JPH0330832A - リポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、製剤、医薬、化粧品、食品分野等で用途を
有する、新規なｐＨ感受性リポソームに関するものであ
る。

［従来の技術］ りん脂質を５０％以上の水、塩類溶液にさらすと、スメ
クチック（ｓａ＋ｅｃｔ　ｉｃ）液晶と呼ばれる２分子
膜の閉鎖小胞を生ずる。この小胞は通常多重の同心球状
構造をもつが、これを超音波処理すると１枚の脂質２重
層で構成された小胞となる。これらは何れも、リポソー
ムと呼ばれている。リポソームは、その中心部の空洞ま
たは層間に有効成分を含ませることができるので、薬物
送達システムとして利用される。

［発明が解決しようとするＲ題〕 既に、多１１１の脂質がリポソームを作り得ることが報
告されているが、そのうち、ｌ）Ｈ感受性をもつものと
しては、１個またはそれ以上の弱酸性官能基を有する両
親媒性分子を少なくとも２０モル％含むリポソームがあ
る（特表昭６１−５０１８９７号）。この公報では、両
親媒性分子の代表としニオレイン酸が挙げられ、この物
質とホスファチジルエタノールアミンから構成されるリ
ポソームは酸性ｐＨで融合し、内包物を放出するとされ
る。しかし、このリポソームは血液中で不安定であり［
コナーら、ビオシミ力・工・ビオフイジカ・アクタ（Ｂ
　１ｏｃｈｉｉｉｃａ　　ｅｔ　　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉ
ｃａ　　Ａｃｔａ）第８８４巻、第４７４頁（１９８６
年）］、安定性を増すために例えばコレステロールを加
えるとｐＨ感受性を失なうという欠点があった。

そのほか、ｐＨ感受性については言及されていないが、
上記のリポソームに類似するものとして、α−トコフェ
ロールの有機酸誘導体の塩（例えばα−トコフェロール
のこはく酸ヘミエステルのトロメタミン塩）を膜成分と
するものが知られている（特表昭６３−５０１５６９号
）。しかし、上記の塩を製造するには、塩基性で加水分
解および酸化を受は易いα−トコフェロールの有機酸エ
ステルを塩基と処理しなければならない（実施例１．２
．９．１０）という欠点があった。それに塩を形成する
ための工程は、それだけリポソームの製造工程を繁雑に
し、製造コストも高いものとなる。

［課題を解決するための手段］ この発明者は、上記の欠点を改善すべく種々検討の結果
、カルボキシ基を少なくとも２個有する脂肪族カルボン
酸とトコフェロールとの酸性エステル（すなわち、カル
ボキシ基を塩ではなく遊離酸の形で含むもの）が、単独
でも第２成分（例えぼりん脂質、コレステロール）の存
在下でもリポソームを形成する能力を有し、′シかも得
られたりボソームがｐＨ感受性（すなわち、特定のｐ）
（で含有成分、例えば薬物を放出する性質）を有するこ
とを見出し、この発明を完成したのである。

すなわち、この発明は、 （１）　　カルボキシ基を少なくとも２個有する低級脂
肪族カルボン酸とトコフェロールとの酸性エステルを膜
成分とする、リポソーム、および（２）上記（１）記載
の酸性エステルおよび脂質を膜成分とする、リポソーム を提供するものである。

この発明において、「トコフェロール」としては、α、
β１、γ、δ、ε、ξ１、ξ、およびη−トコフェロー
ルのような、一般にトコフェロールに含められているも
のはすべて包含されるが、α−トコフェロールが好まし
い。これらのトコフェロールはｄ体と４体が存在し得る
が、この発明ではｄ体または４体単独、およびそれらの
任意の比率の混合物（ｄｄ体を含む）を使用することが
できる。

「カルボキシ基を少なくとも２個有する低級脂肪族カル
ボン酸」としては、例えばジカルボン酸またはトリカル
ボン酸のように、２個または３個以上のカルボキシ基が
脂肪族骨格（不飽和の場合を含む）に結合している炭素
原子数８個以下の化合物が含まれる。代表的な化合物は
、式ＨＯＯＣＣｎＨｔｎ　　ＣＯＯＨ（ｒ＋は１−４の
整数）で示される化合物であり、例えばマロン酸、こは
く酸、ゲルタール酸、アジピン酸、２−メチルゲルター
ル酸、フマール酸、マレイン酸、りんご酸、くえん酸、
ピメリン酸、スペリン酸等が含まれる。

