KR102628529B1 - 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법{Method for screening of Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate dimerization inhibitor}
본 발명은 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
단백질 티로신 탈인산화효소(Protein Tyrosine Phosphatase, PTP)와 단백질 티로신 인산화효소(Protein Tyrosine Kinase, PTK)는 서로 가역적으로 티로신 잔기를 탈인산화/인산화하는 반응을 촉매하는데, 인간 단백질의 전체 인산화된 아미노산 잔기 중에서 1.8%만이 인산화된 티로신 잔기로, 매우 적은 비율에 해당하나 이러한 가역적 반응에 관여하는 PTP/PTK의 비중은 전체 인산화/탈인산화 효소의 상당 부분을 차지하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 효소들은 Insulin, EGF, Wnt 등과 밀접한 관련이 있어, 세포 분화, 성장, 면역 등 대다수의 세포 신호 전달에 관여하고 있다.
그 중에서도, 단백질 티로신 탈인산화효소는 약 200여 종이 알려져 있고, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소는 21종으로 알려져 있다. 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소는 다양한 기전을 통해 암 등의 질병과 연관되어 있는 것으로 보고되어 왔다. 대표적인 암 억제 인자이자 항염증 인자인 PTPRT의 경우, STAT3를 탈인산화하여 비활성화 시키기 때문에 매우 중요한 암 억제 및 항염증 인자로 알려져 있는데, 암 환자 샘플 통계에서도 유방암을 제외한 대다수의 암에서 이의 돌연변이가 발견되었다. 또한, 환자 시료 71841개를 분석한 데이터를 살펴보면, 잘 알려진 암 억제 인자인 PTPRT의 돌연변이를 분석한 결과 이 단백질의 아미노산 치환 돌연변이는 약 2440개의 시료에서 나타났고, 단백질 내 돌연변이가 발생한 아미노산 잔기의 분석 결과, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 동종이량체화에 의해 효소의 활성 저해가 나타날 것이라는 점을 간접적으로 확인할 수 있었다.
따라서, 돌연변이 등으로 인해 활성이 저해된 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 활성을 다시 증가시키기 위한 물질이나 약제를 개발할 경우 암 등 관련 질환의 치료제로 이용할 수 있을 것으로 전망되는데, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 활성화 부위는 다른 단백질 티로신 탈인산화효소(PTP)의 활성화 부위와 유사하여, 특이성이 높은 물질을 고속으로 스크리닝하기 어렵다는 문제점이 있다. 이에, 활성화 부위와의 특이성이 아닌, 상기 효소의 구조적 특성이나 단백질-단백질 상호작용(PPI) 등 다른 특성을 이용하여 상기 효소의 활성을 조절하는 물질을 높은 정확도로 손쉽게 스크리닝할 수 있는 기술에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다.
본 발명은 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소가 이량체를 형성하는 것을 억제할 수 있는 물질을 신속하고 정확하게 스크리닝해 내기 위한 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소(Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate; PTPR)의 세포 내 도메인 및 이량체(dimer) 형성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질;을 동종이량체(homo-dimer)의 형태로 포함하는, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 스크리닝용 조성물을 포함하는 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 스크리닝용 조성물에 후보물질을 첨가하는 단계; 및 탈인산화효소의 활성도를 측정하는 단계;를 포함하는, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소가 이량체를 형성하는 것을 억제함으로써 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 활성이 증가하거나 정상화되도록 하는 물질을 스크리닝하기 위한 조성물 또는 방법에 관한 것이다. 종래의 일반적인 고속 탐색(Hight Throughput Screening, HTS) 시스템을 통한 스크리닝 시에는, 수용체형 효소와 그렇지 않은 효소의 활성화 부위가 유사한 구조를 지녀, 특이적 활성 조절물질을 발굴하는 데 어려움이 있었으나, 본 발명에서는 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 이용함으로써 억제제를 스크리닝하는 새로운 방법을 구축할 수 있었다.
또한 본 발명에서는, 동종이량체를 형성하는 융합 단백질을, 하나가 아닌 2종 이상으로 제조하여 교차검증에 이용할 수 있게 됨으로써 스크리닝의 정확도와 신뢰도를 높일 수 있었으며, 단량체를 형성하는 대조군 단백질도 제조하여 데이터의 신뢰도를 높이고 검증의 다각화를 통해 더욱 적합하고 특이적인 활성 조절 물질을 발굴할 수 있다는 효과가 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 스크리닝 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 GST 및 EcMukFN 단백질이 이량체를 형성하는 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 GST-PTPRT 융합 단백질 및 GST-PTPRA 융합 단백질을 크기 배제 컬럼을 통해 정제하여, 동종이량체를 형성하고 있는지 여부를 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 MukFN-PTPRT 융합 단백질을 크기 배제 컬럼을 통해 정제하여, 동종이량체를 형성하고 있는지 여부를 확인한 것이다.
도 5는 상기 GST-PTPRA를 이용하여 pNPP 어세이를 통해 이의 탈인산화효소 활성을 pH 별 흡광도 측정을 통해 확인하여 비교한 그래프이다.
도 6은 GST-PTPRT에서 상기 GST와 PTPRT를 연결하는 링커 길이에 따른 탈인산화효소 활성의 차이를 pNPP 어세이를 통해 측정하여 비교한 그래프이다.
도 7은 Halo 태그와 PTPRA를 연결시킨 대조군 단백질, GST와 PTPRA를 연결시킨 융합 단백질, 그리고 MukFN 단백질과 PTPRA를 연결시킨 융합 단백질을 이용해 탈인산화효소 활성의 차이를 pNPP 어세이를 통해 측정하여 비교한 그래프이다.
도 8은 Halo-PTPRT 대조군 단백질을 크기 배제 컬럼을 통해 정제하여, 단량체를 형성하고 있는지 여부를 확인한 것이다.
도 9는 GST와 PTPRT를 아미노산 4개의 링커로 연결시킨 대조군 단백질 및 Halo-PTPRT 대조군 단백질을 이용해 탈인산화효소 활성의 차이를 pNPP 어세이를 통해 측정하여 비교한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법을 통해, 6,423개 후보물질로부터 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제를 스크리닝하기 위해 설정한 플레이트 구조 및 시료 배치를 나타낸 모식도로, 아래에는 활성도를 계산하기 위한 식을 나타냈다.
