgG incorporation of IgG to the micelles of example 1 was carried out at pH 4.5 for 1 hour at temperatures of 4, 25, 37 and 45 ° C. After incubation, the samples were centrifuged at 15,000xg for 15 minutes and subjected to molecular filtration on Sephadex G200 to separate the GM1-Ptx-IgG complexes from the free IgGs. Finally, the elution profile of the IgG incorporated in the micelle of GM1 was determined by absorbance at 280 nm against an IgG standard (5mg / ml).
  • Example 4 Effect of incubation time on IgG incorporation in GM1 / Ptx micelles.
  • IgG The incorporation of IgG (5 mg / ml) on the micelles obtained in Example 1 (20 mg / ml), was carried out by incubating the mixture at pH 4.5 and at a temperature of 45 ° C, at different times (see Figure 4 ). After incubation, the samples were centrifuged at 15.0Q0xg for 15 minutes and subjected to molecular filtration on Sephadex G 200 in order to separate the GM1-Ptx-IgG complexes from the free IgGs. The eluted volume was collected through the column in fractions of 1 ml each.
  • Example 5 Effect of temperature on the GM1 micelle in its capacity for IgG incorporation.
  • GM1 micelles (20mg / ml) in pH 4.5 buffer were heated at 45 ° C or 60 ° C for the time of 1 hour. They were left to stand until reaching room temperature (20 ° C). A fixed amount of IgG (5 mg / ml) was incorporated at a temperature at 20 ° C for 1 hour. Samples were centrifuged at 15,000xg for 15 minutes and molecular filtration was performed on Sephadex G 200 to separate GM1-IgG complexes from free IgGs. Finally, the elution profile of IgG incorporated in GM1 micelles preheated at the different temperatures was determined by absorbance at 280 nm against an IgG standard.
  • Example 6 Loading of Immunoglobuiins on the GM1 ganglioside micelles loaded with PacSitaxeS.
  • Example 7 Elution profile of the monocyonal antibodies Rubella and Anti-hepatitis B incorporated in GM1 micelles.
  • GM1 micelles (40mg / ml) in pH 4.5 buffer were heated at 55 ° C for 1 hour. They were then allowed to stand until room temperature (20 ° C) and the Ptx was then incorporated into the GM1 micelles following the procedure of Example 1.
  • the resulting GM1-Ptx micelles were incubated in the presence of a fixed amount of monoclonal antibody anti-rubella (Anti-Rub 7.5mg / ml) or anti-hepatitis b (Anti-HBS 1 Qmg / ml). Antibody controls alone were also incubated at pH 4.5 for 1 hour at 20 ° C. Then, the pH was again adjusted to 7 with NaOH.
  • the elution profile of the Anti-Rub or Anti-HBS monoclonal antibody with respect to the standard antibody occurs (see Figures 7.A and 7.C).
  • the mixtures elute in the first fractions (1-4) that corresponds to the elution volume (Vo) of the column (MW greater than 250kDa.).
  • Example 8 Determination of the biological activity of Sos monoclonal Anti-Rub and Anti-HBS antibodies incorporated in GM1 micelles loaded with Ptx.
  • Anti-Rub monoclonal antibodies anti-rubella
  • Anti-HBS anti hepatitis b
  • GM1 micelles GM1 micelles
  • the determination of immunogenic activity was carried out by "ECLIA” electro chemiluminescence immunoassay technique.
  • Anti-Rub the SIEMENS IMMULITE 2000 test was used, based on a quantitative two-step solid phase chemiluminescent immunoassay, commercially available for in vitro diagnostic use.
  • Antibodies (Anti-HBS) against hepatitis B surface antigen (HBsAg) were quantitatively determined by sandwich chemo luminescent immunoassay (ROCHE ELECSYS anti-HBs kit). Tables 1 and 2 show the results of the electro chemiluminescence assays (ECLIA) obtained for the Anti-Rub or Anti-HBs antibodies respectively, as well as the amounts (mg) of GM1 and antibodies used as the dilutions carried out for each case. . The tests were performed in duplicate. Table 1.
  • A IMMULITE 2000 test for the quantitative determination of IgG antibodies against rubella virus.
  • B ELECSYS anti-HBs test for the quantitative determination of IgG antibodies against the hepatitis B surface antigen.
  • Example 9 Regulation of the Presence of albumin in the incorporation of IgG in the GM1-Ptx micelle.
  • GM1 micelles (20mg / ml) in pH 4.5 buffer were heated at 55 ° C for 1 hour. They were left to stand until reaching room temperature (20 ° C). Ptx was incorporated in the ratio described in Example 1. Incorporation of a fixed amount of IgG (5 mg / ml) in the presence of increasing amounts of purified human serum albumin (2.2, 4.4, and 8.8 mg / ml) on the GM1 micelles (20 mg / ml), was performed by incubating the mixture at pH 4.5 and at a temperature of 20 ° C for 1 hour.
  • Example 10 Sephadex G-200 elution profile of Sas IgG incorporated in GM1 or GIV11-Doxorubicin micelles.
  • GM1 and GM1-Doxo micelles were prepared in acetic / acetate buffer pH 4.5, containing 20mg / ml GM1, and a Doxo-GM1 molar ratio of 1/10. These micelles were incubated in the presence of a fixed amount of human IgG (5mg / ml) for 1 hour at a temperature of 45 ° C. After incubation, the samples were centrifuged at 15,000xg for 15 minutes and filtered on Sephadex G 200 to separate the GM1-Doxo-IgG complexes from the free IgGs. The volume eluted from the column was collected in 1 ml fractions.
  • the elution profile of the IgG incorporated in soluble form in the GM1 or GMI / Doxo micelle was determined by measuring the absorbance at 280 nm against an IgG standard. Also, the elution profile at 490 nm corresponding to the maximum absorbance of Doxorubicin was determined.
  • Doxorubicin elutes from fraction 22 (see Figure 9. A); instead in the presence of GM1, it elutes together with the GM1 micelle in the first fractions (1-4), which corresponds to the exclusion volume of the column (Vo) determined with Dextran Blue.
  • the GM1 / Doxo complex shows similar absorbance maxima at 280 nm and 490 nm with a MW greater than 250 kDa.
  • Example 11 Effect of the order of incorporation of IgG and Doxorubicin in GM1 micelles.
  • GM1 micelles (10mg / ml) in pH 4.5 buffer were heated at 55 ° C for 1 hour. Then they were left to stand until reaching room temperature (20 ° C) and then IgG and Doxorubicin were incorporated according to the following procedure:
  • the amount of IgG that appears forming the GM1 / Doxo / IgG complex is increased when it is incorporated according to procedure (A), at the same time that a fraction of free Doxorubicin is observed (see Figures 10. A and 10. B). It was observed that when IgG is incorporated according to procedure (B) after incorporation of Doxorubicin, a displacement of IgG towards the free form occurs (fractions 5-9).
  • Example 12 Effect of temperature on Sa incorporation of IgG on disialoganglioside micelles (GD1).
  • GD1a and GD1a-Ptx micelles were prepared in acetic / acetate buffer pH 4.5, containing 20mg / ml GM1, and a 1/20 Ptx-GM1 molar ratio. Subsequently, they were incubated in the presence of increasing amounts of IgG (1, 25 - 2.5 - 5 and 10 mg / ml). The incorporation of IgG on the GDi-Ptx micelles was carried out at pH 4.5 for 1 hour, at two different temperatures, 25 ° C and 45 ° C.
  • the samples were centrifuged at 15,000xg for 15 minutes and subjected to molecular filtration on Sephadex G 200 in order to separate the GDi-Ptx-IgG complexes from the free IgGs.
  • the IgG incorporated into the GDi micelle was determined by absorbance at 280 nm against an IgG standard. At higher temperatures, the amount of IgG that appears forming the GDi-Ptx-lgG complex increased.

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Abstract

Una composición farmaceútica soluble en solución acuosa caracterizada porque comprende sialoglicoesfingolípidos; polipéptidos seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos, fragmentos y variantes de los mismos; al menos una sustancia terapéuticamente activa; conformando un complejo micelar ternario, sialoglicoesfingolípido-Sustancia terapéuticamente activa-Polipéptido, donde dichos polipéptidos están asociados en forma no covalente con las micelas conformadas por dicho sialoglicoesfingolípidos y dicha sustancia terapéuticamente activa.

Description

COMPLEJO MICELAR TERNARIO FORMADO POR UN SIALOGLICOESFINGOLÍPIDO,
UNA SUSTANCIA TERAPÉUTICAMENTE ACTIVA Y UN ANTICUERPO
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de las composiciones farmacéuticas solubles en agua para la administración de sustancias terapéuticamente activas, donde dichas composiciones son de micelas recubiertas con polipéptidos que permite administrar de manera eficiente la sustancia terapéuticamente activa a un determinado sitio de acción deseado.
Estado de la técnica
Uno de los puntos críticos de la quimioterapia, y particularmente de las oncológicas, es la llegada ai sitio de acción. En tal sentido, se han ensayado innumerables alternativas para lograr el direccionamiento específico. Por ejemplo, los liposomas pueden ser dirigidos hacia el pulmón cuando se recubren con 0- stearoil amilopectina y polioxietileno o monosialogangliósidos (Deol P, Khuller GK. (1997) “Lung specific stealth liposomes: stability, biodistribution and toxicity of liposomai antitubercular drugs”. Biochim Biophys Acta vol.1334:161-72). También con este mismo objetivo se han incorporado diversas moléculas sobre liposomas pegilados para darle direccionalidad, entre las que se puede mencionar el ácido fólico, la tiamina, péptidos como Arginina-Glicina-Aspártico, azúcares como la galactosa, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos como el anti-HER2, aptámeros de ácidos nucleicos y proteínas como la transferrina. Estas moléculas permiten direccionar el liposoma, al tejido tumoral blanco y no a células sanas. Entre estas moléculas se destacan los anticuerpos, especialmente los anticuerpos monoclonales que se han usado para el tratamiento de tumores tales como colon, ovario, próstata, etc. Recientemente se ha demostrado que inmunoliposomas con anticuerpos anti-GD2, conteniendo una droga antitumoral como la fenretidine la cual induce apoptosis en líneas celulares de neuroblastomas y melanomas, poseen una fuerte actividad antineurotblastoma tanto in vitro como ¡n vivo (Raffaghello L, Pagnan G, Pastorino F, et al. Immunoliposomal fenretinide: a novel antitumoral drug for human neuroblastoma. Cáncer Lett. 2003; 197:151 -155). El fragmento Fab de IgG también se ha usado en inmunoliposomas con disialogangliósidos para inhibir el crecimiento y metástasis de neuroblastomas en modelo animal. Por otra parte, liposomas de Doxorrubicina (Doxil) cargados con anticuerpos monoclonales anti HER2 presentan mayor efecto citotóxico que aquellos liposomas sin los anticuerpos (Park JW, Kirpotin DB, Hong K, et al. Tumor targeting using anti-her2 immunoliposomes. J Control Release. 2001 ; 74:95-1 13) ya que producen una mayor inhibición de los tumores que sobreexpresan este receptor.
