JP2003185655A - プロリンリッチなペプチドとｓｈ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法 - Google Patents
プロリンリッチなペプチドとｓｈ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含
有ペプチドとの相互作用を阻害する能力を有する治療的
価値のある化合物のスクリーニング方法でを提供する。 【解決手段】第一の蛍光マーカーで標識されたプロリン
リッチなペプチドを含有する緩衝液に、スクリーニング
すべき候補化合物を加える。次いで、第二の蛍光マーカ
ーで直接あるいは間接的に標識されたＳＨ３ドメイン含
有ペプチドを加える。ここで、それぞれの蛍光マーカー
は対のフレットで、第１のパートナーあるいは第２のパ
ートナーである。均一時間分解蛍光法により、第１のパ
ートナーに対する励起波長に対応する波長エネルギーを
付し、対のフレット蛍光マーカーである第２のパートナ
ーの発光波長における蛍光シグナルを測定する。スクリ
ーニングされた化合物は、種々の細胞内シグナル伝達経
路に関与するタンパク質を選択的に標的化することがで
きる。
有ペプチドとの相互作用を阻害する能力を有する治療的
価値のある化合物のスクリーニング方法でを提供する。 【解決手段】第一の蛍光マーカーで標識されたプロリン
リッチなペプチドを含有する緩衝液に、スクリーニング
すべき候補化合物を加える。次いで、第二の蛍光マーカ
ーで直接あるいは間接的に標識されたＳＨ３ドメイン含
有ペプチドを加える。ここで、それぞれの蛍光マーカー
は対のフレットで、第１のパートナーあるいは第２のパ
ートナーである。均一時間分解蛍光法により、第１のパ
ートナーに対する励起波長に対応する波長エネルギーを
付し、対のフレット蛍光マーカーである第２のパートナ
ーの発光波長における蛍光シグナルを測定する。スクリ
ーニングされた化合物は、種々の細胞内シグナル伝達経
路に関与するタンパク質を選択的に標的化することがで
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プロリンリッチな
ペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を
阻害する能力を有する治療的価値のある化合物のスクリ
ーニング方法であって、該化合物は、種々の細胞内シグ
ナル伝達経路に関与するタンパク質を選択的に標的化す
ることができる、方法に関する。本発明はまた、そのよ
うなスクリーニング方法を実施するために特異的に設計
された試薬に関する。
ペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を
阻害する能力を有する治療的価値のある化合物のスクリ
ーニング方法であって、該化合物は、種々の細胞内シグ
ナル伝達経路に関与するタンパク質を選択的に標的化す
ることができる、方法に関する。本発明はまた、そのよ
うなスクリーニング方法を実施するために特異的に設計
された試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】シグナル伝達は、協調した特別に規定さ
れた方法による、細胞内標的への細胞外情報の伝達に関
する。情報移動は、主にタンパク質、ペプチド、脂質、
および他の小分子の分子相互作用の変化または共有結合
的修飾を介して起きる。これは、酵素活性のアロステリ
ック調節、多分子アセンブリーの形成、または細胞内局
在化の変化を含む種々のイベントを引き起こす。その結
果としてしばしば、シグナルをさらに下流のエフェクタ
ーに、さらに伝搬することができるプライムされた分子
の局所濃度の真の上昇が起きる。
れた方法による、細胞内標的への細胞外情報の伝達に関
する。情報移動は、主にタンパク質、ペプチド、脂質、
および他の小分子の分子相互作用の変化または共有結合
的修飾を介して起きる。これは、酵素活性のアロステリ
ック調節、多分子アセンブリーの形成、または細胞内局
在化の変化を含む種々のイベントを引き起こす。その結
果としてしばしば、シグナルをさらに下流のエフェクタ
ーに、さらに伝搬することができるプライムされた分子
の局所濃度の真の上昇が起きる。
【０００３】シグナル伝達経路のほとんどの分子的相互
作用は、小セットの保存された非触媒性タンパク質ドメ
インにより支配される。これらの分子は、ＳＨ２、ＳＨ
３、ＷＷ、ＰＤＺ、ＰＴＢおよびＥＨドメインを含有
し、それぞれその標的中の特異的なペプチドモチーフを
認識する。
作用は、小セットの保存された非触媒性タンパク質ドメ
インにより支配される。これらの分子は、ＳＨ２、ＳＨ
３、ＷＷ、ＰＤＺ、ＰＴＢおよびＥＨドメインを含有
し、それぞれその標的中の特異的なペプチドモチーフを
認識する。
【０００４】ＳＨ３（Ｓｒｃ相同性３）ドメインは、プ
ロリンリッチなペプチド配列に結合することによりタン
パク質−タンパク質相互作用を仲介する、小さい非触媒
性タンパク質分子である。ＳＨ３ドメインは典型的に
は、５５〜７０アミノ酸の長さである。ＳＨ３ドメイン
は、無数の細胞内タンパク質中に見いだされている。５
０を超えるＳＨ３ドメインが知られており、これらのＳ
Ｈ３ドメインは広く分布しており、キナーゼ、リパー
ゼ、ＧＴＰａｓｅ、アダプタータンパク質、構造タンパ
ク質ならびにウイルス性制御タンパク質中で見いだされ
ている。
ロリンリッチなペプチド配列に結合することによりタン
パク質−タンパク質相互作用を仲介する、小さい非触媒
性タンパク質分子である。ＳＨ３ドメインは典型的に
は、５５〜７０アミノ酸の長さである。ＳＨ３ドメイン
は、無数の細胞内タンパク質中に見いだされている。５
０を超えるＳＨ３ドメインが知られており、これらのＳ
Ｈ３ドメインは広く分布しており、キナーゼ、リパー
ゼ、ＧＴＰａｓｅ、アダプタータンパク質、構造タンパ
ク質ならびにウイルス性制御タンパク質中で見いだされ
ている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＳＨ３ドメインが関与
するタンパク質−タンパク質相互作用は、真核生物シグ
ナル伝達経路のタンパク質間の一過性結合で起き、複雑
な複数タンパク質凝集物の形成を引き起こす。これらの
凝集物の形成は、複合体の酵素的修飾につながり、新し
いタンパク質−タンパク質相互作用部位の産生、細胞内
化学シグナルの伝搬と増幅とを引き起こす。
するタンパク質−タンパク質相互作用は、真核生物シグ
ナル伝達経路のタンパク質間の一過性結合で起き、複雑
な複数タンパク質凝集物の形成を引き起こす。これらの
凝集物の形成は、複合体の酵素的修飾につながり、新し
いタンパク質−タンパク質相互作用部位の産生、細胞内
化学シグナルの伝搬と増幅とを引き起こす。
【０００６】ＳＨ３ドメインはまた、酵素触媒活性を制
御し、膜や細胞骨格相互作用を促進する。従ってＳＨ３
ドメインは、いくつかの決定的に重要な細胞内シグナル
伝達タンパク質中に存在するため、多くの病状への介入
の標的である。
御し、膜や細胞骨格相互作用を促進する。従ってＳＨ３
ドメインは、いくつかの決定的に重要な細胞内シグナル
伝達タンパク質中に存在するため、多くの病状への介入
の標的である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、プロリンリッ
チなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作
用を阻害する能力を有する治療的価値のある化合物のス
クリーニング方法であって、該化合物は、種々の細胞内
シグナル伝達経路に関与するタンパク質を選択的に標的
化することができる、方法に関する。
チなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作
用を阻害する能力を有する治療的価値のある化合物のス
クリーニング方法であって、該化合物は、種々の細胞内
シグナル伝達経路に関与するタンパク質を選択的に標的
化することができる、方法に関する。
【０００８】１つの一般的な態様において本発明は、均
一時間分解蛍光法（Homogeneous Time-Resolved Fluore
scence technique）による、プロリンリッチなペプチド
とＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する
能力を有する、治療的価値のある化合物のスクリーニン
グ方法であって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドを含有する緩衝液を提供する工程（ここで、該
第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナーで
ある）； ｂ）工程ａ）で得られた溶液に候補化合物を加える工
程； ｃ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドを加える工程（ここで、
該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナー
である）； ｄ）工程ｄ）で得られた混合物を、対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーの励起波長に対
応する波長のエネルギー源に付して、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波長に
おける蛍光シグナルを測定する工程； ｅ）工程ｅ）で得られた蛍光シグナル値を、工程ｂ）が
無い時に得られた蛍光シグナル値と比較して、候補化合
物が、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有
ペプチドとの相互作用を阻害するかどうかを決定する工
程、を含んでなる、上記方法を提供する。
一時間分解蛍光法（Homogeneous Time-Resolved Fluore
scence technique）による、プロリンリッチなペプチド
とＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する
能力を有する、治療的価値のある化合物のスクリーニン
グ方法であって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドを含有する緩衝液を提供する工程（ここで、該
第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナーで
ある）； ｂ）工程ａ）で得られた溶液に候補化合物を加える工
程； ｃ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドを加える工程（ここで、
該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナー
である）； ｄ）工程ｄ）で得られた混合物を、対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーの励起波長に対
応する波長のエネルギー源に付して、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波長に
おける蛍光シグナルを測定する工程； ｅ）工程ｅ）で得られた蛍光シグナル値を、工程ｂ）が
無い時に得られた蛍光シグナル値と比較して、候補化合
物が、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有
ペプチドとの相互作用を阻害するかどうかを決定する工
程、を含んでなる、上記方法を提供する。
【０００９】好適な実施態様において本発明は、均一時
間分解蛍光法による、プロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物のスクリーニング方法であって、第１の蛍光マーカ
ーは対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパ
ートナーであり、第２の蛍光マーカーはその第２のパー
トナーである、上記方法を提供する。
間分解蛍光法による、プロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物のスクリーニング方法であって、第１の蛍光マーカ
ーは対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパ
ートナーであり、第２の蛍光マーカーはその第２のパー
トナーである、上記方法を提供する。
【００１０】別の好適な実施態様において本発明は、均
一時間分解蛍光法による、プロリンリッチなペプチドと
ＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候
補化合物のスクリーニング方法であって、第１の蛍光マ
ーカーは対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２
のパートナーであり、第２の蛍光マーカーはその第１の
パートナーである、上記方法を提供する。本発明の好適
なスクリーニング方法において、対のフレット（ＦＲＥ
Ｔ）蛍光マーカーの第１のパートナーはユーロピウムク
リプテート（Europium cryptate）である。別の本発明
の好適なスクリーニング方法において、対のフレット
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーはＸＬ６
６５である。
一時間分解蛍光法による、プロリンリッチなペプチドと
ＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候
補化合物のスクリーニング方法であって、第１の蛍光マ
ーカーは対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２
のパートナーであり、第２の蛍光マーカーはその第１の
パートナーである、上記方法を提供する。本発明の好適
なスクリーニング方法において、対のフレット（ＦＲＥ
Ｔ）蛍光マーカーの第１のパートナーはユーロピウムク
リプテート（Europium cryptate）である。別の本発明
の好適なスクリーニング方法において、対のフレット
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーはＸＬ６
６５である。
【００１１】本発明の一般的な態様は、本発明のスクリ
ーニング方法を提供し、ここでＳＨ３ドメイン含有ペプ
チドは、第２の蛍光マーカーで間接的に標識され、ここ
で該ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカ
ーを含む標識試薬に対する特異的親和性を有する検出可
能な分子に共有結合し、該標識試薬は、工程ｃ）で、Ｓ
Ｈ３ドメイン含有ペプチドの添加の後に加えられる。上
記スクリーニング方法の好適な実施態様において、検出
可能な分子はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）タンパク質である。上記スクリーニング方法
の別の好適な実施態様において、標識試薬は、第２の蛍
光マーカーで標識されたＧＳＴタンパク質に対する抗体
である。
ーニング方法を提供し、ここでＳＨ３ドメイン含有ペプ
チドは、第２の蛍光マーカーで間接的に標識され、ここ
で該ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカ
ーを含む標識試薬に対する特異的親和性を有する検出可
能な分子に共有結合し、該標識試薬は、工程ｃ）で、Ｓ
Ｈ３ドメイン含有ペプチドの添加の後に加えられる。上
記スクリーニング方法の好適な実施態様において、検出
可能な分子はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）タンパク質である。上記スクリーニング方法
の別の好適な実施態様において、標識試薬は、第２の蛍
光マーカーで標識されたＧＳＴタンパク質に対する抗体
である。
【００１２】本発明の別の一般的な態様は、プロリンリ
ッチなペプチドは、Ｆｙｎ、Ａｂｌ、ＣｒｋＮ、Ｓｒ
ｃ、Ｎｓｒｃ、ＰｌＫ、およびＮｅｆタンパク質中に含
有されるプロリンリッチなペプチドよりなる群から選択
される、本発明のスクリーニング方法を提供する。
ッチなペプチドは、Ｆｙｎ、Ａｂｌ、ＣｒｋＮ、Ｓｒ
ｃ、Ｎｓｒｃ、ＰｌＫ、およびＮｅｆタンパク質中に含
有されるプロリンリッチなペプチドよりなる群から選択
される、本発明のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】本発明の別の一般的な態様は、プロリンリ
ッチなペプチドは、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２
２ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、およびｐ６７ｐｈｏｘサ
ブユニットタンパク質中に含有されるプロリンリッチな
ペプチドの群から選択される、本発明のスクリーニング
方法を提供する。
ッチなペプチドは、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２
２ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘ、およびｐ６７ｐｈｏｘサ
ブユニットタンパク質中に含有されるプロリンリッチな
ペプチドの群から選択される、本発明のスクリーニング
方法を提供する。
【００１４】本発明のスクリーニング方法の好適な実施
態様において、プロリンリッチなペプチドは、ヒトＮＡ
ＤＰＨオキシダーゼのｐ２２ｐｈｏｘサブユニットタン
パク質中に含有されるプロリンリッチなペプチドであ
る。
態様において、プロリンリッチなペプチドは、ヒトＮＡ
ＤＰＨオキシダーゼのｐ２２ｐｈｏｘサブユニットタン
パク質中に含有されるプロリンリッチなペプチドであ
る。
【００１５】本発明の別の一般的な態様は、プロリンリ
ッチなペプチドは、５〜１００μMの解離定数を有する
ＳＨ３ドメインに結合する、約１０アミノ酸の長さのプ
ロリンリッチなアミノ酸配列を含む、スクリーニング方
法を提供する。
ッチなペプチドは、５〜１００μMの解離定数を有する
ＳＨ３ドメインに結合する、約１０アミノ酸の長さのプ
ロリンリッチなアミノ酸配列を含む、スクリーニング方
法を提供する。
【００１６】本発明のスクリーニング方法の好適な実施
態様において、プロリンリッチなペプチドは、「Ｐｒｏ
−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−
Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、
「＋−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ」、および「ｑ
−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」（ここで、Ｘは任
意のアミノ酸残基であり、＋はＡｒｇまたはＬｙｓであ
り、ｑは疎水性アミノ酸である）から選択されるプロリ
ンリッチなアミノ酸配列を含む。
態様において、プロリンリッチなペプチドは、「Ｐｒｏ
−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−
Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、
「＋−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ」、および「ｑ
−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」（ここで、Ｘは任
意のアミノ酸残基であり、＋はＡｒｇまたはＬｙｓであ
り、ｑは疎水性アミノ酸である）から選択されるプロリ
ンリッチなアミノ酸配列を含む。
【００１７】本発明のスクリーニング方法の別の好適な
実施態様において、プロリンリッチなペプチドは、「Ｒ
−Ｘ−＃−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「−Ｐｒｏ−Ｘ
−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｒ」、「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−
Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、
「Ｐｒｏ−Ｘ−＠−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒ
ｏ」、および「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｙ」（ここで、Ｘ
は任意のアミノ酸残基であり、＋はＡｒｇまたはＬｙｓ
であり、＠は芳香族または脂肪族アミノ酸残基であり、
＃は芳香族アミノ酸残基である）から選択されるプロリ
ンリッチなアミノ酸配列を含む。
実施態様において、プロリンリッチなペプチドは、「Ｒ
−Ｘ−＃−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「−Ｐｒｏ−Ｘ
−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｒ」、「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−
Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、
「Ｐｒｏ−Ｘ−＠−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒ
ｏ」、および「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｙ」（ここで、Ｘ
は任意のアミノ酸残基であり、＋はＡｒｇまたはＬｙｓ
であり、＠は芳香族または脂肪族アミノ酸残基であり、
＃は芳香族アミノ酸残基である）から選択されるプロリ
ンリッチなアミノ酸配列を含む。
【００１８】本発明の好適な実施態様において、上記の
スクリーニング方法は、プロリンリッチなペプチドが、
配列番号３のアミノ酸配列からの少なくとも１０個の連
続的なプロリンリッチなアミノ酸を含む、方法である。
本発明の最も好適な実施態様において、上記スクリーニ
ング方法は、プロリンリッチなペプチドが、配列番号３
のアミノ酸配列からなる、方法である。
スクリーニング方法は、プロリンリッチなペプチドが、
配列番号３のアミノ酸配列からの少なくとも１０個の連
続的なプロリンリッチなアミノ酸を含む、方法である。
本発明の最も好適な実施態様において、上記スクリーニ
ング方法は、プロリンリッチなペプチドが、配列番号３
のアミノ酸配列からなる、方法である。
【００１９】本発明はまた、プロリンリッチなペプチド
は、１０〜１００アミノ酸の長さを有する、本発明のス
クリーニング方法に関する。本発明はさらに、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、５５〜１００アミノ酸の長さを
有する、本発明のスクリーニング方法に関する。
は、１０〜１００アミノ酸の長さを有する、本発明のス
クリーニング方法に関する。本発明はさらに、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、５５〜１００アミノ酸の長さを
有する、本発明のスクリーニング方法に関する。
【００２０】本発明のスクリーニング方法の好適な実施
態様において、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ３ド
メインは、ヒトＰｌ３Ｋ ｐ８５、マウスＡｂｌ、ヒト
Ｆｙｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、シー・エレガン
ス（C. elegans）ＳＥＭ−５、マウスＧｒｂ２、ヒトＧ
ｒｂ２、マウスｃ−Ｃｒｋ、ヒト５３ＢＰ２、およびヒ
トＨｃｋキナーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメ
インの群から選択される。
態様において、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ３ド
メインは、ヒトＰｌ３Ｋ ｐ８５、マウスＡｂｌ、ヒト
Ｆｙｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、シー・エレガン
ス（C. elegans）ＳＥＭ−５、マウスＧｒｂ２、ヒトＧ
ｒｂ２、マウスｃ−Ｃｒｋ、ヒト５３ＢＰ２、およびヒ
トＨｃｋキナーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメ
インの群から選択される。
【００２１】本発明のスクリーニング方法の他の好適な
実施態様において、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ
３ドメインは、ヒトＰｌ３Ｋ ｐ８５、ヒトＡｂｌ、ヒ
トＦｙｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、ヒトＬｙｎ、
ヒトＧｒｂ２、ヒトＰＬＣ−γ、ヒト５３ＢＰ２、ヒト
ＧＡＰ、ヒト５３ＢＰ２、ヒトＣｓｋ、およびヒトＨｃ
ｋキナーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインの
群から選択される。
実施態様において、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ
３ドメインは、ヒトＰｌ３Ｋ ｐ８５、ヒトＡｂｌ、ヒ
トＦｙｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、ヒトＬｙｎ、
ヒトＧｒｂ２、ヒトＰＬＣ−γ、ヒト５３ＢＰ２、ヒト
ＧＡＰ、ヒト５３ＢＰ２、ヒトＣｓｋ、およびヒトＨｃ
ｋキナーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインの
群から選択される。
【００２２】本発明のさらなる態様は、ＳＨ３ドメイン
含有ペプチドのＳＨ３ドメインは、ヒトＮＡＤＰＨオキ
シダーゼのｐ４７ｐｈｏｘとｐ６７ｐｈｏｘサブユニッ
トタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインの群から選
択される、スクリーニング方法を提供する。本発明のス
クリーニング方法の好適な実施態様において、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドのＳＨ３ドメインは、ヒトＮＡＤＰ