도 11은 도 10에 따른 스크리닝 방법으로 1차 ~ 3차에 따라 후보물질을 선별하는 과정을 나타낸 것으로, 탈인산화효소 활성에 따라 후보물질을 분류하여 나타냈다.
도 12는 3차 선별된 60종의 화합물을 대상으로, 본 발명의 융합 단백질 2종을 이용해 탈인산화효소 활성을 다시 측정하여 비교한 그래프로, 최종 3종의 억제제를 선별하였다.
도 13은 상기 도 12에 따라 선별된 3종의 화합물을 이용하여, 각 화합물의 농도에 따른 탈인산화효소 활성의 변화를 측정하여 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 조성물 및 키트
본 발명의 일 측면은 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제를 스크리닝하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소(Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate; PTPR)의 세포 내 도메인 및 이량체(dimer) 형성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질;을 동종이량체(homo-dimer)의 형태로 포함한다.
상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소(Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate; PTPR)는 티로신 잔기로부터 탈인산화 반응을 촉매하는 단백질로, 세포 외 도메인 및 세포 내 도메인으로 이루어져 있다. 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소는 동일한 두 단백질이 이량체를 형성할 때, 즉 동종이량체의 형태를 형성할 때, 이의 효소 활성이 억제될 수 있으며, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소가 본래의 효소 활성을 잃어 기능이 저하될 경우 다양한 기전을 통해 암 등의 질환에 영향을 미칠 수 있다.
상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소는, PTPRA, PTPRB, PTPRC, PTPRD, PTPRE, PTPRF, PTPRG, PTPRH, PTPRJ, PTPRK, PTPRM, PTPRN, PTPRN1, PTPRO, PTPRQ, PTPRR, PTPRS, PTPRT, PTPRU, PTPRZ 및 PTPRZ1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있다.
상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 효소 활성을 나타내 탈인산화 반응을 촉매할 수 있는 도메인을 포함하는 것일 수 있으며, 또한 상기 세포 내 도메인이 이량체화되었을 때 상기 효소 활성이 저해되도록 하는 부위를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인은 활성화 도메인(D1) 및 pseudo 도메인(D2)을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 이량체 형성 폴리펩타이드는, 구조적으로 이량체를 형성할 수 있는 특성을 가지는 폴리펩타이드는 제한없이 이용될 수 있으며, 상기 이량체 형성 폴리펩타이드가 이량체를 형성할 때 이에 연결된 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인도 함께 이량체를 형성할 수 있도록 할 수 있는 폴리펩타이드이다. 구체적으로, 상기 이량체 형성 폴리펩타이드는, GST (glutathione S-transferase), MukF 단백질의 N-말단 도메인(MukFN), Smc 단백질의 힌지(hinge) 도메인 등일 수 있다. 상기 MukF 단백질의 N-말단 도메인은 대장균 유래의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 GST는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 대장균 유래의 MukF 단백질의 N-말단 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소 및 상기 이량체 형성 폴리펩타이드는 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되어 융합 단백질에 포함될 수 있다. 상기 이량체 형성 폴리펩타이드는 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 N-말단에 연결되는 것일 수 있다.
상기 융합 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 및 이량체 형성 폴리펩타이드가 7개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결된 것일 수 있으며, 구체적으로 7개 내지 25개, 9개 내지 23개, 15개 내지 23개, 17개 내지 23개 또는 20개의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결된 것일 수 있다. 링커의 길이가 상기 범위일 경우, 상기 융합 단백질이 동종이량체의 형태로 존재하여 탈인산화효소 활성이 더 적게 나타나, 이량체화 억제제 스크리닝의 정확도가 더 높아질 수 있다는 장점이 있다. 상기 링커를 이루는 아미노산은 그 종류에 제한되지 않으며, 예컨대 상기 링커를 이루는 아미노산은 20종의 아미노산이 모두 사용될 수 있어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 프롤린, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 등일 수 있다. 또한, 상기 링커는 한 종류의 아미노산이 반복하여 사용되거나 여러 종류의 아미노산이 다양한 조합을 이루어 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 링커의 길이가 4개일 경우 상기 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 링커의 길이가 9개일 경우 상기 링커는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 링커의 길이가 14개일 경우 상기 링커는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 링커의 길이가 17개일 경우 상기 링커는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 링커의 길이가 20개일 경우 상기 링커는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 링커의 길이가 23개일 경우 상기 링커는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
앞서 설명한 아미노산 서열들은, 이를 포함하는 폴리펩타이드의 구조, 기능, 활성 등에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열들은 당업계에 알려진 통상적인 변형이 일어난 아미노산을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 아미노산 변형은 예컨대 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등일 수 있다. 또한, 앞서 설명한 아미노산 서열들을 포함하는 것뿐만 아니라, 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이나 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것의 의미는, 앞서 설명한 아미노산 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 이량체 형성 폴리펩타이드는, 동종의 다른 이량체 형성 폴리펩타이드와 동종이량체를 형성하는 특성이 있으므로 이를 포함하는 상기 융합 단백질도 동종이량체의 형태를 이룰 수 있으며, 본 발명의 조성물에는 상기 융합 단백질이 동종이량체의 형태로 포함된다. 이량체 형성 폴리펩타이드가 동종이량체를 형성함에 따라, 이와 구조적으로 연결된 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 역시 동종이량체를 형성하게 되고, 이에 따라 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 본래 효소 활성, 즉 탈인산화효소 활성이 억제되거나 제거될 수 있다.
본 발명에서는 상기 융합 단백질이 동종이량체를 형성함에 따라 상기 탈인산화효소 활성이 억제되는 현상을 이용하여, 상기 이량체화를 다시 억제함으로써 상기 융합 단백질을 단량체 형태가 되도록 유도할 수 있는 이량체화 억제제를 스크리닝할 수 있다. 따라서, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제는 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 활성화 물질일 수 있으며, 돌연변이 등으로 인해 이량체화되어 효소 활성이 억제된 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 활성을 회복시켜 정상화시킬 수 있는 물질일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인을 포함하는 대조군 단백질;을 단량체(monomer)의 형태로 더 포함할 수 있다.
상기 대조군 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인이 Halo 태그와 연결된 것일 수 있다. 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소 및 상기 Halo 태그는 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되어 대조군 단백질에 포함될 수 있다. 상기 Halo 태그는 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 N-말단에 연결되는 것일 수 있다.