Por otro lado, otra posibilidad para el delivery de fármacos es el uso de nanopartículas de polímeros como transportadores de fármacos, tienen la ventaja que se acumulan en la zona del tumor por el aumento de la permeabilidad dado por los defectos de la vasculatura. Otra ventaja es que el transporte de fármacos mediante estas nanopartículas muchas veces incluye un sistema de liberación sostenido que mejora la biodisponíbilidad y reduce los efectos sistémicos (Krasnici, S., Werner, A., Eichhorn, M. E., Schmitt-Sody, M., Pahernik, S. A., Sauer, B., Schulze, B., Teifel, M., Michaelis, U., Naujoks, K., and Dellian, M., Effect of the surface charge of liposomes on their uptake by angiogenic tumor vessels, International Journal of Cáncer 105 (4), 561-567, 2003., - Lucarini, M., Franchi, P., Pedulli, G. F., Pengo, P., Scrimin, P., and Pasquato, L, EPR study of dialkyl nitroxides as probes to investígate the exchange of solutes between the ligand shell of monolayers of protected gold nanoparticles and aqueous Solutions, Journal of the American Chemical Society 126 (30), 9326-9329, 2004). Sin embargo, poseen la gran desventaja de estas nanopartículas tienen una baja selectividad hacia las células cancerosas por lo que sigue existiendo una necesidad de desarrollar terapias sitio-específicas.
El anticuerpo monoclonal 2C5 es capaz de unirse a varios tipos de células cancerosas, mediante su interacción con la superficie celular para unirse a los nucleosomas liberados de las células vecinas que entran en muerte por apoptosis. El complejo 2C5-Doxil, siendo el Doxil, liposomas cargados con Doxorubicina, reconoce y destruye varios tipos de células cancerosas como las de pulmón, mama y colon, de forma más efectiva que el Doxil solo (Lukyanov AN, Elbayoumi TA, Chakilam AR, Torchilin VP. Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long- circulating liposomes modified with anti-cancer antibody. J Control Release. 2004; 100:135-144). La terapia selectiva o sitio-específica es aquella en la que ios fármacos usados actúan específicamente en el tejido, órgano o célula diana. Este tipo de terapia sitio-específica permite que el tratamiento sea más efectivo, y reduce los efectos colaterales indeseados de tipo inespecífico. Si bien se han desarrollado varias estrategias para alcanzar este objetivo, sigue existiendo actualmente la necesidad de desarrollar formulaciones que permitan una terapia sitio-específica para el tratamiento del cáncer, especialmente en el caso de los tumores sólidos, para los que los fármacos tienen más impedimentos en alcanzar el destino específico (Poste, G. and Kirsh, R., Site-specific (targeted) drug delivery in cancer- therapy, Bio-Technology 1 (10), 869-878, 1983, - Brigger, I., Dubernet, C., and Couvreur, P., Nanoparticles in cáncer therapy and diagnosis, Advanced Drug Delivery Reviews 54 (5), 631-651 , 2002).
Para conseguir este tipo de terapia es muy ventajoso el hecho de que se produce la sobre-expresión de antígenos asociados a los diferentes tumores, o de receptores que selectivamente captan moléculas específicas relacionadas al crecimiento tumoral. Ello permite el direccionamiento de fármacos mediante nanopartículas con ligandos específicos, que reconocen dichos antígenos o receptores sobre-expresados en las células tumorales. En el caso de los anticuerpos, muchas veces se combinan las dos propiedades de la ¡nmunoglobulina, por el reconocimiento específico, y por otro su actividad biológica per se, como es el caso, por ejemplo, del Trastazumab (Herceptin®). Se trata de un anticuerpo monoclonal humanizado que específicamente se une a la región de la membrana del HER2/neu con muy alta afinidad, inhibiendo los mecanismos de traducción de señal tanto como la proliferación celular, lo cual aparece como una excelente estrategia para direccionar los fármacos debido a la accesibilidad del HER2. El Trastazumab, fue la primera terapia dirigida aprobada por la PDA para el tratamiento del cáncer metastásico de mama, como tratamiento de primera línea en combinación con Ptx, o en monoterapia para pacientes que han recibido al menos un tratamiento de quimioterapia previo (Vogel, C.L., Cobleigh, M.A., Tripathy, D., Gutheil, J.C., Harris, L.N., Fehrenbacher, L., Slamon, D.J., Murphy, M., Novotny, W.F., Burchmore, M., Shak, S., Stewart, S.J., and Press, M. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2- overexpressing metastatic breas! cáncer, Journal of Clinical Oncology 20 (3), 719- 726, 2002).
Por otra parte, también se han descripto efectos antitumorales sinérgicos cuando el Trastazumab es administrado en combinación con otros agentes quimioterápicos como Paclitaxel y Doxorubicina, con reportes de respuesta favorable de hasta un 73% en tres ensayos fase II (Burstein, H. J., Harris, L. N., Gelman, R., Lester, S. C., Nunes, R. A., Kaelin, C. M., Parker, L. M., Ellisen, L. W., Kuter, I., Gadd, M. A., Christian, R. L, Kennedy, P. R., Borges, V. F., Bunnell, C. A., Younger, J., Smith, B. L., and Winer, E. P., Preoperative therapy with trastuzumab and paclitaxel followed by sequential adjuvant doxorubicin/cyclophosphamide for HER2 overexpressing stage II or III breast cáncer: A pilot study, Journal of Clinical Oncology 21 (1 ), 46-53, 2003 - Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., Shak, S., Fuchs, H., Patón, V., Bajamonde, A., Fleming, T., Eiermann, W., Wolter, J., Pegram, M., Baselga, J., and Norton, L., Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cáncer that overexpresses HER2, New England Journal of Medicine 344 (1 1 ), 783- 792, 2001 ; Coudert, B. P., Arnould, L, Moreau, L., Chollet, P., Weber, B., Vanlemmens, L, Molucon, C., Tubiana, N., Causeret, S., Misset, J. L, Feutray, S., Mery-Mignard, D., Garnier, J., and Fumoleau, P., Pre-operative systemic (neo- adjuvant) therapy with trastuzumab and docetaxel for HER2-overexpressing stage II or III breast cáncer: results of a multicenter phase II tria!, Annals of Oncology 17 (3), 409-414, 2006).
La incorporación de anticuerpos monoclonales específicos contra un determinado antígeno en la superficie de nanotransportadores podría lograr un doble efecto, por un lado, el del propio anticuerpo y por otro lado el efecto de los fármacos presentes en la nanoestructura.
Si bien se han descripto en el estado de la técnica nanotrasportadores, en forma de liposomas o micelas, los cuales pueden asociados con anticuerpos para lograr una entrega dirigida de principios activos, tal el caso de Ahn J et al, Antibody fragment-conjugated polymeric micelles incorporating platinum drugs for targeted therapy of pancreatic cáncer; Biomateríals. 2015 Jan; 39:23-30., o Vladimir P. Torchilin et al, Immunomicelles: Targeted pharmaceutical carriers for poorly solubl e drugs. Proc Nati Acad Sel U S A. 2003 May 13; 100(10): 6039-6044.). Si bien en estos documentos se enseñan estrategias para modificar estructuras iiposomales o micelares para dirigir la entrega de un fármaco, las estrategias implican la funcionalización de dichos transportadores con el fin de lograr una asociación entre la superficie del transportador y el anticuerpo. A modo de ejemplo, se cita la patente US6214388 (B1 ), de la Universidad de California, donde se describen inmunoliposomas que comprenden estructuras Iiposomales que presentan en su superficie anticuerpos los cuales se encuentran unidos a lípidos derivatizados con Polietilenglicol.
Otros ejemplos del estado de la técnica, que enseñan formas de asociar un anticuerpo a la superficie de una nanoparticula, pueden ser: Conjugación de Trastazumab, sobre nanoparticulas: Bingfeng Sun 1 , Heni Rachmawati 2, Yutao Liu 3, Jing Zhao 1 , Si-Shen Feng en el capiulo "Antibody-Conjugated Nanopartícles of Biodegradable Polymers for Targeted Drug Delivery” de! libro Bionanotechnology II: Global Prospects by E. Reisner David, August 2010. Otro ejemplo, Anti- CD8 unido a nanopaticulas de poliglicólico: Anti-CD8 conjugated nanopartícles to target mammalian cells expressing CD8 - A. Bicho, Inés N. Pee, a, A.C.A. Roque, M. Margarida Cardoso* - International Journal of Pharmaceutics 399 (2010) 80-86. También se puede citar el ejemplo del Cetuximab unido a nanoparticulas de albúmina. Cetuximab (Erbitux) es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidermal (epidermal growth factor receptor (EGFR)) que fue aprobado por la United States Food and Drug Administration (FDA) en 2004 para el tratamiento del cáncer colorrectal (Wong SF. Cetuximab: an epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of colorectal cáncer. Clin Ther 2005;27: 684-94). Más Recientemente Karin L. et al ha desarrollado nanoparticulas de albúmina sérica humana (ASM) acopladas a anticuerpos monoclonales como cetuximab. Las partículas obtenidas en este caso muestran un tamaño que oscila entre 200 and 250 nanometros (Targeted human serum albumin nanopartícles for specific uptake in EGFR- Expressing colon carcinoma cells, - Karin Lów, Matthias Wacker, Sylvia Wagner, Klaus Langer, Hagen von Briesen, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine (2011)) (Targeted human serum albumin nanopartícles for specific uptake in EGFR-Expressing colon carcinoma cells, Karin Lów, Dipl.-Biol.a, Matthias Wacker, PhDb, Sylvia Wagner, PhDa, Klaus Langer, PhDc, Hagen von Briesen, PhDa, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine (2011).