Ｈオキシダーゼのｐ４７ｐｈｏｘサブユニットタンパク
質中に含有されるＳＨ３ドメインである。本発明のスク
リーニング方法の最も好適な実施態様において、ＳＨ３
ドメイン含有ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を
含む。
含有ペプチドのＳＨ３ドメインは、ヒトＮＡＤＰＨオキ
シダーゼのｐ４７ｐｈｏｘとｐ６７ｐｈｏｘサブユニッ
トタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインの群から選
択される、スクリーニング方法を提供する。本発明のス
クリーニング方法の好適な実施態様において、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドのＳＨ３ドメインは、ヒトＮＡＤＰ
Ｈオキシダーゼのｐ４７ｐｈｏｘサブユニットタンパク
質中に含有されるＳＨ３ドメインである。本発明のスク
リーニング方法の最も好適な実施態様において、ＳＨ３
ドメイン含有ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を
含む。
【００２３】本発明はまた、第１の蛍光マーカーで標識
されたプロリンリッチなペプチドからなるスクリーニン
グ試薬に関し、ここで第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである。本発明はさらに、第１の蛍
光マーカーが、ユーロピウムクリプテート分子である、
本発明のスクリーニング試薬に関する。好適な実施態様
において本発明のスクリーニング試薬は、ユーロピウム
クリプテート分子に共有結合した、配列番号３のアミノ
酸配列を有するプロリンリッチなペプチドからなる。
されたプロリンリッチなペプチドからなるスクリーニン
グ試薬に関し、ここで第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである。本発明はさらに、第１の蛍
光マーカーが、ユーロピウムクリプテート分子である、
本発明のスクリーニング試薬に関する。好適な実施態様
において本発明のスクリーニング試薬は、ユーロピウム
クリプテート分子に共有結合した、配列番号３のアミノ
酸配列を有するプロリンリッチなペプチドからなる。
【００２４】別の好適な実施態様において本発明のスク
リーニング試薬は、第２の蛍光マーカーで直接または間
接的に標識されたＳＨ３ドメイン含有ペプチドからな
り、第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）
蛍光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナ
ーである。本発明の別の態様は、第２の蛍光マーカーは
ＸＬ６６５である、上記スクリーニング試薬である。
リーニング試薬は、第２の蛍光マーカーで直接または間
接的に標識されたＳＨ３ドメイン含有ペプチドからな
り、第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）
蛍光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナ
ーである。本発明の別の態様は、第２の蛍光マーカーは
ＸＬ６６５である、上記スクリーニング試薬である。
【００２５】本発明のさらに一般的な態様は、プロリン
リッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相
互作用を阻害する候補化合物をスクリーニングするため
のキットであって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドからなる第１のスクリーニング試薬（ここで、
該第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナー
である）； ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドからなる第２のスクリー
ニング試薬（ここで、第２の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまた
は第１のパートナーである）、を含む上記キットであ
る。
リッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相
互作用を阻害する候補化合物をスクリーニングするため
のキットであって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドからなる第１のスクリーニング試薬（ここで、
該第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナー
である）； ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドからなる第２のスクリー
ニング試薬（ここで、第２の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまた
は第１のパートナーである）、を含む上記キットであ
る。
【００２６】本発明の別の態様は、ＧＳＴタンパク質に
融合した、配列番号４のアミノ酸配列を有するＳＨ３ド
メイン含有ペプチドからなるスクリーニング試薬であ
る。
融合した、配列番号４のアミノ酸配列を有するＳＨ３ド
メイン含有ペプチドからなるスクリーニング試薬であ
る。
【００２７】本発明の別の一般的な態様は、
ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）、とで
形成される複合体である。
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）、とで
形成される複合体である。
【００２８】本発明の一般的な態様は、
ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）ａ）で定義されたプロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体である。
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）ａ）で定義されたプロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体である。
【００２９】本発明はまた、
ａ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）；およ
び ｂ）プロリンリッチなペプチドとａ）で定義されたＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体に関する。
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）；およ
び ｂ）プロリンリッチなペプチドとａ）で定義されたＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体に関する。
【００３０】本発明の別の態様は、医薬組成物を製造す
るための、本発明のスクリーニング方法に従って選択さ
れた候補化合物の使用である。
るための、本発明のスクリーニング方法に従って選択さ
れた候補化合物の使用である。
【００３１】
【発明の実施の形態】すべてのＳＨ３ドメインは、同じ
全体的な形態を有し、ほぼ直角で互いに詰め込まれた２
つの小さいβシートからなる。ＳＨ３ドメインを比較す
ると、現れる３つの可変ループがある（ＲＴ、Ｎ−Ｓｒ
ｃ、およびディスタルループと呼び、この名前は、ドメ
イン自体の名前のように、Ｓｒｃチロシンキナーゼの特
徴を示す）。ＳＨ３ドメインのペプチド結合表面は、芳
香族残基の伸長した領域からなり、これは、プロリンリ
ッチなペプチドのような比較的疎水性リガンドに結合す
るのに適している。ＳＨ３ドメインは、一般に左手型の
ポリプロリン−IIらせん（ＰＰII）コンフォメーション
を取るプロリンリッチなリガンドに実際に結合し、らせ
んの同じ面の上に２つのプロリンを有し、結合に決定的
に重要な２つのアミノ酸により分離され、構造式「Ｐｒ
ｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」（ここで、Ｘは任意のアミノ酸で
ある）を有してもよいことが証明されている。
全体的な形態を有し、ほぼ直角で互いに詰め込まれた２
つの小さいβシートからなる。ＳＨ３ドメインを比較す
ると、現れる３つの可変ループがある（ＲＴ、Ｎ−Ｓｒ
ｃ、およびディスタルループと呼び、この名前は、ドメ
イン自体の名前のように、Ｓｒｃチロシンキナーゼの特
徴を示す）。ＳＨ３ドメインのペプチド結合表面は、芳
香族残基の伸長した領域からなり、これは、プロリンリ
ッチなペプチドのような比較的疎水性リガンドに結合す
るのに適している。ＳＨ３ドメインは、一般に左手型の
ポリプロリン−IIらせん（ＰＰII）コンフォメーション
を取るプロリンリッチなリガンドに実際に結合し、らせ
んの同じ面の上に２つのプロリンを有し、結合に決定的
に重要な２つのアミノ酸により分離され、構造式「Ｐｒ
ｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」（ここで、Ｘは任意のアミノ酸で
ある）を有してもよいことが証明されている。
【００３２】ＳＨ３ドメインとプロリンリッチなペプチ
ドとの相互作用の典型的な例は、ＮＡＤＰＨオキシダー
ゼの異なるタンパク質サブユニットの組み立てを安定化
するために存在する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素は、
少なくとも４つのポリペプチド成分からなる。この成分
のうちの２つ（ｇｐ９１−ｐｈｏｘとｐ２２−ｐｈｏｘ
と呼ぶ）は、異常なヘテロダイマーチトクロムｂ（すな
わちチトクロムｂ558）を形成する。他の２つの成分
（ｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７−ｐｈｏｘと呼ぶ）は、酵
素の活性化中にチトクロムｂ558と一緒になるサイトゾ
ルタンパク質である。
ドとの相互作用の典型的な例は、ＮＡＤＰＨオキシダー
ゼの異なるタンパク質サブユニットの組み立てを安定化
するために存在する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵素は、
少なくとも４つのポリペプチド成分からなる。この成分
のうちの２つ（ｇｐ９１−ｐｈｏｘとｐ２２−ｐｈｏｘ
と呼ぶ）は、異常なヘテロダイマーチトクロムｂ（すな
わちチトクロムｂ558）を形成する。他の２つの成分
（ｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７−ｐｈｏｘと呼ぶ）は、酵
素の活性化中にチトクロムｂ558と一緒になるサイトゾ
ルタンパク質である。
【００３３】少なくとも１つの追加のタンパク質である
小ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ（Ｒａｃ１またはＲａｃ
２）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化に必要である。
６番目のオキシダーゼ関連タンパク質（ｐ４０−ｐｈｏ
ｘと呼ぶ）が最近同定され、ｐ４７−ｐｈｏｘやｐ６７
−ｐｈｏｘと配列類似性を有し、ｐ６７−ｐｈｏｘと物
理的に結合するようである。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵
素系の成分をコードする４つの遺伝子のいずれかに欠陥
があると、慢性肉芽腫のような疾患を引き起こし得る。
ｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７−ｐｈｏｘのそれぞれは、２
つのＳＨ３ドメインを含有する。新に開示されたｐ４０
−ｐｈｏｘもまた、１つのＳＨ３ドメインを含有する。
この型のＣＧＤを有する患者から得られたｐ６７−ｐｈ
ｏｘ欠損Ｂ細胞株にトランスフェクションされた時、Ｓ
Ｈ３ドメインの１つまたは両方が欠如したｐ６７−ｐｈ
ｏｘの欠損変異体は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化
する能力を回復することができないため、ｐ６７−ｐｈ
ｏｘとｐ４７−ｐｈｏｘの両方のＳＨ３ドメインは、Ｎ
ＡＤＰＨオキシダーゼ活性化に必要である（デ・メンデ
ツ（DE MENDEZ）ら、１９９４）。ＮＡＤＰＨオキシダ
ーゼ成分中のプロリンリッチな配列と、ｐ４７−ｐｈｏ
ｘとｐ６７−ｐｈｏｘのＳＨ３ドメインとの相互作用
が、最近同定された。最初の相互作用は、ｐ６７−ｐｈ
ｏｘの第２のＳＨ３ドメインと、ｐ４７−ｐｈｏｘ中の
ＣＯＯＨ末端プロリンリッチな配列との結合である。第
２の相互作用は、ｐ４７−ｐｈｏｘのＳＨ３ドメイン
と、３つのプロリンリッチな配列を含有するｐ２２−ｐ
ｈｏｘの細胞質領域との結合が関与する。ｐ２２−ｐｈ
ｏｘ中の中央のプロリンリッチな領域中の天然の突然変
異が、ＣＧＤ患者で報告されている。この突然変異は、
ＧＳＴ融合タンパク質中に導入されると、ＧＳＴ−ｐ４
７−ｐｈｏｘ−ＳＨ３の結合が顕著に低下した（レト
（LETO）ら、１９９４）。このグループは、ｐ２２−ｐ
ｈｏｘの中央のプロリンリッチな配列（アミノ酸１４９
〜１６２）を含有する合成ペプチドが、ＧＳＴ−ｐ４７
−ＳＨ３とＧＳＴ−ｐ２２（アミノ酸１２７〜１９５）
との結合を切断し、ＣＯＯＨの末端プロリンリッチな配
列（アミノ酸１７０〜１９５）に基づくまたはｐ２２−
ｐｈｏｘ突然変異Ｐ１５６Ｑを含有するペプチドは無効
であることを証明した。これらの結果は、ｐ４７−ｐｈ
ｏｘとｐ２２−ｐｈｏｘのＳＨ３ドメインの間の相互作
用は、Ｐｒｏ１５６に依存することを示唆し、この結果
は、プロリン依存性相互作用が、活性な酵素の組み立て
に決定的に重要であることを、強く示唆する。
小ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ（Ｒａｃ１またはＲａｃ
２）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化に必要である。
６番目のオキシダーゼ関連タンパク質（ｐ４０−ｐｈｏ
ｘと呼ぶ）が最近同定され、ｐ４７−ｐｈｏｘやｐ６７
−ｐｈｏｘと配列類似性を有し、ｐ６７−ｐｈｏｘと物
理的に結合するようである。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ酵
素系の成分をコードする４つの遺伝子のいずれかに欠陥
があると、慢性肉芽腫のような疾患を引き起こし得る。
ｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７−ｐｈｏｘのそれぞれは、２
つのＳＨ３ドメインを含有する。新に開示されたｐ４０
−ｐｈｏｘもまた、１つのＳＨ３ドメインを含有する。
この型のＣＧＤを有する患者から得られたｐ６７−ｐｈ
ｏｘ欠損Ｂ細胞株にトランスフェクションされた時、Ｓ
Ｈ３ドメインの１つまたは両方が欠如したｐ６７−ｐｈ
ｏｘの欠損変異体は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化
する能力を回復することができないため、ｐ６７−ｐｈ
ｏｘとｐ４７−ｐｈｏｘの両方のＳＨ３ドメインは、Ｎ
ＡＤＰＨオキシダーゼ活性化に必要である（デ・メンデ
ツ（DE MENDEZ）ら、１９９４）。ＮＡＤＰＨオキシダ
ーゼ成分中のプロリンリッチな配列と、ｐ４７−ｐｈｏ
ｘとｐ６７−ｐｈｏｘのＳＨ３ドメインとの相互作用
が、最近同定された。最初の相互作用は、ｐ６７−ｐｈ
ｏｘの第２のＳＨ３ドメインと、ｐ４７−ｐｈｏｘ中の
ＣＯＯＨ末端プロリンリッチな配列との結合である。第
２の相互作用は、ｐ４７−ｐｈｏｘのＳＨ３ドメイン
と、３つのプロリンリッチな配列を含有するｐ２２−ｐ
ｈｏｘの細胞質領域との結合が関与する。ｐ２２−ｐｈ
ｏｘ中の中央のプロリンリッチな領域中の天然の突然変
異が、ＣＧＤ患者で報告されている。この突然変異は、
ＧＳＴ融合タンパク質中に導入されると、ＧＳＴ−ｐ４
７−ｐｈｏｘ−ＳＨ３の結合が顕著に低下した（レト
（LETO）ら、１９９４）。このグループは、ｐ２２−ｐ
ｈｏｘの中央のプロリンリッチな配列（アミノ酸１４９
〜１６２）を含有する合成ペプチドが、ＧＳＴ−ｐ４７
−ＳＨ３とＧＳＴ−ｐ２２（アミノ酸１２７〜１９５）
との結合を切断し、ＣＯＯＨの末端プロリンリッチな配
列（アミノ酸１７０〜１９５）に基づくまたはｐ２２−
ｐｈｏｘ突然変異Ｐ１５６Ｑを含有するペプチドは無効
であることを証明した。これらの結果は、ｐ４７−ｐｈ
ｏｘとｐ２２−ｐｈｏｘのＳＨ３ドメインの間の相互作
用は、Ｐｒｏ１５６に依存することを示唆し、この結果
は、プロリン依存性相互作用が、活性な酵素の組み立て
に決定的に重要であることを、強く示唆する。
【００３４】先行技術の前記分析から、いくつかのＳＨ
３ドメインとプロリンリッチなリガンドとの相互作用を
検出または評価するためのいくつかの測定法が、設計さ
れていることが考えられる。
３ドメインとプロリンリッチなリガンドとの相互作用を
検出または評価するためのいくつかの測定法が、設計さ
れていることが考えられる。
【００３５】例えば、レト（LETO）ら（１９９４）は、
ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ４７−ｐｈｏｘとｐ２２−ｐ
ｈｏｘとの相互作用を評価するための結合測定を行っ
た。この目的のために、ＧＳＴ−ＳＨ３融合タンパク質
をビオチン化し、次にこれを使用して、５％脱脂乳中で
あらかじめブロッキングしたタンパク質のニトロセルロ
ースブロットとプローブ結合させた。相互作用の検出
は、抗ｐ６７−ｐｈｏｘを用いて免疫ブロッティングに
より行った。この測定において、完全長ｐ４７−ｐｈｏ
ｘとＰＰ２Ａｃの両方が使用された。ＮＡＤＰＨオキシ
ダーゼアセンブリーと活性化におけるｐ４７−ｐｈｏｘ
ＳＨ３ドメイン相互作用の特異性を評価するために、同
様の免疫ブロッティングが行われた。デ・メンデジ（DE
MENDEZI）ら（１９９７）。
ＮＡＤＰＨオキシダーゼｐ４７−ｐｈｏｘとｐ２２−ｐ
ｈｏｘとの相互作用を評価するための結合測定を行っ
た。この目的のために、ＧＳＴ−ＳＨ３融合タンパク質
をビオチン化し、次にこれを使用して、５％脱脂乳中で
あらかじめブロッキングしたタンパク質のニトロセルロ
ースブロットとプローブ結合させた。相互作用の検出
は、抗ｐ６７−ｐｈｏｘを用いて免疫ブロッティングに
より行った。この測定において、完全長ｐ４７−ｐｈｏ
ｘとＰＰ２Ａｃの両方が使用された。ＮＡＤＰＨオキシ
ダーゼアセンブリーと活性化におけるｐ４７−ｐｈｏｘ
ＳＨ３ドメイン相互作用の特異性を評価するために、同
様の免疫ブロッティングが行われた。デ・メンデジ（DE
MENDEZI）ら（１９９７）。
【００３６】食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの組み立て
と活性化もまた、スミモト（SUMIMOTO）ら（１９９６）
により研究されている。これらの著者らは、ｐ４７−ｐ
ｈｏｘとｐ２２−ｐｈｏｘとの相互作用を、ＧＳＴとの
融合タンパク質の形でこれらのタンパク質の完全長また
は部分的アミノ酸配列を使用して評価した。ｐ２２−ｐ
ｈｏｘのＣ末端細胞質テイルへの、ｐ４７−ｐｈｏｘの
ＳＨ３ドメインの結合の測定法は、ｐ２２−ｐｈｏｘの
種々の領域を含有する精製ＧＳＴ融合タンパク質をニト
ロセルロース膜に移行させ、次に緩衝液でブロッキング
し、次にｐ４７−ｐｈｏｘの種々のＳＨ３ドメインとの
ＧＳＴ融合タンパク質とインキュベートし、次にフィル
ターを抗ＧＳＴモノクローナル抗体とプローブ結合させ
て、相互作用の存在を検出することを含む。これらの著
者らはまた、ｐ２２−ｐｈｏｘのＣ末端細胞質ドメイン
を含有する第１のベクターと、ｐ４７−ｐｈｏｘのタン
デムＳＨ３ドメインを含有する第２のベクターとを使用
して、酵母で２−ハイブリッド実験を行い、２つのＮＡ
ＤＰＨオキシダーゼサブユニットタンパク質の間の相互
作用を、β−ガラクトシダーゼ測定法により明らかにし
ていた。
と活性化もまた、スミモト（SUMIMOTO）ら（１９９６）
により研究されている。これらの著者らは、ｐ４７−ｐ
ｈｏｘとｐ２２−ｐｈｏｘとの相互作用を、ＧＳＴとの
融合タンパク質の形でこれらのタンパク質の完全長また
は部分的アミノ酸配列を使用して評価した。ｐ２２−ｐ
ｈｏｘのＣ末端細胞質テイルへの、ｐ４７−ｐｈｏｘの
ＳＨ３ドメインの結合の測定法は、ｐ２２−ｐｈｏｘの
種々の領域を含有する精製ＧＳＴ融合タンパク質をニト
ロセルロース膜に移行させ、次に緩衝液でブロッキング
し、次にｐ４７−ｐｈｏｘの種々のＳＨ３ドメインとの
ＧＳＴ融合タンパク質とインキュベートし、次にフィル
ターを抗ＧＳＴモノクローナル抗体とプローブ結合させ
て、相互作用の存在を検出することを含む。これらの著
者らはまた、ｐ２２−ｐｈｏｘのＣ末端細胞質ドメイン
を含有する第１のベクターと、ｐ４７−ｐｈｏｘのタン
デムＳＨ３ドメインを含有する第２のベクターとを使用
して、酵母で２−ハイブリッド実験を行い、２つのＮＡ
ＤＰＨオキシダーゼサブユニットタンパク質の間の相互
作用を、β−ガラクトシダーゼ測定法により明らかにし
ていた。
【００３７】さらに、これらの著者らは、ＳＨ３ドメイ
ンとｐ２２−ｐｈｏｘとのリアルタイム相互作用測定法
を設計し、これは、ＧＳＴ−ｐ２２−ｐｈｏｘを固定化
し、こうして固定化されたタンパク質の相互作用を、リ
アルタイム光学変化のレーザーバイオセンサー測定値に
より解析して、検出した。
ンとｐ２２−ｐｈｏｘとのリアルタイム相互作用測定法
を設計し、これは、ＧＳＴ−ｐ２２−ｐｈｏｘを固定化
し、こうして固定化されたタンパク質の相互作用を、リ
アルタイム光学変化のレーザーバイオセンサー測定値に
より解析して、検出した。
【００３８】上記で詳述した異なる測定法は、１つまた
はいくつかのＳＨ３ドメインを含有する第１のタンパク
質と、プロリンリッチな領域を含有する第２のタンパク
質との結合の有無を評価するのに充分である。
はいくつかのＳＨ３ドメインを含有する第１のタンパク
質と、プロリンリッチな領域を含有する第２のタンパク
質との結合の有無を評価するのに充分である。
【００３９】細胞内経路シグナル伝達に関与するタンパ
ク質のＳＨ３ドメインとプロリンリッチな領域との相互
作用の重要性と、種々の疾患の発症におけるそのような
ペプチドモチーフを有するタンパク質の関与とを考慮し
て、発明者らは、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する能力を有す
る化合物をスクリーニングするための特異的な測定法を
設計し、ここで、そのような化合物は、そのようなタン
パク質の転写、翻訳または生物活性制御欠陥に関連した
疾患を予防または治療するための種々の細胞内シグナル
伝達経路タンパク質の生物活性の制御または調節を可能
にする。
ク質のＳＨ３ドメインとプロリンリッチな領域との相互
作用の重要性と、種々の疾患の発症におけるそのような
ペプチドモチーフを有するタンパク質の関与とを考慮し
て、発明者らは、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する能力を有す
る化合物をスクリーニングするための特異的な測定法を
設計し、ここで、そのような化合物は、そのようなタン
パク質の転写、翻訳または生物活性制御欠陥に関連した
疾患を予防または治療するための種々の細胞内シグナル
伝達経路タンパク質の生物活性の制御または調節を可能
にする。
【００４０】これらのインヒビター化合物のそのような
スクリーニング方法を設計するために、先行技術の測定
法は： ａ）測定中に検出される結合性相互作用の特異性がある
こと； ｂ）結合パートナータンパク質の１つの高レベルの放出
が観察される状況でも、測定の感度があること； ｃ）容易に合成できる試薬の使用すること； ｄ）方法の再現性があること； ｅ）候補インヒビター化合物の高効率スキャニングを可
能にすること のような種々の要件を満足する必要があるため、本発明
者らはそのような方法のいくつかの欠点を避けなければ
ならなかった。
スクリーニング方法を設計するために、先行技術の測定
法は： ａ）測定中に検出される結合性相互作用の特異性がある
こと； ｂ）結合パートナータンパク質の１つの高レベルの放出
が観察される状況でも、測定の感度があること； ｃ）容易に合成できる試薬の使用すること； ｄ）方法の再現性があること； ｅ）候補インヒビター化合物の高効率スキャニングを可
能にすること のような種々の要件を満足する必要があるため、本発明
者らはそのような方法のいくつかの欠点を避けなければ
ならなかった。
【００４１】候補インヒビター化合物のスクリーニング
方法におけるこれらの要件は、上記で詳述した先行技術
によっては満たされない。
方法におけるこれらの要件は、上記で詳述した先行技術
によっては満たされない。
【００４２】免疫ブロッティング法は、膜（通常ニトロ
セルロース）上への第１のパートナータンパク質の固定
化を含み、これは、該固定化タンパク質の空間的コンフ
ォメーションに大きな影響を与えることがあり、第２の
パートナーとの自然に起きる結合の間に観察されるであ
ろう親和性に関して、その親和性を低下または上昇させ
ることにより、第２のパートナータンパク質との以後の
相互作用を実質的に変化させ得る。
セルロース）上への第１のパートナータンパク質の固定
化を含み、これは、該固定化タンパク質の空間的コンフ
ォメーションに大きな影響を与えることがあり、第２の
パートナーとの自然に起きる結合の間に観察されるであ
ろう親和性に関して、その親和性を低下または上昇させ
ることにより、第２のパートナータンパク質との以後の
相互作用を実質的に変化させ得る。
【００４３】さらに、いくつかの先行技術の測定法は、
ＧＳＴ融合タンパク質の形で２つのパートナータンパク
質を利用したが、これは、２つのパートナータンパク質
間の非特異的相互作用を上昇させる。これは、ＧＳＴタ
ンパク質は容易にダイマー化し、従って２つのパートナ
ータンパク質間の弱いかまたは非特異的相互作用が安定
化されたように見えるためである。
ＧＳＴ融合タンパク質の形で２つのパートナータンパク
質を利用したが、これは、２つのパートナータンパク質
間の非特異的相互作用を上昇させる。これは、ＧＳＴタ
ンパク質は容易にダイマー化し、従って２つのパートナ
ータンパク質間の弱いかまたは非特異的相互作用が安定
化されたように見えるためである。
【００４４】免疫ブロッティング測定法で起きる非特異
的相互作用が、求める相互作用の特異性を変化させるの
みでなく、その測定法の感度と再現性も変化させるとい