또한, 상기 대조군 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 및 이량체 형성 폴리펩타이드가 2개 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결된 것일 수 있다. 상기 이량체 형성 폴리펩타이드, 링커에 대한 설명은 전술한 바와 같으나, 상기 대조군 단백질에 포함되는 링커의 길이는 상기 융합 단백질에 포함되는 링커와 서로 다를 수 있다. 구체적으로, 상기 대조군 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 및 이량체 형성 폴리펩타이드가 2개 내지 6개, 2개 내지 5개, 3개 내지 5개, 3개 내지 4개 또는 4개의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결된 것일 수 있다. 링커의 길이가 상기 범위일 경우, 상기 대조군 단백질이 단량체의 형태로 존재하여 탈인산화효소 활성이 억제되지 않고 높게 나타나, 상기 활성을 이량체화 억제제의 스크리닝 과정에서 대조군 데이터로 활용하기에 적합한 장점이 있다.
상기 대조군 단백질은 단량체의 형태로 존재하므로, 탈인산화효소 활성이 억제되지 않고 정상적으로 나타나거나 상기 동종이량체 형태의 융합 단백질의 효소 활성에 비해 더 높게 나타나는바, 상기 대조군 단백질로부터 측정된 효소 활성을 스크리닝 과정에서 대조군 데이터로 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 후보물질을 상기 대조군 단백질이 포함된 조성물에 처리하였을 때 활성의 변화를 유발하지 않는 물질을 선별함으로써 스크리닝 과정 중 선별 기준으로 고려할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, PTPRA 및 PTPRT의 세포 내 도메인을 GST와 융합시킨 융합 단백질, 그리고 PTPRA의 세포 내 도메인과 EcMukFN을 융합시킨 융합 단백질이 동종이량체를 형성하고 탈인산화효소 활성이 저해되어 있음을 확인하였으며, 또한 PTPRA의 세포 내 도메인이 Halo 태그와 융합되어 있거나 아미노산 4개로 이루어진 링커로 GST 및 PTPRT의 세포 내 도메인이 연결될 경우 단량체로 존재하며 탈인산화효소 활성이 감소되지 않거나 상대적으로 높게 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 동종이량체를 형성하는 본 발명의 융합 단백질과 단량체를 형성하는 대조군 단백질을 이용할 경우, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화를 억제하는 물질을 스크리닝하기 위해 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 키트는, 상기 스크리닝용 조성물을 포함한다. 상기 스크리닝용 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 동일하다.
상기 키트는, 조성물 이외에 탈인산화효소의 활성을 측정하기 위해 적합한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 pNPP(p-nitrophenylphosphate) 어세이 또는 DiFMUP(6,8-Difluoro-4-Methylumbelliferyl Phosphate) 어세이를 수행하기 위한 성분, 완충용액, 장치, 설명서 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 키트는 각 시료 별로 탈인산화효소 활성을 측정하기 위한 플레이트를 더 포함할 수 있다.
2. 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 측면은 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법은, 상기 스크리닝용 조성물에 첨가하는 단계; 및 탈인산화효소의 활성도를 측정하는 단계;를 포함한다.
상기 스크리닝용 조성물, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소, 이의 세포 내 도메인, 이량체 형성 폴리펩타이드, 융합 단백질, 대조군 단백질 등에 관한 설명은 전술한 “1. 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 조성물 및 키트”에서 기재한 것과 동일하다.
본 발명의 스크리닝 방법은, 탈인산화효소의 활성도를 측정한 결과, 상기 융합 단백질에 의한 활성이 증가되는 경우 상기 후보물질이 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화를 억제하는 물질인 것으로 판정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 스크리닝용 조성물에는 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인을 포함하는 융합 단백질이 동종이량체의 형태로 포함되어 있어 탈인산화효소 활성이 저해되거나 제거된 상태로 존재하는데, 상기 조성물에 처리된 후보물질이 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화를 억제하는 물질일 경우 상기 융합 단백질의 이량체화를 억제함으로써 융합 단백질을 단량체 형태로 만들게 되고, 이에 따라 융합 단백질에 포함된 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 부분도 단량체가 됨에 따라 다시 탈인산화효소 활성이 증가하게 된다. 따라서, 후보물질을 처리하기 전에 융합 단백질로부터 측정한 탈인산화효소 활성에 비해, 후보물질을 처리한 후에 융합 단백질로부터 측정한 탈인산화효소 활성이 더 높다면, 상기 후보물질을 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화를 억제하는 물질인 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은, 전술한 대조군 단백질이 포함된 조성물을 이용할 경우 스크리닝의 정확도를 더욱 높일 수 있다. 상기 대조군 단백질은 단량체를 유지하여 탈인산화효소 활성이 정상적으로 유지되거나 상대적으로 활성이 높게 나타날 수 있는바, 상기 대조군 단백질의 탈인산화효소 활성 측정 결과를 상기 융합 단백질의 탈인산화효소 활성 측정 결과와 비교함으로써 후보물질이 이량체화 억제 활성을 가지는지 여부를 스크리닝할 때 그 정확성과 신뢰도를 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 대조군 단백질이 포함된 조성물에 후보물질을 처리한 다음, 대조군 단백질의 탈인산화효소 활성도를 측정하여, 활성의 변화가 나타나지 않을 경우, 상기 후보물질이 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화를 억제하는 물질일 가능성이 더 높은 것으로 판정하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 만약 후보물질이 단량체를 형성하는 대조군 단백질의 탈인산화효소 활성을 변화시킨다면, 이는 이량체화 억제와는 무관하게 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소에 영향을 미치는 물질일 수 있으므로, 이러한 후보물질은 제외시킬 수 있다.