「酸性エステル」とは、エステル化されていないカルボ
キシ基が遊離酸（−ＣＯＯｔ（）の形で存在する化合物
を意味し、塩を含まないものとする。

この発明のリポソームは、脂質膜内に純水を含むことが
でき、また水溶液または水性けんだく液を含むことがで
きる。水溶液または水性けんだく液は、水以外の成分と
して、水溶性または半水溶性または水不溶性物質を含み
得る。このような物質としては、薬物（医療効果を目的
とする物質であって、天然には体内に存在しない物質の
ほか、異なった量で天然（こ体内に存在する生理活性物
質を含む）および標識体（診断等の目的で投与され、検
出可能な信号を発生し得る物質）が含まれる。

内包しうる化合物としては、リポソーム成分と相互作用
を起こして変質等しない限り、全ての化合物が適用可能
である。尚、本リポソーム製剤は医薬分野に限らず、化
粧品分野や食品分野にも応用しうる。

適用可能な化合物の一例を挙げれば、チトクロームＰ４
５０、チトクロームＰ４５０還元酵素、ＳＯＤ等の各種
酵素類；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の遺伝子関連物質；インター
リューキン類、インターフェロン、−α、−β、−γ、
ＴＰＡ、　　リンホトキシン類、セルレタイド等の生理
活性物質；プロスタグランジン類；等の他、鎮痛・解熱
・抗炎症薬（例えば麦角アルカロイド、モルヒネ類、ペ
ンタゾシン、アスピリン、イブプロフェン、インドメタ
シン、アセトアミノフェン等）、精神・神経疾患用薬（
例えばジアゼパム、エトスクシミド、フェニトイン、カ
ルバマゼピン、フエノバルビタール、パルプロ酸ナトリ
ウム、レボドパ、塩酸トリヘキシフエニジル、塩酸アマ
ンタジン、塩酸イミプラミン、塩酸アミトリブチリン、
クロルジアゼポキサイド、塩酸クロルプロマジン、ハロ
ペリドール等）、心・血管疾患用薬（例えばジゴキシン
、ドブタミン、イソプロテレノール、エピネフリン、プ
ロプラノロール、ニフェジピン、キニジン、ヒドララジ
ン、ヒドロクロロチアジド、レセルピン、プラゾシン、
グアネチジン、フロセミド、クロルタリドン、スピロノ
ラクトン等）、抗アレルギー・抗ぜん息薬（例えばジフ
ェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、クロ
モグリク酸ナトリウム、硫酸サルブタモール、臭化イブ
ラトロピウム等）、抗リウマチ・痛風薬（例えばフェニ
ルブタシン、Ｄ−ペニシラミン、免疫抑制剤、アロプリ
ノール、スルフィンピラゾン、ナプロキセン等）、抗菌
剤（例えばペニシリン系抗菌剤、セファロスポリン系抗
菌剤、ゲンタマイシン、ミノサイクリン、エリスロマイ
シン、リファンピシン、イソニアシト、カナマイシン、
グリセオフルビン、ナイスクチン）、ジフテリア抗毒素
、抗蛇毒血清やワクチン等、抗寄生虫・抗原虫薬（例え
ばメトロニダゾール、デヒドロエメヂン、スラミンナト
リウム、ニクロサミド等）、抗腫瘍・抗白血病薬（例え
ばプスルファン、シクロホスファミド、プレオマイシン
、フルオロウラシル、メトトレキサート等）、抗脂血・
抗糖尿病薬（例えばクロフィブラート、トルブタミド、
クロルプロパミド等）、血液疾患用薬（例えばフィブリ
ノーゲン、第■因子、ヘパリン、ジアノコバラミン等）
、消化器管用薬（例えばアクリノール、ジアスターゼ、
パンクレアチン等）、ホルモン関連薬（例えばヒドロコ
ルチゾン、ブレにニソロン、デキサメサゾン、メチルテ
ストステロン、ニストロジエン、インシュリン、レボチ
ロキシン等）、ビタミン（例えばビタミンＡ、活性形ビ
タミンＢ１％　ビタミンＣ１ビタミンＥ１パントテン酸
等）、滋養変質薬（例えばアスパラギン酸カルシウム、
イソロイシン、オロチン酸第−鉄等）、外皮用薬等が例
示される。標識体としては、Ｘ線造影剤（例えばメトリ
ザミド、メトリゾ酸）、放射性または非放射性（安定）
同位元素製剤、そのほかのＣＴ用調製剤が含まれる。