う必要はない。さらに免疫ブロッティング測定法は、各
パートナータンパク質を大量に使用することが必要であ
り、これは、大規模スクリーニング方法を行うのに適し
ていない。
的相互作用が、求める相互作用の特異性を変化させるの
みでなく、その測定法の感度と再現性も変化させるとい
う必要はない。さらに免疫ブロッティング測定法は、各
パートナータンパク質を大量に使用することが必要であ
り、これは、大規模スクリーニング方法を行うのに適し
ていない。
【００４５】さらにこれらの方法は、高処理スクリーニ
ングには適していない。２つのパートナータンパク質の
結合のリアルタイム相互作用解析はまた、天然でインビ
ボで起きる結合にできるだけ近い環境条件での結合イベ
ントの試験を可能にしない、少なくとも１つの該パート
ナータンパク質の固定化を含む。
ングには適していない。２つのパートナータンパク質の
結合のリアルタイム相互作用解析はまた、天然でインビ
ボで起きる結合にできるだけ近い環境条件での結合イベ
ントの試験を可能にしない、少なくとも１つの該パート
ナータンパク質の固定化を含む。
【００４６】本発明者らは、プロリンリッチなペプチド
とＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの特異的結合性相互作
用を含む方法を見いだし、これは、その特異性、感度お
よび再現性が、どの相互作用性タンパク質パートナーも
固定化しないで、均一な液相中で起きるこの特異的相互
作用を阻害することができる化合物を、スクリーニング
するのに使用することを可能にする。
とＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの特異的結合性相互作
用を含む方法を見いだし、これは、その特異性、感度お
よび再現性が、どの相互作用性タンパク質パートナーも
固定化しないで、均一な液相中で起きるこの特異的相互
作用を阻害することができる化合物を、スクリーニング
するのに使用することを可能にする。
【００４７】さらに本発明者らは、本発明のスクリーニ
ング方法は、免疫ブロッティング測定における結合を安
定化するために使用されるか、またはリアルタイム相互
作用解析測定の反応キュベットに結合した連結アームと
して使用される、相互作用性ＳＨ３ドメインとプロリン
リッチなモチーフの横に位置するアミノ酸配列の必要性
が無いため、完全長タンパク質や大きなポリペプチドの
使用を必要としないことを見いだした。
ング方法は、免疫ブロッティング測定における結合を安
定化するために使用されるか、またはリアルタイム相互
作用解析測定の反応キュベットに結合した連結アームと
して使用される、相互作用性ＳＨ３ドメインとプロリン
リッチなモチーフの横に位置するアミノ酸配列の必要性
が無いため、完全長タンパク質や大きなポリペプチドの
使用を必要としないことを見いだした。
【００４８】ＳＨ３ドメイン含有ペプチドへのそのよう
な小さいプロリンリッチな配列の結合が、視覚化できる
ことは予想外であった。さらに、ＳＨ３ドメイン含有ペ
プチドとそのような小さいプロリンリッチなペプチドの
間の相互作用は、比較的弱い（５〜１００μMの範囲）
ため、この相互作用がＨＴＲＦで試験できることは予想
外であった。
な小さいプロリンリッチな配列の結合が、視覚化できる
ことは予想外であった。さらに、ＳＨ３ドメイン含有ペ
プチドとそのような小さいプロリンリッチなペプチドの
間の相互作用は、比較的弱い（５〜１００μMの範囲）
ため、この相互作用がＨＴＲＦで試験できることは予想
外であった。
【００４９】従って本発明はまず、均一時間分解蛍光法
による、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含
有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化合物のスクリ
ーニング方法であって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドを含有する緩衝液を提供する工程（ここで、該
第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナーで
ある）； ｂ）工程ａ）で得られた溶液に候補化合物を加える工
程； ｃ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドを加える工程（ここで、
該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナー
である）； ｄ）工程ｄ）で得られた混合物を、対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーの励起波長に対
応する波長のエネルギー源に付して、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波長に
おける蛍光シグナルを測定する工程； ｅ）工程ｅ）で得られた蛍光シグナル値を、工程ｂ）が
無い時に得られた蛍光シグナル値と比較して、候補化合
物が、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有
ペプチドとの相互作用を阻害するかどうかを決定する工
程、を含んでなる、上記方法に関する。
による、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含
有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化合物のスクリ
ーニング方法であって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドを含有する緩衝液を提供する工程（ここで、該
第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナーで
ある）； ｂ）工程ａ）で得られた溶液に候補化合物を加える工
程； ｃ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドを加える工程（ここで、
該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナー
である）； ｄ）工程ｄ）で得られた混合物を、対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーの励起波長に対
応する波長のエネルギー源に付して、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波長に
おける蛍光シグナルを測定する工程； ｅ）工程ｅ）で得られた蛍光シグナル値を、工程ｂ）が
無い時に得られた蛍光シグナル値と比較して、候補化合
物が、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有
ペプチドとの相互作用を阻害するかどうかを決定する工
程、を含んでなる、上記方法に関する。
【００５０】均一時間分解蛍光法は、すべての成分が完
全に溶液中にある均一測定法からなり、これは、均一測
定法の利点、放射性同位元素法の強固さと感度、および
非アイソトープ性蛍光標識物の安全性と安定性とを組合
せている。ＨＴＲＦ法は、蛍光共鳴エネルギー移動を利
用し、これは、蛍光性ドナー分子のエネルギーが、光子
の関与無しで蛍光アクセプターに移動される非放射性の
方法である（フォルスター（Forster）、１９４８，１
９４９）。この相互作用の１つの結果は、ドナー分子の
励起が、より長波長のアクセプター分子の蛍光発光を増
強すること（すなわち、増感されたアクセプター放出）
である。
全に溶液中にある均一測定法からなり、これは、均一測
定法の利点、放射性同位元素法の強固さと感度、および
非アイソトープ性蛍光標識物の安全性と安定性とを組合
せている。ＨＴＲＦ法は、蛍光共鳴エネルギー移動を利
用し、これは、蛍光性ドナー分子のエネルギーが、光子
の関与無しで蛍光アクセプターに移動される非放射性の
方法である（フォルスター（Forster）、１９４８，１
９４９）。この相互作用の１つの結果は、ドナー分子の
励起が、より長波長のアクセプター分子の蛍光発光を増
強すること（すなわち、増感されたアクセプター放出）
である。
【００５１】同時に、ドナーの蛍光発光の量子収率が低
下する。エネルギー移動の効率は、ドナー分子とアクセ
プター分子との距離に強く逆比例する。すなわちＦＲＥ
Ｔは、２つの分子が近接に存在するかどうかの、非常に
特異性の高い指標である。
下する。エネルギー移動の効率は、ドナー分子とアクセ
プター分子との距離に強く逆比例する。すなわちＦＲＥ
Ｔは、２つの分子が近接に存在するかどうかの、非常に
特異性の高い指標である。
【００５２】各ドナー分子とアクセプター分子の性質に
依存して、共鳴エネルギー移動が起きる距離の範囲が変
化する。いくつかの対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マー
カーについて、共鳴エネルギー移動は、ドナー分子とア
クセプター分子との１０〜１００オングストロームの距
離範囲内で起きることは広く認められている。他の対の
ＦＲＥＴマーカー（例えば、ユークリプターゼ（Eucryp
tase）とＸＬ６６５）について、９nmの距離で５０％の
エネルギー移動が起き、７．５nmで７５％のエネルギー
移動が起きることが予測される。
依存して、共鳴エネルギー移動が起きる距離の範囲が変
化する。いくつかの対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マー
カーについて、共鳴エネルギー移動は、ドナー分子とア
クセプター分子との１０〜１００オングストロームの距
離範囲内で起きることは広く認められている。他の対の
ＦＲＥＴマーカー（例えば、ユークリプターゼ（Eucryp
tase）とＸＬ６６５）について、９nmの距離で５０％の
エネルギー移動が起き、７．５nmで７５％のエネルギー
移動が起きることが予測される。
【００５３】本発明の方法では、プロリンリッチなペプ
チドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの結合相互作用の
存在は、アクセプターＦＲＥＴ蛍光マーカーの発光波長
で放出される蛍光シグナルの尺度、均一測定法の溶液中
のプロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプ
チドの間で起きる相互作用の親和性または数を反映する
蛍光シグナルのレベルにより、光学的に検出される。確
かに、測定される蛍光シグナルのレベルは、溶液中の結
合タンパク質パートナーの数と遊離のタンパク質パート
ナーの数との平衡を直接反映し、これらのタンパク質の
間の結合相互作用の実際の親和性を測定することを可能
にする。さらに、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補分子に
よる結合平衡の移動もまた、アクセプター分子発光波長
の蛍光シグナルの低下を評価することにより、直接測定
され、こうして、測定される候補化合物の中から、高い
結合平衡移動が測定されるものを選択することを可能に
する。
チドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの結合相互作用の
存在は、アクセプターＦＲＥＴ蛍光マーカーの発光波長
で放出される蛍光シグナルの尺度、均一測定法の溶液中
のプロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプ
チドの間で起きる相互作用の親和性または数を反映する
蛍光シグナルのレベルにより、光学的に検出される。確
かに、測定される蛍光シグナルのレベルは、溶液中の結
合タンパク質パートナーの数と遊離のタンパク質パート
ナーの数との平衡を直接反映し、これらのタンパク質の
間の結合相互作用の実際の親和性を測定することを可能
にする。さらに、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補分子に
よる結合平衡の移動もまた、アクセプター分子発光波長
の蛍光シグナルの低下を評価することにより、直接測定
され、こうして、測定される候補化合物の中から、高い
結合平衡移動が測定されるものを選択することを可能に
する。
【００５４】「ペプチド」という用語は、１０〜１００
アミノ酸の長さを有する共有結合したアミノ酸残基から
なるポリマー化合物を意味する。
アミノ酸の長さを有する共有結合したアミノ酸残基から
なるポリマー化合物を意味する。
【００５５】プロリンリッチな「ペプチド」という用語
は、１０〜１００アミノ酸の長さを有することを意味す
る。
は、１０〜１００アミノ酸の長さを有することを意味す
る。
【００５６】本発明の目的において、「プロリンリッチ
なペプチド」とは、ＳＨ３ドメインに対して高親和性結
合性を有し、従ってＳＨ３−結合部位を含むプロリンリ
ッチなアミノ酸配列を含む。本発明のプロリンリッチな
ペプチドに含有されるプロリンリッチなアミノ酸配列モ
チーフは、約１０アミノ酸の長さを有し、５〜１００μ
Mの解離定数でＳＨ３ドメインに結合する。本発明のス
クリーニング法において、プロリンリッチなペプチド
は、解離定数が１０μM未満、好ましくは５μM未満、さ
らに好ましくは１μM未満で、ＳＨ３含有ペプチドに結
合しなければならない。
なペプチド」とは、ＳＨ３ドメインに対して高親和性結
合性を有し、従ってＳＨ３−結合部位を含むプロリンリ
ッチなアミノ酸配列を含む。本発明のプロリンリッチな
ペプチドに含有されるプロリンリッチなアミノ酸配列モ
チーフは、約１０アミノ酸の長さを有し、５〜１００μ
Mの解離定数でＳＨ３ドメインに結合する。本発明のス
クリーニング法において、プロリンリッチなペプチド
は、解離定数が１０μM未満、好ましくは５μM未満、さ
らに好ましくは１μM未満で、ＳＨ３含有ペプチドに結
合しなければならない。
【００５７】当業者は、プロリンリッチなアミノ酸配列
モチーフの網羅的な構造および機能の定義について、種
々の公表された論文を参照することが有利であり、例え
ばポーソン（PAWSON）（１９９５）、レン・アール（RE
N R.）ら、１９９３、マウスｍＳｏｓ、ユー（YU）ら
（１９９４ Ｐ１３Ｋｐ８５、ヒト）、チェン（CHEN）
ら（１９９３）、フェング（FENG）ら（１９９４）、リ
ム（LIM）ら（１９９４）、ムサッチオ・エー（MUSACCH
IO A）ら（１９９４、３ＢＰ−１、ヒト）、ウィッテキ
ンド（WITTEKIND）ら（１９９４）、リクレス（RICKLE
S）ら（１９９４）、チェーニアック（CHERNIACK）ら
（１９９４）、メイヤー・ビー・ジェイ（MAYER BJ）、
セサレニ（Cesareni）ら（２００２）、およびエック・
エム・ジェイ（ECK MJ）の論文を参照されたい。これら
の文献のそれぞれは、参照することにより本明細書に組
み込まれる。
モチーフの網羅的な構造および機能の定義について、種
々の公表された論文を参照することが有利であり、例え
ばポーソン（PAWSON）（１９９５）、レン・アール（RE
N R.）ら、１９９３、マウスｍＳｏｓ、ユー（YU）ら
（１９９４ Ｐ１３Ｋｐ８５、ヒト）、チェン（CHEN）
ら（１９９３）、フェング（FENG）ら（１９９４）、リ
ム（LIM）ら（１９９４）、ムサッチオ・エー（MUSACCH
IO A）ら（１９９４、３ＢＰ−１、ヒト）、ウィッテキ
ンド（WITTEKIND）ら（１９９４）、リクレス（RICKLE
S）ら（１９９４）、チェーニアック（CHERNIACK）ら
（１９９４）、メイヤー・ビー・ジェイ（MAYER BJ）、
セサレニ（Cesareni）ら（２００２）、およびエック・
エム・ジェイ（ECK MJ）の論文を参照されたい。これら
の文献のそれぞれは、参照することにより本明細書に組
み込まれる。
【００５８】典型的なプロリンリッチなアミノ酸配列モ
チーフは、それぞれ「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「＋
−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−
Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、「＋−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ
−ｑ−Ｐｒｏ」、および「ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ
−Ｘ−＋」（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、
＋はＡｒｇまたはＬｙｓであり、ｑは疎水性アミノ酸で
ある）である。
チーフは、それぞれ「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「＋
−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−
Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、「＋−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ
−ｑ−Ｐｒｏ」、および「ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ
−Ｘ−＋」（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、
＋はＡｒｇまたはＬｙｓであり、ｑは疎水性アミノ酸で
ある）である。
【００５９】さらに詳しくは典型的なプロリンリッチな
アミノ酸配列モチーフは、それぞれ「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−
Ｐｒｏ」、「Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｐ
ｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｒｇ」、
「Ａｒｇ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ」、および
「ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｒｇ」（ここ
で、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｑは疎水性アミノ
酸である）である。
アミノ酸配列モチーフは、それぞれ「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−
Ｐｒｏ」、「Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｐ
ｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｒｇ」、
「Ａｒｇ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ」、および
「ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｒｇ」（ここ
で、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、ｑは疎水性アミノ
酸である）である。
【００６０】他の典型的なプロリンリッチなアミノ酸配
列モチーフは、それぞれ「Ｒ−Ｘ−＃−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ
−Ｐｒｏ」、「−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｒ」、
「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−
Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、「Ｐｒｏ−Ｘ−＠−Ｘ−Ｘ
−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、および「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ
−Ｄ−Ｙ」（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、
＋はＡｒｇまたはＬｙｓであり、＠は芳香族または脂肪
族アミノ酸残基であり、＃は芳香族アミノ酸残基であ
る）である。
列モチーフは、それぞれ「Ｒ−Ｘ−＃−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ
−Ｐｒｏ」、「−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｒ」、
「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−
Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、「Ｐｒｏ−Ｘ−＠−Ｘ−Ｘ
−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、および「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ
−Ｄ−Ｙ」（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、
＋はＡｒｇまたはＬｙｓであり、＠は芳香族または脂肪
族アミノ酸残基であり、＃は芳香族アミノ酸残基であ
る）である。
【００６１】例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２２
−ｐｈｏｘサブユニットタンパク質中に含有されるプロ
リンリッチなアミノ酸配列モチーフは、以下のアミノ酸
配列を有する：「ＰＰＳＮＰＰＰＲＰＰ」。
−ｐｈｏｘサブユニットタンパク質中に含有されるプロ
リンリッチなアミノ酸配列モチーフは、以下のアミノ酸
配列を有する：「ＰＰＳＮＰＰＰＲＰＰ」。
【００６２】本発明のプロリンリッチなペプチドは、Ｆ
ｙｎ、Ａｂｌ、ＣｒｋＮ、ＧｒｂＮ、Ｓｒｃ、Ｎｓｒ
ｃ、およびＰＩＫタンパク質中に含有されるプロリンリ
ッチなアミノ酸配列モチーフを含有するペプチドを含
み、これらはメイヤー（MAYER）とエック（ECK）（199
5）の論文にも開示されている。
ｙｎ、Ａｂｌ、ＣｒｋＮ、ＧｒｂＮ、Ｓｒｃ、Ｎｓｒ
ｃ、およびＰＩＫタンパク質中に含有されるプロリンリ
ッチなアミノ酸配列モチーフを含有するペプチドを含
み、これらはメイヤー（MAYER）とエック（ECK）（199
5）の論文にも開示されている。
【００６３】本発明のプロリンリッチなペプチドはま
た、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメ
インに結合する、ＨＩＶからのＮｅｆタンパク質中に含
有されるプロリンリッチなアミノ酸配列モチーフ（リム
（LIM）ら、１９９６に開示されている）を含有するペ
プチドを含む。
た、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、ＬｙｎおよびＦｙｎのＳＨ３ドメ
インに結合する、ＨＩＶからのＮｅｆタンパク質中に含
有されるプロリンリッチなアミノ酸配列モチーフ（リム
（LIM）ら、１９９６に開示されている）を含有するペ
プチドを含む。
【００６４】本発明の目的において「ＳＨ３ドメイン含
有ペプチド」は、ＳＨ３ドメインの１つ、２つまたは３
つのアミノ酸配列モチーフからなり、このＳＨ３ドメイ
ンは、上記したようなプロリンリッチなアミノ酸配列モ
チーフと高い結合親和性を有する。ＳＨ３（Ｓｒｃ相同
性３）ドメインは、標的タンパク質中のプロリンリッチ
なリガンドを認識し、従ってタンパク質−タンパク質相
互作用を仲介する、５５〜７０アミノ酸のオリゴマーの
保存されたアミノ酸配列モチーフである。
有ペプチド」は、ＳＨ３ドメインの１つ、２つまたは３
つのアミノ酸配列モチーフからなり、このＳＨ３ドメイ
ンは、上記したようなプロリンリッチなアミノ酸配列モ
チーフと高い結合親和性を有する。ＳＨ３（Ｓｒｃ相同
性３）ドメインは、標的タンパク質中のプロリンリッチ
なリガンドを認識し、従ってタンパク質−タンパク質相
互作用を仲介する、５５〜７０アミノ酸のオリゴマーの
保存されたアミノ酸配列モチーフである。
【００６５】ＳＨ３ドメインは、保存されたアミノ酸配
列は無く、従って、主にプロリンリッチなアミノ酸配列
モチーフに対して高い親和性で結合するアミノ酸配列モ
チーフとして機能的に定義される。
列は無く、従って、主にプロリンリッチなアミノ酸配列
モチーフに対して高い親和性で結合するアミノ酸配列モ
チーフとして機能的に定義される。
【００６６】種々のＳＨ３ドメインアミノ酸配列モチー
フの構造的特徴について、当業者は、ポーソン・ティー
（PAWSON T）（１９９５）、アガザデー（AGHAZADEAH）
ら（１９９９）、ダルガルノ（DALGARNO）ら（１９９
８）、ムサッチオ（MUSACCHIO）ら（１９９２；スペク
トリン（Spectrin）ＳＨ３、ニワトリ）、ユー・エィチ
（YU H）ら（１９９２；ｃ−Ｓｒｃ ＳＨ３、ニワト
リ）、（コヤマ（KOYAMA）ら（１９９３）；Ｐ１３Ｋ
ｐ８５ ＳＨ３、ヒト）、ブーカー（BOOKER）ら（１９
９３；Ｐ１３Ｋ ｐ８５ ＳＨ３、ウシ）、ノーブル
（NOBLE）ら（１９９３；Ｆｙｎ ＳＨ３、ヒト）、コ
ーダ（KOHDA）ら（１９９３；ＰＬＣ−γ ＳＨ３、ヒ
ト）、ボルシェート（BORCHERT）ら（１９９４；Ｃｓｋ
ＳＨ３、ヒト）、コーダ（KOHDA）ら（１９９４；Ｇ
ｒｂ２ ＳＨ３、ヒト）、ヤング（YANG）ら（１９９
４；ＧＡＰ ＳＨ３、ヒト）、ゴッサー（GOSSER）ら
（１９９５；Ａｂｌ ＳＨ３、ヒト）、ザング（ZHAN
G）ら（１９９５；Ｄｒｋ ＳＨ３、キイロショウジョ
ウバエ（Drosophila））、グルプラサド（GRUPRASAD）
ら（１９９５；Ｇｒｂ２、ヒト）、モートン（MORTON）
ら（１９９６；Ｆｙｎ ＳＨ３、ヒト）、マイグナン
（MAIGNAN）ら（１９９５；Ｇｒｂ２ ＳＨ３−ＳＨ２
−ＳＨ３、ヒト）、ブランコ（BLANCO）ら（１９９７；
スペクトリン（Spectrin）ＳＨ３、ニワトリ）、ヒロア
キ（HIROAKI）ら（１９９６；Ｌｃｋ ＳＨ３、ヒ
ト）、ナム（NAM）ら（１９９６；Ａｂｌ ＳＨ２−Ｓ
Ｈ３、ヒト）、リアング（LIANG）ら（１９９６；Ｐ１
３Ｋ ｐ８５ ＳＨ３、ヒト）、キシャン（KISHAN）ら
（１９９７；Ｅｐｓ８ ＳＨ３、マウス）、リム（LI
M）ら（１９９４；ＳＥＭ−５、シー・エレガンス（C.
