JPH0436734B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリポソームの新規製法に関する。

更に詳しくは、本発明は(1)グリセリン、プロピ
レングリコール、１，３−ブチレングリコール、
マルチトール、ベンジルアルコール及びその混合
物から選ばれる水溶性の非揮発性有機溶媒を含有
するリポソーム懸濁液及び(2)グリセリン、ポリグ
リセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレ
ングリコール、１，３−ブチレングリコール、マ
ルチトール、ベンジルアルコール及びその混合物
から選ばれる水溶性の非揮発性有機溶媒とリポソ
ーム膜成分物質とを混合し、次いでこのものを水
性溶液に分散せしめることを特徴とするリポソー
ム懸濁液の製法に関する。

脂質の閉鎖小胞であるリポソームは元来生体膜
モデルとして広く利用されてきたが、最近ドラツ
グ・デリバリーを指向した種々の応用がなされて
いる。このリポソームの種類には大きく分けて多
重層リポソーム（MLV）、大きな一枚膜リポソー
ム（LUV）および小さな一枚膜リポソーム
（SUV）があり、それぞれ種々の調製法が既に報
告されている〔アニユアル・レビユー・オブ・バ
イオフイズイツクス・アンド・バイオエンジニア
リング、９巻、467頁（1980年）〕。しかしこれら
はいずれも試験管あるいはナス型コルベン規模の
実験室レベルでの調製方法にすぎず、既工業的生
産に結びつく製造方法ではない。これらが工業的
産に適さない理由としては(1)どの調製方法も脂質
の溶解剤としてクロロホルム、ベンゼン、エーテ
ル等の人体に望ましくない揮発性有機溶媒を使用
するため、保安上および安全作業上問題となる(2)
同じ理由で最終製品中に上記有機溶媒が残留しや
すい(3)代表的製法であるボルテクスイング
（Vortexing）法〔ジヤーナル・オブ・モルキユ
ラー・バイオロジー、13巻、238頁（1965年）〕で
はガラス壁に脂質のきれいな薄膜を形成すること
が要求されるが、これをそのままスケールアツプ
するのは技術的に困難である、などが挙げられ
る。従つて多くの研究者によりリポソームの臨床
への応用研究がなされているにもかかわらず、い
まだかつてリポソーム製剤が商品化されえない一
つの大きな要因が工業的生産の困難さにあるとい
つても過言ではない。リポソームの工業的製法と
しては最近特開昭57−136514号や特開昭57−
171915号の方法などが開示されてはいるが、前者
は界面活性剤法〔バイオキミカ・エト・バイオフ
イズイカ・アクタ、323巻、547頁（1973年）〕を、
後者はエタノール注入法〔バイオキミカ・エト・
バイオフイズイカ・アクタ、298巻、1015頁
（1973年）〕あるいはエーテル注入法〔バイオキミ
カ・エト・バイオフイズイカ・アクタ、443巻、
629頁（1979年）〕を改良したものである。そし
て、前者は脂質溶解剤として用いたエタノールを
減圧除去せねばならない、又脂質可溶化剤として
用いた界面活性剤を透析またはゲル濾過により分
離除去せねばならない等の欠点を、後者は脂質溶
解剤として用いたエタノール、ヘキサンなどの有
機溶媒を最終的に加温等により除去せねばならな
い。又有機溶媒の水溶液中への注入速度に細心の
注意が必要である等の欠点をそれぞれ持つてお
り、必ずしもリポソームの工業的生産方法として
満足できるものでない。

本発明者らはこれらの状況に鑑み、リポソーム
の工業的生産方法について鋭意検討した結果、リ
ポソームを構成する膜成分物質を水溶性でしかも
生体にとつて無害である非揮発製有機溶媒に溶解
又は膨潤せしめ、これと水性溶液とを混合し撹拌
するとき、均一なリポソームを再現性良く容易に
製することができること、更には、得られたリポ
ソーム懸濁液が、そのままの状態で優れたリポソ
ームの安定性を示すことを見出し、本発明を完成
した。本発明は、水溶性でしかも生体にとつて無
害でありそのまま最終製品に残留しても投与可能
な有機溶媒を膜成分物質の溶解剤として用いると
ころに特徴を有し、この原理自体全く新規なもの
である。しかも本発明によれば、リポソームを大
量に製する上で設備上および操作技術上何らの工
夫も必要とせず、しかも、得られたリポソーム懸
濁液は、そのままの保存状態でも優れたリポソー
ムの安定性を有する。従つて先に挙げたリポソー
ム製剤の工業的生産を困難にならしめている要
因、即ち有毒性有機溶媒使用に際しての保安上及
び安全作業上の問題、上記有毒性有機溶媒の他、
界面活性剤などの最終製品中への残留性およびス
ケールアツプに伴う設備上および操作技術上の困
難さ、は本発明によつて克服されたといえる。

