KR102051159B1 - 단백질 간의 상호작용의 판정 방법 - Google Patents

단백질 간의 상호작용의 판정 방법 Download PDF

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Abstract

제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 방법으로서,
제1 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과 제2 단백질과 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질 간의 결합에 의해서 형성되는 형광 회점을 세포 내에서 검출하는 단계; 그리고
형광 점의 검출에 의해서 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 단계를 포함한다.

Description

단백질 간의 상호작용의 판정 방법 {METHOD FOR DETECTING PROTEIN-PROTEIN INTERACTION}
본 발명은 단백질 간의 상호작용의 판정 방법, 그 응용 및 당해 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
단백질 간의 상호작용의 검출 방법은 대체로 두 가지 그룹으로 나눌 수있다. 첫번째는 살아있는 세포에서 분리된 상태의 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법이다. 예를 들면, 이러한 방법은 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance), 단백질 질량분광법 (protein mass spectroscopy)및 이방성 측정법 (anisotropy measurements)을 포함한다. 그러나 이러한 방법은 실제 세포 내 환경과 유사한 환경에서는 상호작용을 판정하는데 어려움이 있다.
따라서 두번째 방법으로, 살아있는 세포를 이용하여 단백질 간의 상호작용을 판정하는 방법도 개발되고 있다. 대표적인 방법으로는 리포터 (reporter)의 전사 활성을 검출하는 효모 이중 혼성 시스템 (yeast two hybrid system)과 그 변법이 있다. 그 외에도 β-갈락토시다아제, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)와 같은 효소의 재구성을 이용하는 또 다른 방법도 개발되고 있다.
그러나 이러한 방법은 단백질 간의 상호작용이 발생한 위치 (단백질 간의 상호작용의 위치 정보)와 단백질 간의 상호작용이 발생할 때까지의 시간, 그 상호작용이 소실될 때까지의 시간과 상기 상호작용의 지속시간 등 (단백질 간의 상호작용의 시간 정보)을 감지할 수 없는 문제가 있다.
반면에 살아있는 세포를 이용하여 단백질 간의 상호작용을 판정하는 방법으로는 형광 단백질의 재구성을 이용하는 방법도 있지만, 일단 재구성되면 형광 단백질은 분리되지 않는다. 따라서, 본 발명은 단백질 간의 상호작용이 소실될 때까지의 시간, 상기 상호작용의 지속시간 등을 감지할 수 없다는 문제가 있다. 또한, 단백질 간의 상호작용이 발생할 때까지의 시간 등을 감지할 수 없게 되는 문제가 발생하는데 이것은 단백질 간의 상호작용이 발생한 후에 형광 방출은 시간이 필요하기 때문이다.
또한 루시페라아제 재구성 법을 이용하는 방법도 있다. 이 방법에서는 루시페라제가 가역적으로 재구성되고 분리된다. 그러나 재구성한 루시페라아제에 의해서 발하는 발광 신호는 취약하기 때문에 세포 내의 위치 정보를 얻기 위해서는 노출시간이 길어야 하고, 회전 (turnover)속도가 빠른 단백질 간의 상호작용의 위치 정보와 시간 정보를 얻을 수 없게 된다.
추가로 이러한 형광 단백질, 루시페라아제 등의 재구성을 이용하는 방법에서는 재구성 후에만 신호를 감지할 수 있기 때문에 이것은 상호작용을 통해 다른 위치에 있는 단백질을 단백질 간의 상호작용의 발생 전후로 추적이 곤란하다는 문제를 야기한다.
한편으로는, 살아 있는 세포 내에서 단백질 간의 상호작용을 판정하는 방법으로 분자 간 거리에 의존하는 에너지 전달을 검출하는 형광 공명 에너지 전달법 (FRET)이 개발되고 있다. 이 방법은 단백질 간의 상호작용이 어디서, 언제 발생하는지에 대한 위치 정보와 시간 정보를 얻을 수 있다는 이점이 있다. 하지만 이 방법에 사용되는 공여체 형광 단백질과 수용체 형광 단백질의 위치 관계가 단백질 간의 상호작용 판정에 중요하기 때문에 형광 단백질이 검출 대상 단백질에 연결되어 있는 링커 (스페이서)의 최적화를 조사하는 복잡한 단계를 포함하고 있어서 시스템을 구축하는데 어려움이 있다. 또한, 수용체 형광 단백질을 검출하는 교차 여기 (cross excitation)및 수용체 형광 단백질의 형광을 검출하기 위한 필터 (흡수 필터)세트를 통해서 공여체 형광 단백질이 블리드 (bleed)되는 표면 번짐 (bleed-through)으로 인한 결과를 분석하는 데 어려움이 있었다. 또한, 두 가지의 색 형광 단백질 (공여체 형광 단백질과 수용체 형광 단백질)을 사용하는 것은 검색 대상 단백질 이외의 정보를 검출하기 위해서는 제한된 형광 단백질만이 사용가능하다는 문제를 야기한다.