この発明には、トコフェロールとカルボキシ基を少なく
とも２個有する低級脂肪族カルボン酸との酸性エステル
（以下、トコフェロール酸性エステルと略称）単独で膜
を構成したリポソームと、トコフェロール酸性エステル
に他の成分を加えて膜を構成したリポソームが含まれる
。

トコフェロール酸性エステル単独で膜を構成したリポソ
ームは、所望の成分、例えば薬物、標識体等を含む水溶
液とトコフェロール酸性エステルを合わせて撹拌するだ
けという簡単な操作で製造することができる。

トコフェロール酸性エステルに他の成分を加えて膜を構
成する場合の池の成分としては、天然または合成りん脂
質（例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリン、ホスファチジルイノシトール、卵黄レシ
チン、水添レシチン、合成レシチン（例、ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン）、ホスファチジルグリセロー
ル、ホスファチジン酸等のグリセロりん脂質、スフィン
ゴミエリン、スフィンゴホスホリピド等のスフインゴリ
ん脂質）、糖脂質（例えばグリセロ糖脂質、スフィンゴ
糖脂質（例、ガングリオシド））、胆汁酸およびステロ
イド類（例えばコレステロール）等の種々の脂質が含ま
れる。トコフェロール酸性エステルとこれらの脂質との
比は、選択する個々の化合物によって異なり１０００：
１〜１：１０００であり得るが、はぼｌ：３０以下であ
り、通常ｌ：２０以下、好ましくは１：１０以下である
。例えばレシチンの場合１　：２．５以下が好ましく、
ホスファデジルエタノールアミンの場合１：９以下が好
ましｂ）、。ホスファチジルエタノールアミンが好まし
い脂質であり、この場合中性に近い弱酸性下で内包物質
を放出させるためにはホスファチジルエタノールアミン
を上記比率内でできるだけ多くすることが望ましい。ま
た、コレステロールは膜を安定化する作用があり、トコ
フェロール酸性エステルとコレステロールと１−バルミ
トイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミ
ンを例えば２：８：８で含むものはコレステロールを欠
くものに較べて血清に対する安定性が大きい。なお、脂
質としてコレステロールのみを加えることも可能である
。

トコフェロール酸性エステルに脂質を加えて膜を構成し
たリポソームは、例えば有機溶媒にトコフェロール酸性
エステルと脂質を溶解し、溶媒を留去して器壁上に薄膜
を形成し、水または水溶液を加える方法、上記有機溶媒
溶液に直接水または水溶液を加え、超音波処理によりＷ
１０形エマルジョンを形成し、有機溶媒を留去後緩衝液
を加えて転相（０／Ｗ形エマルジヨン化）させる方法等
により製造することができる。多重層リポソームが得ら
れた場合には、超音波処理により単層化することが可能
である。保持されなかった物質の除去は、透析、ゲル濾
過、遠心分離等により行なうことができる。

上記の方法で使用し得る有機溶媒としては、クロロホル
ム、アルコール類（例、エタノール）、エーテル類、芳
香族炭化水素（例、ベンゼン）、エチレンクロリド、ジ
メチルスルホキシド、グリセリン、フロン系溶媒（例、
１，１．２−トリクロルトリフルオルエタン）、脂肪族
炭化水素（例、ヘキサン、シクロヘキサン）、アセトン
、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール等および
これらの混合物が含まれる。