상기 탈인산화효소의 활성도를 측정하는 단계는, pNPP 어세이를 수행하는 단계를 포함하거나 또는 DiFMUP 어세이를 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 탈인산화효소의 활성을 측정할 수 있는 당업계에 알려진 어떠한 방법이라도 적절히 선택되어 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 스크리닝용 조성물에 6,423개의 다양한 종류의 후보물질을 처리한 다음 pNPP 어세이를 수행하여 탈인산화효소 활성도를 측정하여 비교함으로써, 1차적으로 358개 화합물을, 2차적으로 252개 화합물을, 3차적으로 60개 화합물을 선별할 수 있었으며, 그 중에서 최종 3개 화합물을 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제 활성을 갖는 물질로 선별하였다. 구체적인 실험 과정은 도 10 및 도 11을 참조할 수 있으며, 하나 이상의 융합 단백질을 이용해 교차검증하거나, 대조군 단백질을 이용해 교차검증을 수행함으로써, 보다 높은 정확도로 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제를 스크리닝할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[실험예 1] 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 동종이량체 형성을 유도하는 융합 단백질의 제조 및 활성 저해 효과 확인
[1-1] 동종이량체를 형성하는 융합 단백질의 제조
수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소(Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate, 이하 'PTPR')는 다양한 기전을 통해 암 등의 질환과 관련된 단백질로 알려져 있는데, 종래 PTPR은 이의 동종이량체화(homo-dimerization)에 의해 활성이 저해된다는 연구 결과가 보고되어 있으며, 돌연변이에 의한 PTPR의 동종이량체화가 암의 발생과 관련성이 있다는 연구 결과가 제시되어 왔다.
이에, 본 발명에서는 상기 PTPR의 이량체화를 저해하는 물질을 스크리닝함으로써 이를 암 등 관련 질환의 치료제로 이용하기 위하여, 먼저 항상 동종이량체를 형성할 수 있는 PTPR의 융합 단백질을 제조하였다.
구체적으로, PTPR 단백질의 세포 내 도메인이 세포막으로부터 평행하게 내려와 구조적으로 이량체를 형성하기 용이하게 되는 특성을 이용해, 상기 PTPR 단백질의 세포 내 도메인을, 이량체 형성 폴리펩타이드와 융합시켜 융합 단백질을 제조하였다. 상기 이량체 형성 폴리펩타이드로는 GST(glutathione S-transferase) 및 대장균 유래의 MukF 단백질의 N-말단 도메인(EcMukFN)을 이용하여 총 2종의 이량체 형성 폴리펩타이드를 이용하였다. 상기 PTPR 중에서 PTPRT 및 PTPRA의 세포 내 도메인의 N-말단에 상기 GST를 각각 융합시켜 본 발명의 융합 단백질을 제조하였고, 또한 PTPR 중 PTPRT의 세포 내 도메인의 N-말단에 상기 대장균의 MukF 단백질의 N-말단 도메인을 융합시켜 융합 단백질을 제조하였다(도 2). 상기 이량체 형성 폴리펩타이드와 PTPR의 세포 내 도메인은 Tev 프로테아제에 의해 인식되어 절단될 수 있는 부위를 포함하는 링커로 연결하여 융합시켰다.
그리고, 상기와 같이 제조된 3종의 융합 단백질은, 크기 배제 컬럼(size exclusion column)을 이용해 정제하였고, 280 nm의 파장으로 흡광도를 측정하고 전기영동을 수행함으로써, 각각의 융합 단백질이 동종이량체를 형성했는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 이량체 형성 폴리펩타이드로 GST를 융합시킨 PTPRT 및 PTPRA의 융합 단백질의 경우, 약 200 kDa의 분자 위치에서 단백질이 확인되어 동종이량체를 성공적으로 이루고 있는 것임을 확인할 수 있었다(도 3). 그리고, 이량체 형성 폴리펩타이드로 EcMukFN 단백질을 PTPRT와 융합시킨 융합 단백질의 경우에도 약 200 kDa의 분자량을 나타내는 위치에서 검출되어 동종이량체를 형성함을 확인할 수 있었다(도 4).
따라서, 상기와 같이 이량체 형성 폴리펩타이드와 PTPR을 융합시켜 제조한 융합 단백질의 경우, 구조적으로 동종이량체를 형성하므로 PTPR의 활성, 기능이 낮을 것으로 기대되며, 후보물질에 의해 이러한 이량체화가 억제될 경우 다시 온전한 PTPR의 활성을 나타낼 수 있는바 이를 PTPR의 이량체화 억제제를 스크리닝하기 위한 용도, 더 나아가 이를 이용한 암 치료제를 스크리닝하기 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[1-2] GST와 융합된 융합 단백질의 PTPR 활성 저해 효과 확인
상기 실험예 1-1을 통해 이량체 형성 폴리펩타이드로 GST를 활용해 PTPRA의 세포 내 도메인과 융합시킨 GST-PTPRA 융합 단백질이 동종이량체를 형성함을 확인한 것에 더하여, 상기 융합 단백질의 탈인산화효소 활성이 실제로 충분히 저해되어 나타나는지 여부를 확인하였다. 이를 위해, 히스티딘 태그와 결합된 His10-GST-PTPRA의 동종이량체와, GST를 융합시키지 않은 His10-PTPRA 단백질을 각각 정제하여 이들의 탈인산화효소 활성을 측정하기 위해 pNPP(p-nitrophenylphosphate) 어세이를 수행하였다. pNPP 어세이는, 티로신 잔기와 비슷한 화학적 구조를 가진 pNP에 인산기가 결합한 형태인 pNPP를 기질로 이용하여 탈인산화효소인 PTPR의 활성을 측정하는 방법으로, 탈인산화효소인 PTPR와 기질인 pNPP를 37 ℃에서 1시간 반응시킴으로써, 탈인산화효소에 의해 pNPP의 인산기가 떨어져 나가 형성된 pNP가 염기성 상태에서 노란색을 띄게 되고 이를 측정함으로써 PTPR의 활성을 측정할 수 있다. 37 ℃의 온도로 1시간 반응 후에 1 M NaOH를 처리해 준 다음, 이를 405 nm 파장으로 측정하여 그 값으로 PTPR의 활성을 확인하였다.
pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0의 조건에서 각각 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 탈인산화효소의 활성을 측정하여 비교한 결과, GST와 융합되지 않아 단량체 형태를 가지는 His10-PTPRA에서는 효소 활성이 높게 측정되었으나, 본 발명의 GST-PTPRA 융합 단백질에서는 대조군에 비해 효소 활성이 현저하게 감소되었다(도 5). 특히, pH 6.0 조건에서 측정된 효소 활성을 비교하였을 때 His10-PTPRA의 활성은 GST-PTPRA 융합 단백질의 활성보다 약 1.84배 높은 것으로 측정되어, 본 발명의 융합 단백질은 이량체를 형성함으로써 탈인산화효소 활성이 충분히 억제되었음을 확인할 수 있었다. 따라서, GST와 융합시킨 PTPR은 탈인산화효소 활성이 억제되어, 이의 이량체화를 다시 억제함으로써 활성을 회복할 수 있는 활성화 물질의 스크리닝에 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실험예 1-1을 통해 제조했던 GST와 PTPRT의 세포 내 도메인의 융합 단백질을, 링커 길이를 달리해 각각의 탈인산화효소 활성을 측정하여 비교하였다. 구체적으로, GST와 PTPRT 단백질을 각각 4개, 9개, 17개, 20개 및 23개 길이의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결되도록 융합 단백질을 제조한 다음, 각 융합 단백질을 30 nM, 50 nM, 75 nM 및 100 nM의 농도 별로 이들의 효소 활성을 pNPP 어세이를 통해 측정하여 비교하였다. 음성대조군(control)에서는 상기 융합 단백질을 첨가하지 않고 pNPP 기질만을 처리하여 활성을 확인하였다.
