FI107696B - Lipidipartikkelinmuodostusmatriisi ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents

Description

107696

Lipidipartikkelinmuodostusmatriisi ja menetelmä sen valmistamiseksi 5 Johdanto Tämä keksintö koskee lipidimatriisejä, jotka aikaansaavat bioaktiivisten aineiden vapautumisen muodostamalla erään-tyyppisiä liposomeja in vivo, kun matriisit ovat vuorovaikutuksessa veden kanssa. Näin in vivo muodostunut pallomainen 10 lipidikaksoiskerros, jota kutsutaan tämän jälkeen nimellä biosomit (tai lipidipartikkeli) ja lipidimatriisi, jota kutsutaan nimellä biosominmuodostusmatriisi (BFM), pitäisi erottaa hyvin vakiintuneesta liposomien tai liposomiteknologian käsitteestä, joka määritellään lipidirakkuloiden rauo-15 dostuntiseksi vesifaasissa tai pakastekuivatussa muodossa, joka on jo muodostettu in vitro ennen antoa. Keksintö koskee myös näiden lipidimatriisien (BFM) valmistusta ja käyttöä.

Tausta • · i’.| 20 Parenteraaliset varas to järjestelmät ovat ammattimiesten laa- jalti tuntemia, ja ne ovat hyvin hyväksyttyjä käsitteitä ··· lääkkeiden pitkäaikaisvapauttamiseen. Nämä järjestelmät pe- ···· rustuvat biohajoaviin polymeerijärjestelmiin tai lipidifor- • .·. : mulaatioihin, esimerkiksi öljyliuoksiin ja öljysuspensioi- • · · 25 hin. Molemmilla järjestelmillä on kuitenkin vakavia haitto- • · · ja, koska, kun lääkkeenvapautusprosessi on päättynyt, lipidi- tai polymeerikantajat ovat edelleen injektiokohdassa *·]/ pitkän aikaa ja joistain järjestelmistä, kuten siirrännäistä • · · *.* * ne voidaan jopa joutua poistamaan kirurgisella toimenpiteel- : 30 la. Lisäksi joko öljyjen tai biohajoavien polymeerien, kuten polymaito-/polyglykolihapon, annolla on rajallisesti sovel- • · · ·. lutuksia, koska kumpikin vaatii bioaktiivisen materiaalin • · · *·:·[ spesifisiä fysikokemiallisia ominaisuuksia sisällytettäväksi * * järjestelmiin, esimerkiksi liukoisuus tai stabiilisuus/yh- 35 teensopivuus.

Siten parenteraalinen terapia tarvitsee bioaktiivisia materiaaleja varten vapautusjärjestelmää, joka on sovel1ettavis- 2 107696 sa sekä erittäin polaarisille että ei-polaarisille bioaktiivisille materiaaleille, joille vapautusjärjestelmällä nähdään sisäinen nopeutta kontrolloiva mekanismi lääkkeen vapautumiselle, jota voidaan vaihdella laajalla aikavälillä.

5 Tällaisen vapautusjärjestelmän ominaispiirteen pitäisi olla, että sekä lääkkeen vapautumisen että biohajoamisen pitäisi tapahtua samanaikaisesti.

Koska hoitavien lääkärien ja sairaanhoitajien on usein suo-10 ritettava bioaktiivisten materiaalien parenteraalinen anto, ja johtuen tosiseikasta, että useat ihmiset kokevat tällaisen terapian epämiellyttäväksi, tehdään paljon ponnisteluja lääkkeenvapautusmuodojen kehittämiseksi, jotka voidaan soveltaa muille antoreiteille. Silti tavallisin antoreitti on 15 enteraalinen (oraalinen, rektaalinen), mutta viimeisen vuosikymmenen aikana on tehty useita yrityksiä intranasaalisten tai transdermaalisten vapautusjärjestelmien kehittämiseksi vaihtoehdoiksi parenteraaliselle reitille.

20 Adsorptio biologisten membraanien läpi on kuitenkin hyvin monimutkainen prosessi johtuen erilaisten ohitettavien membraanien vaihtelevasta luonteesta. Useat enteraalisesti :.*·· annettavilla lääkkeillä nähdään myös korkea biotransformoi- : tuminen absorboituessa ruoansulatuskanavasta, tai niillä ··· 25 nähdään rajallinen tai säännötön abrorptiokapasiteetti joh- • · · · ;\j tuen niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista, molekyyli- • · : koosta tai herkkyydestä biohajoamisprosesseille suolessa, • · · tai johtuen jostain spesifisestä absorptiomekanismista ruo- • ♦ « ansulatuskanavan rajoitetuissa osissa. Myös intranasaalises-30 ti tai dermaalisesti annetulla bioaktiivisella materiaalilla • · • · · *· *’· voidaan nähdä säännötöntä tai epäsäännöllistä abrsorptiota, : ja siten useat vapautus f ormulaatiot tarvitsevat absorp- tionedistäjiä, joiden on joissain tapauksissa osoitettu .·*·. olevan turmiollisia nenän limakalvolle tai iholle johtuen 35 paikallisista sivuvaikutuksista.

• · • · • ·· Tästä säännöllisyyden puutteesta johtuen enteraalinen/nasaa- 3 107696 linen/dermaalinen terapia tarvitsee vapautusjärjestelmää, joka poistaa vaihtelevuuden ja joka on riittävän joustava erilaisten bioaktiivisten materiaaline sisällyttämiseen, riippumatta niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista, 5 molekyylikoosta tai alkuperästä, erityisesti sellaisille bioaktiivisille materiaaleille, joita ei nylyisin voida antaa enteraalista reittiä rajallisesta absorptiokapasitee-tista johtuen.

10 On julkaistu useita julkaisuja, jotka osoittavat lipidien vaikutuksen lääkkeen absorptioon. On kuitenkin saatu erilaisia tuloksia, jotka osoittavat lisääntyneen oraalisen absorption joko ihmisessä tai eläimissä, esimerkiksi: 15 - greseofulviini öljy-vedessä-emlsiossa (Bates ja Segueria, J. Pharm. Sei. 64 (1975) 793), - sefoksitiini öljy-vedessä-emulsiossa (Palin et ai., Int.

J. Pharm. 33 (1986) 99), - insuliini forfatidyylikoliini/kolesterolin liposomeissa, 20 samoin kuin vesi-öljyssä-mikroemulsiossa (Patel ja Rymaii, FEBS Letters 62 (1976) 60; Cho ja Flynn, Lancet 1989, jouku-kuu 23/30), : ·.: - syklosporiini mikroemulsiossa (Tarr ja Yalkowsky, Pharm.

« · : Res. 6 (1989) 40), « · · · 25 - insuliinin lisääntynyt nasaalinen absorptio rotissa liuok- .·.**: sessa lysofosfatidyylikoliinin kanssa (Ilium et ai., Int. J.

’:/! Pharm. 57 (1989) 49).

• · · • · • · · ’·* ’ Propranololilla havaittiin vähentynyt absorptio kookosöljys- 30 sä (Palin et ai., J. Pharm. Pharmacol. 41 (1989) 579), tai • · ei lainkaan vaikutusta K-vitamiinille lisättynä sekamisel- • · · V ’ leihin, jotka perusatuvat glykolaattiin ja lesitiiniin (Winn :·. et ai, J. Pharm. Pharmacol. 41 (1989) 257). Lisäksi Rowland • ♦ * !*··. ja Woodley (Biochim. Biophys. Acta 620 (1980) 400) ovat φ · *!* 35 osoittaneet, että useat liposomaaliset järjestelmät ovat • · · melko epästabiileja ruoansulatuskanavassa, ja että li-posomeihin sisällytetyt lääkkeet antopivat saman absorption 4 107696 verrattuna vapaaseen lääkkeeseen sinänsä. Viime aikoina on osoitettu termodynaamisissa tutkimuksissa, että liposomeihin suljettu ihmisen insuliini/DEAE/dekstraani-kompleksi voi edustaa stabiilimpaa järjestelmää kuin kompoleksoimaton 5 ja/tai sulkematon ihmisen insuliini. Ei ole kuitenkaan esitetty todisteita siitä, että tämä todella toimii in vivo (Manosroi et ai., Drug Dev. Ind. Pharm. 16 (1990) 837).

Joissain tapauksissa on terapeuttista tarvetta antaa bioak-10 tiivisia materiaaleja paikallisesti, kuten haavoihin tai leukkauksen jälkeen, tai palovammojen hoitoon. Näissä tapauksissa esiintyy tarvetta vapauttaa bioaktiivinen materiaali paikallisesti samoin kuin pidennetyn ajanjakson kopnt-rolloidusti, koska kirurgian jälkeen tällainen formulaation 15 anto ei ole mahdollista, ja kuten palovammojen kohdalla kipu voi aiheuttaa vakavaa vaivaa potilaalle toistuvien antojen kohdalla. Lisäksi paikallisella annolla kehon muille alueille kuten vaginaan pidennetyllä lääkkeen vapautumisella voi olla terapeuttisia etuja.