Elegans）、ウィッテキンド（WITTEKIND）ら（１９９
４；Ｇｒｂ２、マウス）、ケファラス（KEFALAS）ら
（１９９５；Ｌｙｎ）、およびゴリナ（GORINA）ら（１
９９６；５３ＢＰ２、ヒト）（これらは、参照すること
により本明細書に組み込まれる）を参照すると有利であ
ろう。
フの構造的特徴について、当業者は、ポーソン・ティー
（PAWSON T）（１９９５）、アガザデー（AGHAZADEAH）
ら（１９９９）、ダルガルノ（DALGARNO）ら（１９９
８）、ムサッチオ（MUSACCHIO）ら（１９９２；スペク
トリン（Spectrin）ＳＨ３、ニワトリ）、ユー・エィチ
（YU H）ら（１９９２；ｃ−Ｓｒｃ ＳＨ３、ニワト
リ）、（コヤマ（KOYAMA）ら（１９９３）；Ｐ１３Ｋ
ｐ８５ ＳＨ３、ヒト）、ブーカー（BOOKER）ら（１９
９３；Ｐ１３Ｋ ｐ８５ ＳＨ３、ウシ）、ノーブル
（NOBLE）ら（１９９３；Ｆｙｎ ＳＨ３、ヒト）、コ
ーダ（KOHDA）ら（１９９３；ＰＬＣ−γ ＳＨ３、ヒ
ト）、ボルシェート（BORCHERT）ら（１９９４；Ｃｓｋ
ＳＨ３、ヒト）、コーダ（KOHDA）ら（１９９４；Ｇ
ｒｂ２ ＳＨ３、ヒト）、ヤング（YANG）ら（１９９
４；ＧＡＰ ＳＨ３、ヒト）、ゴッサー（GOSSER）ら
（１９９５；Ａｂｌ ＳＨ３、ヒト）、ザング（ZHAN
G）ら（１９９５；Ｄｒｋ ＳＨ３、キイロショウジョ
ウバエ（Drosophila））、グルプラサド（GRUPRASAD）
ら（１９９５；Ｇｒｂ２、ヒト）、モートン（MORTON）
ら（１９９６；Ｆｙｎ ＳＨ３、ヒト）、マイグナン
（MAIGNAN）ら（１９９５；Ｇｒｂ２ ＳＨ３−ＳＨ２
−ＳＨ３、ヒト）、ブランコ（BLANCO）ら（１９９７；
スペクトリン（Spectrin）ＳＨ３、ニワトリ）、ヒロア
キ（HIROAKI）ら（１９９６；Ｌｃｋ ＳＨ３、ヒ
ト）、ナム（NAM）ら（１９９６；Ａｂｌ ＳＨ２−Ｓ
Ｈ３、ヒト）、リアング（LIANG）ら（１９９６；Ｐ１
３Ｋ ｐ８５ ＳＨ３、ヒト）、キシャン（KISHAN）ら
（１９９７；Ｅｐｓ８ ＳＨ３、マウス）、リム（LI
M）ら（１９９４；ＳＥＭ−５、シー・エレガンス（C.
Elegans）、ウィッテキンド（WITTEKIND）ら（１９９
４；Ｇｒｂ２、マウス）、ケファラス（KEFALAS）ら
（１９９５；Ｌｙｎ）、およびゴリナ（GORINA）ら（１
９９６；５３ＢＰ２、ヒト）（これらは、参照すること
により本明細書に組み込まれる）を参照すると有利であ
ろう。
【００６７】本発明のスクリーニング方法はまた、ヒト
Ｐ１３Ｋ ｐ８５、マウスＡｂｌ、ヒトＦｙｎ、ヒトｃ
−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、シー・エレガンス（C. elegan
s）ＳＥＭ−５、マウスＧｒｂ２、ヒトＧｒｂ２、マウ
スｃ−Ｃｒｋ、ヒト５３ＢＰ２、およびヒトＨｃｋキナ
ーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインよりなる
群から選択されるＳＨ３ドメイン含有ペプチドを用い
て、行ってもよい。
Ｐ１３Ｋ ｐ８５、マウスＡｂｌ、ヒトＦｙｎ、ヒトｃ
−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、シー・エレガンス（C. elegan
s）ＳＥＭ−５、マウスＧｒｂ２、ヒトＧｒｂ２、マウ
スｃ−Ｃｒｋ、ヒト５３ＢＰ２、およびヒトＨｃｋキナ
ーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインよりなる
群から選択されるＳＨ３ドメイン含有ペプチドを用い
て、行ってもよい。
【００６８】さらに好ましくは本発明のスクリーニング
方法は、ヒトＰ１３Ｋ ｐ８５、ヒトＡｂｌ、ヒトＦｙ
ｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、ヒトＬｙｎ、ヒトＧ
ｒｂ２、ヒトＰＬＣ−γ、ヒト５３ＢＰ２ヒトＧＡＰ、
ヒト５３ＢＰ２、ヒトＣｓｋ、およびヒトＨｃｋキナー
ゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインよりなる群
から選択されるＳＨ３ドメイン含有ペプチドを用いて、
行ってもよい。
方法は、ヒトＰ１３Ｋ ｐ８５、ヒトＡｂｌ、ヒトＦｙ
ｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、ヒトＬｙｎ、ヒトＧ
ｒｂ２、ヒトＰＬＣ−γ、ヒト５３ＢＰ２ヒトＧＡＰ、
ヒト５３ＢＰ２、ヒトＣｓｋ、およびヒトＨｃｋキナー
ゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインよりなる群
から選択されるＳＨ３ドメイン含有ペプチドを用いて、
行ってもよい。
【００６９】プロリンリッチなペプチドおよびＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、例えばメリフィールド（MERRIF
IELD）ら（１９６５ａ；１９６５ｂ）に記載されたよう
な、化学合成法により得られる。これらのペプチドはま
た、サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）に記載さ
れたような遺伝子操作法により得てもよい。
メイン含有ペプチドは、例えばメリフィールド（MERRIF
IELD）ら（１９６５ａ；１９６５ｂ）に記載されたよう
な、化学合成法により得られる。これらのペプチドはま
た、サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９）に記載さ
れたような遺伝子操作法により得てもよい。
【００７０】本発明のスクリーニング方法において、こ
れらの相互作用ペプチドのそれぞれ（すなわち、プロリ
ンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチド）
は、ドナー分子すなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナー中、またはアクセプター分
子すなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーに存在する１つの蛍光マーカーで標識さ
れる。
れらの相互作用ペプチドのそれぞれ（すなわち、プロリ
ンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチド）
は、ドナー分子すなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナー中、またはアクセプター分
子すなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーに存在する１つの蛍光マーカーで標識さ
れる。
【００７１】実際、プロリンリッチなペプチドを標識す
る第１の蛍光マーカーが、アクセプター分子すなわち対
のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナ
ーである時、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドを標識する第
２の蛍光マーカーは、アクセプター分子すなわち対のフ
レット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーで
ある。
る第１の蛍光マーカーが、アクセプター分子すなわち対
のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナ
ーである時、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドを標識する第
２の蛍光マーカーは、アクセプター分子すなわち対のフ
レット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーで
ある。
【００７２】逆に、プロリンリッチなペプチドを標識す
る第１の蛍光マーカーが、アクセプター分子すなわち対
のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナ
ーである時、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドを標識する第
２の蛍光マーカーは、アクセプター分子すなわち対のフ
レット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーで
ある。
る第１の蛍光マーカーが、アクセプター分子すなわち対
のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナ
ーである時、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドを標識する第
２の蛍光マーカーは、アクセプター分子すなわち対のフ
レット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーで
ある。
【００７３】最も好適な実施態様において、プロリンリ
ッチなペプチドを標識する第１の蛍光マーカーは、該プ
ロリンリッチなペプチドに、有利にはプロリンリッチな
ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に、共有結合し
ている。
ッチなペプチドを標識する第１の蛍光マーカーは、該プ
ロリンリッチなペプチドに、有利にはプロリンリッチな
ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に、共有結合し
ている。
【００７４】ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、第２の蛍
光マーカーで直接または間接的に標識物されてよい。
光マーカーで直接または間接的に標識物されてよい。
【００７５】ＳＨ３ドメイン含有ペプチドが、第２の蛍
光マーカーで直接標識される具体的な実施態様におい
て、該第２の蛍光マーカーは最も好ましくは、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドに、最も好ましくはＳＨ３ドメイン
含有ペプチドのＮ末端またはＣ末端で、共有結合してい
る。
光マーカーで直接標識される具体的な実施態様におい
て、該第２の蛍光マーカーは最も好ましくは、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドに、最も好ましくはＳＨ３ドメイン
含有ペプチドのＮ末端またはＣ末端で、共有結合してい
る。
【００７６】ＳＨ３ドメイン含有ペプチドが、第２の蛍
光マーカーで間接的に標識される具体的な実施態様にお
いて、該ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、第２の蛍光マ
ーカーを含む標識試薬に対して特異的親和性を有する検
出可能な分子に共有結合している。
光マーカーで間接的に標識される具体的な実施態様にお
いて、該ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、第２の蛍光マ
ーカーを含む標識試薬に対して特異的親和性を有する検
出可能な分子に共有結合している。
【００７７】具体的な実施態様において、検出可能な分
子は、標識試薬により認識されることができるポリペプ
チドからなってよい。最も好ましくは、検出可能な分子
は、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＮ末端またはＣ末端
で共有結合している。
子は、標識試薬により認識されることができるポリペプ
チドからなってよい。最も好ましくは、検出可能な分子
は、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＮ末端またはＣ末端
で共有結合している。
【００７８】具体的な実施態様において、標識試薬は好
ましくは、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドに共有結合した
検出可能な分子を特異的に認識する抗体を含む。本明細
書において「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体、ならびに抗体の抗原を認識
するドメイン、例えばＦab、Ｆ(ab')2 ならびに１本鎖
Ｆｖ抗体、およびヒト化抗体のようなキメラ抗体を包含
する。標識試薬はまた、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドに
共有結合した検出可能な分子に対する親和性を有する他
のリガンド、例えばストレプトアビジン（この場合、検
出可能な分子はビオチンタンパク質であることが有利で
ある）も含む。
ましくは、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドに共有結合した
検出可能な分子を特異的に認識する抗体を含む。本明細
書において「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体、ならびに抗体の抗原を認識
するドメイン、例えばＦab、Ｆ(ab')2 ならびに１本鎖
Ｆｖ抗体、およびヒト化抗体のようなキメラ抗体を包含
する。標識試薬はまた、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドに
共有結合した検出可能な分子に対する親和性を有する他
のリガンド、例えばストレプトアビジン（この場合、検
出可能な分子はビオチンタンパク質であることが有利で
ある）も含む。
【００７９】標識試薬はまた、好ましくは、ＳＨ３ドメ
イン含有ペプチドに結合した検出可能な分子に対する親
和性を有するリガンドに共有結合した第２の蛍光マーカ
ーを含む。
イン含有ペプチドに結合した検出可能な分子に対する親
和性を有するリガンドに共有結合した第２の蛍光マーカ
ーを含む。
【００８０】上記で詳述したようにＳＨ３ドメイン含有
ペプチドが第２の蛍光マーカーで間接的に標識されてい
るこの具体的な実施態様において、該標識試薬は、ＳＨ
３ドメイン含有ペプチドの添加後に、本発明の方法の工
程ｃ）の間に加えられる。
ペプチドが第２の蛍光マーカーで間接的に標識されてい
るこの具体的な実施態様において、該標識試薬は、ＳＨ
３ドメイン含有ペプチドの添加後に、本発明の方法の工
程ｃ）の間に加えられる。
【００８１】本発明のスクリーニング方法の最も好適な
実施態様において、プロリンリッチなペプチドは、ドナ
ー蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーからなる第１の蛍光マーカ
ーで標識される；ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、検出
可能な分子、好ましくはタンパク質に共有結合してい
る；該標識試薬は、アクセプター蛍光マーカーすなわち
対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパート
ナーである第２の蛍光マーカーに共有結合している。
実施態様において、プロリンリッチなペプチドは、ドナ
ー蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーからなる第１の蛍光マーカ
ーで標識される；ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、検出
可能な分子、好ましくはタンパク質に共有結合してい
る；該標識試薬は、アクセプター蛍光マーカーすなわち
対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパート
ナーである第２の蛍光マーカーに共有結合している。
【００８２】当該分野で公知のすべての対のフレット
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーは、本発明のスクリーニング
方法を実施するのに使用することができる。
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーは、本発明のスクリーニング
方法を実施するのに使用することができる。
【００８３】しかし該スクリーニング方法の好適な実施
態様において、ドナー蛍光マーカーすなわち対のフレッ
ト（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーは、ユ
ーロピウムクリプテートからなり、この場合アクセプタ
ー蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第２のパートナーはＸＬ６６５である。
態様において、ドナー蛍光マーカーすなわち対のフレッ
ト（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーは、ユ
ーロピウムクリプテートからなり、この場合アクセプタ
ー蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第２のパートナーはＸＬ６６５である。
【００８４】希土類クリプテートが開示され、これら
は、励起エネルギーを集め、それをユーロピウムに送る
ためのエネルギーアンテナとして作用するため、ユーロ
ピウムの蛍光を増強するために必要な性質を有し、ユー
ロピウムをクエンチングから防御し、蛍光発光を妨害せ
ず、そしてユーロピウムを生体巨大分子に結合させるの
に使用することができる。ユーロピウムクリプテート
は、約１kDaの分子量を有する。ユーロピウムクリプテ
ートをドナー蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーであり、アクセ
プター蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）
蛍光マーカーの第２のパートナーは、最も好ましくは、
ＸＬ６６５と呼ぶ分子量が約１０５kDaの修飾アロフィ
コシアニンである。ＸＬ６６５は特徴的に、アクセプタ
ーの必要な特性を有し、ＸＬ６６５はまた、エネルギー
移動によりシグナル増幅をするという追加の利点を有す
る。これは、一部はＸＬ６６５の高量子収率（０．７）
のためである。
は、励起エネルギーを集め、それをユーロピウムに送る
ためのエネルギーアンテナとして作用するため、ユーロ
ピウムの蛍光を増強するために必要な性質を有し、ユー
ロピウムをクエンチングから防御し、蛍光発光を妨害せ
ず、そしてユーロピウムを生体巨大分子に結合させるの
に使用することができる。ユーロピウムクリプテート
は、約１kDaの分子量を有する。ユーロピウムクリプテ
ートをドナー蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーであり、アクセ
プター蛍光マーカーすなわち対のフレット（ＦＲＥＴ）
蛍光マーカーの第２のパートナーは、最も好ましくは、
ＸＬ６６５と呼ぶ分子量が約１０５kDaの修飾アロフィ
コシアニンである。ＸＬ６６５は特徴的に、アクセプタ
ーの必要な特性を有し、ＸＬ６６５はまた、エネルギー
移動によりシグナル増幅をするという追加の利点を有す
る。これは、一部はＸＬ６６５の高量子収率（０．７）
のためである。
【００８５】対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカー
が、それぞれユーロピウムクリプテートとＸＬ６６５で
ある具体的な実施態様において、本発明の方法の工程
ｃ）で得られる混合物は、ユーロピウムクリプテートの
励起波長である３３７nmの波長でエネルギー源に付さ
れ、蛍光シグナルは、ＸＬ６６５の発光波長である６６
５nmで測定される。
が、それぞれユーロピウムクリプテートとＸＬ６６５で
ある具体的な実施態様において、本発明の方法の工程
ｃ）で得られる混合物は、ユーロピウムクリプテートの
励起波長である３３７nmの波長でエネルギー源に付さ
れ、蛍光シグナルは、ＸＬ６６５の発光波長である６６
５nmで測定される。
【００８６】本発明の方法を実施することにより測定さ
れる候補インヒビター化合物は、どのような性質でもよ
く、有機、無機または生体分子でもよい。
れる候補インヒビター化合物は、どのような性質でもよ
く、有機、無機または生体分子でもよい。
【００８７】すべての場合に、プロリンリッチなペプチ
ドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害す
る候補化合物の能力は、以下のように計算される：
ドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害す
る候補化合物の能力は、以下のように計算される：
【００８８】ａ）比
まず、アクセプター蛍光マーカーすなわち対のフレット
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波
長で得られる蛍光シグナルと、ドナー蛍光マーカーすな
わち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパ
ートナーの発光波長で得られる蛍光シグナルとの、比
（Ｒ）がまず計算され、これは以下の式により表され
る： 比（Ｒ）＝（第２のパートナーの発光蛍光シグナル／第
１のパートナーの発光蛍光シグナル）×１０００。
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波
長で得られる蛍光シグナルと、ドナー蛍光マーカーすな
わち対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパ
ートナーの発光波長で得られる蛍光シグナルとの、比
（Ｒ）がまず計算され、これは以下の式により表され
る： 比（Ｒ）＝（第２のパートナーの発光蛍光シグナル／第
１のパートナーの発光蛍光シグナル）×１０００。
【００８９】ｂ）Δ比
Δ比の値は、試料比（Ｒ）と陰性対照比（Ｒ’）の値の
差である。
差である。
【００９０】試料比（Ｒ）は、測定条件が、（ｉ）第１
の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチなペプチド
と、（ii）第２の蛍光マーカーで直接または間接的にに
標識されたＳＨ３ドメイン含有ペプチドとのインキュベ
ーションを含む時に得られる。
の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチなペプチド
と、（ii）第２の蛍光マーカーで直接または間接的にに
標識されたＳＨ３ドメイン含有ペプチドとのインキュベ
ーションを含む時に得られる。
【００９１】陰性対照比（Ｒ’）は、測定条件が、
（ｉ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチ
なペプチドと、（ii）第２の蛍光マーカー単独、または
第２の蛍光マーカーを含む標識試薬とのインキュベーシ
ョンを含む時に得られる。
（ｉ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチ
なペプチドと、（ii）第２の蛍光マーカー単独、または
第２の蛍光マーカーを含む標識試薬とのインキュベーシ
ョンを含む時に得られる。
【００９２】Δ比の値は、以下の式により計算される；
Δ比（ΔＲ）＝試料比（Ｒ）−陰性対照比（Ｒ’）。
Δ比の値は、測定に特異的なシグナルであり、本発明の
方法を実施するのに使用される装置に依存する。
方法を実施するのに使用される装置に依存する。
【００９３】ｃ）ΔＦ値
この値は、特異的なシグナルからバックグランドシグナ
ルを引いたものであり、本発明の方法を実施するのに使
用される装置に依存しない。ΔＦ値は、以下の式により
表される：
ルを引いたものであり、本発明の方法を実施するのに使
用される装置に依存しない。ΔＦ値は、以下の式により
表される：
【００９４】
ΔＦ＝（Δ比（Ｒ）／陰性対照比（Ｒ’））×１００。
ΔＦ値は、パーセント（％）として表される。本明細書
において、本発明のスクリーニング方法の一般的な定義
で参照される蛍光シグナルは、ΔＦ（％）値を包含す
る。
において、本発明のスクリーニング方法の一般的な定義
で参照される蛍光シグナルは、ΔＦ（％）値を包含す
る。
【００９５】ユーロピウムクリプテートで標識されたｐ
２２−ｐｈｏｘタンパク質から得られるプロリンリッチ
なペプチドと、ＸＬ６６５で間接的に標識されたｐ４７
−ｐｈｏｘから得られるＳＨ３ドメイン含有ペプチドで
得られるΔＦ値の計算の例を、以下の例に示す。
２２−ｐｈｏｘタンパク質から得られるプロリンリッチ
なペプチドと、ＸＬ６６５で間接的に標識されたｐ４７
−ｐｈｏｘから得られるＳＨ３ドメイン含有ペプチドで
得られるΔＦ値の計算の例を、以下の例に示す。
【００９６】さらに、上記測定は、上昇する濃度の測定
すべき候補インヒビター化合物でならびに該候補インヒ
ビター化合物無しで行われ、この特異的候補化合物のＩ
Ｃ５０値は、得られたΔＦ値（縦軸）を、測定で使用さ
れる候補化合物の最終濃度（横軸）に対してプロットす
ることにより決定される。ＩＣ５０値は、測定中の候補
インヒビター化合物の非存在下で得られるΔＦ値と比較
して、ΔＦ値の５０％阻害が観察される候補インヒビタ
ー化合物の最終濃度として定義される。
すべき候補インヒビター化合物でならびに該候補インヒ
ビター化合物無しで行われ、この特異的候補化合物のＩ
Ｃ５０値は、得られたΔＦ値（縦軸）を、測定で使用さ
れる候補化合物の最終濃度（横軸）に対してプロットす
ることにより決定される。ＩＣ５０値は、測定中の候補
インヒビター化合物の非存在下で得られるΔＦ値と比較
して、ΔＦ値の５０％阻害が観察される候補インヒビタ
ー化合物の最終濃度として定義される。
【００９７】ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのアミノ酸配
列中の単一のアミノ酸置換が、突然変異ペプチドと対応
するプロリンリッチなペプチドとの結合相互作用を完全
に排除するため、本発明のスクリーニング方法の高い特
異性が証明されている。
列中の単一のアミノ酸置換が、突然変異ペプチドと対応
するプロリンリッチなペプチドとの結合相互作用を完全
に排除するため、本発明のスクリーニング方法の高い特
異性が証明されている。