그 결과, GST와 PTPRT의 세포 내 도메인이 9개, 17개, 20개 및 23개 아미노산 길이의 링커로 각각 연결된 융합 단백질의 경우, 탈인산화효소 활성이 저해된 것으로 확인되어, 동종이량체를 성공적으로 형성함을 확인할 수 있었다. 따라서, PTPRA뿐만 아니라 PTPRT의 경우에도 GST와 연결되어 융합 단백질을 형성하였을 때 효소 활성이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 그 링커의 길이가 9 내지 23개 아미노산 길이일 때 성공적으로 이량체를 형성할 수 있고 특히 링커가 20개 아미노산 길이일 때 활성 억제가 가장 우수하게 나타남을 확인할 수 있었다(도 6).
[1-3] MukF의 N-말단 도메인과 융합된 융합 단백질의 PTPR 활성 저해 효과 확인
나아가, 대장균 유래의 MukF의 N-말단을 PTPRA와 융합시킨 융합 단백질을 대상으로, 상기 실험예 1-2와 마찬가지로 pNPP 어세이를 수행함으로써 탈인산화효소 활성이 억제되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 Halo 태그와 PTPRA를 융합시킨 단백질을 이용하였고, GST-PTPRA 및 EcMukFN-PTPRA 융합 단백질의 효소 활성을 측정하여 비교하였다.
그 결과, Halo 태그와 연결된 PTPRA 단백질의 경우 탈인산화효소 활성이 높게 나타난 것에 반해, GST나 MukF 단백질과 융합시킨 융합 단백질의 경우 효소 활성이 현저하게 감소되어 상기 Halo 태그를 이용한 경우의 절반 이하 수준으로 활성이 줄어든 것으로 나타났다(도 7). MukF 태그를 이용한 경우에는 GST 태그를 이용한 융합 단백질보다도 탈인산화효소 활성이 더 낮게 측정되었는바, 본 발명의 스크리닝 시스템에 MukF 태그를 이용한 융합 단백질을 유용하게 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 단량체를 형성하는 대조군 단백질의 제조 및 효소 활성 확인
상기 실험예 1을 통해, 항상 동종이량체를 형성해 효소 활성이 억제된 융합 단백질을 제조한 것에 더하여, 상기 융합 단백질을 활용한 스크리닝 시스템의 신뢰도를 향상시키기 위하여, 단량체를 유지하는 대조군 단백질을 제조하였다. 다만, 통상적으로 이용된 His 태그의 경우 그 크기가 1.4 kDa에 불과하여 매우 작으므로, His-GST 태그의 27.2 kDa에 비해 분자량이 약 25.8 kDa의 차이가 발생하여, pNPP 어세이를 통한 탈인산화효소 활성을 측정하는 과정에서 정확한 몰 농도를 맞추기 어렵다는 단점이 있어 His 태그만을 PTPR에 연결시킨 융합 단백질은 대조군 단백질로 이용하기에 부적절한 문제점이 있다.
이에, 상기 GST와 융합된 융합 단백질과 크기가 유사한 대조군 단백질을 제조하여 탈인산화효소 활성을 확인하였다.
[2-1] 6개 아미노산 이하의 링커 길이로 GST 및 PTPR을 연결시킨 대조군 단백질의 제조
GST 단백질이 이량체를 형성함에 있어, C-말단에 50 Å 정도의 거리가 있으므로, GST와 융합된 PTPR의 이량체화를 방지하기 위하여, GST와 PTPR 사이의 링커 길이를 조절하여 단백질을 제조한 다음, 이들의 활성을 비교하였다.
상기 실험예 1-2에서 확인한 것과 같이, GST 및 PTPRT의 세포 내 도메인을 다양한 길이의 링커를 통해 연결시켜 융합 단백질을 제조한 다음, 이들의 탈인산화효소 활성을 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 링커의 길이가 9개, 17개, 20개, 23개 아미노산 길이인 융합 단백질에서는 효소 활성이 감소되어 나타났으나, 링커의 길이가 6개 이하인 융합 단백질, 보다 구체적으로 링커 길이가 아미노산 4개의 길이로 형성된 융합 단백질에서는 효소 활성의 저해가 전혀 나타나지 않았다.
따라서, GST를 이용해 PTPR의 세포 내 도메인을 융합시키고자 할 때, 링커의 길이를 6개 아미노산 이하로 설정하여 연결할 경우 단량체를 형성하여 탈인산화효소 활성이 정상적으로 나타나는바, 본 발명의 스크리닝 시스템에서, 링커 길이 6개 아미노산 이하인 GST 융합 단백질을 대조군 단백질로 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[2-2] Halo 태그 및 PTPR을 연결시킨 대조군 단백질의 제조
또한, His-GST 태그(27.2 kDa)와 분자량이 유사한 Halo 태그(35.1 kDa)를 PTPR의 세포 내 도메인과 융합하여 His10-Halo-PTPRT의 대조군 단백질을 제조하였다. 이를 대상으로 크기 배제 컬럼으로 분석한 결과, 단량체를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다(도 8).