20

Ammattimiehet tietävät, että biologisia materiaaleja voidaan sulkea ainutlaatuisiin lipidi/vesi-pallorakenteisiin, jotka määritellään liposomeiksi. Liposomi määritellään rakenteek- ::: si, joka koostuu 1 tai useasta samankeskisestä lipidikak- ··· 25 soiskerroksesta, jotka vesi- tai vesipohjaiset puskuriosas-• · · tot erottavat. Näin pitkälle liposomin muodostaminen ja • · : siten valmistus on rajoittunut tekniikkoihin, joissa mainit- • · tu muodostaminen suoritetaan in vitro.

• · » . . 30 Liposomeista on julkaistu lukuisia patenttijulkaisuja ja • 1 1 l”· tieteellisiä artikkeleita, ja tekniikan ala erilaisten lipi- ♦ · · ’·' 1 di johdannaisten käyttämiseksi yhdistelmänä amf ifaattisten ·1·.. yhdisteiden kuten fosfolipidien kanssa on ammattimiesten .**·. hyvin tuntema. Liposomeja voidaan valmistaa eri tavoilla • · · .·. 35 käyttämällä liuottimia, alennettua painetta, 2-faasijärjes- • · *···1 telmiä, pakastekuivausta, sonikointia ja vastaavia. (Weiner 1 et ai., Drug Dev. Ind. Pharm. 25 (1989) 1523). Näille mene- 5 107696 telmille käytetty prosessiteknologia on erittäin monimutkaista. Johtuen erityisestä vaatimuksesta lääkemolekyylin fysikokemiallisten ominaisuuksien suhteen stabiilien li-posomirakenteiden muodostamiseksi vain rajallisen määrän 5 ehdokaslääkkeitä on osoitettu olevan sovellettavissa li-posomeissa in vitro. Liposomien tärkein sovellutus tähän asti on rajoittunut parenteraaliseen vapauttamiseen ja kosmeettisiin ihonhoitotuotteisiin, vaikka on tehty pyrkimyksiä muita antoreittejä kuten oraalista,. nasaalista, pulmonaaris-10 ta varten. Parenteraaliseen käyttöön tarkoitetut sovelletuk-set ovat keskittyneet laskimonsisäiseen antoon ja lääkkeen kohdistamiseen, ja hieman vähäisemmässä määrin pidennettyyn tai kontrolloituun vapautumiseen varastosta. Tähän asti liposomien sovellutukset rajoittuvat bioaktiivisten materi-15 aalien muodostamiseen ja sisällyttämiseen in vitro.

Yesair (W0 86/056694) on kuvannut koostumuksen lääkkeiden oraaliseen vapauttamiseen, sisältäen esteröimättömiä rasvahappoja, monoglyseridejä rasvahappojen kanssa, joissa on 20 14 - 18 hiiliatomia, fosfatidyylikoliiniin, jossa rasvahap- pokomponentissa on 14 - 18 hiiliatomia, ja lääkettä. Mikään näistä yksiketjuisista komponenteista ei ole kaksoiskerrosta : ·.· muodostavia, mikä on välttämätöntä ainakin yhdelle lipidi- • · • komponenteista tässä keksinnössä.

• ·· · • 25

··· Λ» tJ

US-patenttijulkaisussa 46100868 kuvataan tapa valmistaa • · · l | liposomeja, joihin sisällytetään vesiliukoisia yhdisteitä.

Tämä patenttijulkaisu käsittelee kuitenkin pallomaisia ra- • · · *·’ * kenteita, jotka ovat läsnä alusta lähtien, vastakohtana 30 tälle keksinnölle. Mainitussa keksinnössä käytetään menetel- • · mässä myös orgaanisia liuottimia, mikä on castakohta tälle • · · V : keksinnölle, jossa biosomit muodostuvat spontaanisti ilman mitään kemiallista tai fysikaalista käsittelyä tai aloitus- • · · ... ta.

V 35 • · ·

Muita liposomien valmistusta kuvaavia asiakirjoja ovat EP-patenttijulkaisu 158441, EP-patenttijulkaisu 260241 ja 6 107696 W087/07502. EP-patenttijulkaisun 158441 mukaan, vastakohtana tälle keksinnölle, ainakin yhtä veteensekoittuvaa nestettä (esimerkiksi glyseroli, etanoli) ja 5 - 40 % vettä pitäisi lisätä ainakin yhteen membraanilipidiin (esimerkiksi fosfo-5 lipidit kuten soijalesitiini ja munankeltuaisen lesitiini. EP-patenttijulkaisussa 260241 kuvataan kuiva lipidipohjainen kiinteä materiaali, joka muodostaa tai uudelleenmuodostaa liposomeja veden läsnä ollessa. Tämän koostumuksen pitäisi olla dehydratoitua esimerkiksi lyofilisoimalla tai sumutus-10 kuivauksella, mikä ei saisi tuhota liposomirakennetta. Siten liposomirakenne on läsnä alusta lähtien, vastakohtana tälle keksinnölle. WO-patenttijulkaisussa 87/07502 kuvataan pro-liposomiformulaatio, joka sisältää ainakin yhtä haihtuvaa nestemäistä ponneainetta ja ainakin yhtä lipidikomponenttia.

15 Myös tässä tapauksessa erilliset partikkelit muodostetaan dehydratoimalla ja siten liposomit ovat läsnä alusta.

Nykyinen hyvin tunnettu liposomiteknologia, jossa järjestelmät valmistetaan in vitro ennen antoa, kärsii haitasta, että jär- • · ·’.**: 20 jestelmät ovat melko epästabiileja, ja tekijät kuten lämpötila : : : tai formulaatiossa läsnä olevat muut ainesosat voivat muuttaa • · · i *:· liposomien luonnetta dramaattisesti vahingoittamalla kaksois- ;*·.· kerroksia irreversiibelisti. On myös tunnettua (katso Weiner • · : edellä), että raa'öistä munankeltuaisfosfatideista koostuvat • · · • · 25 liposomit eivät ole fysikaalisesti stabiileja in vitro ympä- • · · ristön lämpötiloissa useampia kuin muutamia kuukausia, mikä ... rajoittaa näiden formulaatioiden soveltamista rutiininomaiseen • · · käytäntöön. Käyttämällä keksinnön mukaista matriisia edellä • · · *·[ ’ mainitut stabiilisuusongelmat voidaan välttää.

: 30 «»·

Edellä mainittuihin ongelmiin ja tarpeisiin voidaan vastata • · · *. käyttämällä tässä patenttihakemuksessa kuvattua vapautusjär- • · · jestelmää. Tällä keksinnöllä, joka liittyy biosominmuodos-tukseen in vivo, on etuja jo hyvin tunnettuihin lipidilääk-35 keenvapautusjärjestelmiin verrattuna.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

7 107696 Tämä keksintö kuvaa tavan valmistaa, käyttää ja/tai hyödyntää sulkemis- tai adsorptiomenettelytapaa bioaktiivisille aineille ainutlaatuisiksi lipidimatriiseiksi. Tällainen yhdistelmä on tarkoitettu käytettäväksi farmaseuttisena formu-5 laationa ihmis- ja eläinlääketieteessä, maataloudessa, tai kosmeettisina tai elintarvike/ravitsemusformulaatioina.

Kuvassa 1 esitetään mikroskooppivalokuva esimerkin 9 mukaisesta formulaatiosta.

10

Kuvassa 2 esitetään mikroskooppivalokuva esimerkin 10 mukaisesta formulaatiosta.

Keksinnön kuvaus 15 Keksinnön mukaisesti lipidipartikkelin muodostavalle matriisille on tunnusomaista, että ainakin kahden eri polaarisuu-den omaavista luokista valitun määritellyn lipidikomponentin järjestelmästä, jossa ainakin yksi lipidikomponenteista on kaksoiskerroksen muodostavaa, muodostuu spontaanisti erilli- • · 20 siä lipidipartikkeleita sen ollessa vuorovaikutuksessa vesi- • · jjj järjestelmien ylimäärän kanssa. Määritelty lipidikomponentti ·;· on lipidi, jonka kemiallinen koostumus on tunnettu ja kont- • · · · :*·.· rolloitu. Järjestelmässä ainakin yksi lipidikomponenteista • · .·.: on amfifaattinen ja polaarinen, ja yksi on ei-polaarinen.

.*:·! 25 • · ·

Amfifaattinen ja polaarinen komponentti on edullisesti fos- ... fatidyylikoliini, ja ei-polaarinen lipidi on edullisesti • · · *;]/ luokista mono-, di- ja triglyseridit ja näiden seokset. Huo- • · « *·* * neenlämpötilassa lipidipartikkelinmuodostusmatriisilla on : 30 nestemäinen tai puolikiinteä koostumus.