上記のようにして製造されるリポソームに薬物等を内包
させるには、リポソームの製造に用いる水相または有機
溶媒相に薬物等を含ませておく方法のほか、製造したリ
ポソームのけんたく液に薬物等を加えることによる方法
も可能である。

なお、リポソームをリガンド、抗体等により修飾して機
能性を付与することも可能である。

［効果］ この発明のリポソームは、ｐ）（感受性を有する。

すなわち、この発明のリポソームは、中性付近およびア
ルカリ性のｐｉ（では安定であり、酸性ｐＨで内包薬物
を放出する。それ故、血液中では安定なまま薬物を保持
し、例えば炎症部位のような弱酸性を示す部位で薬物を
放出させる等、特殊な薬物動態を達成できる。また、こ
のリポソームが、ｐＨ感受性であることと、細胞内エン
ドソームの内部のｐ）（が約５であることにより、標的
組織に送達させた薬物内包リポソームの内包物を細胞質
に有効に放出させることができる。また、この発明のリ
ポソームは製造が容易であり、特にトコフェロール酸性
エステルのみで膜を構成したリポソームは製造が極めて
簡単であるという利点を有する。

［実施例］ 以下、実施例によりこの発明をさらに詳細に説明すると
ともにこの発明の効果を明らかにする。

実施例！ こはく酸水素α−トコフェロール（ＴＡＳ）１０１９に
５６ａＭ５（６）−カルボキシフルオレスセイン（ＣＦ
）０．４ＪＩＩ７２およびｌＮ−ＮａＯＨ２０μｆｆを
加えて乳濁化させた。平均粒径５００−８００ｎｍのリ
ポソームを形成した。これを０．２μ晴のヌクレボア・
メンプランを備えた高圧濾過器（リペックス・バイオメ
ンブランズ・インコーホレイテッド）に通して平均粒径
が約０．２μ量の粒度分布がそろったリポソームを得た
。これをセファデックスＧｌ　００を用いてゲル濾過す
ることにより精製し、この発明のリポソームを得た。Ｃ
Ｆの内包率３．６％。

リポソームのＩ）Ｉ−１感受性の測定は、上記分散溶’
ａＯ，’ｈ＊Ｑを、０．２Ｎ＜えん酸中量でｐＨ調整し
た各種ｐＨのトリス緩衝液（（２５ｍＭ、　０．３７４
％ＮａＣ１２）２ＲＩ２に加え、３７℃で１０分間イン
キュベーションした後１）Ｈを中性に戻して蛍光強度を
測定することによって行なった。インキュベーションす
る前のｐＨ７、５での蛍光強度を基準にして、トライト
ンで処理した場合の蛍光強度の増加分を１００、％とし
、各種ｐＨでインキュベーションした場合の蛍光強度増
加量によりその安定性を下式に基づいて評価した。

結果は第１図に示す通りである。

実施例２ ＴＡＳ　１０ｘ９＋；−０，４２ＣＷ／Ｖ’）％５タモ
キセフのトリス緩衝液（３０ｍＭ）を０　、３　ｘＱを
加え、ついでｌＮＮａＯＨを２５μＱ添加したところ、
乳濁化が起った。次にこれに５０１１Ｍトリス緩衡液を
緩衝液希釈し、遠心分離（１００，，０Ｏ０９Ｘ６０分
間）してリポソーム分画を得た。これを３回くり返して
得たリポソーム分画のラタモキセフの取り込み率は８．
０％であった。

実施例３ ＴＡＳのクロロホルム溶液（１，３８ｍ？／ｘυ０゜５
ｉ（！と卵黄ホスファチジルエタノールアミン（ＥＹＰ
Ｅ）のクロロホルム溶液（１０ｍ９／ｘＱ）　０　、９
１１２を１０１１Ｉ２容のナスフラスコに取り、ロータ
リーエバポレーターで有機溶媒を除去した後、減圧下に
デシケータ−で残留する有機溶媒を更に充分に除去した
。この時点では、ナスフラスコの内壁に脂質性の薄膜が
はりついた状態になっているが、これに２５ｍＭカルセ
イン水溶液０　、６　ｘ（ｌを加えて手で振とうしたと
ころ、乳濁化が起るとともに、フラスコ内壁の薄膜が消
失した。次にこの分散溶液を孔径０．２μｍのヌクレボ
ア・メンプランを装着した高圧濾過器にかけ、平均粒径
が約０．２μｍのリポソーム分散液を得た。続いてこれ
をゲル濾過（セファデックスｃ−ｔ　ｏ　ｏ）にかけて
ＴＡＳ／Ｆ：ＹＰＥのモル比が１／９のリポソームを遊
離のカルセインから分離した。