최근에 Tobias Meyer 등은 세포 내의 배치 (translocation)를 이용함으로써 단백질 간의 상호작용 판정 방법을 보고하였다 (특허 문헌 1). 이 방법은 상호작용을 판정하는 단백질 중 하나가 세포 내 특정 부위에 특이적으로 결합하는 단백질에 융합되는 반면, 상호작용을 판정하는 단백질 중 다른 하나는 형광 단백질에 융합된다. 이어서, 이들 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키고 세포 내의 특정 부위에서 형광 단백질 등의 신호를 지표로 해서 단백질 간의 상호작용을 판정한다.
또한 Nibert 등은 상호작용을 판정하는 단백질 중 한쪽에 바이러스 내포체 (viral inclusion body)를 형성하는 단백질을 융합한 융합 단백질을 사용하여 상호작용을 판정하는 단백질의 다른 바이러스 내포체에 축적하는 것을 지표로 하여 단백질 간의 상호작용을 판정하는 방법을 보고하였다 (특허 문헌 2).
그러나, 이러한 세포 내 배치를 이용한 단백질 간의 상호작용 판정 방법에서는, 상호작용을 판정하는 단백질 중 하나가 세포의 특정 부위에 강제적으로 (인공적으로)이동되고 한정된다. 따라서, 단백질 간의 상호작용이 당연히 발생하는 부위, 즉 단백질 간의 상호작용에 관련된 세포내 환경에서는 검출할 수 없고 단백질 간의 상호작용의 위치 정보를 얻을 수 없다는 문제점과 기타 유사 문제점들이 있다. 또한, 세포 내 배치된 부위와 동일한 부위에, 자연 상태에서 배치되어 있는 단백질 간의 상호작용을 판정할 수 없다.
이 문제에 대해서 Sara Peterson Bjorn 등은 단백질이 자연적으로 기능하는 세포 내 환경에서 단백질이 상호작용하도록 하고 이어서 세포는 약물 등으로 자극을 받아서 상호작용 단백질로부터 결합체 형성을 유도하며, 그 결합체 형성은 상호작용을 나타내는 것인, 단백질 간의 상호작용 판정 방법 (redistribution-trap method)을 보고하였다 (특허문헌 3).
그러나 이러한 방법은 특정 시간에 응집체 형성을 유도할 수 있도록 세포에 자극을 줄 필요가 있고, 자극을 준 후에도 계속 상호작용 유무를 검출하기 위해서는 자극을 위해 사용되는 약물 등을 제거할 필요가 있다. 따라서, 이러한 방법으로는 단백질 간의 상호작용이 발생할 때의 시간 정보를 얻을 수 없으며, 특정 시간에 특정 위치에서 변화 (발생, 소실, 재발생 등)하는 단백질 간의 상호작용은 감할 수 없다는 문제가 있다.