• · · • m· • · • · • · t *. Polaarisen lipidiluokan komponenttien määrän pitäisi olla • « · ***\ alueella 5 - 80 % (paino/paino) lipidijärjestelmästä, edul lisesti alueella 10 - 60 % (paino/paino).

Polaarisen ja amfifaattisen lipidiluokan komponenttien määrän pitäisi olla alueella 5 - 80 % (paino/paino) lipidijärjestelmästä, edullisesti alueella 25 - 50 % (paino/paino).

35 8 107696

Lipidipartikkelinmuodostusmatriisi on tarkoitettu sisältämään bioaktiivisia materiaaleja, jotka voitaisiin valita ryhmistä lääkkeet, herbisidit, pestisidit, lannoitteet, elintarvike- ja kosmeettiset valmistusaineet tai lisäaineet. 5 Bioaktiivisen materiaalin määrä on alle 70 % (paino/paino) matriisista, edullisesti alle 50 % (paino/paino).

Lipidipartikkelinmuodostusmatriisissa erilliset partikkelit muodostuvat matriisista spontaanisti ilman mitään kemiallis-10 ta tai fysikaalista käsittelyä tai aloitusta.

Lipidipartikkelinmuodostusmatriisin valmistuksessa amfifaat-tinen ja polaarinen tai ei-polaarinen lipidi sekoitetaan bioaktiivisen materiaalin kanssa sinänsä, tai liuoksessa, ja 15 edullisesti ei-polaarinen lipidi tai lipidit sekoitetaan bioaktiivisen materiaalin ja amfifaattisen ja polaarisen lipidin tai lipidien seokseen.

Lipidipartikkelinmuodostusmatriisi on tarkoitettu käytettä- • · V·· 20 väksi väliainejärjestelmänä bioaktiivisille materiaaleille :j'j ja erityisesti farmaseuttisissa koostumuksissa, kuten oraa- ··· lisissä, rektaalisissa, nasaalisissa, vaginaalisissa, oku- • · · · ;\{ laarisissa tai parenteraalisissa väliaineissa, ihovoiteissa, • · .·. : voiteissa, kapseleissa ja tableteissa, ja valmistettaessa • · .·;·. 25 farmaseuttista koostumusta enteraaliseen, parenteraaliseen, • ta nasaaliseen, intravaginaaliseen, okulaariseen antoon tai an- ... toon paikallisesti iholle, haavoihin tai limakalvoille.

• · · • · · • · · • · · *·* Ominaisuus "kaksoiskerroksen muodostava" on hyvin tunnettu : 30 fysikaalinen parametri, ja se voidaan helposti osoittaa so- ·· · pivilla fysikokemiallisilla menetelmillä (esimerkiksi pinta- • · · *. tasapainomenetelmä). Muodostuneiden erillisten lipidipartik- • · * **··] kelien osoittaminen voidaan tehdä fysikaalisilla ja/tai ke miallisilla menetelmillä, kuten mikroskopia polarisoitua 9 107696 valoa käyttämällä, tai diffraktiomenetelmillä.

Tämä keksintö koskee lipidimatriiseihin suljettavia bioaktiivisia materiaaleja, eikä se rajoitu mihinkään bioaktiivi-5 sen materiaalin erityiseen luokkaan fysikokemiallisia ominaisuuksia, molekyylikokoa tai alkuperää ajatellen, ts. synteettisiä, bioteknologisia materiaaleja ja vastaavia. Lipidikoostumuksen vaihtelu antaa käyttöön kontrollimekanismin, jolla biosomit muodostetaan ja täten kontrollimekanis-10 min biosominmuodostuksen nopeudelle, joka toimii kontrolloivana tekijänä suljettujen tai liittyneiden bioaktiivisten materiaalien joko välittömälle tai ylläpidetylle vapautumiselle .

15 Keksinnön mukainen matriisi voidaan määritellä vain patent-tivaatimukasessa 1 esitetyssä yleisessä mielessä. Keksinnön mukaisen matriisin ja jo tunnettujen lipidijärjestelmien välinen ero on kyky muodostaa biosomeja spontaanisti kontaktissa vesiväliaineen ylimäärän kanssa. Siten keksinnön mu-20 kainen järjestelmä voidaan saavuttaa a) käyttämällä hyvin määriteltyjä lipidikomponentteja ainakin kahdesta eri lipi-: ·.: diluökasta ja b) suunnittelemalla nämä lipidikomnponentit • ainutlaatuisiksi lipidimatriiseiksi, jotka muodostavat bio-»·· · .:. some ja in vivo ollessaan vuorovaikutuksessa veden kanssa.

• · ·· • · 25 • · · • · · j Bioaktiivinenn materiaali määritellään keksinnön suoja-alan • · · puitteissa laajimmassa mielessään, kuten biologisesti aktii- • · · *** * vinen aine, jolla on vaikutusta ja/tai jota käytetään ihmis- ja/tai eläinlääketieteessä, kosmetiikassa samoin kuin maata- • · *.**: 30 lousaloilla (pestisidit, herbisidit ja/tai lannoitteet).

• · · · Mukaan luetaan myös alueet kuten elintarvike.

• ♦ • · • · · ... Voidaan käyttää mitä hyvänsä bioaktiivisen aineen. tyyppiä.

• · *Γ Siten tämä keksintö kohdistuu lipidipartikkelinmuodostusmat- • · · *...· 35 riisien periaatteeseen, jotka matriisit voivat sisältää *i**: bioaktiivista ainetta, jossa mainittu bioaktiivinen aine ja siten biosominmuodostusmatriisirakenne perustuvat eri mat- 10 107696 riisikomponenttien fysikokemiallisiin ominaisuuksiin.

Ammattimiehelle on selvää, ettei näitä aineita millään lailla rajoiteta käyttöön yllä mainituilla alueilla, aineita 5 voidaan käyttää ja käytetään muihin tarkoituksiin tai hoi-donsyihin kuin yllä kuvatut. Lisäksi ihmis- ja eläinlääketieteessä voidaan käyttää farmakologisesti aktiivista ainetta, suolaa, solvaattia, enantiomeeriä tai näiden polymorfia, mukaan lukien aineet, jotka ovat alkuperältään synteettisiä 10 tai biosynteettisiä. Maatalousaloilla voidaan käyttää aineita, joita käytetään herbisideinä tai aineina, jotka toimivat kasvien stimuloijina. Mukaan luetaan myös aineet, joilla on vaikutusta erilaisiin parasiitteihin (pestisidit). Elintarvikealalla keksintöä voidaan käyttää sisällyttämään lisäai-15 neita, kuten vitamiineja, säilöntäaineita, nausteita tai muita maunkantajia suojaamaan ja/tai vapauttamaan tällaisia aineita elintarvikkeen kulutuksen tai varastoinnin yhteydessä.

20 Käytetään seuraavia määritelmiä: lipidit - yleisnimi luonnollisille tai synteettisille yhdis-teille, jotka koostuvat asyylinkantajista, kuten glyseroli, : kolesteroli ja vastaavat tai näiden johdannaiset, joihin on «t · · ··· liittynyt tai voisi liittyä 1 tai useita rasvahappoja. Mu- • · · · .·. : 25 kaan voidaan lukea myös samanlaiset molekyylit, jotka sisäl-• · ; tävät oleellisen hiilivetyosan.

• ·· • · • · · • ♦ · • · ♦ * Biosominmuodostusmatriiseihin (BFM) käytetyt lipidit voidaan luokitella polaarisuutensa mukaan eri lipidiluokkiin, ts.: • · · *. *: 30 • · · *.· · ei-polaariset lipidiluokat - näissä ei ole polaarisia pääty- # ryhmiä. Esimerkkejä ei-polaarisista ainesosista ovat hiili- ..... vedyt, tai turpoamattomat amfifiilit, kuten mono-, di- ja ♦ · [♦’ triglyseridit, kolesteroli, rasva-alkoholit tai kolestero- 35 liesterit.

0 • · polaariset lipidiluokat - näissä on polaarisia päätyryhmiä 11 107696 ja niillä on pinta-aktiivisuutta, kuten fosfolipidit tai glykolipidit. Riippuen erityisistä vuorovaikutuksistaan veden kanssa ne jaetaan edelleen turpoavien ja liukoisten amfifiilien alaluokkiin.

5 amfifaattiset tai amfifiiliset lipidiluokat - kuten fosfolipidit ja glykolipidit, ollen pinta-aktiivisia.

kaksoiskerroksenmuodostuslipidiluokat - amfifaattisaet lipi-10 dit, kuten PC (fosfatidyylikoliini), sfingomyeliini, PI

(fosfatidyyli-inositoli), joilla on molekyyligeometria, joka johtaa suesien kaksoiskerrosrakenteisiin veden läsnä ollessa.