Como puede observarse en ios ejemplos mencionados tanto los transportadores empleados (liposomas o micelas funcionalizadas con anticuerpos) así los procedimientos utilizados para incorporar los anticuerpos, todos presentan varios pasos diferentes para llegar al complejo Ac-nanopartícula o Anticuerpo- liposoma o anticuerpo-micela, pero lo más importante de estos procedimientos resulta que, en todos los casos se menciona el uso de distintos agentes químicos entrecruzantes para unir en forma covalente o bien conjugando de manera química el anticuerpo a diferentes partes de las nanopartículas utilizadas.
El uso de estos agentes entrecruzantes es una condición no deseada en este tipo de acoplamientos, ya que es bien conocido que estos reactivos pueden unirse a grupos específicos como aminos (NH2) o carboxilos (COOH) en distintos lugares de las proteínas terapéuticamente activas o bien de las nanopartículas, y desde aquí unir a los anticuerpos pudiendo producir cambios en la actividad biológica de anticuerpos (disminución de la actividad) como así también en otras proteínas con actividad biológica como son las enzimas.
Si bien se han detectado intentos por incorporar sobre la superficie de estructuras micelares, cargadas con sustancias terapéuticamente activas, anticuerpos o fragmentos o variantes de estos que permitan el direccionamiento a un tejido u órgano enfermo particular, todavía se requiere de procesos de funcionalización de los compuestos estructurales de las micelas o bien del empleo de linkers que vuelvan eficiente la interacción anticuerpo/micela.
La novedad y relevancia de la incorporación de los anticuerpos sobre las micelas de gangliósidos descripto en esta invención reside en que es el primer nanotransportador de drogas que puede ser recubierto de forma no covalente, sin la necesidad de derivatizar o modificar los componentes de las micelas para lograr la interacción entre la micela y el polipéptido de reconocimiento de antígeno, tal como los anticuerpos
Breve descripción de la invención La composición farmacéutica soluble en solución acuosa, objeto de la presente invención, comprende sialoglicoesfingolípidos; polipéptidos seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos, fragmentos y variantes de los mismos; al menos una sustancia terapéuticamente activa; conformando un complejo micelar ternario, sialoglicoesfingolípido-Sustancia terapéuticemente activa-Polipéptido, donde dichos polipéptidos están asociados en forma no covalente con las micelas conformadas por dicho sialoglicoesfingolípidos y dicha sustancia terapéuticamente activa. Donde preferentemente dichos polipéptidos recubren dichas micelas. Donde dichos sialoglicoesfingolípidos son seleccionados del conjunto comprendido por monosialogangliósidos, disialogangliósidos, trisialogangliósido, GM1 , LIGA-GM1 , GM2, GD1a, GD1 b GT1y sus mezclas. Donde dichos polipéptidos son seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos humanos policlonales, anticuerpos humanizados policlonales, anticuerpos humanizados monoclonales, anticuerpos policlonales de origen animal, anticuerpos monoclonales de origen animal, anticuerpos quiméricos, fragmentos de ellos y sus mezclas. Donde dicha sustancia terapéuticamente activa es seleccionada del conjunto comprendido por drogas antitumorales, drogas antifúngicas, drogas hidrofóbicas, drogas hidrofílicas, taxanos, paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina, prostaglandinas, isosorbide dinitrito, prostaglandinas, propofol, dinitrato de isosorbide, testosterona, nitroglicerina, estradiol, vitamina E, cortisona, dexametasona y sus ésteres y el valerato de betametasona, preferentemente paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina y anfotericina; en una relación molar de sustancia terapéuticamente activa/ sialoglicoesfingolípidos que va entre 1 :2 y 1 : 100. Y comprende una relación molar de sustancia terapéuticamente activa/sialoglicoesfingolípidos que va entre 1 :2 y 1 :100.
Preferentemente la composición de la invención es inyectable estéril y translúcida, donde dicho complejo micelar posee un tamaño promedio menor que 100 nm, más preferentemente un tamaño promedio comprendido entre 10 nm y 60 nm. Además la composición farmacéutica de la invención dirige la administración de la sustancia terapeúticamente activa hacia el blanco de dicho anticuerpo. Además, la composición farmacéutica de la invención comprende dicho complejo micelar en ausencia de albúmina, linkers, agentes entrecruzantes y moléculas derivatizadas. Además en una versión preferida de la formulación de la presente invención, dichos poiipéptidos, que son anticuerpos, fragmentos o variantes de anticuerpos, cuando ya forman parte del complejo micelar ternario, conservan la capacidad de unión a su ligando. Es decir que mantienen su actividad biológica natural.
Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica, soluble en solución acuosa que comprende sialoglicoesfingolípidos y una sustancia terapéuticamente activa, que conforman micelas con la capacidad de unir no covalentemente anticuerpos sobre sus superficies, para formar un complejo micelar ternario, Sialoglicoesfingolípido-Sustancia terapéuticemente activa-Anticuerpo.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para obtener la composición farmacéutica soluble en solución acuosa, del complejo micelar ternario, Sialoglicoesfingolípido-Sustancia terapéuticemente activa-Anticuerpo de la presente invención, que comprende los siguientes pasos:
(a) solubilizar sialoglicoesfingolípidos, en solución tampón o en una solución salina de un pH 4,5, en una concentración superior a la concentración micelar crítica, y calentar a una temperatura de entre 45 y 60 0C, durante un tiempo mayor a 15 minutos y luego dejar reposar la solución para formar micelas;
(b) agregar una solución de solvente, preferentemente seleccionado del conjunto comprendido por un solvente orgánico, dimetilsulfóxido y etanol, conteniendo una sustancia terapéuticamente activa;
(c) incubar la mezcla del paso (b) para la incorporación de dicha sustancia terapéuticamente activa en las micelas;
(d) dializar la solución micelar conteniendo la sustancia terapéuticamente activa del paso (c) frente a una solución de agua destilada o una solución farmacéuticamente aceptable que tenga un pH comprendido entre 4 y 7, de manera de remover el solvente;
(e) incubar las micelas resultantes del paso (d) en presencia de dicho polipéptido a un pH de entre 4 y 7,6, de manera de permitir la formación del complejo ternario Sialoglicoesfingolípidos-Sustancia terapéuticamente activa- Polipéptido, donde, preferentemente, la relación másica entre sialoglicoesfingolípidos y polipétido es de entre 2:1 y 6:1 (p/p), y dicha incubación se lleva a cabo durante un tiempo comprendido entre 1 y 2 hs a una temperatura de al menos 45 °C; más preferentemente el pH de las micelas está en rango comprendido entre pH 4 y 7 en las que dichas micelas son calentadas a una temperatura comprendida entre 45 y 65 °C durante 1 hora.
Donde opcionalmente se realiza el paso (g) para liofilizar el complejo micelar ternario esterilizado obtenido en el paso (f). Y además, opcionalmente se realiza el paso (h) el que consiste en resuspender el liofilizado del paso (g) en una solución farmacéuticamente aceptable al momento de su uso.
Además, en el procedimiento de la invención, en una versión preferida, dichos polipéptidos son seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos humanos policlonales, anticuerpos humanizados policlonales, anticuerpos humanizados monoclonales, anticuerpos policlonales de origen animal, anticuerpos monoclonales de origen animal, anticuerpos quiméricos, fragmentos de ellos y sus mezclas. Así como dichos sialoglicoesfingolípidos son seleccionados del conjunto comprendido por monosialogangliósidos, disialogangliósidos, trisialogangliósido, GM1 , LIGA-GM1 , GM2, GD1a, GD1 b GT1 y sus mezclas. Y dicha sustancia terapéuticamente activa es seleccionada del conjunto comprendido por drogas antitumorales, drogas antifúngicas, drogas hidrofóbicas, drogas hidrofílicas, taxanos, paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina, prostaglandinas, isosorbide dinitrito, prostaglandinas, propofol, dinitrato de isosorbide, testosterona, nitroglicerina, estradiol, vitamina E, cortisona, dexametasona y sus ésteres y el va le rato de betametasona en una relación molar de sustancia terapéuticamente activa/sialoglicoesfingolípidos que va entre 1 :2 y 1 :100. Donde, en una alternativa de realización, la presente invención comprende como sustancia terapéuticamente activa docetaxel y como sialoglicoesfingolípidos: GM1 , presentes en una relación molar docetaxel/GM1 comprendida entre 1 : 10 y 1 : 100.
Y donde en otra realización prefererida de realización del procedimiento de la invención comprende como sustancia terapéuticamente activa entre 0,1 mg/ml a 6 mg/ml de paclitaxel o docetaxel y entre 200 y 300 mg/ml de sialoglicoesfingolípidos.
Y donde en otra alternativa de realización del procedimiento de la presente invención, dicha sustancia terapéuticamente activa comprende doxorubicina en una relación molar doxorrubicina/ sialoglicoesfingolípidos comprendida entre 1 :2,5 y 1 :20. Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica soluble en solución acuosa, que es obtenible mediante dicho procedimiento de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica soluble en solución acuosa, caracterizada porque es obtenible en el paso d) de dicho procedimiento de presente invención.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para obtener la composición farmacéutica soluble en solución acuosa, de la presente invención que comprende los siguientes pasos:
a- solubilizar sialoglicoesfingolípidos: GM1 en solución tampón acético- acetato o en una solución salina de un pH 4,5 siempre por sobre la concentración micelar crítica, y dejar reposar la solución por 24 hs;
b- calentar le solución de sialoglicoesfingolípidos a 60 °C durante 1 hora, y luego dejar enfriar a temperatura ambiente;
o- agregar una solución de IgG a pH 4,5 sobre la solución de micelas de GM1 a temperatura ambiente y dejar reposar por 2 horas;
d- agregar una solución de DMSO conteniendo paclitaxel o docetaxel; e- dializar para remover el solvente y fármaco no incorporado;
f- esterilizar esta solución por filtración en 0,2 um.;
g- liofilizar.