그리고, 상기 Halo 태그와 융합된 단량체의 PTPRT를 이용하여 이의 탈인산화효소 활성을 측정하였다. 이 때, 상기 실험예 2-1을 통해 GST와 PTPRT를 아미노산 4개 길이의 링커로 연결시켜 단량체를 형성하도록 했던 대조군 단백질과 함께 효소 활성을 측정하여 비교하였다. 그 결과, Halo 태그를 융합시킨 PTPRT는 상기 아미노산 4개 길이의 링커로 연결된 GST-PTPRT보다는 활성이 낮게 측정되었으나, 이와 유사한 수준의 활성을 나타내어 활성의 억제 현상이 나타나지 않음을 확인할 수 있었으며(도 9), 따라서 본 발명의 스크리닝 시스템에서 대조군 단백질로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 본 발명의 스크리닝 방법을 이용한, PTPR의 이량체화 억제제 물질의 스크리닝
상기 실험예 1을 통해 동종이량체를 형성하여 탈인산화효소 활성이 저해되는 것으로 확인된 본 발명의 융합 단백질(GST-PTPRT, 아미노산 20개 길이의 링커), 그리고 실험예 2를 통해 단량체를 형성해 효소 활성이 저해되지 않는 것으로 확인된 대조군 단백질(His10-Halo-PTPRT)을 이용하여, PTPR의 이량체화를 억제하는 제제를 스크리닝하였다. 한국화학연구원 화합물 은행의 대표 화합물 라이브러리 6,423개 물질을 후보물질로 하여, 도 10에 따라 각 시료를 플레이트에 배치하고 pNPP 어세이를 통해 활성도를 측정/계산하여 비교하였다.
먼저, 상기 이량체 형태의 융합 단백질을 이용한 1차 스크리닝 결과, PTPR의 활성을 다시 증가시키는 물질로 358개 화합물을 발굴하였다. 구체적으로, 화합물을 처리하지 않은 상태에서 이량체를 형성한 융합 단백질에서 측정된 활성도 대비, 활성도가 15% 내지 20% 증가된 물질 57개, 활성도가 20% 내지 30% 증가된 물질 218개, 활성도가 30% 내지 40% 증가된 물질 70개, 그리고 활성도가 40% 내지 55% 증가된 물질 13개로 분류하였다(도 11).
2차 스크리닝을 위해서는, 상기 358개 화합물을 대상으로, 상기 대조군 단백질(His10-Halo-PTPRT)을 이용한 교차검증을 수행하였고, 그 결과 358개 화합물 중에서 106개 물질의 경우 5% 이상의 활성 증가가 확인되었으나, 252개 물질의 경우 활성에 변화가 나타나지 않았는바, 대조군 단백질에서 활성 변화를 일으킨 물질을 제외하여 252개 물질을 2차적으로 선별하였다(도 11).
나아가, 상기 2차 스크리닝된 물질을 대상으로, His10-EcMukFN-PTPRT 융합 단백질을 이용해 3차 스크리닝을 수행하여 활성을 증가시킨 화합물을 다시 선별하였다. 그 결과, 3차 스크리닝 과정에서 상기 MukF 단백질과 융합된 융합 단백질의 효소 활성을 증가시킨 60종의 화합물을 3차 선별할 수 있었다(도 11).
마지막으로, 상기 GST-PTPRT(링커 길이 20) 융합 단백질 및 EcMukFN-PTPRT 융합 단백질의 농도를 35 nM로 증가시키고, 상기와 같이 3차 선별된 화합물들의 농도를 20 μM의 농도로 하여, 효소 활성도를 측정하여 스크리닝을 수행한 결과, 2가지 융합 단백질 모두에서 활성을 증가시키는 화합물 3개를 최종적으로 선별할 수 있었다(도 12).
최종적으로 선별된 3개 화합물을 이용해, 화합물들의 농도를 0 ~ 50 μM 또는 0 ~ 100 μM으로 달리하면서, 본 발명의 이량체 형태의 융합 단백질(GST-PTPRT)의 탈인산화효소 활성을 측정하여 비교하였다. 그 결과, 3종의 화합물 모두, 화합물의 농도가 증가함에 따라 탈인산화효소 활성도 함께 증가되는 경향을 나타냈다(도 13). 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 선별한 3종의 화합물이, 활성이 저해된 PTPR의 이량체화를 억제하여 다시 활성화시킬 수 있는 물질일 가능성을 다시 한 번 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method for screening of Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate dimerization inhibitor <130> 2021-DPA-4123 <160> 11 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 660 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Leu Ala Lys Lys Gln Lys Glu Thr Gln Ser Gly Ala Gln Arg Glu 1 5 10 15 Met Gly Pro Val Ala Ser Ala Asp Lys Pro Thr Thr Lys Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Arg Asn Asp Glu Gly Phe Ser Ser Ser Ser Gln Asp Val Asn Gly 35 40 45 Phe Thr Asp Gly Ser Arg Gly Glu Leu Ser Gln Pro Thr Leu Thr Ile 50 55 60 Gln Thr His Pro Tyr Arg Thr Cys Asp Pro Val Glu Met Ser Tyr Pro 65 70 75 80 Arg Asp Gln Phe Gln Pro Ala Ile Arg Val Ala Asp Leu Leu Gln His 85 90 95 Ile Thr Gln Met Lys Arg Gly Gln Gly Tyr Gly Phe Lys Glu Glu Tyr 100 105 110 Glu Ala Leu Pro Glu Gly Gln Thr Ala Ser Trp Asp Thr Ala Lys Glu 115 120 125 Asp Glu Asn Arg Asn Lys Asn Arg Tyr Gly Asn Ile Ile Ser Tyr Asp 130 135 140 His Ser Arg Val Arg Leu Leu Val Leu Asp Gly Asp Pro His Ser Asp 145 150 155 160 Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr His Arg Pro Arg His Tyr 165 170 175 Ile Ala Thr Gln Gly Pro Met Gln Glu Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg 180 185 190 Met Ile Trp Gln Glu Asn Ser Ala Ser Ile Val Met Val Thr Asn Leu 195 200 205 Val Glu Val Gly Arg Val Lys Cys Val Arg Tyr Trp Pro Asp Asp Thr 210 215 220 Glu Val Tyr Gly Asp Ile Lys Val Thr Leu Ile Glu Thr Glu Pro Leu 225 230 235 240 Ala Glu Tyr Val Ile Arg Thr Phe Thr Val Gln Lys Lys Gly Tyr His 245 250 255 Glu Ile Arg Glu Leu Arg Leu Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His 260 265 270 Gly Val Pro Cys Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Gly Phe Val Arg Gln Val 275 280 285 Lys Phe Leu Asn Pro Pro Glu Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser 290 295 300 Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Ala Ile Asp Thr Met Leu 305 310 315 320 Asp Met Ala Glu Asn Glu Gly Val Val Asp Ile Phe Asn Cys Val Arg 325 330 335 Glu Leu Arg Ala Gln Arg Val Asn Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr 340 345 350 Val Phe Val His Asp Ala Ile Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Asn Thr 355 360 365 Ala Ile Pro Val Cys Glu Phe Arg Ser Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Arg 370 375 380 Leu Asp Pro Gln Thr Asn Ser Ser Gln Ile Lys Asp Glu Phe Gln Thr 385 390 395 400 Leu Asn Ile Val Thr Pro Arg Val Arg Pro Glu Asp Cys Ser Ile Gly 405 410 415 Leu Leu Pro Arg Asn His Asp Lys Asn Arg Ser Met Asp Val Leu Pro 420 425 430 Leu Asp Arg Cys Leu Pro Phe Leu Ile Ser Val Asp Gly Glu Ser Ser 435 440 445 Asn Tyr Ile Asn Ala Ala Leu Met Asp Ser His Lys Gln Pro Ala Ala 450 455 460 Phe Val Val Thr Gln His Pro Leu Pro Asn Thr Val Ala Asp Phe Trp 465 470 475 480 Arg Leu Val Phe Asp Tyr Asn Cys Ser Ser Val Val Met Leu Asn Glu 485 490 495 Met Asp Thr Ala Gln Phe Cys Met Gln Tyr Trp Pro Glu Lys Thr Ser 500 505 