15 BFMiään käytetyt lipidit koostuvat seoksesta lipidiluokkia, joille ovat tunnusomaisia niiden erilaiset polaarisuudet.

Polaariset lipidit, kuten fosfolipidit tai glykolipidit ja ei-polaariset lipidit, kuten mono-, di- ja triglyseridit, ovat järjestelmässä tärkeimmät ainesosaset, mutta voidaan 20 käyttää myös steroleja, rasvahappoja, rasva-alkoholeja ja näiden estereitä, samoin kuin muita lipidiluokkia. Tätä :.1·· hyvin määriteltyä lipidien seosta eri yllä määritellyistä : luokista ei pitäisi sekoittaa kaupallisten tuotteiden kuten ··· soijaöljyn, maissiöljyn tai soijalesitiinin ja munalesitii- : 25 nin kanssa. Hyvin määriteltyjen lipidiluokkien saamiseksi • · .·. : kaupallinen materiaali kuten öljy tai lesitiini fraktioi- • · ♦ daan, ja eri lipidiluokat sekoitetaan tavalla, joka selite- • · « tään yksityiskohtaisemmin alla olevissa esimerkeissä.

• · • · · *. ·: 30 Lisäksi lipidien johdannaisia voidaan käyttää yhdistelmänä • 1 » *.1 1 yllä olevien lipidien kanssa. Yksi esimerkkis tästä on poly- etyleeniglykoli, joka liitetty fosfatidyylietanoliamiiniin, .···. jonka on osoitetttu pidentävät liposomien kiertoaikaa veri- • · · m1mt virtaan injisoimisen jälkeen. Toinen esimerkki tällaisesta • · *...1 35 johdannaisesta on palmitoyylikarnitiini, joka toimii bioak- 1’ tiivisille aineille absorption edistäjänä suolessa.

12 107696

Edullisessa tavassa BFM;n muodostuksen aloittamiseksi bioaktiivinen aine sekoitetaan valittuun lipidiin, minkä jälkeen seuraa erilaisen polaarisuuden omaavan lipidin sekoittaminen. Tätä polaarista/ei-polaarista muutosta voidaan jatkaa 5 niin monta kertaa kuin erityisessä tapauksessa on välttämätöntä, käsittäen erilaiset polaarisuudet omaavien lipidien alueen.

Edullinen tapa bioaktiivisen aineen, sisällyttämiseksi 10 BFMiään on sekoittaa bioaktiivinen aine amfifiilisiin lipi-deihin homogeenisen formulaation luomiseksi, jossa amfifii-listen lipidien määrä on yleensä kokonaisalueella 5 - 80 % (paino/paino). Tällaisen amfifiilisen lipidin pitäisi pystyä muodostamaan spontaanisti kaksoiskerroksen. Esimerkkejä 15 siitä ovat amfifiiliset ja polaariset lipidiluokat, kuten fosfatidyylikoliini, fosfatidyyliglyseroli, fosfatidyyli-inositoli tai fosfatidyyliseriini tai näiden seokset.

Vmfifiili(e)n välittömän vuorovaikutuksen eksogeenisen veden 20 kanssa estämiseksi tai viivyttämiseksi BFM:n pitäisi sisältää myös yhtä tai useaa ei-polaarista lipidiluokkaa. Esi- 9 ϊ.*·· merkkejä tällaisista ei-polaarisista lipideistä ovat mono-, : di- tai triglyserolit, kolesteroli tai sen esterit.

• · « • · · · .*.J 25 BFMsssä voi olla läsnä pieniä määriä (ei riittävästi bioso-• · .·. : min muodostukseen) endogeenistä vettä, etanolia tai muita • ·· ·.·' liuottimia, jos bioaktiivinen aine vaatii tällaisen soivaa- • · · ' ^ • · · tin sisällyttämistä.

• « • · · *· *' 30 BFM:n suunnitteluun ei ainoastaan kuulu lipidiluokkien kun- • · · *·* * nollinen valinta ja/tai yhdistäminen, jokaisen bioaktiivisen aineen liuotusta varten räätälöitynä, vaan myös rasvahappo- .**·. jen jakauman kunnollinen valinta, ts. asyyliryhmät, jotka • · · ovat kiinnittyneet käytettyihin lipidiluokkiin. Asyyliryhmi- • · *...' 35 en vaihtelu antaa erilaiseia fysikokemiallisia ominaisuuk- *’** siä, kuten alla olevista esimerkeistä nähdään.

13 107696

Vaihtelemalla täekeinunän kaksoiskerroksenmuodostuslipidiluo-kan geometristä muotoa, ts. tehokasta päätyryhmäaluetta suhteessa hiilivetyhäntien steeriseen konformaatioon, nopeuteen jolla biosomit muodostuvat BFMsstä määrätyssä vesi-5 pohjaisessa ympäristössä voidaan vaikuttaa, ja sitä voidaan kontrolloida.

Toinen tapa biosomien muodostukseen vaikuttamiseksi ja sen kontrolloimiseksi on vaihtelemalla hiilivetyketjujen raken-10 teeseen, siten sen fluidisuuteen, BFM:n ei-polaarisessa osassa. Tämä vaikuttaa sisäisten amfifiilisten lipidien ja ulkoisen vesiväliaineen vuorovaikutuksen nopeuteen.

Siten vaaditaan lipidin ainesosasten huolellista valintaa 15 erityiseen BFM:ään a) bioaktiivisen yhdisteen sisällyttämiseksi in vitro ja b) bioaktiivisen komponentin vapauttamiseksi biosominmuodostuksella in vivo. Tähän liittyy lipidi-luokkien samoin kuin rasvahappotähteiden valinta, ja vaatii sen vuoksi analuyyttisesti puhtaiden ja hyvin karakterisoi-20 tujen lipidien saatavuutta. Alla olevat esimerkit kuvaavat matriisien vaihtelua lipidien ja niiden yhdistelmien valin- :.*·· nalla keksinnön suoja-alaa rajoittamatta.

• · • · a • * · ··· ♦ ··· Siten keksintö koskee erityisesti BFM: n suunnittelua ja • · · · 25 käyttäytymistä, mikä on uusi käsite bioaktiivisten materiaa- • · lien lääkkeenvapautukseen. Keksintö ei rajoita BFM s n käyttöä mihinkään erityiseen antoreitrtiin, koska BFM:llä nähdään • · « mahdollisia käyttöjä erilaisille lääkkeenvapautusmuodoille, . . kuten oraalisten, rektaalisten, nasaalisten, dermaalisten ♦ · · 30 formulaatioiden absorption edistäminen, tai kontrolloitu • ♦ * *** * vapauttaminen parenteraalisesti tai paikallisesti, esimer- kiksi vaginassa tai haavoissa.

• · · • · • · • · «

Biosomien muodostuksen jälkeen in vivo, kontrolloitavan • · ’···* 35 nopeuden avulla, BFM:ään suljetut, tai siihen assosioituneet ***** * * lääkemolekyylit vapautuvat nopeasti kun biosomit ilmestyvät verenkiertoon jotta lääke voisi vaikuttaa farmakologisesti.

14 107696 Tätä oletusta tukee se tosiseikka, että liposomaalisten rakenteiden tiedetään olevan nopeasti vuorovaikutuksessa plasmaproteiinien kuten albumiinin, transferiinin ja makro-globuliinien kanssa, mutta ne myös hydrolysoituvat in vivo 5 spesifisillä fosfolipaaseilla (Wiener et ai., Drug Dev. Ind. Pharm. 15 (1989) 1523). Siten keksinnön mukaisesti voidaan välttää sideaineyhdisteiden (mortar compounds) käyttö.

Keksinnön mukaisesti on joustavalla tavalla mahdollista 10 sisällyttää lipidimatriisirakenteeseen sekä erittäin polaarisia samoin kuin ei-polaarisia bioaktiivisia materiaaleja, ei-polaaristen lipidien ja amfifaattisten yhdisteiden yhdistelmällä, ja että nämä lääkettä sisältävät BFM't muodostavat biosomeja kun BFM't ovat vuorovaikutuksessa veden kanssa 15 muodostaen siten lääkkeenvapautusjärjestelmän, joka soveltuu joko lisääntyneeseen tai kontrolloituun suonenulkoiseen absorptioon tai kontrolloituun parenteraaliseen lääkkeen vapautumiseen yhdistettynä biohajoamisen kanssa.

20 Tämä keksintö aikaansaa parannetun ja joustavan lääkkeenvapautus järjestelmän, joka on sovellettavissa erilaisille *.*·: bioaktiivisten materiaalien luokille. B12-vitamiinin (syano- • · ·.· * kobolamiini) in vitro-vapautumiskokeet ovat osoittaneet, ..il* että on mahdollista saada BFM'iä, joilla on erilaiset bioso- :*·.· 25 minmuodostusnopeudet BFM-koostumuksen funktiona. Lisäksi • a ./. : parewnteraalinen lääkkeenvapautus kontrolloidulla vapautumi- • · sella on havaittu myös erittäin vesiliukoisella bioaktiivi- • a · sella materiaalilla, kuten frakmentoidulla hepariinilla (FragminR) tätä keksintöä käyttämällä. Tällaista erittäin a *« 30 hydrofiilisen bioaktiivisen aineen yhdistelmää hydrofobisen • · · **! ‘ väliaineen kanssa ei ole tähän mennessä vielä näytetty.