Descripción de las figuras:
Figura 1.A: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 y GM1/Ptx.
Figura 1.B: Perfil de elución obtenido mediante cromatografía de exclusión por tamaño de IgG.
Figura 1.C: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 y GM1/Ptx incubadas con IgG.
Figura 2: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 incubadas con IgG a diferentes pH.
Figura 3: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 incubadas con IgG a diferentes temperaturas. Figura 4: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 incubadas con IgG a diferentes tiempos.
Figura 5: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 incubadas con IgG en diferentes condiciones: ( -
) IgG sola, (-«-) Micelas de GM1 (20mg/ml) en tampón pH 4,5 fueron calentadas a 45°C y luego se incorporan las IgG , (-*-) Micelas de GM1 (20mg/ml) en tampón pH 4,5 fueron calentadas a 60°C , luego se dejan enfriar y se incorporan las IgG.
Figura 6. Micelas de GM1 incubadas con cantidades crecientes de IgG.
Figura 7. A: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 incubadas con anticuerpos IgG anti-Rub.
Figura 7.B: Electroforesis SDS-PAGE nativo de las alícuotas de elución 1 al 7 de la muestra GM1-lgG anti-Rub (carril 2-8). El carril 1 corresponde el estándar de IgG anti-Rub.
Figura 7.C: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 incubadas con anticuerpos IgG anti-HBS.
Figura 7.D: Electroforesis SDS-PAGE nativo de las alícuotas de elución 1 al 7 de la muestra GM1-lgG anti-HBS (carril 2-8). El carril 1 corresponde el estándar de IgG anti-HBS.
Figura 8.A: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1-lgG incubada con diferentes cantidades de Albúmina.
Figura 8.B: Electroforesis SDS-PAGE (sin 2-mercaptoetanol) de micelas GM1/lgG incubadas con diferentes cantidades de albúmina (Alb.) a pH 4,5. Los carriles 1 -2-para los estándares de IgG y Alb.; Carriles 3-10 para las fracciones eluídas de la columna de exclusión de tamaño a): micelas GM1 -lgG con 2,2 mg.ml- 1 de Alb.. b): micelas GM1-lgG con 4,4 mg.ml-1 de Alb.. c): micelas GM1-lgG con 8,8 mg.ml-1 de Alb.
Figura 9.A: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1 y GM1/Doxo.
Figura 9.B: Perfil de elución obtenido mediante cromatografía de exclusión por tamaño de IgG.
Figura 9.C: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM/lgG y GM1/lgG/Doxo. Figura 10.A: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1/lgG/Doxo (A) y GM1/Doxo/lgG (B). Absorbancia 280nm.
Figura 10. B: Perfiles de elución obtenidos mediante cromatografía de exclusión por tamaño de micelas de GM1/lgG/Doxo (A) y GM1/Doxo/lgG (B). Absorbancia 490 nm.
Figura 1 1 : Incorporación de IgG en micelas de GM1.
Descripción detallada de la presente invención
Definiciones
A efectos de la presente invención se definen los siguientes términos o expresiones:
Los términos “sustancia terapéuticamente activa”, “fármaco”, “principio activo”,“agente activo” y“sustancia bioactiva”, tienen el mismo significado y se usan indistintamente.
En la presente invención, ia expresión: polipéptido hace referencia a poiipéptidos o proteínas capaces de direccionar las micelas específicamente a un tejido, órgano o célula diana, por ejemplo, al reconocer una molécula de superficie presente en dicho tejido, órgano o célula diana. Particularmente, dicho polipéptido puede ser una inmunoglobulina, un anticuerpo o fragmentos de estos.
Los términos inmunoglobulina, anticuerpo, Ac. e íg se usan indistintamente y tiene el mismo significado que es el que normalmente tienen en el estado de la técnica. En la presente invención el“polipéptido” de la presente invención puede ser una inmunoglobulina o fragmentos o variantes de esta.
Los términos micelas o nanomicelas, se emplean indistintamente y se refieren a estructuras micelares conformadas por sialoglicoesfingolípidos y donde dichos sialoglicoesfingolípidos pueden ser seleccionados del conjunto comprendido por monosialogangliósidos, disialogangliósidos, trisiaiogangliósidos y mezcla de estos; donde dicha estructura micelar puede contener una sustancia terapéuticamente activa.
La presente invención destaca cuatro diferencias entre el complejo micelar ternario, objeto principal de la presente invención, de otros intentos enseñados en el estado de la técnica, relacionados a la incorporación de anticuerpos mono o policlonaies sobre micelas de gangliósidos y otras estructuras (liposomas o nanopartículas) que pueden contener fármacos en su interior. La primera diferencia a resaltar es frente a aquellas micelas de gangliósidos que se encuentran recubiertas con proteínas del suero, por ejemplo, albúmina, dado que éstas últimas no tienen la capacidad de direccionamiento específico a los distintos tipos de tejidos como puede obtenerse mediante la aplicación de anticuerpos específicos mono o policlonaies sobre estas micelas de gangliósidos tal como se menciona en la presente invención. Particularmente en esta solicitud se describe una serie de procedimientos que se aplican sobre la micela de gangliósidos, o bien sobre los anticuerpos, que permiten la incorporación de los mismos de forma estable sobre las micelas de gangliósidos.
Una segunda diferencia es que los anticuerpos incorporados en la micela no están unidos covalentemente como ocurre en los otros procedimientos en donde se incorporan anticuerpos sobre distintas nanopartículas utilizando agentes entrecruzantes que pueden afectar tanto al anticuerpo empleado como a la nanopartícula. El uso de estos agentes entrecruzantes es una condición no deseada en este tipo de acoplamientos, ya que pueden producir cambios tanto en la actividad biológica de anticuerpos como así también en otras proteínas con actividad biológica, tal como se mencionó anteriormente.
Otra diferencia es la baja complejidad de los procedimientos involucrados para la obtención de dicho complejo. Como puede observarse en los antecedentes del estado de la técnica mencionados sobre los procedimientos utilizados para incorporar los anticuerpos, todos presentan varios pasos diferentes para llegar la complejo Ac-nanopartícula, pero lo más importante de estos procedimientos resulta que, en todos los casos, se menciona el uso de distintos agentes químicos entrecruzantes para unir en forma covalente el anticuerpo a diferentes partes de las nanopartículas utilizadas.
Finalmente, una cuarta diferencia radica en el tamaño de las nanopartículas sobre las cuales se incorporan los anticuerpos generando complejos de un tamaño comprendido entre 10 y 60 nm.
Los inventores de la presente invención han desarrollado una nueva formulación en base a estructuras micelares estables de sialoglicoesfigolípidos que supera ios problemas mencionados anteriormente, ya que permiten incorporar de forma no covalente en su superficie anticuerpos con capacidad para retener de manera específica estas micelas en sitios o tejidos específicos donde puedan liberar aquellos fármacos que pueden ser incorporados en estas micelas.
La presente invención es relativa a una composición farmacéutica, solubles en agua, basada en sialoglicoesfingolípidos, y una sustancia terapéuticamente activa, que tienen la capacidad de incorporar de forma no covalente anticuerpos mono o policlonales para realizar un direccionamiento sitio específico de la micela, Esta combinación de sialoglicoesfingolípidos, sustancia terapéuticamente activa y anticuerpo se denomina complejo micelar ternario.
En una forma de realización de la presente invención, los sialoglicoesfingolípidos comprendidos en el complejo micelar ternario son seleccionados del conjunto comprendido por monosialogangliósidos, disialogangliósidos, trisialogangliósidos y mezcla de estos. En una forma de realización más preferida, los monosialogangliósido se seleccionan del grupo que consiste en GM1 , GM1 denominado LIGA (GM1 en el que se ha reemplazado un ácido graso clásico del GM1 por un grupo acetilo) y GM2 o una mezcla de los mismos, los disialogangliósidos se selecciona del grupo que consiste en entre GD1 a y GD1 b o una mezcla de los mismos; y el trisialogangliósido se selecciona del conjunto comprendido por GT1 o una mezcla de los mismos.
En otra forma de realización de la presente invención, la sustancia terapéuticamente activa comprendida en el complejo micelar ternario, sialoglicoesfingolípidos-sustancia terapéuticamente activa-polipéptido, es seleccionada del conjunto comprendido por drogas antitumorales, drogas antifúngicas, drogas hidrofóbicas, drogas hidrofílicas, taxanos, paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina, prostaglandinas, isosorbide dinitrito, prostaglandinas, propofol, dinitrato de isosorbide, testosterona, nitroglicerina, estradiol, vitamina E, cortisona, dexametasona y sus éste res y el va le rato de betametasona
En otra forma de realización de la presente invención, los anticuerpos comprendidos en el complejo micelar ternario, que recubren asociados no covalentemente, la estructura micelar son seleccionados del complejo comprendido por anticuerpos humanos policlonales, anticuerpos humanizados policlonales, anticuerpos humanizados monoclonales, anticuerpos policlonales de origen animal, anticuerpos monoclonales de origen animal, anticuerpos quiméricos, fragmentos de ellos y sus mezclas.
En otra forma de realización preferida, la composición farmacéutica, soluble en solución acuosa, compuesta por gangliósidos solubles en agua, que comprenden al menos un compuesto seleccionado entre los sialoglicoesfingolípidos (mono-, di- y tri-sialo gangliósidos, GM, GD o GT respectivamente), que forman una estructura micelar que tiene la capacidad de ser recubierta con al menos un anticuerpo mono o policlonal, o fragmentos o variantes de estos, biológicamente activo, unida de forma no covalente a dicha estructura micelar, y que además puede contener una o varias sustancias terapéuticamente activas en su interior. En una forma de realización más preferida, los monosialogangliósidos se seleccionan del grupo que consiste en GM1 , GM1 denominado LIGA (GM1 en el que se ha reemplazado un ácido graso clásico del GM1 por un grupo acetilo) y GM2 o una mezcla de los mismos, los disialogangliósidos se selecciona del grupo que consiste en entre GD1a y GD1 b o una mezcla de los mismos; y el trisialogangliósido se selecciona del conjunto comprendido por GT1 o una mezcla de los mismos. En otra forma de realización preferida, dicha sustancia activa es seleccionada del conjunto comprendido por drogas antitumorales, drogas antifúngicas, drogas hidrofóbicas, drogas hidrofílicas, taxanos, paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina, prostaglandinas, isosorbide dinitrito, prostaglandinas, propofol, dinitrato de isosorbide, testosterona, nitroglicerina, estradiol, vitamina E, cortisona, dexametasona y sus éste res y el valerato de betametasona En otra forma de realización más preferida, los anticuerpos que recubren la superficie de la estructura micelar son seleccionados del complejo comprendido por anticuerpos humanos policlonales, anticuerpos humanizados policlonales, anticuerpos humanizados monoclonales, anticuerpos policlonales de origen animal, anticuerpos monoclonales de origen animal, anticuerpos quiméricos, fragmentos de ellos y sus mezclas.