특허문헌1 국제 공개 제WO2000-017221호 특허문헌2 국제 공개 제WO2006/099486호 특허문헌3 미국 특허 제7282347호
본 발명은 전술한 종래 기술에서의 문제점들을 고려하였다. 본 발명의 목적은 단백질 간의 상호작용에 관련된 세포 내 환경에서 세포 내에서의 단백질 간의 상호작용을 판정할 수 있고, 단백질 간의 상호작용의 위치 정보와 시간 정보를 검색할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 두 가지 단백질 (제1 단백질과 제2 단백질)의 상호작용을 판정하는 데 있어서, 제1 단백질과 결합 유도 (association-inducing) 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과, 제2 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 이용하는 것을 구상하였다. 특정하게는, 본 발명자들은 이하와 같이 시스템의 구축을 구상하였다. 이 두 가지 융합 단백질을 세포 내에서 발현시킬 때, 제1 단백질과 제2 단백질이 상호작용하면 결합 유도 단백질과 또 다른 결합 유도 단백질의 결합 작용을 유도한다. 그 결과, 융합 단백질은 결합체를 자발적으로 형성하고, 융합 단백질에 함유되어 있는 형광 단백질을 형광 휘점으로 감지하였다 (도1과 2 참고). 또한 발명자들은 결합 유도 단백질로서, 단량체 형광 단백질 중 하나인, 단량체 아자미 그린 (단량체 Azami Green 1) (mAG1)과 융합한 경우에는 세포 내에서 분산하여 존재하고, 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 융합시킨 경우에는 세포 내에서 형광 휘점 (결합체)을 형성하는 성질을 가지는 단백질의 이용을 구상하였다.
따라서 발명자들은 먼저 mAG1 또는 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 융합시킨 후보 단백질을 세포 내에서 발현시켰고, 형광 휘점의 형성을 지표로 해서 결합 유도 단백질을 스크리닝하였다 (도3 및 4 참고).
스크리닝 결과는 p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, PKCiota의 PB1 도메인, TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1의 SAM 도메인이 결합 유도 단백질로 사용가능하다는 것을 나타내었다.
이어서 본 발명자들은 다량체화 능력을 가진 형광 단백질과 결합 유도 단백질로서 확인된 이들 단백질의 사용은 형광 휘점을 지표로 해서 임의의 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있다는 것을 나타내었다.
이러한 방법은 단백질 상호작용에 관련된 세포내 환경에서 단백질 간의 상호작용을 판정할 수 있으며, 단백질 간의 상호작용에 관한 위치 정보와 시간 정보를 검색할 수 있다. 또한, 단백질 간의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 동정하고 단백질 간의 상호작용을 조정하는 물질을 스크리닝하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명은 단백질 간의 상호작용의 판정 방법, 그것의 응용 및 본 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 더 특정하게는, 본 발명은 이하의 발명을 제공하는 것이다.
(1) 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 방법으로서,
제1의 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과, 제2 단백질 과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
이러한 세포 내에서 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점을 검출하는 단계;
상기 형광 휘점의 검출에 의해 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 단계를 포함하는 방법.
(2) (1)에 있어서, 상호작용이 발생 또는 소실, 해당 상호작용이 발생 또는 소실할 때까지의 시간 또는 상호작용의 지속시간을 감지하기 위해서 형광 휘점이 검출되는 방법.
(3) (1)에 있어서, 특정 자극에 응답하는 상호작용의 발생 또는 소실, 해당 상호작용이 발생 또는 소실할 때까지의 시간 또는 상호작용의 지속시간을 감지하기 위해서 형광 휘점이 검출되는 방법.
(4) (1)~(3)중 어느 하나에 있어서, 특정 단백질과 상호작용하는 단백질을 스크리닝하기 위한 방법으로서,
제1 단백질과 제2 단백질 중 하나는 특정 단백질인 반면, 다른 하나는 시험 단백질이고,
특정 단백질과 상호작용하는 단백질은 형광 휘점의 검출에 의해 선택되는 단백질인 방법.
(5) (1)~(3)중 어느 하나에 있어서 해당 상호작용에 관여하는, 제1 단백질 의 아미노산 잔기와 제2 단백질의 아미노산 잔기 중 어느 하나를 동정하기 위한 방법으로서,
제1 단백질과 제2 단백질 중 어느 하나에 변이가 도입되어 있는 단백질을 사용할 때 형광 휘점의 형광 강도가 변이가 도입되어 있지 않은 단백질과 비교해서 감쇠한 경우는, 그 변이가 도입된 아미노산 잔기를 해당 상호작용에 관여한다는 것을 판정하는 방법.
(6) 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
시험 화합물의 존재 하에서, 제1 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과, 제2 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 과정으로,
이러한 세포 내에서 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 결합에 의해 발생하는 형광 휘점을 검출하는 과정;
상기 형광 휘점의 형광 강도를 상기 시험 화합물의 비존재 하에서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도가 증대되는 경우에는 상기 시험 화합물을 상호작용 유도물질로 선택하거나, 또는 형광 휘점의 형광 강도가 시험 화합물의 비존재 하에서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도보다 감쇠하는 경우에는 상기 시험 화합물을 상전기 상호작용 억제 물질로 선택하는 과정을 포함하는 방법.