:*·.. Ammattimiesten on pidettävä tätä keksinnön lipidilääkkeenva- pautusväliaineen (ts. BFM) uutta ja ainutlaatuista ominai- • ·· .!. suutta erittäin ennustamattomana. Tämän varmistavat tulokset a a ’···] 35 esitetään esimerkeissä 9, 10 ja 15. On myös osoiotettu ole van mahdollista sisällyttää synteettistä pienimolekyylipai-noista ainetta, ts. buspironia (esimerkki 22) samoin kuin 15 107696 suurimolekyylipainoista yhdistettä, ts. koentsyymiä Q10 (vertaa esimerkki 23).

Sisällyttämällä tässä keksinnössä lipidimatriisiperiaatteen 5 mukaisia bioaktiivisia materiaaleja saavuretaan seuraavat edut verrattuna tavanomaisiin farmaseuttisiin annosmuotoihin tai vapautusjärjestelmiin: - lipidimatriisista ja bioaktiivisesta materiaalista koostuit) va lääkkeenvapautusjärjestelmä, joka voidaan suunnitella joustavalla tavalla, osoittaen ainutlaatuisen kapasiteetin joko polaaristen tai ei-polaaristen bioaktiivisten materiaalien sisällyttämiselle, jotka bioaktiiviset materiaalit esittävät laajaa molekyylipainojen aluetta materiaalien 15 kemiallista rakennetta ja siten biologista aktiivisuutta muuttamalla.

- BFMsstä ja bioaktiivisesta materiaalista koostuva lääkkeenvapautusjär jestelmä, joka muodostaa biosomeja in vivo, 20 ja jolla biosominmuodostusnopeutta voidaan muuttaa ei-polaa-risten ja amfifaattisten lipidijohdannaisten ainutlaatuisil- ·,*·: la yhdistelmillä.

• · » i i < I I »·· · ··· - lipidimatriisista ja bioaktiivisesta materiaalista koostu- • · · · :*·.· 25 va lääkkeenvapautusjär jestelmä, jota voidaan käyttää moni-• · .*.j tarkoitussovellutuksiin, kuten suonenulkoisen absorption • · .···. edistäminen, parenteraalinen kontrolloitu lääkkeen vapautu- « i · minen tai paikallinen pidennetty lääkkeen vapautuminen, . . joista kukin erikoistarkoitus voidaan saavuttaa ainutlaatui- * · · 30 silla lipidiyhdistelmillä joustavalla tavalla.

• · · « » · - lipidimatriisista ja bioaktiivisesta materiaalista koostu- ;***. va lääkkeenvapautusjär jestelmä, joka on termodynaamisesti stabiili.

:···! 35 * * - lääkkeenvapautusjärjestelmä, jossa lääke ja väliaine hajo avat samanaikaisesti.

16 107696 - lääkkeenvapautusjärjestelmä, joka antaa mahdollisuuden parantaa suurimolekyylipainoisten yhdisteiden kuten proteiinien, peptidien, polysakkaridien ja vastaavien oraalista antoa.

5 Tämä keksintö koskee pelkästään uusien lipidimatriisien, biosominmuodostusmatriisien käsitteeseen ja suunnitteluun, jotka osoittavat annon jälkeen ainutlaatuisen biosomien muodostuksen in vivo, ja johon voidaan sisällyttää mitä 10 hyvänsä sopivaa bioaktiivista materiaalia, mikäli sitä tarvitaan erityiseen tarkoitukseen, kuten parannetun biosaatavuuden tai pidennetyn/kontrolloidun vapautumisen tarkoituksiin.

15 Ammattimiehelle ovat selviä erilaiset modifikaatiot ja ekvivalentit, ja näitä voidaan käyttää keksinnön yhdisteissä, koostumiksissa ja menetelmissä sen hengestä ja suoja-alasta poikkeamatta, ja siksi on ymmärrettävä, että keksintö ei rajoitu tässä oleviin erityisiin esimerkkeihin ja suoritus-20 muotoihin.

• **: Esimerkit ',· · Esimerkki 1 1,25 g fosfolipidiä soijapavusta (I) lisätään 1,25 g:aan i\: 25 glyseridiseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 12 tunnin ajan * · .*.#J 60 °C:ssa. Sitten lisätään 2,50 g triglyseridiä (III), ja # φ koko seosta sekoitetaan 1 tunti 60 eC:ssa.

...

.

^ Lipidiluokkakooetumua (g) I II III Triaeyyliglyserolin l *,* 30 rasvahappokoostumua (paino-*) *'i · foefatidyylikoliini 0,50 • foefatidyylietanoliamiini 0,40 ·*· foefatidyyli-inoeitoli 0,23 1 ** 35 ei-polaariaet lipidit 0,12 ··«· J | monoaayyliglyseroli 0,63 1' diaeyyliglyeeroli 0,63 ,***, triasyyliglyeeroli 2,50 ·»·* 8:0-kaprylaatti 58,5 40 10:0-kapraatti 40,5 12s0-lauraatti 0,6 muut 0,4

YhteeneB 1,25 1,25 2,50 YhteeneS 100 17 107696

Esimerkki 2 1.25 g fosfolipidiä soijapavusta (I) lisätään 1,25 g:aan glyseridiseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 12 tunnin ajan 60 °C:ssa. Sitten lisätään 2,50 g triglyseridiä (III), ja 5 koko seosta sekoitetaan 1 tunti 60 °C:ssa.

LipidiluokkakoostumUB (g) I II III Triaeyyliglyserolin rasvahappokoostumus (paino-t) foefatidyylikoliini 0,50 10 fosfatidyylietanoliamiini 0,35 fosfatidyyli-inositoli 0,18 fosfatidihappo 0,07 ei-polaariaet lipidit 0,25 monoasyyliglyaeroli 0,63 15 diasyyliglyeeroli 0,63 triaayyliglyeeroli 2,50 8:0-kaprylaatti 58,5 10:0-kapraatti 40,S 12:0-lauraatti 0,6 20 muut 0,4

Yhteensä 1,25 1,25 2,50 Yhteensä 100

Esimerkki 3 1.25 g fosfolipidiä soijapavusta (I) lisätään 1,25 g:aan 25 glyseridiseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 12 tunnin ajan 60 °C:ssa. Sitten lisätään 2,50 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan 1 tunti 60 °C:ssa.

· Lipidiluokkakooetumue (g) X II III Triaeyyliglyserolin * , * · r&evahappokoostumue i 30 (paino-t) ··♦ · foefatidyylikoliini 0,50 «*« fosfatidyylietanoliamiini 0,40 fosfatidyyli-inositoli 0,23 • » • · · ei-polaarieet lipidit 0,12 ; * 35 monoasyyliglyseroli 0,63 * diasyyliglyeeroli 0,63 ,,, triaayyliglyeeroli 2,50 · 16:0-palmitaatti 10,0 18:0-etearaatti 2,8 40 18:1-oleaatti 20,6 * · 18s2-linoleaatti 58,9 • 1 · *· *; 18:3-linolenaatti 6,7 a *{* t muut 1,0 • * YhteenaS 1,25 1,25 2,50 YhteenaS 100 45 • *·

Esimerkki 4 * · • t ‘I* 1,25 g fosfolipidiä soijapavusta (I) lisätään 1,25 g:aan ··· ·...· glyseridiseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 12 tunnin ajan *:**: 60 eC:ssa. Sitten lisätään 2,50 g triglyseridiä (III), ja 50 koko seosta sekoitetaan 1 tunti 60 eC:ssa.

18 107696

Lipidiluokkakoostumus (g) I II III triasyyliglyserolin rasvahappokoostumus (paino-t) fosfatidyylikoliini 0,40 5 foefatidyylietanoliamiini 0,35 fos fatidyyli-inoeitoli 0,18 fosfatidihappo 0,07 ei-polaariaet lipidit 0,25 monoasyyliglyseroli 0,63 10 diaeyyliglyaeroli 0,63 triaeyyliglyaeroli 2,50 16:0-palmitaatti 10,0 18:0-atearaatti 2,8 18:l-oleaatti 20,6 15 18:2-linoleaatti 58,9 18:3-linolenaatti 6,7 muut 1,0

Yhteensä 1,25 1,25 2,50 Yhteensä 100 20 Esimerkki 5 1.25 g fosfolipidiä soijapavusta (I) lisätään 1,25 g:aan glyseridiseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 12 tunnin ajan 60 °C:ssa.