En otra forma de realización preferida, la composición farmacéutica de la presente invención es una composición inyectable estéril y translúcida.
Las micelas de sialoglicoesfingolípidos de la presente invención, al ser calentadas a temperaturas de 55-60°C, sufren un cambio a nivel de su cabeza polar que consiste en la extrusión de moléculas de agua entre las cadenas de oligosacáridos, lo que conlleva el incremento en la hidrofobicidad del medio. Este incremento de hidrofobicidad es lo que permite que los anticuerpos puedan intercalarse en la micela de gangliósidos, haciéndolo por una interacción a través de su fracción Fe, aquella fracción de la ¡nmunoglobulina que no posee reconocimiento específico, dejando en la superficie el segmento conocido como Fab que presenta la actividad biológica de reconocimiento de antígeno específico.
Un factor relevante de esta invención es que las micelas de monosialo y disialogangliósidos o sus mezclas con fármacos anticancerígenos como Paclitaxel (Ptx) o Doxorrubicina (Doxo), conservan su capacidad parta ¡nteraccionar e incorporar en su superficie las inmunoglobulinas o anticuerpos mono o policlonales mediante el procedimiento de la presente invención mencionado previamente. En este procedimiento, la interacción hidrofóbica entre las micelas de GM1 y las inmunoglobulinas, se produce de forma espontánea y no cova lente, formando un nuevo complejo estable de micela-anticuerpo o micela-fármacos-anticuerpo. Dicho complejo ternario sialoglicoesfingolípidos-sustancia terapéuticamente activa- polipéptido presenta propiedades especiales debidas a la presencia de dichos polipéptidos (por ejemplo anticuerpos) en la superficie, asociados no covalentemente, que permiten concentrar dichas micelas cargadas con la sustancia terapéuticamente activa (por ejemplo: oncológicos), específicamente en el tejido blanco reconocido por el anticuerpo seleccionado.
En una forma de realización, los complejos de monosialogangliósidos, disialogangliósidos y trisialogangliósidos o sus mezclas, conteniendo Ptx o Doxo, pueden ser recubiertas con anticuerpos policlonales, monoclonales o fragmentos de estos, las cuales pueden ser vehiculizados en humanos directamente en el torrente sanguíneo vía inyección, o bien mediante su inserción previa en bolsas de transfusión conteniendo albúmina humana, suero humano completo o bien plasma humano completo.
La extremadamente baja CMC de los gangliósidos (10 8Ί0 9 M), sumado a la ya mencionada estabilización dada por la carga de los principios activos en la estructura, permitiría un mayor tiempo de vida media en circulación.
Es por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención, una formulación que presenta un transportador, o soporte, compuesto por micelas de sialoglicoesfingolípidos, más específicamente por monosialo, disialos o trisialoglicoesfingolípidos, o una mezcla de ellos por sobre su CMC, que permiten incorporar polipéptidos de unión a ligando de forma no covalente, como son los anticuerpos, formando complejos altamente solubles que además pueden contener fármacos hidrofóbicos o altamente citotóxicos.
En otra forma de realización preferida, la composición farmacéutica de la invención es una composición adaptada para ser administrada a un paciente en inyectable, estéril y translúcida. De manera particular, la composición farmacéutica soluble en agua de la invención está liofilizada. En ese caso, la composición es reconstituida con un solvente seleccionado del grupo que consiste en agua destilada, solución salina (NaCI 0,9%), solución íampón de fosfato salino (PBS), agua destilada conteniendo 5% de dextrosa y solución salina con 5% de dextrosa. Así, son también objetos particulares de la presente invención, una composición farmacéutica liofilizada, soluble en agua y estéril, que puede ser resuspendida de modo que los fármacos antitumorales como Docetaxel (Dtx) o Ptx tengan una concentración final comprendida entre 0,1 y 10 mg/ml, más preferiblemente entre 1 y 6 mg/ml; y aún más preferiblemente entre 3 y 6 mg/ml.
También es objeto de la presente invención que las formulaciones de micelas contengan en su superficie proteínas terapéuticamente activas como son los anticuerpos mono o policlonales unidos de forma no covalente, en una concentración final comprendida entre 0,1 y 2 mg de anticuerpos por cada 5 mg de micela de sialoglicoesfingolípidos. Por lo antes mencionado, es de destacar que el polipéptido de unión al ligando puede tener como función el dirigir y concentrar la micela de sialoglicoesfingolípidos, pero también puede tener acción terapéutica, tal es el caso del Trastuzumab®.
Más preferentemente aún, el pH de las micelas está comprendido en el rango de entre de 4 y 7. En una realización todavía más preferida, el pH de las nanomicelas está comprendido en el rango de entre 4 y 6.
Particularmente, en las composiciones farmacéuticas solubles de la invención, las nanomicelas poseen un tamaño promedio menor que 100 nm, más particularmente aún, menor que 50 nm, de preferencia, entre alrededor de 5 nm y alrededor de 40 nm y, todavía más preferentemente, entre alrededor de 10 nm y alrededor de 30 nm. En una realización particularmente preferida de la invención, la composición farmacéutica soluble en agua comprende nanomicelas de gangliósidos cubiertas en forma no-covalente con inmunoglobulinas sérica humana, inmunoglobulinas G (IgG) séricas humanas policlonales, inmunoglobulinas G (IgG) séricas humanizadas monoclonales, más preferentemente con inmunoglobulinas tipo G (IgG) dirigidas contra antígenos específicos presentes en la superficie de células tumorales, o de células endoteliales. Más particularmente aún, están cubiertas con inmunoglobulinas tipo G (IgG) policlonal o monoclonal, en una relación de masa GM1 : IgG comprendida entre 2:1 y 10:1.
En una realización particularmente preferida de la invención, la composición farmacéutica soluble en agua comprende nanomicelas de gangliósidos recubiertas, asociadas de forma no-covalente, con inmunoglobulinas humanas tipo IgG policlonales, o bien con inmunoglobulinas tipo IgG monoclonales humanizadas, dirigidas contra antígenos de superficie de células tumorales o endoteliales.
En realizaciones preferidas de la invención, la composición farmacéutica soluble en agua de micelas de sialoglicoesfingolípidos recubiertas con anticuerpos, contenga fármacos como Ptx o Dtx. De preferencia, comprende Ptx o Dtx en una relación molar fármaco: gangliósidos de entre 1 :10 y 1 :100. Más preferentemente aún, comprende entre 0,1 mg/ml y 6 mg/ml de Ptx o Dtx y entre 4 mg/ml y entre 200 y 300 mg/ml de glicoesfingolípidos.
En otra realización particular, la composición farmacéutica soluble en agua de micelas de gangliósidos recubiertas con anticuerpos de la presente invención, contenga Doxo en una relación molar Doxo: gangliósido comprendida entre 1 :1 y 1 :50.
En otra realización particularmente preferida, la composición farmacéutica soluble en agua de micelas de gangliósidos recubiertas, de manera no covalente, con anticuerpos de la presente invención que contiene al menos dos sustancias terapéuticamente activas, donde una de ellas es Doxo, donde la segunda se selecciona entre Ptx y Dtx en una relación molar para cada una de las drogas, droga: gangliósido comprendida entre 1 :10 y de 1 :100.
Otro objeto de la presente invención comprende un procedimiento para obtener la composición farmacéutica soluble en solución acuosa de la presente invención. En lo que respecta a la carga de la sustancia terapéuticamente activa a las micelas, para la obtención la composición farmacéutica soluble en solución acuosa objeto de la presente invención, se lo puede realizar como se describe a continuación: Las micelas obtenidas se incuban en presencia de un décimo de su volumen (1/10 vol/vol) con solventes orgánicos capaces de disolver la sustancia terapéuticamente activa hidrofóbica. Las muestras son incubadas a una temperatura entre 4 y 8 °C durante, al menos, 4hs. A continuación, el solvente orgánico se elimina de la preparación de las micelas obtenidas mediante un proceso de diálisis y finalmente se centrifuga entre 15.000 y SO.OOOxg durante 15 minutos con el fin de remover la sustancia terapéuticamente activa que no hubieran sido incorporados en las micelas. La formulación acuosa transparente de micelas obtenidas anteriormente es incubada bajo dos condiciones experimentales diferentes.
En el caso específico de la carga de las inmunoglobulinas, resulta necesario introducir una serie de modificaciones en el medio de incubación de las micelas con las IgG, para que pueda ocurrir la asociación de las mismas a la estructura micelar, ya que, en condiciones clásicas de pH y temperatura, las inmunoglobulinas no se incorporan a las micelas de gangliósidos. En tal sentido, para obtener la máxima incorporación de las IgG en las micelas el sistema debe ser incubado a pH ácido, preferentemente a pH 4,5, donde las IgG incrementan la exposición de sus dominios hidrofóbicos, además es necesario que la incubación se haga a una temperatura comprendida entre 40 y 65°C. En el caso del efecto de la temperatura se puede realizar de dos formas: (1 )- incubando el anticuerpo y las micelas, por ejemplo, de GM1 , a 45 °C, lo que favorece la incorporación de las IgG en las micelas, sin afectar esencialmente la actividad de los anticuerpos y (2) Se realiza solamente el calentamiento de las micelas de sialoglicoesfingolípidos a 65°C, luego se deja enfriar la solución y finalmente se incorporan los anticuerpos a temperatura ambiente, manteniendo el pH 4,5.