(7) (1)~(6)중 어느 하나의 방법에 있어서, 결합 유도 단백질은 p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, PKCiota의 PB1 도메인 TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1의 SAM 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 방법.
(8) 결합 유도 단백질을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 시험 단백질과 mAG1을 포함하는 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 과정;
(b) 상기 시험 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 과정;
(c) 단계 (a)에서는 형광 휘점이 검출되지는 않지만 단계 (b)에서는 형광 휘점이 검출된 경우, 시험 단백질을 결합 유도 단백질로 선택하는 과정을 포함하는 방법.
(9) (1)~(8) 중 어느 하나에 있어서, 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 단량체 Kusabira-Orange 2, Azami-Green, Kusabira-Orange 1, 이량체 Keima-Red, Kikume Green-Red, 단량체 Keima-Red, 단량체 Midoriishi-Cyan1, 단량체 Kusabira-Orange 1, 단량체 Kikume Green-Red1, Midoriishi－Cyan1, Kusabira－Cyan1,이량체 Azami－Green（AB), 이량체 Azami－Green（AC), TGuv, Momiji, COR3.01, COR5과 DsRed2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형광 단백질인 방법.
(10) 다음의 (a)~(j)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 물질 및 사용 설명서를 포함하는 (1)~(9) 중 어느 하나에 따른 방법에서 사용하기 위한 키트,
(a) 결합 유도 단백질을 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 결합 유도 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
(b) 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 인코딩하는 DNA와, 발현되면해당되는 형광 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
(c) mAG1를 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 mAG1와 융합하도록 특정 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
(d) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터;
(e) 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터;
(f) (a) 또는 (d) 중 어느 하나에 따른 벡터와, (b) 또는 (e) 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 벡터 세트;
(g) (b)에 따른 벡터와 (c)에 따른 벡터를 포함하는 벡터 세트;
(h) 제1의 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포;
(i) 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포;
(j) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터와 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.
본 발명에 따르면, 특정한 세포내 환경에서 단백질 간의 상호작용을 판정할수 있고, 또한 단백질 간의 상호작용의 위치 정보와 시간 정보를 검색하는 것이 가능하다.
도1은 본 발명의 단백질 간의 상호작용의 판정 방법의 개념을 예시하는 다이어그램이다. 특정하게는, 다이어그램은 제1의 단백질 (B)와 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과 제2 단백질 (A)와 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시킬 경우 세포에서 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 결합체 형성에 의해서 발생하는 형광 휘점의 검출에 의해 제1의 단백질 (B)와 제2 단백질 (A)와의 상호작용을 확인할 수 있었다는 것을 예시한 것이다.
도2는 본 발명의 단백질 간의 상호작용 판정 방법의 개념을 예시하는 다이어그램이다. 특정하게는, 다이어그램은 제1 단백질 (C)가 제2 단백질 (A)와 상호작용하지 않으면, 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질은 결합하지 않고 분산되어 있는 상태로 세포 내에 존재하기 때문에, 제1 단백질 (C)와 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과 제2 단백질 (A)와 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에 발현시킨다 해도 형광 휘점은 검출되지 않는다는 것을 예시하는 것이다.
도3은 본 발명에 따른 결합 유도 단백질 스크리닝 방법의 개념을 예시하는 다이어그램이다. 특정하게는, 본 발명에 따른 결합 유도 단백질은 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 융합시킨 경우에는 세포 내에서 결합체 (형광 휘점)를 형성할 수 있음을 예시하는 다이어그램이다.
도4는 본 발명에 따른 결합 유도 단백질을 위한 스크리닝 방법의 개념을 예시하는 다이어그램이다. 특정하게는, 다이어그램은 본 발명에 따른 결합 유도 단백질이 단량체 Azami Green 1 (mAG1)와 융합한 경우에는 세포 내에서 분산되어 있다는 것을 예시한 것이다.