１）Ｈ感受性の評価は次のように行なった。ゲル濾過に
より得たリポソームを含む分画０．１ｚＱを、０．２Ｎ
＜えん酸を少量加えてＩ）Ｈ調整した各１１ｊｐト■の
トリス緩衝液（２５ｍＭ、　　０．３７５％Ｎ　ａ　Ｃ
Ｑ）２ｚＱ＋ζ加えて３７℃で１０分間インキュベーシ
ョンした。次に、ｐ）（を中性に戻した後、その蛍光強
度を測定し実施例１と同様にその安定性を評価した。

結果は第２図に示す通りである。

実施例４ 実施例３において、ＴＡＳのクロロホルム溶液（１，３
８貢９／　ＩＩ（Ｄ　Ｏ、５ｘ（ｌの代わりに１ｍ１２
を用い、ＥＹＰＥのクロロホルム溶液（１０ｘ９／ｘ（
１）０．９ｘＱの代わりに０　、８　ｘ（ｌを用いて、
同じ方法でＴＡＳ／Ｅ　Ｙ　Ｐ　Ｅのモル比が２／８の
リポソームを得た。

このリポソームのｐＨ感受性を同様に評価した。

結果を第２図に示す。

実施例５ 実施例３において、ＴＡＳのクロロホルム溶液０．５村
の代わりに１．５ｍ１２を用い、ＥＹＰＥのクロロホル
ム溶液０　、９１１Ｑの代わりに０　、７　ｘＱを用い
て、同じ方法でＴＡＳ／ＥＹＰＥのモル比が３／７のリ
ポソームを得た。そのｐＨ感受性を同様に評価した。結
果を第２図に示す。

実施例６ １−バルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタ
ノールアミン（Ｐ　ＯＰ　Ｅ）のクロロホルム溶Ｍ（１
０ｍ９／ｘＱ）　０　、８　ｘＱとＴＡＳ（７）クロロ
ホルム溶液（２，９８ｘ９／＊Ｑ”）０．５ｍ（ｌの混
合液から、実施例３と同様の方法で有機溶媒を除去し、
その後ラタモキセフ（０，４２Ｗ／ｖ％）　０　、３　
ｘＱを加え、ついで０．ｌＮ−ＮａＯＨを２５μＮ加え
て手で振とうし、リポソームの分散液を得た。次にリポ
ソームの分散液に５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）
を加えて希釈し、遠心分離（１００，０００９，６０分
）によりリポソームを分離する操作を３回（り返して、
ラタモキセフを内包したリポソームを得た。その内包率
は８．８％であった。

実施例７ 実施例６のＰＯＰＥの代わりにジオレオイルホスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、１ｏＲ９／ＩＩＱ）
の０　、８　ｘＱを用いた。得られたリポソームのラタ
モキセフ内包率は８．９％であった。

試験例１ 血清中でのｐ）ｌ感受性リポソームの安定性とｐＨ感受
性をこの発明のリポソームと公知のｌ）Ｈ感受性リポソ
ームについて比較する実験を行った。この実拳に用いた
リポソームは第１表に示す配合によって作成した。その
調製の手順は実施例３に従い、カルセインの代わりに５
６ｍＭの５（６）−カルボキシフルオレスセイン（ＣＦ
）のトリスｔｌ衝液（１０ｍＭ５０．００６Ｎ−ＮａＯ
Ｈを含む）溶液０゜４翼Ｑを用いた。