本発明において使用される膜成分物質は、例え
ばホスフアチジルコリン、ホスフアチジルエタノ
ールアミン、ホスフアチジルセリン、ホスフアチ
ジルイノシトール、リゾホスフアチジルコリン、
スフインゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチ
ン等に代表されるリン脂質の他、糖脂質、ジアル
キル型合成界面活性剤等の一種又は二種以上の混
合物が主体となる。なお、これに膜安定化剤とし
てコレステロール、コレスタノール等のステロー
ル類を、荷電物質としてジセチルホスフエート、
ホスフアチジン酸、ガングリオシド、ステアリル
アミン等を、更に酸化防止剤としてα−トコフエ
ロール等を加えて膜成分物質を形成させてもよ
い。これらリポソームの膜生物物質の比率は何ら
限定されるべきものではないが、好ましくは脂質
１重量部に対しステロール類を０〜２重量部程
度、荷電物質を0.1重量部程度加えるのが適して
いる。

本発明のリポソームの製造法に使用される水溶
性の非揮発性有機溶媒としては、グリセリン、ポ
リグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロ
ピレングリコール、１，３−ブチレングリコー
ル、マルチトール、ベンジルアルコール及びその
混合物を挙げることができる。又、これらの溶媒
のうちグリセリン、プロピレングリコール、１，
３−ブチレングリコール、マルチトール、ベンジ
ルアルコール及びその混合物については、リポソ
ーム懸濁液に含有させることにより、優れたリポ
ソームの安定性を付与することもできる。これ等
有機溶媒の使用量は膜生物質に対し約１〜100重
量倍、水性溶液に対しては約0.001〜２重量倍程
度となるよう使用するのが好ましい。

なお、膜成分物質を溶解又は膨潤せしめた有機
溶媒を混合する水性溶液としては、水、生理食塩
水、緩衝液、糖液の水溶液およびこれ等の混合液
等が好ましく使用される。ここでいう溶解又は膨
潤とは膜成分物質が有機溶媒により分子レベルで
自由混合あるいは溶媒和された状態をいい、外観
上は何ら限定されない。すなわち澄明な液体状あ
るいはペースト状であれ、不透明なペースト状あ
るいは固体状であれ、これらの混合状態であれ、
膜成分物質が分子レベルで自由混合あるいは溶媒
和された状態ならば外観は全く問題としない（以
下単に混合という）。一般に膜安定化剤であるス
テロール類以外の膜成分物質は比較的容易に本発
明水溶性有機溶媒に混合しうるが、加温等の手段
を用いれば更に効率が良い。

即ち、ステロール類以外の膜成分物質は、有機
溶媒と70〜90℃くらいまで加温し撹拌することに
より、容易に混合せしめることが可能である。膜
成分物質の一成分としてステロール類を用いる場
合には、まずステロール類の融点まで有機溶媒を
加温して一度ステロール類を混合せしめ、次に70
〜90℃の温度範囲にて、他の膜成分物質を混合せ
しめることが好ましい。もちろんステロール類を
混合せしめた温度にて他の膜成分物質を混合せし
めることは可能であるが、不必要な高温に膜成分
物質をさらすことにより膜成分物質自体の分解が
生ずる恐れがあるので、より低温で混合せしめた
方が望ましいことは言うまでもない。また膜成分
物質を個々に上記方法により混合せしめ、その後
に混合しても良い。

かくして製されるリポソームに薬剤を保持させ
るには、膜成分物質を有機溶媒に混合せしめたも
のと、薬剤を含有する水性溶液とを混合し撹拌す
ればよい。この両者の混合においては混合する順
序は任意であるが、この混合、撹拌の操作におい
ては次の点に留意した方がよい。即ち ａ 一般には脂質の相転移温度（Tc）以上で行
つた方が効率は良い。従つて膜成分物質を有機
溶媒に混合せしめたものと、薬剤を含有する水
性溶媒は両者共にあらかじめ脂質の相転移温度
以上にしておくことが好ましい。