Lipidiluokkakoostumua (g) I II

25 fosfatidyylikoliini 0,40 foefatidyylietanoliamiini 0,35 fosfatidyyli-inositoli 0,18 fosfatidihappo 0,07 ei-polaariset lipidit 0,25 30 monoasyyliglyseroli 0,63 diasyyliglyeeroli 0,63 triaayyliglyseroli . Yhteensä 1,25 1,25 «> · · • · · e · ·.: : 35 Esimerkki 6 1.25 g fosfolipidiä soijapavusta (I) lisätään 1,25 g:aan glyseridiseosta (II) ja 0,16 g:aan etanolia. Koko seosta ·*·.· sekoitetaan varovasti 6 tuntia 60 °C:ssa. Lisätään 0,16 g • · triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä tunti « 40 korotetussa lämpötilassa.

( a LipidiluokkakooBtumus (g) I II III

• fosfatidyylikoliini 0,40 • · ,,. foefatidyylietanoliamiini 0,35 • · · fosfatidyyli-inositoli 0,18 45 fosfatidihappo 0,07 ·.

J · ei-polaariset lipidit 0,25 • monoasyyliglyseroli 0,63 • ! diasyyliglyeeroli 0,63 ··· • triasyyliglyseroli 0,16 50 yhteensä 1,25 1,25 0,16 • · • · · « · 19 107696

Esimerkki 7 15 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 1,25 g:aan glyseri-diseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 1,25 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta 5 (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 2,50 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakoostumue <g) I II III triasyyliglyaerolin 10 raevahappokoostumua (paino-t) foefatidyylikoliini 1,25 monoaeyyliglyseroli 0,63 diaeyyliglyeeroli 0,63 15 triaeyyliglyseroli 2,50 8:O-kaprylaatti 58,5 10:O-kapraatti 40,5 12:0-lauraatti 0,6 muut 0,4 20 Yhteensä 1,25 1,25 2,50 Yhteensä 100

Esimerkki 8 15 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 1,25 g:aan glyseri- diseosta (II) ja sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 25 °C:ssa. Lisätään 1,25 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään . . : 2,50 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä • · · • « ; .·' tunti korotetussa lämpötilassa.

• · * • ·· · • · · .... 30 Lipidiluokkakoostumus (g) I II III triaeyyliglyeerolin • · • · j raevahappokooetunme * ; (paino-») ! *,! fosfatidyylikoliini 1,25 • · monoaeyyliglyeeroli 0,63 • · · 35 diaeyyliglyeeroli 0,63 triaeyyliglyeeroli 2,50 16: 0-palmitaatti 10,0 * 18:0-etearaatti 2,0 *» *1 38:l-oleaatti 20,6 .·:·. 40 l8x2-linoleaatti 58,9 * 18:3-linolenaatti 6,7 .. muut 1,0 • « • ♦ · • ··· Yhteensä 1,25 1,25 2,50 Yhteensä 100 • · www - ·...· 45 :***: Taulukossa I alla esimerkkien 1-8 koostumuksille on mitat- • · · ·;·♦· tu viakositeetti, sulamislämpötila ja sulamisentalpia.

Esimerkki Viskositeetti Tm deltaH

20 107696

Taulukko I

(mPa·s) (°C) (J/g) 5----- 1 167 2 104 -37,9 5,9 10 -3,5 50,3 3 199 -72,1 0,7 -23,1 41,9 15 4 104 -72,1 0,7 -22,2 42,0 5 2100 -17,2 18,7 20 6 — -26,1 36,5 +6,4 14,4 ·Υ·:: 7 133 • · • · · • · · • ·· · ·:· 25 8 900 • · · · • · • · · • · · • · - — — — — - - ---- • · · • · · .···. Viskositeetti on mitattu Bohlin-reometrissä 25 °C:ssa. Tm • · · (faasimuutoslämpötila) ja deltaH (entalpian muutos faasin- . . 30 muutoksessa) saadaan "differential scanning"-kalorimetrin *· ’· avulla.

• · · • · · • · ·

Kuten taulukosta I nähdään, voidaan BFM'ille saada erilaisia fysikokemiallisia ominaisuuksia käytettyjen lipidiyhdistel- ♦ · · 35 mien samoin kuin rasvahappokoostumusten funktiona. Tämä • · *···[ tekee mahdolliseksi valmistaa BMF'iä, joilla on laaja joukko 21 107696

Esimerkki 9 30 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 2,50 g:aan mono-glyseridiä, ja seosta sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 2,50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta 5 (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 öC:ssa. Lisätään 5,00 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakoostumus (g) I II III Triaeyyliglyeerolin 10 rasvahappokooetumue (paino-*) f oefatidyylikoliini 2,50 monoaeyyliglyeeroli 2,50 triasyyliglyseroli 5,00

15 8:0-kaprylaatti 58, S

10:0-kapraatti 40,5 12:O-lauraatti 0,6 muut 0,4 20 YhteeneK 2,50 2,50 5,00 YhteeneK 100

Esimerkki 10 30 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 2,50 g:aan mono-glyseridiä, ja seosta sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 25 °C:ssa. Lisätään 2,50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään . . : 5,00 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä ; tunti korotetussa lämpötilassa.

• · · » · · « • · · ···: 30 Lipidiluokkakoostumus (g) Σ ΖΣ ΙΣΣ Triaeyyliglyeerolin • · · raevahappokooetumue * ’ (paino-*) I *.J fosfatidyylikoliini 2,50 • · ... monoasyyliglyeeroli 2,50 : : : 35 triasyyliglyseroli 5,00 16i0-palmitaatti 10,0 18:0-stearaatti 2,8 ; 18:l-oleaatti 20,6 *· 'Ϊ 18:2-linoleaatti 58,9 40 18:3-linolenaatti 6,7 • · · * muut 1,0 • · • Yhteensä 2,50 2,50 5,00 Yhteensä 100 M· • · Φ · « · · #;e 45 Kuviossa 1 esitetään mikroskooppivalokuva esimerkin 9 mukai- • · *···* sesta formulaatiosta, 4 min ulkoisen veden lisäämisen jäl- *’** keen (suurennos = 60x) . Kuviosta ilmenee, että biosominmuo- dostusmatriisista muodostuu vesi- ja lipidifaasin välisellä 22 107696 rajapinnalla lipidirakkuloita, joita kutsutaan tässä bioso-meiksi, ja että prosessi vaikuttaa tapahtuvan spontaanilla "silmikoitumia”-mekanismilla, joka tapahtuu välittömästi ulkoisen veden kanssa kontaktiin joutumisen jälkeen.

5

Kuviossa 2 esitetään mikroskooppivalokuva esimerkin 10 mukaisesta formulaatiosta, 10 s ulkoisen veden lisäämisen jälkeen (suurennos = 60x). Kuten voidaan nähdä, lipidifaasissa, ts. biosominmuodostusmatriisissa muodostuu matomaisia 10 kuvioita, jotka liikkuvat veden ja lipidin rajapintaa kohden Sitten vesi/lipidi-rajapinnalla nämä kuviot muuttuvat nopeasti "silmikoitumis"-peoaswessilla pallomaisiksi lipidi-rakkuloiksi, joita kutsutaan tässä keksinnössä biosomeiksi.

15 Testattiin Bl2-vitamiinin vapautuminen in vitro esimerkkien 9 ja 10 BFM'istä. BFM-formulaatiot lisättiin veteen 20 °C:ssa, ja ravistettiin sitten varovasti 3 min ajan ennen

Bl2-konsentraation mittaamista vesifaasissa. Formulaatiot saivat seistä 120 min, minkä jälkeen seurasi toistuva ana- 20 lyysi. Kirkkaan vesifaasin saavuttamiseksi suoritettiin sentrifugointi 30 min ajan nopeudella 45 000 r/min ennen

. konsentraatiomittauksia. Tulokset esitetään taulukossa II

• · · • · » * · • · • « ·

*·· * Taulukko II

»·· ···· 25 - • · V*: Vapautuminen * ·

Aika (min) Esimerkki 9 Esimerkki 10 • · · • · · ________^___________^ • · · 3 85 % 76 % : 30 120 85 % 84 % • · · • · • · · ---- - ---- --- ---- --------- ---- .... ----.

• · · • · · « • · » ** Kuten voidaan nähdä, näistä kahdesta BFM-formulaatiosta saatiin hyvin nopea ja spontaani B12-vitamiinin vapautumi- .***. 35 nen. Lipidikoostumuksesta riippuen saatiin myös erilaiset «·» vapautumi s ominaisuudet. Vain pienet muutokset rasvahappo- koostumuksessa antoivat erilaiset vapautumisominaisuudet.

• · 23 107696

Yllä olevassa taulukossa II esitetyn kokeen mukaiset lipidi-partikkelit, ts. esimerkeistä 9 ja 10 muodostetut biosomit, alistettiin kokoanalyysille Malvern-laitetta käyttämällä. Näin saadut tulokset esitetään taulukossa III.