510 Gly Cys Tyr Gly Pro Ile Gln Val Glu Phe Val Ser Ala Asp Ile Asp 515 520 525 Glu Asp Ile Ile His Arg Ile Phe Arg Ile Cys Asn Met Ala Arg Pro 530 535 540 Gln Asp Gly Tyr Arg Ile Val Gln His Leu Gln Tyr Ile Gly Trp Pro 545 550 555 560 Ala Tyr Arg Asp Thr Pro Pro Ser Lys Arg Ser Leu Leu Lys Val Val 565 570 575 Arg Arg Leu Glu Lys Trp Gln Glu Gln Tyr Asp Gly Arg Glu Gly Arg 580 585 590 Thr Val Val His Cys Leu Asn Gly Gly Gly Arg Ser Gly Thr Phe Cys 595 600 605 Ala Ile Cys Ser Val Cys Glu Met Ile Gln Gln Gln Asn Ile Ile Asp 610 615 620 Val Phe His Ile Val Lys Thr Leu Arg Asn Asn Lys Ser Asn Met Val 625 630 635 640 Glu Thr Leu Glu Gln Tyr Lys Phe Val Tyr Glu Val Ala Leu Glu Tyr 645 650 655 Leu Ser Ser Phe 660 <210> 2 <211> 588 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Arg Lys Tyr Pro Pro Leu Pro Val Asp Lys Leu Glu Glu Glu Ile 1 5 10 15 Asn Arg Arg Met Ala Asp Asp Asn Lys Leu Phe Arg Glu Glu Phe Asn 20 25 30 Ala Leu Pro Ala Cys Pro Ile Gln Ala Thr Cys Glu Ala Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Glu Asn Lys Glu Lys Asn Arg Tyr Val Asn Ile Leu Pro Tyr Asp 50 55 60 His Ser Arg Val His Leu Thr Pro Val Glu Gly Val Pro Asp Ser Asp 65 70 75 80 Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Asn Gly Tyr Gln Glu Lys Asn Lys Phe 85 90 95 Ile Ala Ala Gln Gly Pro Lys Glu Glu Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg 100 105 110 Met Ile Trp Glu Gln Asn Thr Ala Thr Ile Val Met Val Thr Asn Leu 115 120 125 Lys Glu Arg Lys Glu Cys Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro Asp Gln Gly 130 135 140 Cys Trp Thr Tyr Gly Asn Ile Arg Val Ser Val Glu Asp Val Thr Val 145 150 155 160 Leu Val Asp Tyr Thr Val Arg Lys Phe Cys Ile Gln Gln Val Gly Asp 165 170 175 Met Thr Asn Arg Lys Pro Gln Arg Leu Ile Thr Gln Phe His Phe Thr 180 185 190 Ser Trp Pro Asp Phe Gly Val Pro Phe Thr Pro Ile Gly Met Leu Lys 195 200 205 Phe Leu Lys Lys Val Lys Ala Cys Asn Pro Gln Tyr Ala Gly Ala Ile 210 215 220 Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Val Val 225 230 235 240 Ile Asp Ala Met Leu Asp Met Met His Thr Glu Arg Lys Val Asp Val 245 250 255 Tyr Gly Phe Val Ser Arg Ile Arg Ala Gln Arg Cys Gln Met Val Gln 260 265 270 Thr Asp Met Gln Tyr Val Phe Ile Tyr Gln Ala Leu Leu Glu His Tyr 275 280 285 Leu Tyr Gly Asp Thr Glu Leu Glu Val Thr Ser Leu Glu Thr His Leu 290 295 300 Gln Lys Ile Tyr Asn Lys Ile Pro Gly Thr Ser Asn Asn Gly Leu Glu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Lys Leu Thr Ser Ile Lys Ile Gln Asn Asp Lys Met 325 330 335 Arg Thr Gly Asn Leu Pro Ala Asn Met Lys Lys Asn Arg Val Leu Gln 340 345 350 Ile Ile Pro Tyr Glu Phe Asn Arg Val Ile Ile Pro Val Lys Arg Gly 355 360 365 Glu Glu Asn Thr Asp Tyr Val Asn Ala Ser Phe Ile Asp Gly Tyr Arg 370 375 380 Gln Lys Asp Ser Tyr Ile Ala Ser Gln Gly Pro Leu Leu His Thr Ile 385 390 395 400 Glu Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu Trp Lys Ser Cys Ser Ile Val 405 410 415 Met Leu Thr Glu Leu Glu Glu Arg Gly Gln Glu Lys Cys Ala Gln Tyr 420 425 430 Trp Pro Ser Asp Gly Leu Val Ser Tyr Gly Asp Ile Thr Val Glu Leu 435 440 445 Lys Lys Glu Glu Glu Cys Glu Ser Tyr Thr Val Arg Asp Leu Leu Val 450 455 460 Thr Asn Thr Arg Glu Asn Lys Ser Arg Gln Ile Arg Gln Phe His Phe 465 470 475 480 His Gly Trp Pro Glu Val Gly Ile Pro Ser Asp Gly Lys Gly Met Ile 485 490 495 Ser Ile Ile Ala Ala Val Gln Lys Gln Gln Gln Gln Ser Gly Asn His 500 505 510 Pro Ile Thr Val His Cys Ser Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Phe 515 520 525 Cys Ala Leu Ser Thr Val Leu Glu Arg Val Lys Ala Glu Gly Ile Leu 530 535 540 Asp Val Phe Gln Thr Val Lys Ser Leu Arg Leu Gln Arg Pro His Met 545 550 555 560 Val Gln Thr Leu Glu Gln Tyr Glu Phe Cys Tyr Lys Val Val Gln Glu 565 570 575 Tyr Ile Asp Ala Phe Ser Asp Tyr Ala Asn Phe Lys 580 585 <210> 3 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GST <400> 3 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp 210 215 220 <210> 4 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MukFN <400> 4 Met Ser Glu Phe Ser Gln Thr Val Pro Glu Leu Val Ala Trp Ala Arg 1 5 10 15 Lys Asn Asp Phe Ser Ile Ser Leu Pro Val Asp Arg Leu Ser Phe Leu 20 25 30 Leu Ala Val Ala Thr Leu Asn Gly Glu Arg Leu Asp Gly Glu Met Ser 35 40 45 Glu Gly Glu Leu Val Asp Ala Phe Arg His Val Ser Asp Ala Phe Glu 50 55 60 Gln Thr Ser Glu Thr Ile Gly Val Arg Ala Asn Asn Ala Ile Asn Asp 65 70 75 80 Met Val Arg Gln Arg Leu Leu Asn Arg Phe Thr Ser Glu Gln Ala Glu 85 90 95 Gly Asn Ala Ile Tyr Arg Leu Thr Pro Leu Gly Ile Gly Ile Thr Asp 100 105 110 Tyr Tyr Ile Arg Gln Arg Glu Phe Ser Thr Leu Arg Leu Ser Met Gln 115 120 125 Leu Ser Ile Val Ala Gly Glu Leu Lys Arg Ala Ala Asp Ala Ala Glu 130 135 140 Glu Gly Gly Asp Glu Phe His Trp His Arg Asn Val Tyr Ala Pro Leu 145 150 155 160 Lys Tyr Ser Val Ala Glu Ile Phe Asp Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg 165 170 175 Leu Met Asp Glu Gln Gln Gln Gln Val Lys Asp