ｂ 膜成分物質を有機溶媒に混合せしめたものが
澄明な液体状あるいはペースト状を呈している
場合には、できるリポソームは比較的粒径の小
さなものとなりやすい。

ｃ 膜成分物質の有機溶媒に混合せしめたものが
不透明なペースト状あるいは固体状を呈してい
る場合には、できるリポソームは比較的粒径の
多きなものとなりやすい。

ｄ 撹拌における撹拌機の選択により、できるリ
ポソームの粒径は影響を受ける。即ちプロペラ
ミキサーの如く比較的緩和な撹拌機を用いた場
合には多きな粒径のリポソームができやすい
し、ホモミキサーの如く比較的せん断力の強い
撹拌機を用いた場合には小さな粒径のリポソー
ムができやすい。また更に小さな粒径のリポソ
ームを製するには超音波乳化機、高圧乳化機等
を用いるのも良いし、径を均一にするため限外
濾過膜法、例えばポリカーボネート製メンブラ
ン・フイルターによつて粒径分布をコントロー
ルすることも可能である。

ｅ 同一処方内で薬剤のリポソームへの保持率を
高めるには保持させる薬剤をできるだけ少量の
水性溶媒に溶かしこみ、これを有機溶媒に膜成
分物質を溶解又は膨潤せしめたものと混合し、
残りの水性溶媒は希釈に用いた方がよい。

本発明のリポソーム製剤に保持させる薬剤とし
ては特に制限はないが、サイトシンアラビノシ
ド、メトトレキセートに代表される制癌剤、ペニ
シリンＧに代表される抗生物質、インシユリン、
インターフエロン、グルコアミラーゼに代表され
るたんぱく質、デキストランに代表される多糖
類、DNA、RNAの如き核酸類、ビタミンＡに代
表されるビタミン類などの他サリチル酸ナトリウ
ムのような一般薬剤が用いられる。これ等薬剤は
前述した如く一般には水性溶媒に溶解して用いる
が、クロロフイル、グラミシジンＳ、ビタミンＡ
等に代表される膜親和制薬剤は膜成分物質と一緒
に濃グリセリン、プロピレングリコール等の水溶
性有機溶媒に混合せしめた方が効率は良い。また
水に可溶性の薬剤であつても酢酸クロルヘキシジ
ン、アセトアミノフエンの如く濃グリセリン、プ
ロピレングリコール等の水溶性有機溶媒に混合す
る薬剤の場合には、やはり膜成分物質と一緒に水
溶性有機溶媒に混合せしめて用いた方が効率は良
い。

このようにして薬剤を保持した均一粒径のリポ
ソーム製剤が再現性良くしかも大量に得られる
が、このリポソーム製剤はこのまま使用しても良
く、また透析、ゲル濾過、遠心分離等の手段によ
りリポソームに保持されなかつた薬剤を分離除去
して使用しても良い。

既知のリポソーム調製法に比して本発明法が優
れている点としては先述した他下記の点が挙げら
れる。

Γ本発明の有機溶媒はそのまま等張化剤として用
いることができる。

Γ本発明の有機溶媒は粘稠剤あるいは分散剤とし
ての働きもあるため、リポソームの凝集あるい
は沈降を防止することができ、リポソーム製剤
の安定性向上にも役立つ。

Γ本発明の有機溶媒の製剤への添加により、リポ
ソーム製剤の凍結・融解等に対する安定性も向
上する。

次に実施例により本発明を例示するが、これら
の実施例は何ら本発明を限定するものではない。

実施例 １ 濃グリセリン9.4ｇを94℃に加温し、これに完
全水添精製卵黄レシチン（IV＝１、リン脂質99
％以上、Tc＝45〜60℃、Tmax＝52℃）2.2ｇ及
びジセチルホスフエート164mgを加え撹拌し均一
に膨潤せしめた。次に60℃水浴上更に撹拌を続け
たところ試料は白色の均一なペースト状になつ
た。上記ペーストにあらかじめ60℃に保温してお
いた0.5％サリチル酸ナトリウム水溶液300mlを加
え、そのまま60℃で３分間放置してペーストを膨
潤させた。最後にこの液を60℃に保つたままホモ
ミキサーにより３分間撹拌し室温に戻したとこ
ろ、サリチル酸ナトリウムを保持した乳白色のリ
ポソーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液８mlをUCCセロフアン
チユーブ透析バツグに入れ、１の生理食塩水に
対し透析（５℃、１×１時間×６回）してリポ
ソームに保持されなかつたサリチル酸ナトリウム
を分離除去した。次いでリポソーム内に保持され
たサリチル酸ナトリウムを常法に従つて油／水配
分により水層中に抽出し定量したところ保持率は
10.0％であつた。