5

Taulukko III

Esimerkki no. Aika (min) Koko 109 3 26 % <1 pm >1 μια 66 % <2 μπι 120 41 % <1 μπι >1 pm 46 % <2 μπι 10 3 0 % <1 μπι >1 μπι 96 % <10 pm 120 44 % <1 μπι >1 μπι 52 % <2 μπι 15 -

Esimerkille 9 muodostuu aluksi pienempiä biosomeja verrattuna esimerkkiin 10, kuten taulukosta III ilmenee. Lisäksi pienemmillä biosominmuodostusmatriiseilla voidaan nähdä 20 nopeampi lääkkeen vapautuminen, vertaa taulukkoa II. Toinen kiinnostava ilmiö voidaan nähdä taulukosta III pienempien biosomien muodostumisen aikana. Tässä prosessissa havaittiin • · · *· '* esimerkissä 10 pitempi viive verrattuna esimerkkiin 9, mikä « · : osoittaa mahdollisuuden kontrolloida tätä prosessia BFM'ien 25 lipidikoostumuksen avulla.

• · • · · • ♦ · • ·

Esimerkki 11 • · 2,50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I) ja 7,50 g mono- glyseridiä (II) sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan ; 30 60 °C:ssa. Lisätään 1,25 g vettä, ja sekoitusta jatketaan • · · vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

• # « • ·

! LipidiluoMcakoostuaue (g) I II

*... foefatidyylikoliini 2,50 35 monoaeyyl g yseroli 7,50 ***** Yhteensä 2.50 7/50 * * ' • · ·

Esimerkki 12 24 107696 2.50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I) ja 7,50 g mono-glyseridiä (II) sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan 60 °C:s-sa. Lisätään 1,25 g FragminR-liuosta (120 mg/g vettä), ja 5 sekoitusta jatketaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

lipidiluokkakoostumus (g) I II

fosfatxdyylikoliini 2,50 monoaeyyliglyeeroli 7,50 10

Yhteensä 2,50 7,50

Esimerkki 13 2.50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I) ja 7,50 g mono-15 glyseridiä (II) sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 0,625 g FragminR-liuosta (120 mg/g vettä), ja sekoitusta jatketaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

20 Lipidiluokkakoostumus (9) I II Monoasyyliglyserolin raevahappokoostumus (paino-%) foefatidyylikoliini 2,50 monoaeyyliglyeeroli 7,50 25 8:0-kaprylaattx 79,6 10i0-kapraatti 19,8 # 12tO-lauraattx 0,2 • · · •e ·{ muut 0,4 • · ‘.f ; 30 Yhteensä 2,50 7,50 Yhteensä 100 • • Il

I IM

.·. : Esimerkki 14 • Il .·, · 2,50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I) ja 7,50 g mono- • · · I..* glyseridiä (II) sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan 60 * 35 °C:ssa. Lisätään 1,25 g FragminR-liuosta (120 mg/g vettä), ja sekoitusta jatketaan vielä tunti korotetussa lämpötilas- • · · * · sa * »·· • « · Lipidiluokkakoostumus (g) I II Honoasyyliglyserolin . raevahappokoostumus ·*·.. 40 (paino-») * foefatidyylikoliini 2,50 J · monoaeyyliglyeeroli 7,50 * * 8:0-kaprylaatti 78,4 ·***. 10 s0-kapraatti 21,2 45 12 s0-lauraatti 0,2 ..... muut 0,2

Yhteensä 2,50 7,50 Yhteensä 100 107S96 25

Esimerkki 15 2,50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I) ja 7,50 g mono-glyseridiä (II) sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan 60 °Cissa. Lisätään 0,625 g FragminR-liuosta (120 mg/g vettä), 5 ja sekoitusta jatketaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakooetunrae (g) I II Monoaeyyliglyeerolin rasvahappokooatunus 10 (paino-t) foefatidyylikoliini 2,50 monoaeyyliglyeeroli 7,50 8:O-kaprylaatti 78,4 lOsO-kapraa-tti 21,2 15 12:0-iauraatti 0,2 muut 0,2

Yhteensä 2,50 7,50 Yhteensä 100 20 Vedessä 37 °C:ssa muodostuneiden biosomien kokojakauma määritettiin esimerkille 15 Malvern-laitetta käyttämällä. BFM-formulaatiota ravistettiin varovasti vedessä 17 tunnin ajan, minkä jälkeen seuraa sentrifugointi lipidifaasin erottamiseksi vesifaasista. Tulos esitetään taulukossa IV.

25

Taulukko IV

t · « • · * * · • :*: Koko % * ·♦ · ··· I . I — " - ···· : 30 <1 un 36 *· ,·. · >1 pm, <2 pm 60 • «· • · ··· ^.

• · · • · ·

Esimerkki 15 määritettiin myös kanissa ihonalaisella injek- • · · *· ” 35 tiolla. Kerättiin verinäytteitä, ja analysoitiin FrahminR:n : plasmakonsentraatio ajan funktiona. Tulokset esitetään tau- ί*. lukossa V.

• · · • · · • * • · • · · ·« · » · • · ··· m • · 26 107696

Taulukko V

Aika (h) FragminR-plasmakonsentraatio (IU/ml) 5 - 0 0 1.0 o 2.0 0 2.5 0,051.

10 3,0 0,100 3.5 0,110 4.0 0,127 4.5 0,130 5.0 0,122 15 5,5 0,126 6.0 0,133 7.0 0,126 20 Kuten taulukosta V nähdään, saavutettiin vakio ja pidennetty FragminR:n vapautuminen in vivo. Vaikuttaa siltä, että keksinnön mukaisesti on nyt mahdollista vapauttaa in vivo erit- : ·,; täin vesiliukoista suurimolekyylipainoista yhdistettä va- « · ; kionopeudella.

··· · 25 *·**. Esimerkeissä 16 - 23 esitetään erilaisia tähän keksintöön « » » • k · I * perustuvia formulaatioita osoittaen tämän keksinnön jouusta- lvuuden. Esimerkit osoittavat, että on mahdollista sisällyt-» · * *·* ' tää sekä erittäin monimutkaisia molekyylejä kuten B12-vita- 30 miini, samoin kuin pienimolekyylipainoista yhdistettä, esi- • « V*: merkiksi buspironia, ja suurimolekyylipainoisia molekyylejä, t?: esimerkiksi fragmentoitua hepariinia (FragminR), jolloin ··* jokaisella bioaktiivisella yhdisteellä on erilaiset fysiko- • ♦· kemialliset ominaisuudet.

» · • · *:· 35 f M « · ¥ ♦ 0 • «

Esimerkki 16 27 107696 150 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 12,50 gjaan mono-glyseridiä (II), ja seosta sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 12,50 g fosfatidyylikoliinia soija-5 pavusta (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 eC:ssa.

Lisätään 25,00 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakoostumus (g) I II III Triasyyliglyserolin 10 rasvahappokoostumus (paino-*) fosfatidyylikoliini 12,50 monoasyyliglyseroli 12,50 triaayyliglyBsroli 25,00 15 8«0-kaprylaatti 58,5 10:0-kapraatti 40,5 12>0-lauraatti 0,6 muut 0,4 20 Yhteensä 12,50 12,50 25,00 Yhteensä 100

Esimerkki 17 150 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 12,50 g:aan mono- glyseridiä (II), ja seosta sekoitetaan varovasti 3 tunnin 25 ajan 60 °C:ssa. Lisätään 12,50 g fosfatidyylikoliinia soija- pavusta (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa.

. .· Lisätään 25,00 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoi- * ·· tetaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

0 · · • * f >»* ·

«•I

• 30 Lipidiluokkakoostumue (g) I II III Triaeyyliglyeerolin 1 * ! raevahappokooetumue • ·· * · (paino·!) . .

* ·#· f08fatidyylikoliini 12,50 * * monoaayyliglyeeroli 12,50 * ! J 35 triasyyliglyseroli 25,00 16 sO-palmitaatti 10,0 18:0-stearaatti 2,8 . . 18il-oleaatti 20,6 ·, ♦} 18t2-linoleaatti 58,9 .... 40 18<3-linolenaatti 6,7 *·* * muut 1,0 ·♦ S *.. Yhteensä 12,50 12,50 25,00 Yhteensä 100 «4« * » > · *»* 45 Esimerkki 18 150 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 33,30 g:aan mono-'*4** glyseridiä (II), ja seosta sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 11,10 g fosfatidyylikoliinia soija- 107696 28 pavusta (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 5,60 g vettä, ja koko seosta sekoitetaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

5 Lipidiluokkakoostunus (g) I II

fosfatidyylikoliini 11,10 monoasyyliglyssroli 33,30

Yhteensä 11,10 33,30 10

Esimerkki 19 15 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 1,25 g:aan glyseri-diseosta (II), ja sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 °Csssa. Lisätään 1,25 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta 15 (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 2.50 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakoostumus (g) I II III Triasyyliglyeerolin

2 0 rasvahappokooBturauB

(paino-t) fosfatidyylikoliini 1,25 monoasyyliglyseroli 0,63 diasyyliglyseroli 0,63 25 triasyyliglyseroli 2*50 8:O-kaprylaatti 58*5 10s0-kapraatt± 40*5 ♦ 12:O-lauraatti 0*6 ♦ * · *1 muut 0*4 . ♦ 30 I I · ··* · Yhteensä 1*25 1*25 2*50 Yhteensä 100 ··» » i »»·