도5는 p62의 PB1 도메인 (p62(PB1))에 융합한 mAG1로 구성된 단백질 (mAG1-p62(PB1)), p62(PB1) 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로 Azami Green (AG)을 융합시킨 단백질 (AG-p62(PB1))을 배양 세포에서 발현하고 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도6은 mTOR 단백질의 FRB 도메인과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질, p62(PB1)과 FKBP12로 구성된 융합 단백질을 배양 세포에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. mTOR 단백질의 FRB 도메인 (mTOR (FRB))과 FKBP12 단백질은 라파마이신의 존재 하에서 상호작용하는 것으로 알려져 있는 것을 알아야 한다.
도7은 mTOR 단백질의 FRB 도메인과 p62(PB1)의 융합 단백질, AG 단백질과 FKBP12로 구성된 융합 단잭질을 배양 세포에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다는 것을 알아야 한다.
도8은 mTOR 단백질의 FRB 도메인과 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질, mAG1 단백질과 FKBP12로 구성된 융합 단백질을 배양 세포에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다.
도9는 mTOR 단백질의 FRB 도메인과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (mTOR-AG), p62(PB1) 단백질과 FKBP12 융합 단백질 (p62(PB1)－FKBP12) 및 배양 세포에 발현시킴으로써 라파마이신의 비존재 (-) 또는 존재 (+)하에서 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도10은 mTOR 단백질의 FRB 도메인과 mAG1 단백질로 구성된 융합 단백질 (mTOR-mAG1), p62(PB1) 단백질과 FKBP12로 구성된 융합 단백질 (p62(PB1)－FKBP12)을 배양 세포 내에 발현시킴으로써 라파마이신의 비존재 (-) 또는 존재 (+) 하에서 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도11는 mTOR 단백질의 FRB 도메인과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (mTOR-AG), 동종다량체 기능을 상실한 p62(PB1) 단백질 변이체 및 FKBP12로 구성된 융합 단백질 (p62 (PB1_nc)-FKBP12)를 배양 세포에 발현시키고 라파마이신의 비존재 (-) 또는 존재 (+)에 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도12는 MEK5의 PB1 도메인 (MEK5(PB1)) 또는 Nbr1의 PB1 도메인 (Nbr1(PB1))을 융합시킨 mAG1 단백질 또는 AG 단백질 (다량체화 능력을 가진 형광 단백질)로 구성된 단백질을 배양 세포 내에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도13은 PKCiota의 PB1 도메인 (PKCiota(PB1)) 또는 TFG의 PB1 도메인 (TFG(PB1))을 융합시킨 mAG1 단백질 또는 AG 단백질로 구성된 단백질을 배양 세포 내에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도14는 TEL의 SAM 도메인 (TEL(SAM)) 또는 DGK delta (DGKd)의 SAM 도메인 (DGK delta(SAM))에 융합한 mAG1 단백질 또는 AG 단백질로 구성된 단백질을 배양 세포 내에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도15는 Tankyrase의 SAM 도메인 (Tankyrase(SAM)) 또는 EphB2의 SAM 도메인 (EphB2(SAM))을 융합시킨 mAG1 단백질 또는 AG 단백질로 구성된 단백질을 배양 세포 내에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도16은 라파마이신 존재 하에서 이하의 융합 단백질의 조합: mTOR 단백질의 FRB 도메인과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (mTOR (FRB 도메인)-AG)와 FKBP12 단백질과 TFG(PB1)로 구성된 융합 단백질 (FKBP12-TFG(PB1)) 조합; mTOR (FRB 도메인)-AG과, FKBP12 단백질과 TEL(SAM)로 구성된 융합 단백질 (FKBP12-TEL(SAM))와의 조합; mTOR (FRB 도메인)-AG과, FKBP12 단백질과 DGK delta(SAM)로 구성된 융합 단백질 (FKBP12-DGKd(SAM))와의 조합; mTOR (FRB 도메인)-AG과, FKBP12 단백질과 Tankyrase(SAM)로 구성된 융합 단백질 (FKBP12-Tankyrase(SAM))와의 조합을 배양 세포 내에 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도17은 본 발명에 따른 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로서 KO1, dKeima, KikGR 또는 AG를 이용함으로써 mTOR (FRB)와 FKBP12 단백질의 라파마이신 의존 상호작용을 형광 휘점의 발생을 검출할 수 있는지 여부를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도18은 p62(PB1)를 융합시킨 단량체 Kusabira-Orange 2 (mKO2)로 구성된 단백질을 배양 세포에서 발현시킴으로써 형광 휘점의 발생 유무를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도19는 mTOR (FRB 도메인)-AG와 FKBP12-p62(PB1)이 결합에 의해 발생한 형광 휘점의 형광 강도는 라파마이신의 농도에 의존하는 것인지 여부를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
도20은 mTOR (FRB 도메인)-AG와 FKBP12-p62(PB1)의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도가 라파마이신의 농도에 의존하는 것인지 여부를 분석한 결과를 예시하는 그래프이다.