またこのリポソーム懸濁液を光学顕微鏡（日本
光学、広視野顕微鏡）により観察したところ、粒
径1μｍ、前後の均一な球状を呈していた。

実施例 ２ プロピレングリコール7.2ｇを水浴上にて92℃
に加温した。ここに部分水添精製卵黄レシチン
（IV＝20、リン脂質99％以上、Tc＝５〜50℃、
Tmax＝35℃）8.9ｇ及びステアリルアミン320mg
を加え澄明に溶解せしめた。このものを60℃に放
置しても試料は無色澄明のままであつた。この無
色澄明液にあらかじめ55℃に保温しておいた１％
デキストランT40水溶液300mlを加え、そのまま
50〜55℃でプロペラミキサーにより３分間撹拌し
室温に戻したところ、デキストランT40を保持し
た乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液１mlをとり、セフアロー
ズCL−4Bを用いてゲル濾過（2.2cmφ×4.2cm、
生理食塩水、５℃）し、リポソームに保持されな
かつたデキストランT40を分離除去した。次いで
リポソーム画分のデキストランT40を常法に従つ
て油／水分配により水層中に抽出し定量したとこ
ろ保持率は14.3％であつた。

またゲル濾過して得たリポソーム画分を広視野
光学顕微鏡により観察したところ、粒径が0.5〜
1μｍの均一な球状を呈していた。

実施例 ３ 実施例２と同一の諸方で行つたが、デキストラ
ンT40は高濃度水溶液で添加し膜成分物質と練合
の後水を加えて撹拌した。即ち、実施例２と同様
にまずプロピレングリコール7.2ｇ、部分水添精
製卵黄レシチン8.9ｇ及びステアリルアミン320mg
の無色澄明液を製した。別に３ｇのデキストラン
T40を40mlの水に溶解させた液を作り、60℃にて
上記無色澄明液に添加し、撹拌棒でよく撹拌した
ところ白色の粘稠液が得られた。次いでこの粘稠
液にあらかじめ55℃に保温しておいた水260mlを
加え、プロペラミキサーにより３分間撹拌し室温
に戻したところ、デキストランT40を保持した乳
白色のリポソーム懸濁液が得られた。

この液１mlをとり実施例２と同様にゲル濾過を
行なつて保持率を求めたところ19.2％であつた。

実施例 ４ 実施例２及び実施例３と同一の処方で行つた
が、デキストランT40は更に高濃度水溶液で添加
した。即ち、３ｇのデキストランT40を６mlの水
に溶解し、これを60℃にて膜成分物質の無色澄明
液に添加、練合したところ白色のペーストが得ら
れた。次いでこのペーストにあらかじめ55℃に保
温しておいた水294mlを加え、プロペラミキサー
により３分間撹拌し室温に戻したところ、実施例
３と同様の乳白色リポソーム懸濁液が得られた。

この液１mlをとり実施例２と同様にゲル濾過を
行つて保持率を求めたところ33.5％であつた。

実施例 ５ プロピレングリコール3.6ｇを160℃に加温し
た。次にコレステロール2.3ｇを加えて溶融せし
めた後そのままボルテツクスミキサーによつて振
盪してコレステロールをプロピレングリコール中
に溶解せしめた。更にこのものを60℃上放置し、
内容物を膨潤固化させた。別の容器にプロピレン
グリコール3.6ｇをとり水溶にて90℃に加温、こ
れに完全水添精製卵黄レシチン4.4ｇ及びジセチ
ルホスフエート330mgを加えた後ボルテツクスミ
キサーによる振盪を行つて溶解せしめ、60℃に放
置した。両者を混合し、これにあらかじめ65℃に
保温しておいた0.5％安息香酸ナトリウム水溶液
300mlをすばやく加え、60〜65℃においてホモミ
キサーにより３分間撹拌後室温に戻した。かくし
て安息香酸ナトリウムを保持した乳白色のリポソ
ーム懸濁液が得られた。