Esimerkki 20 * e j*.#: 15 mg syanokobalamiinia (B12) lisätään 1,25 g saan glyseri- * · 35 diseosta (II), ja sekoitetaan varovasti 3 tunnin ajan 60 t > « eC:ssa. Lisätään 1,25 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta , . (I), ja sekoitus jatkuu 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään j » · 2.50 g triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan vielä • · t V * tunti korotetussa lämpötilassa.

i*. 40 ··· • « • » « ·· * «·* • e • · «e· • · 29 107696

Lipidiluokkakaosturous (g) I II III Triasyyliglyserolin rasvahappokooBtumus (paino-t) foefatidyylikoliini 1,25 5 monoasyyliglyseroli 0,63 diasyyliglyseroli 0,63 triaeyyliglyeeroli 2,50 16:0-palmitaatti 10,0 18:0-stearaatti 2,8 10 18:2-oleaatti 20,6 18:2-linoleaatti 58,9 18s3-linolenaatti 6,7 muut 1,0

Yhteensä 1,25 1,25 2,50 Yhteensä 100 15

Esimerkki 21 2,50 g fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I) ja 7,50 g mono-glyseridiä (II) sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 2,0 ml FragminR-liuosta (334 mg/g vettä), 20 ja sekoitusta jatketaan vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakoostumus (g) I II

foefatidyylikoliini 2,50 25 monoasyyliglyseroli 7,50

Yhteensä 2,50 7,50

Esimerkki 22 *.*·: 30 10 mg buspironihydrokloridia lisätään 50 mg:aan monoglyseri- : diä (II) ja seosta sekoitetaan varovasti 1 tunti 60 °C:ssa.

··· Lisätään 200 mg diglyseridiä (III) ja 250 mg fosfatidyyliko- ···· :\j liinia soijapavusta (I), ja sekoitus jatkuu 3 tunnin ajan 60 • ♦ .·.j °C:ssa. Lisätään 500 mg triglyseridiä (IV), ja koko seosta ,·:·[ 35 sekoitetaan vielä 10 min korotetussa lämpötilassa.

• · · * Lipidiluokkakoostumus (g) I 11 III IV triasyyliglyse- xolin rasvahappo- . , koostumus (paino-t) • * · * foefatidyylikoliini 250 ... 40 monoasyyliglyseroli 50 *,· · diasyyliglyseroli 200 , * triaeyyliglyeeroli 500 J ·,, 8i0-kaprylaatti 58,5 10JO-kapraatti 40,5 : : 45 12 * 0-lauraatti 0,6 ...

• muut 0,4 • · · • · ··· Yhteensä 250 50 200 500 Yhteensä 100 • t 50 Esimerkki 23 30 107696 20 mg koentsyymi Q10:tä lisätään 200 mg;aan diglyseridiä (II) ja 250 mgiaan fosfatidyylikoliinia soijapavusta (I), ja seosta sekoitetaan varovasti 6 tunnin ajan 60 °C:ssa. Lisätään 500 mg triglyseridiä (III), ja koko seosta sekoitetaan 5 vielä tunti korotetussa lämpötilassa.

Lipidiluokkakoostumus (g) X II III Triasyyliglyserolin rasvahappokoostumus (paino-t) 10 fosfatidyylikoliini 250 diaeyyliglyeeroli 200 triasyyliglyeeroli 500 8 s0-kaprylaatti 58,5 10:0-kapraatti 40,5 15 12:0-lauraatti 0,£ muut 0,4

YhteansS 250 200 500 Yhteensä 100 20 φ • « · • · · • · • « • * · * · · *·· · • · · • · · · • · • · · • · · • · • * • · · • · a a · • a · • · · * a a a • · a a a • · · « · • · · • · · • · · • a • a • · • ·· a a a a • · • a a a a a • a · • · • · • · · a • ·

Claims (14)

31 107696

1. Oleellisesti vedetön, nestemäinen tai puolikiinteä lipi-dipartikkelinmuodostusmatriisi, joka on tarkoitettu sisältä- 5 maan bioaktiivista materiaalia, tunnettu siitä, että se sisältää erilaisen polaarisuuden omaavista luokista valittujen ainakin kahden lipidikomponentin määritellyn järjestelmän, joista i) ainakin yksi lipidikomponentti on amfifaattinen ja polaa-10 rinen kaksoiskerroksen muodostava fosfolipidi määrässä 5- 50 % (paino/paino) lipidisysteemistä, ja ii) ainakin yksi lipidikomponentti on ei-polaarinen mono-, di- tai triglyseridi tai näiden seos, ja jossa järjestelmässä muodostuu spontaanisti erillisiä lipi-15 dipartikkeleita vesifaasin ja lipidifaasin rajapinnalla ulkoisen veden tai vesipitoisen väliaineen kanssa kontaktiin saattamisen jälkeen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen lipidipartikkelinmuodos-20 tusmatriisi, tunnettu siitä, että ei-polaarinen lipidi si- •' · : sältää triglyseridiä oleellisesti 8:0-kaprylaatin ja 10:0- • · · **V kapraatin seoksena.

• · · · • · • · · ’* *] 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2'mukainen lipidipartikkelin- • · · '· ”· 25 muodostusmatriisi, tunnettu siitä, että ei-polaarinen lipidi * sisältää triglyseridiä oleellisesti 18:2-linoleaatin, 18:1- oleaatin ja 16:0-palmitaatin seoksena. • · · • i · • · · • :T:

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen lipi- e 3 0 dipartikkelinmuodostusmatriisi, tunnettu siitä, että ei-po-• · · VV. laarinen lipidi sisältää monoglyseridiä oleellisesti 8:0- • · **;·* kaprylaatin ja 10:0-kapraatin seoksena.

• · · • · · «·· ·:*·: 5. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen 35 lipidipartikkelinmuodostusmatriisi, tunnettu siitä, että am-fifaattisen ja polaarisen kaksoiskerroksen muodostavan fos-folipidin määrä on alueella 10 - 50 % (paino/paino) lipidi-j ärj estelmästä. 32 107696

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen lipidipartikkelinmuodos-tusmatriisi, tunnettu siitä, että amfifaattisen ja polaarisen kaksoiskerroksen muodostavan fosfolipidin määrä on alueella 25 - 50 % (paino/paino) lipidijärjestelmästä. 5

7. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen lipidipartikkelin-muodostusmatriisi, tunnettu siitä, että amfifaattinen ja polaarinen kaksoiskerroksen muodostava fos-folipidi on fosfatidyylikoliini. 10

8. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen lipidipartikkelin-muodostusmatriisi, tunnettu siitä, että amfifaattinen ja polaarinen kaksoiskerroksen muodostava fos-folipidi on fosfatidyylikoliini määrässä 50 % (paino/paino). 15

9. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen lipidipartikkelinmuodostusmatriisi, tunnettu siitä, että bioaktiivinen materiaali valitaan joukosta lääkkeet, herbi- sidit, pestisidit, lannoitteet, elintarvike- ja kosmeettiset : 20 valmistusaineet ja lisäaineet. • · • · • · · • · · **V

10. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen li- ”**. pidipartikkelinmuodostusmatriisi, tunnettu siitä, että bio- • · * *· *j aktiivisen materiaalin määrä on alle 70 % (paino/paino) mat- • · · *· ** 25 riisistä, edullisesti alle 50 % (paino/paino) . • · · * tm· • · ·

11. Menetelmä minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen ··· ·/· · mukaisen lipidipartikkelinmuodostusmatriisin valmi st amis ek- :Ti si, tunnettu siitä, että amf ifaattinen ja polaarinen tai ei- ^30 polaarinen lipidikomponentti sekoitetaan bioaktiivisen mate-• · · "I riaalin kanssa sinänsä tai liuoksessa.

• · • · ··* * : : : 12. Patenttivaatimuksen li mukainen menetelmä, tunnettu sii- ·«« ' *:··: tä, että ensin ei-polaarinen lipidi tai lipidit sekoitetaan 35 bioaktiivisen materiaalin kanssa, ja saatu seos sekoitetaan tämän jälkeen amf ifaattisen ja polaarisen lipidin tai lipidien kanssa. 33 107696

13. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-10 mukainen lipi-dipartikkelinmuodostusmatriisi, tunnettu siitä, että se on tarkoitettu käytettäväksi väliainejärjestelmänä bioaktiiviselle materiaalille. 5

14. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen lipidipartikkelin-muodostusmatriisi, tunnettu siitä, että se on tarkoitettu käytettäväksi väliainejärjestelmänä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi enteraaliseen, parenteraaliseen, na- 10 saaliseen, intravaginaaliseen, okulaariseen antoon tai antoon paikallisesti iholle, haavoille tai limakalvoille.