【００９８】この測定法の高い特異性はまた、以下の例
に示されるように、例えばＳＨ３ドメイン含有ペプチド
への結合について、第１の蛍光マーカーで標識されたプ
ロリンリッチなペプチドとの競合について未標識のプロ
リンリッチなペプチドを使用することにより、証明され
ている。
に示されるように、例えばＳＨ３ドメイン含有ペプチド
への結合について、第１の蛍光マーカーで標識されたプ
ロリンリッチなペプチドとの競合について未標識のプロ
リンリッチなペプチドを使用することにより、証明され
ている。
【００９９】また、本発明の方法は、プロリンリッチな
ペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの結合相互作
用を阻害することができる種々の有機化合物（例えば、
種々のクマリンおよびキナゾリン化合物）の検出におい
て、特にプロリンリッチなペプチドがｐ２２−ｐｈｏｘ
タンパク質から得られ、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドが
ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質から得られ、両方のタンパ
ク質がＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体のサブユニットで
ある実施態様において、効率的であることが証明されて
いる。
ペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの結合相互作
用を阻害することができる種々の有機化合物（例えば、
種々のクマリンおよびキナゾリン化合物）の検出におい
て、特にプロリンリッチなペプチドがｐ２２−ｐｈｏｘ
タンパク質から得られ、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドが
ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質から得られ、両方のタンパ
ク質がＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体のサブユニットで
ある実施態様において、効率的であることが証明されて
いる。
【０１００】さらに、本発明者らは、無細胞測定法また
は２次ＨＬ６０細胞ベース測定法で測定した時、同じイ
ンヒビター化合物がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害
する能力で、ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質由来のプロリ
ンリッチなペプチドとｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質由来
のＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの結合を阻害するある
化合物の能力の間の高い相関を証明した。
は２次ＨＬ６０細胞ベース測定法で測定した時、同じイ
ンヒビター化合物がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害
する能力で、ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質由来のプロリ
ンリッチなペプチドとｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質由来
のＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの結合を阻害するある
化合物の能力の間の高い相関を証明した。
【０１０１】これらの結果は、本発明のスクリーニング
方法を実施して得られたデータの生物学的意義と、イン
ビボ条件でその阻害性を示す化合物をスクリーニングす
ることの関連を、明瞭に示している。
方法を実施して得られたデータの生物学的意義と、イン
ビボ条件でその阻害性を示す化合物をスクリーニングす
ることの関連を、明瞭に示している。
【０１０２】すでに記載したように、シグナル伝達経路
タンパク質の制御における欠陥は、種々の病態に関与
し、従って、そのような疾患を予防または治療するため
の治療行為に応答する、生物活性のあるインヒビター化
合物を同定するニーズがある。上記で定義した本発明の
方法は、これらのシグナル伝達経路タンパク質中に含有
されるプロリンリッチな試薬とＳＨ３ドメインとの相互
作用を阻害することができる、治療価値のある化合物を
選択することを可能にするであろう。
タンパク質の制御における欠陥は、種々の病態に関与
し、従って、そのような疾患を予防または治療するため
の治療行為に応答する、生物活性のあるインヒビター化
合物を同定するニーズがある。上記で定義した本発明の
方法は、これらのシグナル伝達経路タンパク質中に含有
されるプロリンリッチな試薬とＳＨ３ドメインとの相互
作用を阻害することができる、治療価値のある化合物を
選択することを可能にするであろう。
【０１０３】従って本発明は、ＳＨ３ドメイン含有ペプ
チドが、その制限解除がある病態の発症に関連するシグ
ナル伝達タンパク質由来である、上記スクリーニング方
法を包含する。
チドが、その制限解除がある病態の発症に関連するシグ
ナル伝達タンパク質由来である、上記スクリーニング方
法を包含する。
【０１０４】そこからＳＨ３ドメイン含有ペプチドが得
られるタンパク質の例示的であるが非限定的な例には、
以下のタンパク質がある：Ｌｙｎ（サクセラ（SAKSEL
A）ら、１９９５；ＡＩＤＳ）、Ｈｃｋ（サクセラ（SAK
SELA）ら、１９９５；ＡＩＤＳ）、Ｌｙｎ（ヤマチタ
（YAMACHITA）ら、１９９４；アレルギーと喘息）、Ｇ
ｒｂ２（ジェームズ（JAMES）ら、１９９４；デーリー
（DALY）ら、１９９４；乳癌）、Ｓｒｃ（ルットレル
（LUTTRELL）ら、１９９４；乳癌）、ｐ８５（ジュン
（JHUN）ら、１９９４）；（フー（HU）ら、癌）、Ｇｒ
ｂ２（ラビクンドラン（RAVICHNDRAN）ら、１９９５；
ゴッテスマン（GOTTESMANN）、１９９４；チャージン
（CHARDIN）ら、１９９３；リー（LI）ら、１９９３；
癌）、Ｇａｐ（ムーディー（MOODIE）ら、１９９４；
癌）、Ｇｒｂ２（ペンダーガスト（PENDERGAST）ら、１
９９３；ＣＭＬとＡＬＬ）。ＣｒｋＬ（オダ（ODA）
ら、１９９４；ＣＭＬとＡＬＬ）、ＳＴＡＴｓ（イーレ
（IHLE）、１９９４；ダーネル（DARNELL）ら、１９９
４；炎症性疾患）、ｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７−ｐｈｏ
ｘ（レト（LETO）ら、１９９４；炎症性疾患）、Ｂｔｋ
（デ・ウェーセ（DE WEERSE）ら、１９９４；プレ−Ｂ
−細胞白血病）、Ｔｅｃ（サト（SATO）ら、１９９４；
骨髄異形成症候群）、Ｓｒｃ（カプラン（KAPLAN）ら、
１９９４；ロウェ（LOWE）ら、１９９３；骨粗鬆症）。
上記論文はそれぞれ、参照することにより本明細書に組
み込まれる。
られるタンパク質の例示的であるが非限定的な例には、
以下のタンパク質がある：Ｌｙｎ（サクセラ（SAKSEL
A）ら、１９９５；ＡＩＤＳ）、Ｈｃｋ（サクセラ（SAK
SELA）ら、１９９５；ＡＩＤＳ）、Ｌｙｎ（ヤマチタ
（YAMACHITA）ら、１９９４；アレルギーと喘息）、Ｇ
ｒｂ２（ジェームズ（JAMES）ら、１９９４；デーリー
（DALY）ら、１９９４；乳癌）、Ｓｒｃ（ルットレル
（LUTTRELL）ら、１９９４；乳癌）、ｐ８５（ジュン
（JHUN）ら、１９９４）；（フー（HU）ら、癌）、Ｇｒ
ｂ２（ラビクンドラン（RAVICHNDRAN）ら、１９９５；
ゴッテスマン（GOTTESMANN）、１９９４；チャージン
（CHARDIN）ら、１９９３；リー（LI）ら、１９９３；
癌）、Ｇａｐ（ムーディー（MOODIE）ら、１９９４；
癌）、Ｇｒｂ２（ペンダーガスト（PENDERGAST）ら、１
９９３；ＣＭＬとＡＬＬ）。ＣｒｋＬ（オダ（ODA）
ら、１９９４；ＣＭＬとＡＬＬ）、ＳＴＡＴｓ（イーレ
（IHLE）、１９９４；ダーネル（DARNELL）ら、１９９
４；炎症性疾患）、ｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７−ｐｈｏ
ｘ（レト（LETO）ら、１９９４；炎症性疾患）、Ｂｔｋ
（デ・ウェーセ（DE WEERSE）ら、１９９４；プレ−Ｂ
−細胞白血病）、Ｔｅｃ（サト（SATO）ら、１９９４；
骨髄異形成症候群）、Ｓｒｃ（カプラン（KAPLAN）ら、
１９９４；ロウェ（LOWE）ら、１９９３；骨粗鬆症）。
上記論文はそれぞれ、参照することにより本明細書に組
み込まれる。
【０１０５】本発明のスクリーニング方法の典型的な実
施態様において、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体
に属するサブユニットタンパク質から得られる。主に多
形核白血球または好中球で発現されるＮＡＤＰＨオキシ
ダーゼは、外来病原体に対する免疫応答の間に好中球の
刺激中に活性化され、過酸化物陰イオン（Ｏ2 -）を生成
する。次にＯ2 -は急速に、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、ヒド
ロキシルラジカル（ＯＨ）、および次亜塩素酸（ＨＯＣ
ｌ）のような２次毒性酸素種に変換される。
施態様において、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体
に属するサブユニットタンパク質から得られる。主に多
形核白血球または好中球で発現されるＮＡＤＰＨオキシ
ダーゼは、外来病原体に対する免疫応答の間に好中球の
刺激中に活性化され、過酸化物陰イオン（Ｏ2 -）を生成
する。次にＯ2 -は急速に、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、ヒド
ロキシルラジカル（ＯＨ）、および次亜塩素酸（ＨＯＣ
ｌ）のような２次毒性酸素種に変換される。
【０１０６】この反応の目的は、生体から感染性物質、
外来粒子、および傷害組織を除去することであるが、好
中球が生成した反応性酸素種もまた、炎症部位近くの宿
主組織を傷害することがある。実際、反応性酸素種は、
多くの炎症性疾患（リウマチ様関節炎、虚血再潅流傷
害、および成人型呼吸窮迫症候群を含む）に関連する組
織傷害に関与していることが報告されている。
外来粒子、および傷害組織を除去することであるが、好
中球が生成した反応性酸素種もまた、炎症部位近くの宿
主組織を傷害することがある。実際、反応性酸素種は、
多くの炎症性疾患（リウマチ様関節炎、虚血再潅流傷
害、および成人型呼吸窮迫症候群を含む）に関連する組
織傷害に関与していることが報告されている。
【０１０７】前記実験データから、ＮＡＤＰＨオキシダ
ーゼ複合体の異なるタンパク質サブユニットのＳＨ３ド
メインとプロリンリッチな領域との結合を阻害する能力
を有する化合物の発見は、炎症症状、ＣＯＰＤ、アテロ
ーム性動脈硬化症、ＡＲＤＳ、敗血症ショック、ならび
に一般的な加齢と癌を、予防または治療するための治療
的価値を有することがわかる。
ーゼ複合体の異なるタンパク質サブユニットのＳＨ３ド
メインとプロリンリッチな領域との結合を阻害する能力
を有する化合物の発見は、炎症症状、ＣＯＰＤ、アテロ
ーム性動脈硬化症、ＡＲＤＳ、敗血症ショック、ならび
に一般的な加齢と癌を、予防または治療するための治療
的価値を有することがわかる。
【０１０８】ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害する有
用なインヒビター化合物は、以下の化合物を包含する：
用なインヒビター化合物は、以下の化合物を包含する：
【０１０９】（ｉ）ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質中に含
有されるプロリンリッチな領域と、ｐ４７−ｐｈｏｘタ
ンパク質中に含有される最初のＳＨ３ドメインとの相互
作用を阻害する化合物； （ii）ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質のＣ末端中に含有さ
れるプロリンリッチな領域と、ｐ６７−ｐｈｏｘタンパ
ク質のＮ末端に含有されるＳＨ３ドメインとの相互作用
を阻害する化合物； （iii）ｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるプ
ロリンリッチな領域と、ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質中
に含有される第２のＳＨ３ドメインとの相互作用を阻害
する化合物。
有されるプロリンリッチな領域と、ｐ４７−ｐｈｏｘタ
ンパク質中に含有される最初のＳＨ３ドメインとの相互
作用を阻害する化合物； （ii）ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質のＣ末端中に含有さ
れるプロリンリッチな領域と、ｐ６７−ｐｈｏｘタンパ
ク質のＮ末端に含有されるＳＨ３ドメインとの相互作用
を阻害する化合物； （iii）ｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるプ
ロリンリッチな領域と、ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質中
に含有される第２のＳＨ３ドメインとの相互作用を阻害
する化合物。
【０１１０】ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質中に含有され
るプロリンリッチな領域と、ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク
質中に含有される最初のＳＨ３ドメインとの結合を阻害
する化合物を同定するのに有用な本発明のスクリーニン
グ方法の具体的な実施態様の例を、図１に示す。
るプロリンリッチな領域と、ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク
質中に含有される最初のＳＨ３ドメインとの結合を阻害
する化合物を同定するのに有用な本発明のスクリーニン
グ方法の具体的な実施態様の例を、図１に示す。
【０１１１】本発明の方法の具体的な実施態様におい
て、ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質由来の２７アミノ酸の
長さのプロリンリッチなペプチドは、ユーロピウムクリ
プテートからなる第１の蛍光マーカーで標識される。Ｓ
Ｈ３ドメイン含有ペプチドは、１３４アミノ酸の長さを
有するｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質由来の２つのＳＨ３
ドメインを含有するペプチドからなり、このペプチド
は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
からなる検出可能な分子に結合している。ＳＨ３ドメイ
ン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカー（これはＸＬ６
６５である）に結合した抗ＧＳＴ抗体からなる標識試薬
を介して、間接的に第２の蛍光マーカーで標識されてい
る。
て、ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質由来の２７アミノ酸の
長さのプロリンリッチなペプチドは、ユーロピウムクリ
プテートからなる第１の蛍光マーカーで標識される。Ｓ
Ｈ３ドメイン含有ペプチドは、１３４アミノ酸の長さを
有するｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質由来の２つのＳＨ３
ドメインを含有するペプチドからなり、このペプチド
は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
からなる検出可能な分子に結合している。ＳＨ３ドメイ
ン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカー（これはＸＬ６
６５である）に結合した抗ＧＳＴ抗体からなる標識試薬
を介して、間接的に第２の蛍光マーカーで標識されてい
る。
【０１１２】この実施態様において本発明の方法の工程
ｄ）は、プロリンリッチなペプチドと間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドとを含有する均一な混合
液を、ユーロピウムクリプテートの励起波長である３３
７nmの波長のエネルギー源に付し、ＸＬ６６５の発光波
長である６６５nmと、ユーロピウムクリプテートの発光
波長である６２０nmの両方で蛍光シグナルを測定するこ
とにより行われる。この測定は、候補インヒビター化合
物の非存在下と、上昇する濃度のあるインヒビター候補
化合物の存在下の両方で行われ、そして前記したように
ＩＣ５０値が計算される。
ｄ）は、プロリンリッチなペプチドと間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドとを含有する均一な混合
液を、ユーロピウムクリプテートの励起波長である３３
７nmの波長のエネルギー源に付し、ＸＬ６６５の発光波
長である６６５nmと、ユーロピウムクリプテートの発光
波長である６２０nmの両方で蛍光シグナルを測定するこ
とにより行われる。この測定は、候補インヒビター化合
物の非存在下と、上昇する濃度のあるインヒビター候補
化合物の存在下の両方で行われ、そして前記したように
ＩＣ５０値が計算される。
【０１１３】本発明のスクリーニング方法の具体的な実
施態様の別の例は、図２に示され、この例示した実施態
様は、ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるプロ
リンリッチな領域とｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質中に含
有されるＣ末端ＳＨ３ドメインとの結合相互作用を阻害
する化合物を選択するのに有用である。
施態様の別の例は、図２に示され、この例示した実施態
様は、ｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるプロ
リンリッチな領域とｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質中に含
有されるＣ末端ＳＨ３ドメインとの結合相互作用を阻害
する化合物を選択するのに有用である。
【０１１４】すなわち、本発明のスクリーニング方法の
好適な実施態様において、プロリンリッチなペプチド
は、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２２−ｐｈｏｘ、
ｐ４７−ｐｈｏｘ、およびｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質
中に含有されるプロリンリッチなペプチドの群から選択
される。
好適な実施態様において、プロリンリッチなペプチド
は、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２２−ｐｈｏｘ、
ｐ４７−ｐｈｏｘ、およびｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質
中に含有されるプロリンリッチなペプチドの群から選択
される。
【０１１５】最も好ましくはプロリンリッチなペプチド
は、配列番号３のアミノ酸配列からの少なくとも１０個
の連続的アミノ酸を含む。あるいはプロリンリッチなペ
プチドは、配列番号１の核酸配列によりコードされる、
配列番号３のアミノ酸配列中にある。
は、配列番号３のアミノ酸配列からの少なくとも１０個
の連続的アミノ酸を含む。あるいはプロリンリッチなペ
プチドは、配列番号１の核酸配列によりコードされる、
配列番号３のアミノ酸配列中にある。
【０１１６】本発明のスクリーニング方法の別の好適な
実施態様において、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、ヒ
トＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７
−ｐｈｏｘサブユニットタンパク質中に含有されるＳＨ
３ドメインの群から選択される。
実施態様において、ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、ヒ
トＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ４７−ｐｈｏｘとｐ６７
−ｐｈｏｘサブユニットタンパク質中に含有されるＳＨ
３ドメインの群から選択される。
【０１１７】最も好適な実施態様において、ＳＨ３ドメ
イン含有ペプチドは、配列番号２の核酸配列によりコー
ドされる配列番号４のアミノ酸配列を含む。あるいはＳ
Ｈ３ドメイン含有ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配
列からなる。
イン含有ペプチドは、配列番号２の核酸配列によりコー
ドされる配列番号４のアミノ酸配列を含む。あるいはＳ
Ｈ３ドメイン含有ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配
列からなる。
【０１１８】別の態様において本発明はまた、第１の蛍
光マーカーで標識されたプロリンリッチなペプチドから
なるスクリーニング試薬に関し、該第１の蛍光マーカー
は、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパ
ートナーまたは第２のパートナーである。
光マーカーで標識されたプロリンリッチなペプチドから
なるスクリーニング試薬に関し、該第１の蛍光マーカー
は、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパ
ートナーまたは第２のパートナーである。
【０１１９】第１の好適な実施態様において、上記スク
リーニング試薬中に含有される第１の蛍光マーカーは、
ユーロピウムクリプテート分子である。
リーニング試薬中に含有される第１の蛍光マーカーは、
ユーロピウムクリプテート分子である。
【０１２０】第２の好適な実施態様において、スクリー
ニング試薬は、ユーロピウムクリプテート分子に共有結
合した配列番号１のアミノ酸配列を有するプロリンリッ
チなペプチドからなる。
ニング試薬は、ユーロピウムクリプテート分子に共有結
合した配列番号１のアミノ酸配列を有するプロリンリッ
チなペプチドからなる。
【０１２１】さらなる態様において本発明はまた、第２
の蛍光マーカーで直接または間接的に標識されたＳＨ３
ドメイン含有ペプチドからなるスクリーニング試薬に関
し、ここで該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまたは第１の
パートナーである。
の蛍光マーカーで直接または間接的に標識されたＳＨ３
ドメイン含有ペプチドからなるスクリーニング試薬に関
し、ここで該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまたは第１の
パートナーである。
【０１２２】上記スクリーニング試薬の第１の好適な実
施態様において、第２の蛍光マーカーはＸＬ６６５であ
る。
施態様において、第２の蛍光マーカーはＸＬ６６５であ
る。
【０１２３】第２の好適な実施態様において、スクリー
ニング試薬は、ＧＳＴタンパク質に融合した配列番号２
のアミノ酸配列を有するＳＨ３ドメイン含有ペプチドか
らなる。この第２の好適な実施態様（ここで、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカーで間接的に
標識されている）において、間接的標識物は、第２の蛍
光マーカーＸＬ６６５に共有結合したＧＳＴタンパク質
に対する抗体からなる標識試薬からなる。
ニング試薬は、ＧＳＴタンパク質に融合した配列番号２
のアミノ酸配列を有するＳＨ３ドメイン含有ペプチドか
らなる。この第２の好適な実施態様（ここで、ＳＨ３ド
メイン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカーで間接的に
標識されている）において、間接的標識物は、第２の蛍
光マーカーＸＬ６６５に共有結合したＧＳＴタンパク質
に対する抗体からなる標識試薬からなる。
【０１２４】本発明はまた、プロリンリッチなペプチド
とＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する
候補化合物をスクリーニングするためのキットであっ
て： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドからなる第１のスクリーニング試薬（ここで、
該第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナー
である）； ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドからなる第２のスクリー
ニング試薬（ここで、第２の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまた
は第１のパートナーである）、を含む上記キットに関す
る。
とＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する
候補化合物をスクリーニングするためのキットであっ
て： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドからなる第１のスクリーニング試薬（ここで、
該第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナー
である）； ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドからなる第２のスクリー
ニング試薬（ここで、第２の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまた
は第１のパートナーである）、を含む上記キットに関す
る。
【０１２５】さらなる態様において本発明は：
ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、該第２の蛍光
マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの
第２のパートナーまたは第１のパートナーである）、と
で形成される複合体に関する。
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、該第２の蛍光
マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの
第２のパートナーまたは第１のパートナーである）、と
で形成される複合体に関する。
【０１２６】本発明はまた：
ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）ａ）で定義されたプロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体に関する。
ペプチド（ここで、該第１の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまた
は第２のパートナーである）；および ｂ）ａ）で定義されたプロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体に関する。
【０１２７】本発明の別の目的は：
ａ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）；およ
び ｂ）プロリンリッチなペプチドとａ）で定義されたＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体からなる。
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）；およ
び ｂ）プロリンリッチなペプチドとａ）で定義されたＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、とで形成される複合体からなる。
【０１２８】本発明はまた、医薬組成物を製造するため
の、本発明の方法に従って選択される候補化合物の使用
に関する。本発明はさらに、特に限定されないが、以下
の図と例により例示される。
の、本発明の方法に従って選択される候補化合物の使用
に関する。本発明はさらに、特に限定されないが、以下
の図と例により例示される。
【０１２９】
【実施例】例１：ＳＨ３ドメイン含有ペプチドＧＳＴ−
ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABの産生
ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABの産生
【０１３０】１．１ グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ融合ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB発現ベクターの作成 ｐ４７ｐｈｏｘのアミノ酸残基１５１〜２８４（配列番
号４）をコードするＤＮＡ断片（配列番号２）を、その
５’末端と３’末端でそれぞれＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ
部位を取り込むプライマーを使用して、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
ラーゼ融合ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB発現ベクターの作成 ｐ４７ｐｈｏｘのアミノ酸残基１５１〜２８４（配列番
号４）をコードするＤＮＡ断片（配列番号２）を、その
５’末端と３’末端でそれぞれＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ
部位を取り込むプライマーを使用して、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【０１３１】増幅生成物を、大腸菌（Escherichia col
i）発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシアバイオ
テクインク（Pharmacia Biotech Inc.））のＢａｍＨＩ
とＥｃｏＲＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＧＥ
Ｘ−２Ｔ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABを産生した。構築
は、ヌクレオチド配列決定により証明した。
i）発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシアバイオ
テクインク（Pharmacia Biotech Inc.））のＢａｍＨＩ
とＥｃｏＲＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＧＥ
Ｘ−２Ｔ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABを産生した。構築
は、ヌクレオチド配列決定により証明した。
【０１３２】１．２ ＧＳＴ−ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３
AB組換え融合タンパク質の産生 ＧＳＴ−融合タンパク質をコードするプラスミドを、大
腸菌（E. coli）株ＤＨ５αに導入した。形質転換体
を、５０μg/mlのアンピシリンを補足したＬＢ培地中で
３７℃で一晩培養した。一晩培養物を１リットルの新鮮
なＬＢ培地に１：１００希釈し、３０℃でＯＤ＝０．８
まで増殖させた。次に、イソプロピル−１−チオ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドを０．４mMまで添加して３０℃
でインキュベートして、融合タンパク質の発現を誘導し
た。１時間後、２０００ｇ、＋４℃で１５分、細菌を遠
心分離し、凍結させた。
AB組換え融合タンパク質の産生 ＧＳＴ−融合タンパク質をコードするプラスミドを、大
腸菌（E. coli）株ＤＨ５αに導入した。形質転換体
を、５０μg/mlのアンピシリンを補足したＬＢ培地中で
３７℃で一晩培養した。一晩培養物を１リットルの新鮮
なＬＢ培地に１：１００希釈し、３０℃でＯＤ＝０．８
まで増殖させた。次に、イソプロピル−１−チオ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドを０．４mMまで添加して３０℃
でインキュベートして、融合タンパク質の発現を誘導し
た。１時間後、２０００ｇ、＋４℃で１５分、細菌を遠
心分離し、凍結させた。
【０１３３】１．３ ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB
組換え融合タンパク質の精製 １．３．１ 細菌溶解物の調製 次に、１リットルの細菌培養物からのペレットを、１５
mlの氷冷ＰＢＳ１×−１０mM ＤＴＴ−１％トリトンＸ
−１００（緩衝液Ａ）に再懸濁した。次に８００μlの
抗プロテアーゼ溶液を、ならびに５mlの溶解溶液（緩衝
液Ａ中１mg）を、２mlの緩衝液Ａ中のこの懸濁液（コン
プレート（Complete）の名前でベーリンガマンハイム
（Boehringer Mannheim）から販売されているカクテル
インヒビターの１つの錠剤、照会番号：１８３６１４
５）に加えた。静かに振盪後、混合物を氷上で５分間イ
ンキュベートした。氷上で、音波発生器で、１０秒間を
３回、１０秒の間隔で、溶解を完了した。遠心分離して
溶解物を清澄化した（５分間、４℃、２００００ｇ）。
上清を取り、そのまま＋４℃で保存できる。
組換え融合タンパク質の精製 １．３．１ 細菌溶解物の調製 次に、１リットルの細菌培養物からのペレットを、１５
mlの氷冷ＰＢＳ１×−１０mM ＤＴＴ−１％トリトンＸ
−１００（緩衝液Ａ）に再懸濁した。次に８００μlの
抗プロテアーゼ溶液を、ならびに５mlの溶解溶液（緩衝
液Ａ中１mg）を、２mlの緩衝液Ａ中のこの懸濁液（コン
プレート（Complete）の名前でベーリンガマンハイム
（Boehringer Mannheim）から販売されているカクテル
インヒビターの１つの錠剤、照会番号：１８３６１４
５）に加えた。静かに振盪後、混合物を氷上で５分間イ
ンキュベートした。氷上で、音波発生器で、１０秒間を
３回、１０秒の間隔で、溶解を完了した。遠心分離して
溶解物を清澄化した（５分間、４℃、２００００ｇ）。
上清を取り、そのまま＋４℃で保存できる。
【０１３４】１．３．２ 精製
１リットルの細菌培養物について、２mlのゲル（グルタ
チオンセファロース４Ｂ、アマシャム・ファルマシア・
バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、照会番
号：１７−０７５６−０１）を、内径１．６cmのカラム
に充填した。このカラムを、流速２４０cm/hを使用し
て、５カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａで平衡化した。カ
ラムに、上清を４２cm/hの流速で充填し、次に１２ｃｖ
の緩衝液Ａで流速６００cm/hで洗浄した。最後に、ＧＳ
Ｔ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABを、３ｃｖの緩衝液Ｂで流
速２４０cm/hで溶出した（５０mMトリス−塩酸、ｐＨ
８、５mMグルタチオンを含有する緩衝液Ｂ。ｐＨは、グ
ルタチオンの添加後にチェックしなければならない）。
チオンセファロース４Ｂ、アマシャム・ファルマシア・
バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、照会番
号：１７−０７５６−０１）を、内径１．６cmのカラム
に充填した。このカラムを、流速２４０cm/hを使用し
て、５カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａで平衡化した。カ
ラムに、上清を４２cm/hの流速で充填し、次に１２ｃｖ
の緩衝液Ａで流速６００cm/hで洗浄した。最後に、ＧＳ
Ｔ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABを、３ｃｖの緩衝液Ｂで流
速２４０cm/hで溶出した（５０mMトリス−塩酸、ｐＨ
８、５mMグルタチオンを含有する緩衝液Ｂ。ｐＨは、グ
ルタチオンの添加後にチェックしなければならない）。
【０１３５】１．３．３ 透析ろ過と定量
遊離のグルタチオンは通常タンパク質測定と反応するた
め、タンパク質定量が必要な場合は、精製したｐ４７−
ｐｈｏｘＳＨ３ABを含有した溶出液は透析ろ過しなけれ
ばならない。透析ろ過は、１０kDaのカットオフを有す
る膜（セントリプレップ（Centriprep）、アミコン（Am
icon）、照会番号：４３０４）で行った。ヘペス０．１
Ｍ、０．４Ｍ ＫＦによる連続的透析により、グルタチ
オン濃度が８μM未満に低下した。この段階で、タンパ
ク質をビシンコニニック酸（bicinchoninic acid）ミク
ロ法（照会番号：ピー・ケー・スミス（P.K. Smith）
ら、Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985)）により定量し
た。調製物の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、硝酸銀染色法を使用してチェックし
た。
め、タンパク質定量が必要な場合は、精製したｐ４７−
ｐｈｏｘＳＨ３ABを含有した溶出液は透析ろ過しなけれ
ばならない。透析ろ過は、１０kDaのカットオフを有す
る膜（セントリプレップ（Centriprep）、アミコン（Am
icon）、照会番号：４３０４）で行った。ヘペス０．１
Ｍ、０．４Ｍ ＫＦによる連続的透析により、グルタチ
オン濃度が８μM未満に低下した。この段階で、タンパ
ク質をビシンコニニック酸（bicinchoninic acid）ミク
ロ法（照会番号：ピー・ケー・スミス（P.K. Smith）
ら、Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985)）により定量し
た。調製物の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、硝酸銀染色法を使用してチェックし
た。
【０１３６】例１ビス（ｂｉｓ）：プロリンリッチなペ
プチドｐ２２−ｐｈｏｘの産生 プロリンリッチなペプチドを合成（配列番号３）し、そ
の純度を配列解析とゲルろ過によりチェックした（９５
％を越える）
プチドｐ２２−ｐｈｏｘの産生 プロリンリッチなペプチドを合成（配列番号３）し、そ
の純度を配列解析とゲルろ過によりチェックした（９５
％を越える）
【０１３７】例２：ＨＴＲＦ測定
２．１ 材料と方法
【０１３８】２．１．１．試薬の調製
測定混合物を最終容量２００μlで調製した。
・緩衝液：すべての試薬を、ヘペス１００mM（シグマ
（Sigma）Ｈ３３７５ＰＭ２３８．３）、５０mM ＫＦ
（フルカ（Fluka）６０２３８ ＰＭ５８．１）、０．
１％ＢＳＡ画分Ｖ（シグマ（Sigma）Ａ７９０６）中で
調製した。ｐＨは、８に調整した。１ヶ月間４℃で維持
した。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB（ＰＭ４０００
０）：５０μlの４×ストック溶液（２００nM）の使
用。最終濃度は、ウェルあたり５０nMである。４℃で４
８時間まで安定。測定緩衝液中で−２０または−８０℃
で長期保存。
（Sigma）Ｈ３３７５ＰＭ２３８．３）、５０mM ＫＦ
（フルカ（Fluka）６０２３８ ＰＭ５８．１）、０．
１％ＢＳＡ画分Ｖ（シグマ（Sigma）Ａ７９０６）中で
調製した。ｐＨは、８に調整した。１ヶ月間４℃で維持
した。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB（ＰＭ４０００
０）：５０μlの４×ストック溶液（２００nM）の使
用。最終濃度は、ウェルあたり５０nMである。４℃で４
８時間まで安定。測定緩衝液中で−２０または−８０℃
で長期保存。
【０１３９】・ペプチドｐ２２−（ＥｕＫ）3+ （ＰＭ
３２００、［Ｅｕ3+］＝０．０６３８mg/ml）を、ネオ
システム（Neosystem）により合成し、次にユーロピウ
ムクリプテートで標識し、パッカード／シスビオ（Pack
ard/CisBio）インターナショナル（照会番号 Ｃ−２８
−Ｅ−Ｋ−００４）により精製した。ウェル当たりに使
用したユーロピウムクリプテートの量は、ディスカバリ
ー（Discovery）で６２０nmで４００００カウント（蛍
光強度）を得るために、０．４ngであった。標識ペプチ
ドを、必要な時まで−２０℃で保存した。２．５nMのス
トック溶液５０μlの使用。最終濃度０．６３nM。
３２００、［Ｅｕ3+］＝０．０６３８mg/ml）を、ネオ
システム（Neosystem）により合成し、次にユーロピウ
ムクリプテートで標識し、パッカード／シスビオ（Pack
ard/CisBio）インターナショナル（照会番号 Ｃ−２８
−Ｅ−Ｋ−００４）により精製した。ウェル当たりに使
用したユーロピウムクリプテートの量は、ディスカバリ
ー（Discovery）で６２０nmで４００００カウント（蛍
光強度）を得るために、０．４ngであった。標識ペプチ
ドを、必要な時まで−２０℃で保存した。２．５nMのス
トック溶液５０μlの使用。最終濃度０．６３nM。
【０１４０】・ＧＳＴ抗体をＸＬ６６５で標識し、パッ
カード／シスビオ（Packard/CisBio）インターナショナ
ル（照会 ｍＡｂ ＧＳＴ−ＸＩ ００９）で精製し
た。標識抗体を、必要な時まで−８０℃で保存した。ス
トック溶液は０．２５μg/mlであり、９６μlの容量中
４００ng/ウェル（２７．８nM）で使用した。最終濃度
１３．３nM。
カード／シスビオ（Packard/CisBio）インターナショナ
ル（照会 ｍＡｂ ＧＳＴ−ＸＩ ００９）で精製し
た。標識抗体を、必要な時まで−８０℃で保存した。ス
トック溶液は０．２５μg/mlであり、９６μlの容量中
４００ng/ウェル（２７．８nM）で使用した。最終濃度
１３．３nM。
【０１４１】
【０１４２】２．１．２．ＨＴＲＦ読み
測定混合物を、９６ウェルの黒プレートに加えた（パッ
カードオプチプレート（Packard Optiplate）ＨＴＲ
Ｆ）（照会番号６００５２０７）。プレインキュベーシ
ョン時間は不要であった。ＨＴＲＦデータは、ＨＴＲＦ
に特化したディスカバリー（Discovery）（登録商標）
マイクロタイタープレートアナライザー（パッカードイ
ンストルメンツ（Packard instruments））を使用して
集めた。窒素レーザーで３３７nmで励起し、６２０nmと
６６５nmで蛍光を同時に読んだ。曲線当てはめは、２つ
のエクセルユーティリティプログラムを使用して行った − Xlfitウィザード（モデル２００） − データ解析ウィザード（モデル６８）
カードオプチプレート（Packard Optiplate）ＨＴＲ
Ｆ）（照会番号６００５２０７）。プレインキュベーシ
ョン時間は不要であった。ＨＴＲＦデータは、ＨＴＲＦ
に特化したディスカバリー（Discovery）（登録商標）
マイクロタイタープレートアナライザー（パッカードイ
ンストルメンツ（Packard instruments））を使用して
集めた。窒素レーザーで３３７nmで励起し、６２０nmと
６６５nmで蛍光を同時に読んだ。曲線当てはめは、２つ
のエクセルユーティリティプログラムを使用して行った − Xlfitウィザード（モデル２００） − データ解析ウィザード（モデル６８）
【０１４３】２．１．３ 計算
マイクロタイタープレートの各ウェルについて、以下の
値を測定した： ・比 比（Ｒ）＝シグナル665nm／シグナル620nm×10000 ・デルタ比 デルタ比＝デルタ比−陰性対照比 この値は、測定に特異的なシグナルであり、装置に依存
する。 ・デルタＦ（％として表される）： デルタ比＝（デルタ比／陰性対照比×100） 値は、特異的シグナル−バックグランドシグナルであ
り、装置には依存しない。
値を測定した： ・比 比（Ｒ）＝シグナル665nm／シグナル620nm×10000 ・デルタ比 デルタ比＝デルタ比−陰性対照比 この値は、測定に特異的なシグナルであり、装置に依存
する。 ・デルタＦ（％として表される）： デルタ比＝（デルタ比／陰性対照比×100） 値は、特異的シグナル−バックグランドシグナルであ
り、装置には依存しない。
【０１４４】２．２．結果
２．２．１ 組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの組換え
ｐ２２−ｐｈｏｘ−ＥｕＫへの結合の測定 固定した最終濃度８０nMのｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３AB組
換えタンパク質を、ｐ２２−ｐｈｏｘ−ＥｕＫを含有す
る９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え
た。次に最終濃度の抗ＧＳＴモノクローナル抗体を加
え、６２０nmと６６５nmの蛍光シグナルを測定した。結
果を以下の表２に示す。
ｐ２２−ｐｈｏｘ−ＥｕＫへの結合の測定 固定した最終濃度８０nMのｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３AB組
換えタンパク質を、ｐ２２−ｐｈｏｘ−ＥｕＫを含有す
る９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え
た。次に最終濃度の抗ＧＳＴモノクローナル抗体を加
え、６２０nmと６６５nmの蛍光シグナルを測定した。結
果を以下の表２に示す。
【０１４５】
【０１４６】蛍光測定は、測定試薬の添加後２４時間の
間、１時間毎に蛍光測定を繰り返した。全体のシグナル
は、４時間まで安定であり、２時間後やや低下した（図
３）。シグナルは小さかったが、２４時間後も読みは可
能であった。
間、１時間毎に蛍光測定を繰り返した。全体のシグナル
は、４時間まで安定であり、２時間後やや低下した（図
３）。シグナルは小さかったが、２４時間後も読みは可
能であった。
【０１４７】２．２．２．ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ
３ABの力価測定 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABの最終濃度は、容量
５０μl中で２００〜１０nM（４×ストック溶液から）
に変化した。・ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドと抗ＧＳ
Ｔ抗体−ＸＬ６６５は、それぞれ最終濃度０．６３nMと
１３．３nMで使用した。結果を図４に示す。データは、
組換えｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABの最終濃度約６０nMにつ
いて、最大デルタＦ％が達成されることを示した。
３ABの力価測定 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABの最終濃度は、容量
５０μl中で２００〜１０nM（４×ストック溶液から）
に変化した。・ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドと抗ＧＳ
Ｔ抗体−ＸＬ６６５は、それぞれ最終濃度０．６３nMと
１３．３nMで使用した。結果を図４に示す。データは、
組換えｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABの最終濃度約６０nMにつ
いて、最大デルタＦ％が達成されることを示した。
【０１４８】２．２．３．抗体抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５の
力価測定 抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５抗体濃度は、９６μlの容量で
０．２５mg/mlのストック溶液から、５０〜８００ng／
ウェルで変化した。ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ ABと
ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドは、それぞれウェル当た
り５０nMと０．６３nMの最終濃度で使用した。結果を図
５に示す。図５に示すデータは、９６ウェルマイクロタ
イタープレートの各ウェルに加えた抗ＧＳＴ組換え抗体
の量の増加とともに、デルタＦ％値が増加した。最大デ
ルタＦ％値は、８００ngの抗ＧＳＴ抗体／ウェルで見ら
れた。
力価測定 抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５抗体濃度は、９６μlの容量で
０．２５mg/mlのストック溶液から、５０〜８００ng／
ウェルで変化した。ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ ABと
ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドは、それぞれウェル当た
り５０nMと０．６３nMの最終濃度で使用した。結果を図
５に示す。図５に示すデータは、９６ウェルマイクロタ
イタープレートの各ウェルに加えた抗ＧＳＴ組換え抗体
の量の増加とともに、デルタＦ％値が増加した。最大デ
ルタＦ％値は、８００ngの抗ＧＳＴ抗体／ウェルで見ら
れた。
【０１４９】例３：ＨＴＲＦ測定−結合の特異性
３．１．ＧＳＴ−ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの突然変異
・突然変異したＧＳＴ−ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３AB：Ｇ
ＳＴ−ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの最終濃度は、５０μ
lの容量中で２００〜１０nM（４×ストック溶液から）
に変化した。 ・ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドと抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ
６６５は、前の実験と同じ最終濃度（それぞれ０．６３
nMと１３．３nM）で使用した。結果を図６に示す。デー
タは、組換えＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABが、野生
型組換えＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABと比較して、
単一のアミノ酸置換（１５６ Ｐ→Ｑ）を有するが、こ
のペプチドは、組換えｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドに
まったく結合することができないことを示した。
ＳＴ−ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの最終濃度は、５０μ
lの容量中で２００〜１０nM（４×ストック溶液から）
に変化した。 ・ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドと抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ
６６５は、前の実験と同じ最終濃度（それぞれ０．６３
nMと１３．３nM）で使用した。結果を図６に示す。デー
タは、組換えＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABが、野生
型組換えＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABと比較して、
単一のアミノ酸置換（１５６ Ｐ→Ｑ）を有するが、こ
のペプチドは、組換えｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドに
まったく結合することができないことを示した。
【０１５０】例４：インヒビター化合物を用いるスクリ
ーニング測定の評価 未標識組換えｐ２２−ｐｈｏｘペプチドからなる結合の
インヒビターを用いて、スクリーニング測定を行った。
測定条件は以下の通りであった： ・ｐ２２ペプチド：ｐ２２ペプチドの最終濃度は、１か
ら１００nMに変化した。４μlの５０×ストック溶液を
使用。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABとｐ２２−（Ｅｕ
Ｋ）3+ペプチドおよび抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５ＸＬ６
６５は、前の実験と同じ最終濃度（それぞれ５０nM、
０．６３nMおよび１３．３nM）で使用した。 測定に使用した異なる試薬の濃度を、以下の表３に示
す。
ーニング測定の評価 未標識組換えｐ２２−ｐｈｏｘペプチドからなる結合の
インヒビターを用いて、スクリーニング測定を行った。
測定条件は以下の通りであった： ・ｐ２２ペプチド：ｐ２２ペプチドの最終濃度は、１か
ら１００nMに変化した。４μlの５０×ストック溶液を
使用。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ABとｐ２２−（Ｅｕ
Ｋ）3+ペプチドおよび抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５ＸＬ６
６５は、前の実験と同じ最終濃度（それぞれ５０nM、
０．６３nMおよび１３．３nM）で使用した。 測定に使用した異なる試薬の濃度を、以下の表３に示
す。
【０１５１】
【０１５２】結果は、図７Ａと７Ｂに示す。図７Ａ（図
７の左側）に示すデータは、ｐ４７ｐｈｏｘ−ＧＳＴ上
のｐ２２ＥｕＫの結合に及ぼす未標識ｐ２２ペプチドの
競合的阻害作用が、濃度依存性であることを示した。測
定の各未標識ｐ２２最終濃度の阻害パーセント値のプロ
ットは、ＩＣ５０値の計算を可能にし、これは５．８nM
であった（図７Ｂ）。
７の左側）に示すデータは、ｐ４７ｐｈｏｘ−ＧＳＴ上
のｐ２２ＥｕＫの結合に及ぼす未標識ｐ２２ペプチドの
競合的阻害作用が、濃度依存性であることを示した。測
定の各未標識ｐ２２最終濃度の阻害パーセント値のプロ
ットは、ＩＣ５０値の計算を可能にし、これは５．８nM
であった（図７Ｂ）。
【０１５３】例５：本発明のスクリーニング方法による
候補インヒビター化合物の大規模スクリーニング
候補インヒビター化合物の大規模スクリーニング
【０１５４】Ａ．材料と方法
Ａ．１ スクリーニング測定
・試験した候補化合物：０．２％ＤＭＳＯ中２０μMで
試験した。１mMのストック濃度の４μlの生成物の使
用。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB、ｐ２２−（Ｅｕ
Ｋ）3+ペプチド、および抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５は、
前の実験と同じ最終濃度で使用した（それぞれ５０nM、
０．６３nMおよび１３．３nM）。 ・ｐ２２ペプチド：５００nMのストック溶液の調製。各
プレートを評価するために、阻害の内部対照として、そ
のＩＣ５０（４μl中１０nM）より少し高い濃度で使用
した。
試験した。１mMのストック濃度の４μlの生成物の使
用。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB、ｐ２２−（Ｅｕ
Ｋ）3+ペプチド、および抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５は、
前の実験と同じ最終濃度で使用した（それぞれ５０nM、
０．６３nMおよび１３．３nM）。 ・ｐ２２ペプチド：５００nMのストック溶液の調製。各
プレートを評価するために、阻害の内部対照として、そ
のＩＣ５０（４μl中１０nM）より少し高い濃度で使用
した。
【０１５５】このプレートへの試薬の添加順序は：
１．緩衝液／ｐ２２ペプチド／候補化合物
２．ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB
３．ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチド
４． 抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５
陽性対照と陰性対照は、各７ウェルで試験した。候補化
合物とｐ２２ペプチド内部対照は、二重測定で試験し
た。それぞれについて平均±Ｃｖを計算した。
合物とｐ２２ペプチド内部対照は、二重測定で試験し
た。それぞれについて平均±Ｃｖを計算した。
【０１５６】Ａ．２ ＩＣ５０の測定
候補化合物：最終濃度は３０から０．０４μMに変化し
た。１．５mMから２μMの範囲の５０×ストック溶液４
μlの使用。ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB、ｐ２２
−（ＥｕＫ）3+ペプチドおよび抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６
５は、前の実験と同じ最終濃度で使用した（それぞれ５
０nM、０．６３nMおよび１３．３nM）。
た。１．５mMから２μMの範囲の５０×ストック溶液４
μlの使用。ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB、ｐ２２
−（ＥｕＫ）3+ペプチドおよび抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６
５は、前の実験と同じ最終濃度で使用した（それぞれ５
０nM、０．６３nMおよび１３．３nM）。
【０１５７】
【０１５８】Ａ．３ ＮＡＤＰＨオキシダーゼの無細胞
測定 使用した測定法は、アボ（ABO）ら（１９９５）が開示
したものに由来する。過酸化物生成測定は、９６ウェル
プレートでｐＨ８で１００μlの最終容量（所望の濃度
でＤＭＳＯ中に溶解した２μlの化合物、０．４μｇの
ＰＬＢ９８５膜、０．２μｇの組換えｐ４７phox、０．
１μｇの組換えｐ６７phox、０．１５μｇのＲａｃ１−
ＧＴＰγＳ充填、１０μM ＦＡＤ、１００μMフェリチ
トクロムｃ、６５mM ＮａＰＯ４、１mM ＭｇＣｌ２、
１mM ＥＧＴＡを含む）で行った。アセンブリープロセ
スは、室温で２５μlのＬｉＤＳ（最終濃度８０μM）を
加えて開始した。反応は、２５μlのＮＡＤＰＨ（最終
濃度２００μM）の添加５分後に開始した。過酸化物生
成は、ラボシステム（Labsystem）ｉＥＭＳリーダーＭ
Ｆで５５０nMでフェリチトクロムｃのスーパーオキシド
ジスムターゼで阻害可能な還元の速度を追跡して測定し
た。測定したＩＣ５０は、酵素の初期速度を半分にする
インヒビターの濃度として定義される。
測定 使用した測定法は、アボ（ABO）ら（１９９５）が開示
したものに由来する。過酸化物生成測定は、９６ウェル
プレートでｐＨ８で１００μlの最終容量（所望の濃度
でＤＭＳＯ中に溶解した２μlの化合物、０．４μｇの
ＰＬＢ９８５膜、０．２μｇの組換えｐ４７phox、０．
１μｇの組換えｐ６７phox、０．１５μｇのＲａｃ１−
ＧＴＰγＳ充填、１０μM ＦＡＤ、１００μMフェリチ
トクロムｃ、６５mM ＮａＰＯ４、１mM ＭｇＣｌ２、
１mM ＥＧＴＡを含む）で行った。アセンブリープロセ
スは、室温で２５μlのＬｉＤＳ（最終濃度８０μM）を
加えて開始した。反応は、２５μlのＮＡＤＰＨ（最終
濃度２００μM）の添加５分後に開始した。過酸化物生
成は、ラボシステム（Labsystem）ｉＥＭＳリーダーＭ
Ｆで５５０nMでフェリチトクロムｃのスーパーオキシド
ジスムターゼで阻害可能な還元の速度を追跡して測定し
た。測定したＩＣ５０は、酵素の初期速度を半分にする
インヒビターの濃度として定義される。
【０１５９】好中球膜：オニクス（Onyx）によりＰＬＢ
９８５細胞から調製された。１２０mM ＮａＰＯ4（ｐ
Ｈ７．４）、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ2、１mM
ＤＴＴ、１mM ロイペプチン、１mM ＰＭＳＦ、２０
％グリセロール、８mM γ−Ｄオクチグルコシド中で保
存した。−８０℃の保存で１回の融解と再凍結サイクル
に安定。 Ｒａｃ１−ＧＴＰγＳ（ＥＥ標識）：オニクス（Onyx）
により調製し精製された。２５mMトリス（ｐＨ７．
５）、２５mM ＮａＣｌ、７．５mM ＭｇＣｌ2、５mM
ＥＤＴＡ、５０％グリセロール中で保存した。−８０
℃で小アリコートで保存して凍結／融解を避けた。 ｐ４７−ｐｈｏｘ（ＥＥ標識）：オニクス（Onyx）によ
り調製し精製された。２５mMトリス（ｐＨ７．５）、１
mM ＥＤＴＡ、５０％グリセロール中で保存した。安
定、−８０℃で保存。 ｐ６７−ｐｈｏｘ（ＥＥ標識）：オニクス（Onyx）によ
り調製し精製された。２５mMトリス（ｐＨ７．５）、１
mM ＥＤＴＡ、５０％グリセロール中で保存した。安
定、−８０℃で保存。
９８５細胞から調製された。１２０mM ＮａＰＯ4（ｐ
Ｈ７．４）、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ2、１mM
ＤＴＴ、１mM ロイペプチン、１mM ＰＭＳＦ、２０
％グリセロール、８mM γ−Ｄオクチグルコシド中で保
存した。−８０℃の保存で１回の融解と再凍結サイクル
に安定。 Ｒａｃ１−ＧＴＰγＳ（ＥＥ標識）：オニクス（Onyx）
により調製し精製された。２５mMトリス（ｐＨ７．
５）、２５mM ＮａＣｌ、７．５mM ＭｇＣｌ2、５mM
ＥＤＴＡ、５０％グリセロール中で保存した。−８０
℃で小アリコートで保存して凍結／融解を避けた。 ｐ４７−ｐｈｏｘ（ＥＥ標識）：オニクス（Onyx）によ
り調製し精製された。２５mMトリス（ｐＨ７．５）、１
mM ＥＤＴＡ、５０％グリセロール中で保存した。安
定、−８０℃で保存。 ｐ６７−ｐｈｏｘ（ＥＥ標識）：オニクス（Onyx）によ
り調製し精製された。２５mMトリス（ｐＨ７．５）、１
mM ＥＤＴＡ、５０％グリセロール中で保存した。安
定、−８０℃で保存。
【０１６０】Ａ．４ ＮＡＤＰＨオキシダーゼの２次Ｈ
Ｌ６０細胞ベースの測定 プロトコール：好中球中で分化したＨＬ６０細胞中のＮ
ＡＤＰＨオキシダーゼ測定
Ｌ６０細胞ベースの測定 プロトコール：好中球中で分化したＨＬ６０細胞中のＮ
ＡＤＰＨオキシダーゼ測定
【０１６１】１．材料
ＲＰＭＩ培地、ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）、
胎児牛血清、Ｌ−グルタミン、ゲンタマイシン、ＰＢＳ
およびヘペスは、ギブコビ／アールエル（Gibco/BRL）
から得た。ＤＭＳＯはメルク（Merck）から得た。サイ
トカラシン、ＴＰＡおよびチトクロムＣは、シグマ（Si
gma）から得た。
胎児牛血清、Ｌ−グルタミン、ゲンタマイシン、ＰＢＳ
およびヘペスは、ギブコビ／アールエル（Gibco/BRL）
から得た。ＤＭＳＯはメルク（Merck）から得た。サイ
トカラシン、ＴＰＡおよびチトクロムＣは、シグマ（Si
gma）から得た。
【０１６２】２．方法
２．１ 細胞培養と分化
ＨＬ−６０細胞は、ヨーロピーアンコレクションオブセ
ルカルチャ（EuropeanCollection of Cell Culture）
（ＥＣＡＣＣ）から得た。これらは、１０％（v/v）熱
不活性化子牛血清を補足したＲＰＭＩ培地で、３７℃で
９５％空気−５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で増殖させた。
培地は２〜３日毎に交換した。分化のために、ＨＬ−６
０細胞を２５０，０００〜４００，０００細胞／mlで接
種し、培地に１．３％ＤＭＳＯを７〜１０日間加えた。
分化プロセスの間に、培地は交換せず、細胞は７〜１０
日で準備ができ、約１，０００，０００細胞/mlであっ
た。
ルカルチャ（EuropeanCollection of Cell Culture）
（ＥＣＡＣＣ）から得た。これらは、１０％（v/v）熱
不活性化子牛血清を補足したＲＰＭＩ培地で、３７℃で
９５％空気−５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で増殖させた。
培地は２〜３日毎に交換した。分化のために、ＨＬ−６
０細胞を２５０，０００〜４００，０００細胞／mlで接
種し、培地に１．３％ＤＭＳＯを７〜１０日間加えた。
分化プロセスの間に、培地は交換せず、細胞は７〜１０
日で準備ができ、約１，０００，０００細胞/mlであっ
た。
【０１６３】２．２ 測定
好中球中で分化したＨＬ−６０細胞を、ハンクス＋１２
０μMチトクロムＣ中１．２×１０6 細胞の濃度で使用
し、９６ウェルプレートの各ウェルに２４０μlを蒔
き、室温で５分間インキュベートした。次に、細胞懸濁
液２４０μlを、３０μlのＤＭＳＯで希釈した選択され
た濃度の試験化合物をすでに含有する９６ウェルプレー
ト中に蒔いた。化合物の存在下で、細胞を３７℃で３０
分インキュベートし、懸濁液の光学密度を５５０nmで連
続的に追跡した。３０μLの１μMＴＰＡ。異なる濃度の
試験化合物（ＤＭＳＯ中最大１０μl／ウェル １／１
０）を細胞と、３７℃で攪拌しながら３０分インキュベ
ートし、次に１００nM ＰＭＡを３０〜４０分加えた。
陰性対照では、化合物もＰＭＡも加えず、陽性対照で
は、化合物は加えなかったが、細胞をＰＭＡで刺激した
（０％阻害）。各ウェルの吸光度を５５０nmで追跡し
た。
０μMチトクロムＣ中１．２×１０6 細胞の濃度で使用
し、９６ウェルプレートの各ウェルに２４０μlを蒔
き、室温で５分間インキュベートした。次に、細胞懸濁
液２４０μlを、３０μlのＤＭＳＯで希釈した選択され
た濃度の試験化合物をすでに含有する９６ウェルプレー
ト中に蒔いた。化合物の存在下で、細胞を３７℃で３０
分インキュベートし、懸濁液の光学密度を５５０nmで連
続的に追跡した。３０μLの１μMＴＰＡ。異なる濃度の
試験化合物（ＤＭＳＯ中最大１０μl／ウェル １／１
０）を細胞と、３７℃で攪拌しながら３０分インキュベ
ートし、次に１００nM ＰＭＡを３０〜４０分加えた。
陰性対照では、化合物もＰＭＡも加えず、陽性対照で
は、化合物は加えなかったが、細胞をＰＭＡで刺激した
（０％阻害）。各ウェルの吸光度を５５０nmで追跡し
た。
【０１６４】化合物の活性は、ビヒクルで処理した細胞
と比較したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の阻害パーセン
トとして表した。阻害パーセントは以下のように計算さ
れる： ％阻害＝１００−［（Ｘ−Ｔ-）×１００／（Ｔ+−
Ｔ-）］ Ｘ：試験した化合物の各濃度についてのウェル中のＯＤ Ｔ-：陰性対照ウェル中のＯＤ（刺激無し） Ｔ+：陽性対照ウェル中のＯＤ（０％阻害）
と比較したＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の阻害パーセン
トとして表した。阻害パーセントは以下のように計算さ
れる： ％阻害＝１００−［（Ｘ−Ｔ-）×１００／（Ｔ+−
Ｔ-）］ Ｘ：試験した化合物の各濃度についてのウェル中のＯＤ Ｔ-：陰性対照ウェル中のＯＤ（刺激無し） Ｔ+：陽性対照ウェル中のＯＤ（０％阻害）
【０１６５】Ｂ．結果
クマリンとキナゾリンファミリーに属する種々の化合物
を、本発明のスクリーニング方法を使用して試験した。
本発明のＨＴＲＦ測定法の生物学的関連を評価するため
に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の阻害を明らかにする
本発明のスクリーニング方法に従って得られたＩＣ５０
値と測定（無細胞測定および細胞ベースの測定）で得ら
れたＩＣ５０値との比較を行った。結果を以下の表６に
示す。
を、本発明のスクリーニング方法を使用して試験した。
本発明のＨＴＲＦ測定法の生物学的関連を評価するため
に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の阻害を明らかにする
本発明のスクリーニング方法に従って得られたＩＣ５０
値と測定（無細胞測定および細胞ベースの測定）で得ら
れたＩＣ５０値との比較を行った。結果を以下の表６に
示す。
【０１６６】
【０１６７】上記表６に示す結果は、本発明のスクリー
ニング方法に従って検出された、ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏ
ｘＳＨ３ABとｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドとの結合の
阻害は、絶えず無細胞測定と細胞ベースのＮＡＤＰＨオ
キシダーゼ測定に従って検出されるこれらの化合物の阻
害活性により例示されるように、ＮＡＤＰＨオキシダー
ゼ酵素活性を有効に阻害する化合物に、対応する。
ニング方法に従って検出された、ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏ
ｘＳＨ３ABとｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドとの結合の
阻害は、絶えず無細胞測定と細胞ベースのＮＡＤＰＨオ
キシダーゼ測定に従って検出されるこれらの化合物の阻
害活性により例示されるように、ＮＡＤＰＨオキシダー
ゼ酵素活性を有効に阻害する化合物に、対応する。
【０１６８】例６：高処理量スクリーニング測定
【０１６９】Ａ．材料と方法
Ａ．１ スクリーニング測定
測定混合物を最終容量５０μl中で調製した。
・緩衝液：９６ウェルフォーマットと同一。
・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB：１２μlの４．１
６７×ストック溶液（２０８nM）の使用。最終濃度は、
ウェル当たり５０nMである。 ・ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチド：ウェル当たりで使用
したユーロピウムクリプテートの量は、ディスカバリー
（Discovery）で６２０nmで４００００カウント（蛍光
強度）を得るために、１．６ngであった。１２μlの４
１．６７nMのストック溶液の使用。最終濃度１０nM。 ・抗ＧＳＴ抗体：ストック溶液は０．２５mg/mlであ
り、２４μlの容量中４００ng/ウェルで使用した。最終
濃度５３．３nM。 ・候補化合物：０．２％ＤＭＳＯ中２０μMで試験し
た。１mMのストック濃度で１μMの生産を使用した。
６７×ストック溶液（２０８nM）の使用。最終濃度は、
ウェル当たり５０nMである。 ・ｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチド：ウェル当たりで使用
したユーロピウムクリプテートの量は、ディスカバリー
（Discovery）で６２０nmで４００００カウント（蛍光
強度）を得るために、１．６ngであった。１２μlの４
１．６７nMのストック溶液の使用。最終濃度１０nM。 ・抗ＧＳＴ抗体：ストック溶液は０．２５mg/mlであ
り、２４μlの容量中４００ng/ウェルで使用した。最終
濃度５３．３nM。 ・候補化合物：０．２％ＤＭＳＯ中２０μMで試験し
た。１mMのストック濃度で１μMの生産を使用した。
【０１７０】Ａ．２ ＩＣ５０の測定
・候補化合物：１．５mM〜２μMの範囲の５０×ストッ
ク溶液１μlを使用。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB、ｐ２２−（Ｅｕ
Ｋ）3+ペプチドと抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５は、前の実
験と同じ最終濃度で使用した（それぞれ５０nM、１０nM
および５３．３nM）。
ク溶液１μlを使用。 ・ＧＳＴ−ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３AB、ｐ２２−（Ｅｕ
Ｋ）3+ペプチドと抗ＧＳＴ抗体−ＸＬ６６５は、前の実
験と同じ最終濃度で使用した（それぞれ５０nM、１０nM
および５３．３nM）。
【０１７１】Ｂ．結果：３８４ウェルＨＴＲＦ測定フォ
ーマットの評価 Ｂ．１ ９６ウェル測定と３８４ウェル測定との比較分
析 上記例に記載の９６ウェルフォーマットで得られたシグ
ナル／ノイズ比と、高処理量３８４ウェル測定フォーマ
ットで得られた比との比較を行った。結果を、以下の表
５に記載する。
ーマットの評価 Ｂ．１ ９６ウェル測定と３８４ウェル測定との比較分
析 上記例に記載の９６ウェルフォーマットで得られたシグ
ナル／ノイズ比と、高処理量３８４ウェル測定フォーマ
ットで得られた比との比較を行った。結果を、以下の表
５に記載する。
【０１７２】
【０１７３】Ｂ．２ 異なるペプチド−ＥｕＫ濃度での
９６ウェル測定と３８４ウェル測定の間の異なる化合物
の阻害性の比較 ３つの異なる候補インヒビター化合物についてＧＳＴ−
ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ ABとｐ２２−（ＥｕＫ）3+の間の
結合の阻害パーセントを行った。結果を図８に示す。図
８に示すデータは、９６ウェル測定と３８４ウェル測定
を使用して、実質的に同じ阻害パーセント値が得られる
ことを示した。さらに、０．４から１．６ng/ウェルの
増加するｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドの量について、
ほぼ同じ値が得られる。
９６ウェル測定と３８４ウェル測定の間の異なる化合物
の阻害性の比較 ３つの異なる候補インヒビター化合物についてＧＳＴ−
ｐ４７ｐｈｏｘＳＨ３ ABとｐ２２−（ＥｕＫ）3+の間の
結合の阻害パーセントを行った。結果を図８に示す。図
８に示すデータは、９６ウェル測定と３８４ウェル測定
を使用して、実質的に同じ阻害パーセント値が得られる
ことを示した。さらに、０．４から１．６ng/ウェルの
増加するｐ２２−（ＥｕＫ）3+ペプチドの量について、
ほぼ同じ値が得られる。
【０１７４】（参考文献）
【０１７５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Warner Lambert Company
<120> Method for the screening of compounds that inhibit the
interaction between a proline-rich peptide and a SH3
domain-comprising peptide
<130> PA-28821
<150> EP 01402064.8
<151> 2001-07-30
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 81
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
cggaggcacc atcaagcagc cgcccagcaa ccccccgccg cggcccccgg ccgaggcccg 60
caagaagccc agcgaggagg a 81
<210> 2
<211> 402
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
gacatcaccg gccccatcat cctgcagacg taccgcgcca ttgccgacta cgagaagacc 60
tcgggctccg agatggctct gtccacgggg gacgtggtgg aggtcgtgga gaagagcgag 120
agcggttggt ggttctgtca gatgaaagca aagcgaggct ggatcccagc atccttcctc 180
gagcccctgg acagtcctga cgagacggaa gaccctgagc ccaactatgc aggtgagcca 240
tacgtcgcca tcaaggccta cactgctgtg gagggggacg aggtgtccct gctcgagggt 300
gaagctgttg aggtcattca caagctcctg gacggctggt gggtcatcag gaaagacgac 360
gtcacaggct actttccgtc catgtacctg caaaagtcgg gg 402
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Cys Gly Gly Thr Ile Lys Gln Pro Pro Ser Asn Pro Pro Pro Arg Pro
1 5 10 15
Pro Ala Glu Ala Arg Lys Lys Pro Ser Glu Glu Glu
20 25
<210> 4
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Ile Thr Gly Pro Ile Ile Leu Gln Thr Tyr Arg Ala Ile Ala Asp
1 5 10 15
Tyr Glu Lys Thr Ser Gly Ser Glu Met Ala Leu Ser Thr Gly Asp Val
20 25 30
Val Glu Val Val Glu Lys Ser Glu Ser Gly Trp Trp Phe Cys Gln Met
35 40 45
Lys Ala Lys Arg Gly Trp Ile Pro Ala Ser Phe Leu Glu Pro Leu Asp
50 55 60
Ser Pro Asp Glu Thr Glu Asp Pro Glu Pro Asn Tyr Ala Gly Glu Pro
65 70 75 80
Tyr Val Ala Ile Lys Ala Tyr Thr Ala Val Glu Gly Asp Glu Val Ser
85 90 95
Leu Leu Glu Gly Glu Ala Val Glu Val Ile His Lys Leu Leu Asp Gly
100 105 110
Trp Trp Val Ile Arg Lys Asp Asp Val Thr Gly Tyr Phe Pro Ser Met
115 120 125
Tyr Leu Gln Lys Ser Gly
130