Así, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de micelas recubiertas superficialmente, de manera no covalentemente, por al menos un polipéptido, más específicamente anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos, las cuales pueden contener en su interior al menos una sustancia terapéuticamente activa. En una forma de realización preferida, el procedimiento puede ser resumido de la siguiente manera: (a) solubilizar sialoglicoesfingolípidos, en solución lampón o en una solución salina de un pH 4,5, en una concentración superior a la concentración micelar crítica, y calentar a una temperatura de entre 45 y 60 0C, durante un tiempo mayor a 15 minutos y luego dejar reposar la solución para formar micelas; (b) agregar una solución de solvente conteniendo una sustancia terapéuticamente activa; (c) incubar la mezcla del paso (b) para la incorporación de dicha sustancia terapéuticamente activa en las micelas; (d) dializar la solución micelar conteniendo la sustancia terapéuticamente activa del paso (c) frente a una solución de agua destilada o una solución farmacéuticamente aceptable que tenga un pH comprendido entre 4 y 7, de manera de remover el solvente; (e) incubar las micelas resultantes del paso (d) en presencia de dicho polipéptido a un pH de entre 4 y 7,6, de manera de permitir la formación del complejo ternario Sialoglicoesfingolípidos-Sustancia terapéuticamente activa-Polipéptido; (f) esterilizar la solución acuosa y transparente obtenida de la etapa anterior. En una forma de realización más preferida, el procedimiento para obtener la composición farmacéutica soluble en solución acuosa de la presente invención, comprende además un paso de liofilización del complejo micelar ternario esterilizado obtenido en el paso (f).
A continuación, se describen formas alternativas de lograr la asociación no covalente entre la micela y el polipéptido: el monosialogangliósido GM1 o GM2, o los disialogangliósidos GD1 a y GD1 b o sus mezclas se disuelven en agua destilada mediante una suave agitación y luego se deja reposar a una temperatura entre 4 y 8 °C durante, al menos, 24hs, luego:
1- Las micelas y los anticuerpos son incubados a pH 4,5 en una proporción micela/anticuerpo en peso comprendida entre 1/0,25 y 1/0,5, y se las deja reposar 30 min. A continuación, se calienta a 45 °C durante un intervalo de tiempo entre 30 y 60 minutos, a fin de asegurar la interacción e incorporación del anticuerpo a la micela.
Finalmente, se pasa por una columna de filtración molecular (Sephadex G200) para eliminar el anticuerpo que no haya sido incorporada en la micela, o
2- La micela de GM1 a pH 4,5 se la calienta a 60 °C durante 30 o 60 minutos y luego se deja enfriar la solución. Luego se le adicionan los anticuerpos en una proporción en peso GM1-lgG 1/0,25 o 1/0,5 y se deja reposar 1 hora. Finalmente, el material se pasa por una columna de filtración molecular (Sephadex G200) a fin de remover la inmunoglobulina que no haya sido incorporado en la micela.
A continuación, se describen en detalle los procedimientos para la incorporación de anticuerpos en la superficie de las micelas de gangliósidos, como así también la incorporación de diferentes fármacos en el interior de los complejos micelas-anticuerpos:
PROCEDIMIENTO 1 - Comprende las siguientes etapas:
(a) Solubilizar los gangliósidos en agua destilada o en una solución salina de un pH que entre 3 y 7, siempre por sobre la concentración micelar crítica, dejando reposar la solución a 4 °C durante al menos 24hs.
(b) Incubar el producto obtenido en el paso (a) con el agente bioactivo, en este caso los anticuerpos mono o policlonales como se ha definido previamente.
(c) Filtración del material obtenido en el paso (b) por una columna de filtración molecular (Sephadex G2Q0) a fin de remover la IgG que no haya sido incorporada en la micela.
(d) En el caso particular de la incorporación de fármacos en las micelas con anticuerpos, la misma se puede realizar de la siguiente manera. Inicialmente se calientan las micelas de GM1 a 65°C y luego se enfriar, se incorporar los fármacos en la micela como se menciona previamente, y finalmente los anticuerpos a pH 4.5, logrando formar el complejo ternario micela-fármaco-lgG.
(e) Dializar la solución micelar obtenida en el paso (d) frente a una solución de agua destilada o una solución farmacéuticamente aceptable que tenga un pH comprendido entre 3 y 7, durante 24 hs a una temperatura entre 4 y 8 °C, para remover completamente el solvente orgánico.
(f) Finalmente las soluciones obtenidas en ambos procedimientos 1 y 2, pueden ser esterilizadas en forma líquida, mediante filtración por 0,1 o 0,2 mieras y envasadas directamente para su uso, o bien, proceder a liofilizarlas en una nueva presentación.
(i) Resuspender las micelas liofilizadas en una solución farmacéuticamente aceptable de manera que puedan ser administradas en forma inyectable endovenosa para el tratamiento de la patología en cuestión. La cantidad de las distintas sustancias terapéuticamente activas incorporadas (Ptx, Dtx, Doxo) y la concentración de los polipéptidos en las nanomicelas de gangliósidos puede ser determinada utilizando técnicas espectroscópicas o bien técnicas cromatográficas adecuadas, tales como la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o electroforesis en geles de poliacrilamida.
EJEMPLOS
Ejemploü : Perfil de elución de SgG incorporada en micelas de GM1 solas o previamente cargadas con Ptx por columna Sephadex G-200.
Se prepararon micelas de GM1 y de GM1-Ptx en tampón acético/acetato pH=4,5, conteniendo 20mg/ml de GM1 , y una relación molar de Ptx-GM1 de 1/20. Estas micelas fueron incubadas en presencia de una cantidad fija de IgG humana (5mg/ml) durante 1 hora a una temperatura de 37°C.
Tras la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular mediante columna de Sephadex G200 para separar los complejos GM1-Ptx-lgG de las IgG libres. Se recogió el volumen eluído a través de la columna en fracciones de 1 ml cada una. Finalmente, el perfil de elución de la IgG incorporada en forma soluble en la micela de GM1 o GM1/Ptx fue determinada por absorbancla a 280 nm contra un estándar de IgG.
La micela de GM1 como así micelas GM1/Ptx no poseen absorbancía a 280nm. El aumento de absorbancía a 227nm en las fracciones recolectadas 1-4 de micelas de GM1 o GM1/Ptx coincide con el volumen de elución de la columna (Vo) determinado con Dextran Blue. Este perfil muestra que el Ptx eluye conjuntamente con la micela y que al complejo le corresponde un PM mayor a 250kDa (ver Figura 1.A). Como se muestra en la Figura 1 .B el aumento de absorbancía de la fracción 5 a la 9 corresponde al PM de 150 kDa correspondiente a una inmunoglobulina. En la figura 1 .C se puede ver un corrimiento hacia la izquierda en el perfil de elución a 280nm de la IgG incubada con micelas de GM1 o GM1/Ptx respecto a IgG estándar, lo que evidencia que existe una interacción entre la IgG incubada con micelas de GM1 o GM1/Ptx, así como que la presencia de Ptx cargado en la micela no modifica la interacción de la IgG con la misma.
EjempIo2: Efecto del pH en la incorporación de IgG sobre la micela de GM1 cargadas con Ptx.
El Ptx es cargado en las micelas de GM1 en relaciones como se ha descripto previamente en el ejemplo 1. La incorporación de una cantidad fija de IgG (10mg/ml) sobre las micelas de GM1 cargadas con Ptx se realiza a los pHs 3,6 - 4,5 y 7, durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular sobre Sephadex G 200 separando los complejos GM1-Ptx-lgG de las IgG libres. Finalmente, el perfil de elución de la IgG incorporada en la micela de GM1 , a distintos pHs, fue determinado por absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG (10mg/ml).
El pH del medio influye sobre la interacción entre micelas de GM1 e IgG. La cantidad de IgG que aparece formando el complejo GM1-Ptx-lgG (fracciones 1 -4) se incrementa a pH ácido (4.5) respecto al neutro (7). La formación de agregados insolubles a pH <4 no permiten eluir a través de la columna demostrando inestabilidad en los complejos formados o desnaturalización de la IgG. Las fracciones 1-4 corresponden a volumen de elución de la columna (Vo). De la fracción 5 a la 9 corresponde al PM de 150 kDa que tiene la inmunoglobulina G (ver Figura 2).
EjemploS: Efecto de la temperatura en la incorporación de IgG sobre micelas de monosialogangliósidos cargadas con Ptx.
La incorporación de IgG a las micelas del ejemplo 1 , se realizó a pH 4,5 durante 1 hora a temperaturas de 4, 25, 37 y 45°C. Tras la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular sobre Sephadex G200 para separar los complejos GM1-Ptx-lgG de las IgG libres. Finalmente, el perfil de elución de la IgG incorporada en la micela de GM1 fue determinado por absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG (5mg/ml).
La temperatura regula la interacción del complejo GM1/Ptx con la IgG agregada al medio (ver Figura 3). A medida que aumenta la temperatura, la cantidad de IgG que aparece formando el complejo GM1-Ptx-!gG incrementa. A mayor temperatura, se observa mayor absorbancia en las fracciones 1 -4 que corresponden al volumen de elución de la columna (Vo). Las fracciones 5-9 corresponden al PM de la IgG que es de 150 kDa.
Ejemplo 4: Efecto del tiempo de incubación sobre la incorporación de IgG en micelas de GM1/Ptx.
La incorporación de IgG (5 mg/ml) sobre las micelas obtenidas en el ejemplo 1 (20 mg/ml), se realizó incubando la mezcla a pH 4,5 y a una temperatura de 45°C, a diferentes tiempos (ver Figura 4). Después de la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.0Q0xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular sobre Sephadex G 200 de modo de separar los complejos GM1-Ptx-lgG de las IgG libres. Se recolectó el volumen eluído a través de la columna en fracciones de 1 ml cada una. Finalmente, el perfil de elución de IgG incorporada en la micela de GM1 a distintos tiempos de incubación fue determinado por absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG. Se observó que, a medida que aumenta el tiempo de incubación, la cantidad de IgG formando el complejo GM1 -Ptx-lgG incrementa (ver Figura 4). A mayor tiempo de incubación, aparece mayor absorbancia en las fracciones 1 -4 (volumen de elución de la columna (Vo)). Fracciones 5 a 9 corresponde al PM de una IgG (150 kDa).