Asp Ile Ala Gln Leu 180 185 190 Leu Asn Lys Asp Trp Arg Ala Ala Ile Ser Ser Cys Glu Leu Leu Leu 195 200 205 Ser Glu Thr Ser Gly Thr Leu Arg Glu Leu Gln Asp Thr Leu Glu Ala 210 215 220 Ala Gly Asp Lys Leu Gln Ala Asn Leu Leu Arg Ile Gln Asp Ala Thr 225 230 235 240 Met Thr His Asp Asp Leu His Phe Val Asp Arg Leu Val Phe Asp Leu 245 250 255 Gln Ser Lys Leu Asp Arg Ile Ile Ser Trp Gly Gln Gln Ser Ile Asp 260 265 270 Leu Trp Ile Gly Tyr Asp Arg His Val His Lys Phe Ile Arg Thr Ala 275 280 285 Ile Asp Met Asp Lys Asn 290 <210> 5 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Halo <400> 5 Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val 1 5 10 15 Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr 20 25 30 Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg 35 40 45 Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp 50 55 60 Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe 65 70 75 80 Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu 85 90 95 Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe 100 105 110 His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met 115 120 125 Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala 130 135 140 Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu 145 150 155 160 Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val 165 170 175 Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe 180 185 190 Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu 195 200 205 Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr 210 215 220 Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly 225 230 235 240 Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys 245 250 255 Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu 260 265 270 Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp 275 280 285 Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly 290 295 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker4 <400> 6 Phe Gln Gly His 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker9 <400> 7 Pro Gly Asp Tyr Asp Phe Gln Gly His 1 5 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker14 <400> 8 Pro Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Phe Gln Gly His 1 5 10 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker17 <400> 9 Pro Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 10 15 His <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker20 <400> 10 Pro Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Gly Pro Thr Glu Asn Leu Tyr 1 5 10 15 Phe Gln Gly His 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker23 <400> 11 Pro Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Ser Gly Ser Gly Pro Thr Glu 1 5 10 15 Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His 20

Claims (12)

  1. 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소(Receptor-type Protein Tyrosine Phosphate; PTPR)의 세포 내 도메인 및 이량체(dimer) 형성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질;을 동종이량체(homo-dimer)의 형태로 포함하는, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인을 포함하는 대조군 단백질;을 단량체(monomer)의 형태로 더 포함하는 것인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 이량체 형성 폴리펩타이드는 GST 및 MukF의 N-말단 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 융합 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 및 이량체 형성 폴리펩타이드가 7개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결된 것인, 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 이량체 형성 폴리펩타이드는, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인의 N-말단에 연결되어 동종이량체의 형성을 유도하는 것인, 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 대조군 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인이 Halo 태그와 연결된 것인, 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서,
    상기 대조군 단백질은, 상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 세포 내 도메인 및 이량체 형성 폴리펩타이드가 2개 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 링커로 연결된 것인, 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소는, PTPRA, PTPRB, PTPRC, PTPRD, PTPRE, PTPRF, PTPRG, PTPRH, PTPRJ, PTPRK, PTPRM, PTPRN, PTPRN1, PTPRO, PTPRQ, PTPRR, PTPRS, PTPRT, PTPRU, PTPRZ 및 PTPRZ1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 조성물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 스크리닝용 조성물을 포함하는, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝용 키트.
  10. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 스크리닝용 조성물에 후보물질을 첨가하는 단계; 및
    탈인산화효소의 활성도를 측정하는 단계;를 포함하는, 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    탈인산화효소의 활성도를 측정한 결과, 상기 융합 단백질에 의한 활성이 증가되는 경우 상기 후보물질이 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화를 억제하는 물질인 것으로 판정하는 단계;를 더 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 탈인산화효소의 활성도를 측정하는 단계는 pNPP 어세이를 수행하는 단계;를 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
KR1020210091787A 2021-07-13 2021-07-13 수용체형 단백질 티로신 탈인산화효소의 이량체화 억제제의 스크리닝 방법 KR102628529B1 (ko)

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