【図１】ｐ２２−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるプ
ロリンリッチな領域とｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質中に
含有されるＳＨ３ドメインとの結合を阻害する化合物を
同定するのに有用な、本発明のスクリーニング方法の具
体例の略図である。
ロリンリッチな領域とｐ４７−ｐｈｏｘタンパク質中に
含有されるＳＨ３ドメインとの結合を阻害する化合物を
同定するのに有用な、本発明のスクリーニング方法の具
体例の略図である。
【図２】ｐ４７−ｐｈｏｘに含有されるプロリンリッチ
な領域とｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるＳ
Ｈ３ドメインとの結合を阻害する化合物を同定するのに
有用な、本発明のスクリーニング方法の具体例の略図で
ある。
な領域とｐ６７−ｐｈｏｘタンパク質中に含有されるＳ
Ｈ３ドメインとの結合を阻害する化合物を同定するのに
有用な、本発明のスクリーニング方法の具体例の略図で
ある。
【図３】８０nMの組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの最
終濃度について、組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABと組
換えｐ２２−ｐｈｏｘ−Ｅｕｋとの結合を、時間（時
間）の関数として反映するΔＦ比の測定である。
終濃度について、組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABと組
換えｐ２２−ｐｈｏｘ−Ｅｕｋとの結合を、時間（時
間）の関数として反映するΔＦ比の測定である。
【図４】組換えｐ４７−ｐｈｏｘ ＡＢの最終濃度の上
昇について測定したΔＦ比である。
昇について測定したΔＦ比である。
【図５】抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５の増加する量について組
換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの増加する濃度のΔＦ比
測定値。第１の曲線（上の曲線）：８００ng/ウェルの
抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５。第２の曲線：４００ng/ウェル
の抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５。第３の曲線：２００ng/ウェ
ルの抗ＧＳＴ ＸＬ６６５。第４の曲線：１００ng/ウ
ェルの抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５。第５の曲線（下の曲
線）：５０ng/ウェルの抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５を示す。
換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABの増加する濃度のΔＦ比
測定値。第１の曲線（上の曲線）：８００ng/ウェルの
抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５。第２の曲線：４００ng/ウェル
の抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５。第３の曲線：２００ng/ウェ
ルの抗ＧＳＴ ＸＬ６６５。第４の曲線：１００ng/ウ
ェルの抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５。第５の曲線（下の曲
線）：５０ng/ウェルの抗ＧＳＴ−ＸＬ６６５を示す。
【図６】組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABまたは組換え
突然変異ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABを使用したΔＦ比測
定値の比較。上の曲線：野生型組換えｐ４７−ｐｈｏｘ
ＳＨ３ABを使用したΔＦ比測定値。下の曲線：１５６位
のプロリン残基をグルタミンアミノ酸残基で置換して突
然変異した組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABを使用して
得られたΔＦ比測定値を示す。
突然変異ｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABを使用したΔＦ比測
定値の比較。上の曲線：野生型組換えｐ４７−ｐｈｏｘ
ＳＨ３ABを使用したΔＦ比測定値。下の曲線：１５６位
のプロリン残基をグルタミンアミノ酸残基で置換して突
然変異した組換えｐ４７−ｐｈｏｘＳＨ３ABを使用して
得られたΔＦ比測定値を示す。
【図７】未標識ｐ２２−ＥｕＫペプチドによるｐ４７−
ｐｈｏｘＳＨ３ABとｐ２２−ＥｕＫペプチドとの結合の
阻害を示す。Ａ：増加する最終濃度（nM）の未ｐ２２−
ＥｕＫペプチドを測定に加えて得られたΔＦ比測定値を
示す。Ｂ：未標識ｐ２２−ＥｕＫペプチドのＩＣ５０計
算を示す。９６ウェル測定（左の空白の棒）または３８
４ウェル高処理量測定を使用して、増加する濃度のｐ２
２−ＥｕＫペプチド、それぞれ０．４ng/ウェル（２番
目の棒）、０．８ng/ウェル（３番目の棒）、および
１．６ng/ウェル（４番目、すなわち右側の棒）を使用
して、３つの異なる候補化合物で得られたｐ４７−ｐｈ
ｏｘＳＨ３ABとｐ２２−ＥｕＫペプチドとの結合の阻害
パーセントが示される。
ｐｈｏｘＳＨ３ABとｐ２２−ＥｕＫペプチドとの結合の
阻害を示す。Ａ：増加する最終濃度（nM）の未ｐ２２−
ＥｕＫペプチドを測定に加えて得られたΔＦ比測定値を
示す。Ｂ：未標識ｐ２２−ＥｕＫペプチドのＩＣ５０計
算を示す。９６ウェル測定（左の空白の棒）または３８
４ウェル高処理量測定を使用して、増加する濃度のｐ２
２−ＥｕＫペプチド、それぞれ０．４ng/ウェル（２番
目の棒）、０．８ng/ウェル（３番目の棒）、および
１．６ng/ウェル（４番目、すなわち右側の棒）を使用
して、３つの異なる候補化合物で得られたｐ４７−ｐｈ
ｏｘＳＨ３ABとｐ２２−ＥｕＫペプチドとの結合の阻害
パーセントが示される。
【図８】増加する濃度のｐ２２−ＥｕＫペプチドの存在
下で、３つの異なる候補インヒビターによる阻害パーセ
ントの、９６ウェルフォーマットと３８４ウェルフォー
マットの比較を示す。
下で、３つの異なる候補インヒビターによる阻害パーセ
ントの、９６ウェルフォーマットと３８４ウェルフォー
マットの比較を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４
Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｂ
Ｆ
21/78 21/78 Ｃ
33/15 33/15 Ｚ
33/483 33/483 Ｃ
33/53 33/53 Ｄ
33/566 33/566
33/58 33/58 Ｚ
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 イザベル デ メンデ
フランス国 パリ、リュ ボイエ バレ、
19
Ｆターム(参考） 2G043 AA04 BA16 CA03 DA02 EA01
GA07 GB21 KA02 KA03 KA05
LA01
2G045 AA34 AA35 BB20 BB24 BB29
BB41 BB46 BB50 BB51 CB01
DA13 DA36 FA29 FB02 FB03
FB12 GC15
2G054 AA06 AB10 BB08 BB12 BB13
CA23 CE02 EA03 GA04
4B024 AA01 AA11 BA10 BA80 CA02
DA06 HA01
4B063 QA01 QA05 QA18 QQ26 QR48
QR66 QS28 QS36 QX02
4C084 AA17 NA14 ZA451 ZB111
ZB261 ZB351 ZC781
Claims (34)
- 【請求項１】 均一時間分解蛍光法による、プロリンリ
ッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有ペプチドとの相互
作用を阻害する候補化合物のスクリーニング方法であっ
て： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドを含有する緩衝液を提供する工程（ここで、該
第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光
マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナーで
ある）； ｂ）工程ａ）で得られた溶液に候補化合物を加える工
程； ｃ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドを加える工程（ここで、
該第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナー
である）； ｄ）工程ｄ）で得られた混合物を、対のフレット（ＦＲ
ＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーの励起波長に対
応する波長のエネルギー源に付して、対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーの発光波長に
おける蛍光シグナルを測定する工程； ｅ）工程ｅ）で得られた蛍光シグナル値を、工程ｂ）が
無い時に得られた蛍光シグナル値と比較して、候補化合
物が、プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ドメイン含有
ペプチドとの相互作用を阻害するかどうかを決定する工
程、 を含んでなる、上記方法。 - 【請求項２】 第１の蛍光マーカーは対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーであり、第２
の蛍光マーカーはその第２のパートナーである、請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 第１の蛍光マーカーは対のフレット（Ｆ
ＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーであり、第２
の蛍光マーカーはその第１のパートナーである、請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】 対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカー
の第１のパートナーは、ユーロピウムマーカークリプテ
ートである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項５】 対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカー
の第２のパートナーはＸＬ６６５である、請求項１〜４
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、第２の
蛍光マーカーで間接的に標識され、ここで該ＳＨ３ドメ
イン含有ペプチドは、第２の蛍光マーカーを含む標識試
薬に対する特異的親和性を有する検出可能な分子に共有
結合し、該標識試薬は、工程ｃ）で、ＳＨ３ドメイン含
有ペプチドの添加の後に加えられる、請求項１〜５のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 検出可能な分子はグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質である、請求項
６記載の方法。 - 【請求項８】 標識試薬は、第２の蛍光マーカーで標識
されたＧＳＴタンパク質に対する抗体である、請求項６
記載の方法。 - 【請求項９】 プロリンリッチなペプチドは、Ｆｙｎ、
Ａｂｌ、ＣｒｋＮ、Ｓｒｃ、Ｎｓｒｃ、ＰｌＫ、および
Ｎｅｆタンパク質中に含有されるプロリンリッチなペプ
チドの群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項１０】 プロリンリッチなペプチドは、ヒトＮ
ＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２２ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏ
ｘ、およびｐ６７ｐｈｏｘサブユニットタンパク質中に
含有されるプロリンリッチなペプチドの群から選択され
る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】 プロリンリッチなペプチドは、ヒトＮ
ＡＤＰＨオキシダーゼのｐ２２ｐｈｏｘサブユニットタ
ンパク質中に含有されるプロリンリッチなペプチドであ
る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 プロリンリッチなペプチドは、５〜１
００μMの解離定数でＳＨ３ドメインに結合する、約１
０アミノ酸の長さのプロリンリッチなアミノ酸配列を含
む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】 プロリンリッチなペプチドは、「Ｐｒ
ｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ
−Ｘ−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−
＋」、「＋−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ」、およ
び「ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｑ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」（ここで、
Ｘは任意のアミノ酸残基であり、＋はＡｒｇまたはＬｙ
ｓであり、ｑは疎水性アミノ酸である）から選択される
プロリンリッチなアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 プロリンリッチなペプチドは、「Ｒ−
Ｘ−＃−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ」、「−Ｐｒｏ−Ｘ−
Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｒ」、「＋−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ
−Ｐｒｏ」、「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−＋」、
「Ｐｒｏ−Ｘ−＠−Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒ
ｏ」、および「Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｙ」（ここで、Ｘ
は任意のアミノ酸残基であり、＋はＡｒｇまたはＬｙｓ
であり、＠は芳香族または脂肪族アミノ酸残基であり、
＃は芳香族アミノ酸残基である）から選択されるプロリ
ンリッチなアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】 プロリンリッチなペプチドは、配列番
号３のアミノ酸配列からの少なくとも１０個の連続的な
プロリンリッチなアミノ酸を含む、請求項１１〜１４の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】 プロリンリッチなペプチドは、配列番
号３のアミノ酸配列からなる、請求項１１〜１５のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項１７】 プロリンリッチなペプチドは、１０〜
１００アミノ酸の長さを有する、請求項１１〜１６のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１８】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、５５
〜１００アミノ酸の長さを有する、請求項１１〜１７の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ３
ドメインは、ヒトＰ１３Ｋ ｐ８５、マウスＡｂｌ、ヒ
トＦｙｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、シー・エレガ
ンス（C. elegans）ＳＥＭ−５、マウスＧｒｂ２、ヒト
Ｇｒｂ２、マウスｃ−Ｃｒｋ、ヒト５３ＢＰ２、および
ヒトＨｃｋキナーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ド
メインの群から選択される、請求項１〜１８のいずれか
一項に記載の方法。 - 【請求項２０】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ３
ドメインは、ヒトＰ１３Ｋ ｐ８５、ヒトＡｂｌ、ヒト
Ｆｙｎ、ヒトｃ−Ｓｒｃ、ヒトＬｃｋ、ヒトＬｙｎ、ヒ
トＧｒｂ２、ヒトＰＬＣ−γ、ヒト５３ＢＰ２、ヒトＧ
ＡＰ、ヒト５３ＢＰ２、ヒトＣｓｋ、およびヒトＨｃｋ
キナーゼタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメインの群
から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載
の方法。 - 【請求項２１】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ３
ドメインは、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ４７ｐｈ
ｏｘとｐ６７ｐｈｏｘサブユニットタンパク質中に含有
されるＳＨ３ドメインの群から選択される、請求項１〜
１８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２２】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドのＳＨ３
ドメインは、ヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼのｐ４７ｐｈ
ｏｘサブユニットタンパク質中に含有されるＳＨ３ドメ
インである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項２３】 ＳＨ３ドメイン含有ペプチドは、配列
番号４のアミノ酸配列を含む、請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 第１の蛍光マーカーは、対のフレット
（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１のパートナーまたは第
２のパートナーである、第１の蛍光マーカーで標識され
たプロリンリッチなペプチドからなるスクリーニング試
薬。 - 【請求項２５】 第１の蛍光マーカーは、ユーロピウム
クリプテート分子である、請求項２４記載のスクリーニ
ング試薬。 - 【請求項２６】 ユーロピウムクリプテート分子に共有
結合した、配列番号３のアミノ酸配列を有するプロリン
リッチなペプチドからなる、請求項２４または２５に記
載のスクリーニング試薬。 - 【請求項２７】 第２の蛍光マーカーで直接または間接
的に標識されたＳＨ３ドメイン含有ペプチドからなるス
クリーニング試薬であって、第２の蛍光マーカーは、対
のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナ
ーまたは第１のパートナーである、上記試薬。 - 【請求項２８】 第２の蛍光マーカーはＸＬ６６５であ
る、請求項２７記載のスクリーニング試薬。 - 【請求項２９】 プロリンリッチなペプチドとＳＨ３ド
メイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化合物
をスクリーニングするためのキットであって： ａ）第１の蛍光マーカーで標識されたプロリンリッチな
ペプチドからなる第１のスクリーニング試薬（ここで、
該第１の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍
光マーカーの第１のパートナーまたは第２のパートナー
である）； ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチドからなる第２のスクリー
ニング試薬（ここで、第２の蛍光マーカーは、対のフレ
ット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第２のパートナーまた
は第１のパートナーである）、を含む上記キット。 - 【請求項３０】 ＧＳＴタンパク質に融合した、配列番
号４のアミノ酸配列を有するＳＨ３ドメイン含有ペプチ
ドからなる、請求項２７または２８に記載のスクリーニ
ング試薬。 - 【請求項３１】 ａ）第１の蛍光マーカーで標識された
プロリンリッチなペプチド（ここで、該第１の蛍光マー
カーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１
のパートナーまたは第２のパートナーである）；および
ｂ）第２の蛍光マーカーで直接または間接的に標識され
たＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここで、第２の蛍光マ
ーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第
２のパートナーまたは第１のパートナーである）、 とで形成される複合体。 - 【請求項３２】 ａ）第１の蛍光マーカーで標識された
プロリンリッチなペプチド（ここで、該第１の蛍光マー
カーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）蛍光マーカーの第１
のパートナーまたは第２のパートナーである）；および ｂ）ａ）で定義されたプロリンリッチなペプチドとＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、 とで形成される複合体。 - 【請求項３３】 ａ）第２の蛍光マーカーで直接または
間接的に標識されたＳＨ３ドメイン含有ペプチド（ここ
で、第２の蛍光マーカーは、対のフレット（ＦＲＥＴ）
蛍光マーカーの第２のパートナーまたは第１のパートナ
ーである）；および ｂ）プロリンリッチなペプチドとａ）で定義されたＳＨ
３ドメイン含有ペプチドとの相互作用を阻害する候補化
合物、 とで形成される複合体。 - 【請求項３４】 医薬組成物を製造するための、請求項
１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従って選択され
る候補化合物の使用。
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|---|---|---|---|
| EP01402064.8 | 2001-07-30 | ||
| EP01402064A EP1281962A1 (en) | 2001-07-30 | 2001-07-30 | Method for the screening of compounds that inhibit the interaction between a proline-rich peptide and an SH3 domain comprising peptide |
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|---|---|
| JP2003185655A true JP2003185655A (ja) | 2003-07-03 |
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP2003185655A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007069604A1 (ja) * | 2005-12-14 | 2007-06-21 | National University Corporation Hokkaido University | 修飾蛋白質の製造方法 |
| WO2023032994A1 (ja) * | 2021-08-31 | 2023-03-09 | 富士フイルム株式会社 | 化合物及びこれを用いた標識生体物質 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2001525535A (ja) * | 1997-09-04 | 2001-12-11 | ボード オブ トラスティーズ オブ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 細胞骨格機能のモジュレーターを検出するためのアッセイ |
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-
2001
- 2001-07-30 EP EP01402064A patent/EP1281962A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-07-29 JP JP2002255835A patent/JP2003185655A/ja not_active Abandoned
- 2002-07-29 CA CA002395992A patent/CA2395992A1/en not_active Abandoned
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2395992A1 (en) | 2003-01-30 |
| EP1281962A1 (en) | 2003-02-05 |
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