第１表 ＴＡＳ：こはく酸水素トコフェロール Ｃｈｏｌ：コレステロール ＰＯＰＥ：１−バルミトイル−２−オレオイルホスファ
チジルエタノールアミン ＯＡ＝オレイン酸ナトリウム 孔径０．２μＩのヌクレボア・メンプランを装着した高
圧濾過器を通した後ゲル濾過（セファデックスＧ−１０
０）で分離して得た上記組成のリポソームはいずれもそ
の平均粒径が０．３μｍ前後であった。

２０％ラット（Ｊｃ（７ＳＤ雄性）血清中での安定性と
ｐｌ（感受性の測定結果を第３．４図に示す。

その結果から、ＯＡ／ＰＯＰＥリポソームは測定のｐＨ
全領域にわたって不安定であること、ＴＡＳ／ＰＯＰＥ
リポソームは、中性付近でやや不安定であるがｐＨ感受
性を示すことがわかった。

方コレステロールを加えたＯ　Ａ／　Ｃｈｏｌ／　Ｐ　
ＯＰＥリポソームは安定であるがｐＨ感受性を消失しテ
ィ４゜これに対して、ＴＡＳ／Ｃｈｏｌ／ＰＯＰＥリポ
ソームでは血清に対する安定性が増強されているととも
にｐＨ感受性についてはコレステロールを加えない場合
と大差ないことを示している。

試験例２ 試験例１と同様の方法により下記第２表に示すリポソー
ムを作り、その取り込み率を測定した。

結果は第２表に示す通りであり、この発明のりボソーム
の方が取り込み率が大きなことがわかった。

て１日後および８日後の過酸化係数を測定した。

第２表 第３表 試験例３ 下記第３表に示す分散系を、混合物を実施例３と同様に
脱溶媒し、２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７。

４　）　０　、５１１Ｑを加え、さらに■にはＯ，ｌＮ
−ＮａＯＨを０．１５１１２．■には同じく２５μｉ加
えて分散させることにより製造し、これらを４℃で保存
し測定は、下記条件下の液体クロマトグラフィーによっ
た。カラム二μｍボンダバックＮ　Ｈｔ　、展開溶媒：
ｎ−ヘキサン／イソプロパツール／メタノール／水（６
／９／ｌ、、’１．５）、流速＋　１　、２１（／分、
クラインの方法〔ビオシミ力・工・ビオフイジカ・アク
タ（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍｉｃａ　　ｅｔ　　Ｂ　１ｏｐｈ
ｙｓｉｃａ　　Ａｃｔａ）第２１０巻ζ４８６頁（１９
７０年）］を改良してホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥ）の２０６１−吸収検出による吸光面積と２３３
ｎｍでの吸光面積の比を過酸化係数として表わした。

結果は第４表に示す通りである。

第４表 ＥＹＰＥ　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　７
，８３ＴＡＳ／ＥＹＰＥ（２／８）　　　　　１　　　
　　　　５　、１３ＯＡ／ＥＹＰＥ（２／８）　　　　
　１　　　　　　　５　、６６ＥＹＰＥ　　　　　　　
　　　　　８　　　　　　　１０．６５ＴＡＳ／ＥＹＰ
Ｅ（２／８）　　　　　８　　　　　　　７　、９０Ｏ
Ａ／ＥＹＰＥ（２／ｌ）　　　　　８　　　　　　１０
　、７１ＥＹＰＥ：卵黄ホスファチジルエタノールアミ
ンＴＡＳ　：こはく酸水素トコフェロールＯＡニオレイ
ン酸 上記の結果から、この発明のリポソームは公知方法によ
るものに比較して大きな過酸化抑制作用を有することが
わかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られたこの発明のリポソームの
ｐ）（感受性を示すグラフである。 第２図は、実施例３．４および５で得られたこの発明の
リポソームのｐ）（感受性を示すグラフである。 第３図および第４図は、それぞれ、試験例１で測定した
公知のリポソームおよびこの発明のリポソームのｐＨ安
定性を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カルボキシ基を少なくとも２個有する低級脂肪族
   カルボン酸とトコフェロールとの酸性エステルを膜成分
   とする、リポソーム。
2. （２）請求項（１）記載の酸性エステルおよび脂質を膜
   成分とする、リポソーム。