この液につき実施例１と同様、透析法によつて
安息香酸ナトリウムのリポソーム内への保持率を
求めたところ11.4％であつた。

また実施例２と同様に、このリポソーム懸濁液
を広視野光学顕微鏡により観察したところ、粒径
１〜数μｍの均一な球状を呈していた。なおこの
大きな球状のものは玉ねぎ状の構造を呈してい
た。

実施例 ６ プロピレングリコール7.2ｇを160℃に加温し
た。ここにまずコレステロール970mgを加えて澄
明に溶解せしめ、次いで部分水添精製卵黄レシチ
ン4.4ｇ及びジセチルホスフエート330mgを加えて
撹拌し澄明に溶解せしめた。次にこれを92℃水浴
に浸し、膜成分物質をプロピレングリコールに澄
明に溶解させたままあらかじめ55℃に保温してお
いた0.5％安息香酸ナトリウム水溶液300mlをすば
やく加え、50〜55℃にてホモミキサーにより３分
間撹拌後室温に戻した。かくして安息香酸ナトリ
ウムを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得ら
れた。

この液0.5mlをとり、セフアデツクスＧ−50を
用いてゲル濾過（１cmφ×18cm、生理食塩水、５
℃）し、リポソームに保持されなかつた安息香酸
ナトリウムを分離除去した。次いでリポソーム画
分の安息香酸ナトリウムを常法に従い定量したと
ころ、保持率は3.9％であつた。

また、このリポソーム画分を広視野光学顕微鏡
により観察したところ、粒径が0.5μｍ以下の均一
なリポソームがみられた。

実施例 ７ 実施例６のコレステロールを2.3ｇにして同様
に調製したところ、保持率は5.9％であつた。ま
たゲル濾過して得たリポソーム画分の広視野光学
顕微鏡観察の結果、粒径はやはり0.5μｍ以下であ
つた。

実施例 ８ 濃グリセリン9.4ｇを160℃に加温した。ここに
まずコレステロール1.47ｇを入れて溶融せしめ、
撹拌し充分膨潤せしめた。次に完全水添精鋭卵黄
レシチン6.7ｇ及びジセチルホスフエート490mgを
加えよく練合した。160℃においては無色半透明
のペーストであつた試料は、60℃にすることによ
り白色不透明のペーストに変化した。このペース
トにあらかじめ65℃に保温しておいた0.5％サリ
チル酸ナトリウム水溶液300mlを加え60〜65℃で
ホモミキサーにより３分間撹拌後室温に戻した。
かくしてサリチル酸ナトリウムを保持した乳白色
のリポソーム懸濁液が得られた。

この液0.5mlをとり実施例６と同様にゲル濾過
（室温）を行つたところサリチル酸ナトリウムの
リポソーム内への保持率は17.0％であつた。

広視野光学顕微鏡観察の結果では、得られたリ
ポソームの平均粒径は約1μｍ程度で比較的大き
なものを散見された。この大きなものは玉ねぎ状
の構造を呈していた。

実施例 ９ 実施例１と同様にして完全水添精製卵黄レシチ
ンの代りにＬ−α−ジパルミトイルホスフアチジ
ルコリン（純度98％、Tc−41℃）を用い、撹拌
温度40〜45℃で行つたところ、サリチル酸ナトリ
ウムを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得ら
れた。

この液につき実施例１と同様、透析法によつて
サリチル酸ナトリウムのリポソーム内への保持率
を求めたところ、13.3％であつた。

またこの液を広視野光学顕微鏡により観察した
ところ、粒径１〜数μｍの均一な球状を呈してい
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グリセリン、プロピレングリコール、１，３
   −ブチレングリコール、マルチトール、ベンジル
   アルコール及びその混合物から選ばれる水溶性の
   非揮発性有機溶媒を含有するリポソーム懸濁液。 ２ グリセリン、ポリグリセリン、プロピレング
   リコール、ポリプロピレングリコール、１，３−
   ブチレングリコール、マルチトール、ベンジルア
   ルコール及びその混合物から選ばれる水溶性の非
   揮発性有機溶媒とリポソーム膜成分物質とを混合
   し、次いでこのものを水性溶液に分散せしめるこ
   とを特徴とするリポソーム懸濁液の製法。