Ejemplo 5: Efecto de la temperatura sobre la micela de GM1 en su capacidad para ¡a incorporación de IgG.
Micelas de GM1 (20mg/ml) en tampón pH 4,5 fueron calentadas a 45°C o 60°C durante el tiempo de 1 hora. Se dejaron reposar hasta alcanzar la temperatura ambiente (20°C). Se incorporó una cantidad fija de IgG (5 mg/ml) a una temperatura de 20°C durante 1 hora. Se centrifugaron las muestras a 15.000xg durante 15 minutos y se realizó la filtración molecular sobre Sephadex G 200 para separar los complejos GM1-lgG de las IgG libres. Finalmente, el perfil de elución de IgG incorporada en micelas de GM1 precalentadas a las diferentes temperaturas fue determinado por absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG.
Ejemplo 6: Carga de Inmunoglobuiinas sobre las micelas de gangliósidos GM1 cargadas con PacSitaxeS.
Las micelas obtenidas en el ejemplo 1 , cargadas con Ptx a una concentración de 5 mg/ml, fueron luego incubadas en presencia de cantidades crecientes de IgG para alcanzar una concentración final de 1 ,25; 2,5; 5; 10 y 15 mg/ml. Las incubaciones fueron realizadas a una temperatura de 20°C durante 1 hora. Seguidamente se centrifugaron las muestras a 15.000xg durante 15 minutos y se filtraron sobre Sephadex G 200 para separar los complejos GMi-Ptx-lgG de las IgG libres. Finalmente, cantidad de la IgG incorporada en la micela de GMi-Ptx fue determinado por absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG.
Se observó que en presencia de una cantidad fija de GMi (20mg/ml), el incremento en la cantidad de IgG produce un incremento en la cantidad del complejo GM1-Ptx-lgG hasta alcanzar la saturación a partir de 5mg/mí (ver figura 6).
Ejemplo 7: Perfil de elución de los anticuerpos monocíonales Anti- rubeola y Anti-hepatitis B incorporados en micelas de GM1.
Micelas de GM1 (40mg/ml) en tampón pH 4,5 fueron calentadas a 55°C durante 1 hora. A continuación, se dejaron reposar hasta alcanzar la temperatura ambiente (20°C) y seguidamente el Ptx se incorporó en las micelas GM1 siguiendo el procedimiento del ejemplo 1. Las micelas GM1-Ptx resultantes fueron incubadas en presencia de una cantidad fija de anticuerpo monoclonal anti-rubeola (Anti-Rub 7,5mg/ml) o anti-hepatitis b (Anti-HBS 1 Qmg/ml). Los controles de los anticuerpos solos también fueron incubados a pH 4.5 durante 1 hora, a 20°C. A continuación, se ajuntó nuevamente el pH a 7 con NaOH. Tras la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular sobre Sephadex G 200 para separar los complejos GM1/Acs monoclonales de los Acs libres. Se recolectó el volumen eluído a través de la columna en fracciones de 1 ml. El perfil de elución del anticuerpo monoclonal incorporado en micelas de GM1 fue determinado por absorbancia a 280 nm contra el anticuerpo usado como control. Para la confirmar la correlación entre los picos de elución a 280 nm con la presencia de las proteínas (IgG), se realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 7,5%, con SDS.
En presencia de micelas de GM1 , se produce un corrimiento del perfil de elución del anticuerpo monoclonal Anti-Rub o Anti-HBS respecto al anticuerpo estándar (ver Figuras 7.A y 7.C). Las mezclas eluyen en las primeras fracciones (1- 4) que corresponde al volumen de elusión (Vo) de la columna (PM mayor a 250kDa.).
Ejemplo 8: Determinación de la actividad biológica de Sos anticuerpos monoclonales Anti-Rub y Anti-HBS incorporados en micelas de GM1 cargadas con Ptx.
La incorporación de los anticuerpos monoclonales anti-rubeola (Anti-Rub) y anti hepatitis b (Anti-HBS) en micelas de GM1 se realizó siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 7. La determinación de la actividad inmunogénica se llevó a cabo mediante la técnica electro quimioluminiscencia inmunoensayo "ECLIA". Para los anticuerpos anti rubéola (Anti-Rub) se utilizó el test IMMULITE 2000 de SIEMENS, basado en un inmunoensayo quimio luminiscente cuantitativo de dos pasos en fase sólida, disponible comercialmente para uso en diagnostico“in vitro”.
Se determinaron cuantitativamente mediante inmunoensayo quimio luminiscente tipo sándwich los anticuerpos (Anti-HBS) contra el antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) se realizó (kit ELECSYS anti-HBs de ROCHE). Las tablas 1 y 2, muestran los resultados de los ensayos de electro quimioluminiscencia (ECLIA) obtenidos para los anticuerpos Anti-Rub o Anti-HBs respectivamente, así como las cantidades (mg) de GM1 y anticuerpos utilizados como las diluciones realizadas para cada caso. Los ensayos se realizaron por duplicado. Tabla 1. A: Prueba IMMULITE 2000 para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra el virus de la rubéola. B: Prueba ELECSYS anti-HBs para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra el antígeno de superficie de hepatitis B.
A B
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Ejemplo 9: Regulación de la Presencia de albúmina en la incorporación de IgG en la micela de GM1-Ptx.
Micelas de GM1 (20mg/ml) en tampón pH 4,5 fueron calentadas a 55°C durante 1 hora. Se dejaron reposar hasta alcanzar temperatura ambiente (20°C). Se incorporó el Ptx en la relación descrita en el ejemplo 1. La incorporación de una cantidad fija de IgG (5 mg/ml) en presencia de cantidades crecientes de albúmina sérica humana purificada (2,2; 4,4 y 8,8 mg/ml) sobre las micelas de GM1 (20 mg/ml), se realizó incubando la mezcla a pH 4,5 y a una temperatura de 20°C durante 1 hora.
Después de la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular con Sephadex G 200 para separar los distintos complejos formados de las proteínas libres. Finalmente, el perfil de elución de IgG incorporada en micelas de GM1/Ptx en presencia de Albúmina fue determinado por absorbancia a 280 nm contra estándar. A modo de complemento, se realizaron geles de poliacrilamida al 7,5%, mediante la técnica de SDS-PAGE, sin 2-mercaptoetanol para confirmar la presencia de Albúmina e IgG nativa.
A medida que la cantidad de Albúmina adicionada incrementa, se produce un aumento de la población de PM: 150kDa (fracción 5-9) que corresponde a IgG libre (ver Figura 8.A). Los SDS-PAGE de la figura 8.B muestran los cambios en el perfil de elución de una cantidad fija de IgG (20 mg) en función de cantidades crecientes de Albúmina desde 2,2 a 4,4 y 8,8 mg, respectivamente (ver Figuras 8.B: a, b, c). Se observa una disminución en la cantidad de IgG que eluye en las primeras fracciones (1-4), que corresponden al volumen de exclusión de la columna (Vo), Paralelamente se observó un aumento en la cantidad de IgG en las fracciones (5- 8) que representan las fracciones donde eluye la IgG libre (PM: 150kDa).
Ejemplo 10: Perfil de elución en Sephadex G-200 de Sas IgG incorporadas en micelas de GM1 o GIV11 -Doxorrubicina.
Se prepararon micelas de GM1 y de GM1-Doxo en tampón acético/acetato pH 4,5, conteniendo 20mg/ml de GM1 , y una relación molar de Doxo-GM1 de 1/10. Estas micelas fueron incubadas en presencia de una cantidad fija de IgG humana (5mg/ml) durante 1 hora a una temperatura de 45°C. Después de la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración sobre Sephadex G 200 para separar los complejos GM1-Doxo-lgG de las IgG libres. Se recolectó el volumen eluído de la columna en fracciones de 1 ml.
El perfil de elución de la IgG incorporada en forma soluble en la micela de GM1 o GMI/Doxo fue determinada por medición de la absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG. También, se determinó el perfil de elución a 490 nm que corresponde al máximo de absorbancia de la Doxorrubicina.
La Doxorrubicina eluye a partir de la fracción 22 (ver Figura 9. A); en cambio en presencia de GM1 , eluye conjuntamente con la micela de GM1 en las primeras fracciones (1-4), que corresponde al volumen de exclusión de la columna (Vo) determinado con Dextran Blue. El complejo GM1/Doxo presenta máximos de absorbancia similares a 280 nm y 490 nm con un PM superior a los 250 kDa.
El pico observado en los perfiles de elución de una solución de IgG (5mg/ml) a 280nm en las fracciones 5 a la 9 coincide con el PM de 150 kDa correspondiente a una inmunoglobulina (ver Figura 9.B). La incubación de IgG con micelas de GM1 o GMI/Doxo produce un corrimiento en el perfil de elución de la IgG desde un PM de 150 kDa a la fracción correspondiente al Vo (fracciones 1-4) (ver Figura 9.C).
Ejemplo 11 : Efecto del orden de incorporación de IgG y Doxorrubicina en micelas de GM1.
Micelas de GM1 (10mg/ml) en tampón pH 4,5 fueron calentadas a 55°C durante 1 hora. Seguidamente se dejaron reposar hasta alcanzar la temperatura ambiente (20°C) y a continuación, la IgG y Doxorrubicina fueron incorporadas de acuerdo al siguiente procedimiento:
1 Se adicionó una cantidad fija de IgG (2,5mg/ml) sobre las micelas de GM1 (10 mg/ml), y se incubó la mezcla a pH 4,5, durante 1 hora a 20°C.
2.- Se adicionó una cantidad fija de Doxorrubicina (0,7mg/ml) sobre las micelas de GM1 (10mg/ml), y se incubó a pH 4,5, durante 1 hora a 20°C.
3.- Se adicionó IgG (2,5mg/ml) y se incubó nuevamente 1 hora a 20°C.
4.- Ambas muestras, (A) aquellas en las cuales se cargó primero las IgG en las micelas y luego la Doxo; y (B) donde primero se cargó la Doxo en las micelas y luego las IgG, fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular sobre Sephadex G 200 para separar los complejos GM1/Doxo/lgG de las IgG libres. Se determinó el espectro de absorbancia a 280 nm y 490 nm del perfil de elución de la IgG y de la Doxorrubicina.
La cantidad de IgG que aparece formando el complejo GM1/Doxo/lgG está incrementada cuando se incorpora de acuerdo al procedimiento (A), al mismo tiempo que se observa una fracción de Doxorrubicina libre (ver Figura 10. A y 10. B). Se observó que cuando la IgG se incorpora de acuerdo al procedimiento (B) previa incorporación de Doxorubicina, se produce un desplazamiento de la IgG hacia la forma libre (fracciones 5-9).
Ejemplo 12. Efecto de la temperatura en Sa incorporación de IgG sobre micelas de disialogangliósidos (GD1). Se prepararon micelas de GD1a y de GD1a-Ptx en tampón acético/acetato pH 4,5, conteniendo 20mg/ml de GM1 , y una relación molar de Ptx-GM1 1/20. Posteriormente, fueron incubadas en presencia de cantidades crecientes de IgG (1 ,25 - 2,5 - 5 y 10 mg/ml). La incorporación de IgG sobre las micelas de GDi-Ptx se realizó a pH 4,5 durante 1 hora, a dos temperaturas distintas, 25°C y 45°C. Tras la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 15.000xg durante 15 minutos y sometidas a filtración molecular sobre Sephadex G 200 de modo de separar los complejos GDi-Ptx-lgG de las IgG libres. La IgG incorporada en la micela de GDi fue determinada por absorbancia a 280 nm contra un estándar de IgG. A mayor temperatura, la cantidad de IgG que aparece formando el complejo GDi-Ptx-lgG se incrementó.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiendo así descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, lo que se declara reivindicar como invención y de propiedad exclusiva, es:
1- Una composición farmacéutica soluble en solución acuosa caracterizada porque comprende sialoglicoesfingolípidos; polipéptidos seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos, fragmentos y variantes de los mismos; al menos una sustancia terapéuticamente activa; conformando un complejo micelar ternario, sialoglicoesfingolípido-Sustancia terapéuticemente activa-Polipéptido, donde dichos polipéptidos están asociados en forma no covalente con las micelas conformadas por dicho sialoglicoesfingolípidos y dicha sustancia terapéuticamente activa.
2- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dichos sialoglicoesfingolípidos son seleccionados del conjunto comprendido por monosialogangliósidos, disialogangliósidos, trisialogangliósido, GM1 , LIGA-GM1 , GM2, GD1 a, GDi b GT1y sus mezclas.
3- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dichos polipéptidos son seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos humanos policlonales, anticuerpos humanizados policlonales, anticuerpos humanizados monoclonales, anticuerpos policlonales de origen animal, anticuerpos monoclonales de origen animal, anticuerpos quiméricos, fragmentos de ellos y sus mezclas.
4- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dicha sustancia terapéuticamente activa es seleccionada del conjunto comprendido por drogas antitumorales, drogas antifúngicas, drogas hidrofóbicas, drogas hidrofílicas, taxanos, paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina, prostaglandinas, isosorbide dinitrito, prostaglandinas, propofol, dinitrato de isosorbide, testosterona, nitroglicerina, estradiol, vitamina E, cortisona, dexametasona y sus ésteres y el valerato de betametasona en una relación molar de sustancia terapéuticamente activa/ sialoglicoesfingolípidos que va entre 1 :2 y 1 :100. 5- La composición farmacéutica de ia reivindicación 1 caracterizada porque dicha sustancia terapéuticamente activa es seleccionada del conjunto comprendido por paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina.
6- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dicha sustancia terapéuticamente activa comprende una relación molar de sustancia terapéuticamente activa/sialoglicoesfingolípidos que va entre 1 :2 y 1 :100.
7- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende una composición inyectable estéril y translúcida, donde dichas micelas poseen un tamaño promedio menor que 100 nm.
8- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dicho complejo micelar pose un tamaño promedio comprendido entre 10 nm y 60 nm.
9- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dirige la administración de la sustancia terapéuticamente activa hacia el blanco de dicho anticuerpo.
10- La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende dicho complejo micelar en ausencia de albúmina, linkers, agentes entrecruzantes y moléculas derivatizadas.
1 1 -La composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque dichos polipéptidos del complejo micelar ternario conservan la capacidad de unión a su ligando.
12-Una composición farmacéutica, soluble en solución acuosa caracterizada porque comprende sialoglicoesfingolípidos y una sustancia terapéuticamente activa, que conforman micelas con la capacidad de unir no covalentemente anticuerpos sobre sus superficies, para formar un complejo micelar ternario, Sialoglicoesfingolípido-Sustancia terapéuticemente activa-Anticuerpo.
13-Un procedimiento para obtener la composición farmacéutica soluble en solución acuosa, de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende los siguientes pasos:
(a) solubilizar sialoglicoesfingolípidos, en solución tampón o en una solución salina de un pH 4,5, en una concentración superior a la concentración micelar crítica, y calentar a una temperatura de entre 45 y 60 °C, durante un tiempo mayor a 15 minutos y luego dejar reposar la solución para formar micelas; (b) agregar una solución de solvente conteniendo una sustancia terapéuticamente activa;
(c) incubar la mezcla del paso (b) para la incorporación de dicha sustancia terapéuticamente activa en las micelas;
(d) dializar la solución micelar conteniendo la sustancia terapéuticamente activa del paso (c) frente a una solución de agua destilada o una solución farmacéuticamente aceptable que tenga un pH comprendido entre 4 y 7, de manera de remover el solvente;
(e) incubar las micelas resultantes del paso (d) en presencia de dicho polipéptido a un pH de entre 4 y 7,6, de manera de permitir la formación del complejo ternario Sialoglicoesfingolípidos-Sustancia terapéuticamente activa- Polipéptido;
(f) esterilizar la solución acuosa y transparente obtenida de la etapa anterior.
14-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque además comprende el paso de:
(g) liofilizar el complejo micelar esterilizado, obtenido en el paso (f).
15-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque además comprende el paso de:
(h) resuspender el liofilizado del paso (g) en una solución farmacéuticamente aceptable al momento de su uso.
16-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque dicho solvente es seleccionado del conjunto comprendido por un solvente orgánico, dimetilsulfóxido y etanol.
17-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque en el paso (f) la esterilización se realiza mediante filtración.
18-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque en el paso (e) la relación másica entre sialoglicoesfingolípidos y polipétido es de entre 2: 1 y 6:1 (p/p), y dicha incubación se lleva a cabo durante un tiempo comprendido entre 1 y 2 hs a una temperatura de al menos 45 °C.
19-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque dichos polipéptidos son seleccionados del conjunto comprendido por anticuerpos humanos policlonales, anticuerpos humanizados policlonales, anticuerpos humanizados monoclonales, anticuerpos policionales de origen animal, anticuerpos monoclonales de origen animal, anticuerpos quiméricos, fragmentos de ellos y sus mezclas.
20-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque dichos sialoglicoesfingolípidos son seleccionados del conjunto comprendido por monosialogangliósidos, disialogangliósidos, trisialogangliósido, GM1 , LIGA-GM1 , GM2, GD1a, GD1 b GT1 y sus mezclas.
21 -El procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque dicha sustancia terapéuticamente activa es seleccionada del conjunto comprendido por drogas antitumorales, drogas aníifúngicas, drogas hidrofóbicas, drogas hidrofílicas, taxanos, paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, anfotericina, prostaglandinas, isosorbide dinitrito, prostaglandinas, propofol, dinitrato de isosorbide, testosterona, nitroglicerina, estradiol, vitamina E, cortisona, dexametasona y sus ésteres y el valerato de betametasona en una relación molar de sustancia terapéuticamente activa/sialoglicoesfingolípidos que va entre 1 :2 y 1 :100.
22-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque en el paso (e) el pH de las micelas está en rango comprendido entre pH 4 y 7 en las que dichas micelas son calentadas a una temperatura comprendida entre 45 y 65 °C durante 1 hora.
23-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque comprende como sustancia terapéuticamente activa docetaxel y como sialoglicoesfingolípidos: GM1 , presentes en una relación molar docetaxel/GM1 comprendida entre 1 :10 y 1 :100.
24-EI procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque comprende como sustancia terapéuticamente activa entre 0,1 mg/ml a 6 mg/ml de paclitaxel o docetaxel y entre 200 y 300 mg/ml de sialoglicoesfingolípidos.
25-El procedimiento de la reivindicación 13 caracterizado porque dicha sustancia terapéuticamente activa comprende doxorubicina en una relación molar doxorrubicina/ sialoglicoesfingolípidos comprendida entre 1 :2,5 y 1 :20.
26-Un procedimiento para obtener la composición farmacéutica soluble en solución acuosa, de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende los siguientes pasos: a- solubilizar sialoglicoesfingolípidos: GM1 en solución tampón acético-acetato o en una solución salina de un pH 4,5 siempre por sobre la concentración micelar crítica, y dejar reposar la solución por 24 hs;
b- calentar le solución de sialoglicoesfingolípidos a 60 °C durante 1 hora, y luego dejar enfriar a temperatura ambiente;
c- agregar una solución de IgG a pH 4,5 sobre la solución de micelas de GM1 a temperatura ambiente y dejar reposar por 2 horas;
d- agregar una solución de DMSO conteniendo paclitaxel o docetaxel;
e- dializar para remover el solvente y fármaco no incorporado;
f- esterilizar esta solución por filtración en 0,2 um.;
g- liofilizar.
27-Una composición farmacéutica soluble en solución acuosa, caracterizada porque es obtenible mediante el proceso de la reivindicación 13.
28-Una composición farmacéutica soluble en solución acuosa, caracterizada porque es obtenible en el paso d) del proceso de la reivindicación 13.
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WO2011113981A1 (es) * 2010-03-17 2011-09-22 Conicet -Consejo Nac. De Investigaciones Científicas Y Técnicas Una composición farmacéutica soluble en agua que comprende al menos una sustancia terapéuticamente activa de características hidrofóbicas y al menos un compuesto seleccionado entre los sialoglicoesfingolípidos, los glicoesfingolípidos o una mezcla de sialoglicoesfingolípidos y glicoesfingolípidos

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