도21은 mTOR (FRB 도메인)-AG와 p62(PB1)－FKBP12 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도가 라파마이신의 농도에 의존하는 것인지 여부를 분석한 결과를 예시하는 그래프이다.
도22는 라파마이신의 존재 하에서 mTOR (FRB 도메인)-AG와 p62(PB1)－FKBP12의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도가 FK506 농도에 의존적으로 억제되는지 여부를 분석한 결과를 예시하는 그래프이다. FK506은 FKBP12 단백질과 라파마이신의 상호작용을 경쟁적으로 저해하여 mTOR 단백질의 FRB 도메인 (mTOR (FRB)) FKBP12 단백질의 상호작용을 저해한다는 것을 알아야 한다.
도23은 p62(PB1)과 p53의 한 부분으로 구성된 융합 단백질 (p62(PB1)－p53)과, AG 단백질과 MDM2로 구성된 융합 단백질 (AG-MDM2)을 배양 세포에서 발현시켜서, Nutlin-3의 존재 하에서 형광 휘점의 형광 강도를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. Nutlin-3는 p53 단백질과 MDM2 단백질의 상호작용에 대한 억제제로 알려져 있다. 또한 도면에서 좌측 하단에 있는 눈금 막대는 10 μm를 나타낸다.
도24는 p62(PB1)－p53과 AG-MDM2의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도가 Nutlin-3 농도에 의존적으로 억제되는지 여부를 분석한 결과를 예시하는 그래프이다.
도25는 p62(PB1)－p53과 AG-MDM2의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도가 Nutlin-3 농도 의존적으로 억제하는지 여부를 분석한 결과를 예시하는 그래프이다.
도26는 p62(PB1)－p50과 AG-p65를 발현시키는 세포 (IκBα(-)), p62(PB1)－p50, AG-p65, IκBα를 발현시키는 세포 (IκBα(+))을 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. p50과 p65이 핵 내에 배치되어 있고 IκBα와의 상호작용에 의해 세포질 내에 배치되어 있는 이종이량체를 형성한다. 또한, 도면에서 "AG"는 AG 유래 형광을 검출한 결과를 나타낸다. "항IκBα 항체에 의한 면역 염색"은 면역 염색된 세포를 관찰한 결과를 나타낸다. "중첩"은 "AG", "항IκBα 항체와의 면역 염색"과 Hoechst33342로 핵을 염색한 세포를 관찰한 결과를 합한 결과를 나타낸다.
도27은 p62(PB1)－p50/AG-p65의 결합에 의해 발생하는 형광 휘점의 세포 내의 위치가 IκBα 관련 세포에의 도입량 (pIκBα 첨가량)에 따른 여부를 분석한 결과를 예시하는 그래프이다.
도28은 p62(PB1)-CDK4과 AG-p21를 공동 발현시킨 세포 (AG-p21 + PB1-CDK4), p62(PB1)-CDK4, AG-p21 및 Cyclin D1을 발현시킨 세포 (AG-p21 + PB1-CDK4 + Cyclin D1)를 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. p21은 CDK4와 Cyclin D1로 이루어진 복합체과 상호작용한다. 또한, 도면에서 "AG"는 AG 유래 형광을 검출한 결과를 나타낸다. "항 Cyclin D1 항체와의 한 면역 염색"은 면역 염색된 세포를 관찰한 결과를 나타낸다. "중첩"은 "AG", "항 Cyclin D1 항체와의 면역 염색"를 합한 결과를 나타낸다.
도29는 다음 융합 단백질의 결합을 배양 세포에서 발현함으로써 형광 휘점의 형광 강도와 위치를 분석한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 도면에서 우측 하단 눈금 막대는 20 μm를 나타내고, p62(PB1)과 Sec5 단백질의 한 부분으로 구성된 융합 단백질 (p62(PB1)－Sec5)과, AG 단백질과 RalB 단백질 (야생형)으로 구성된 융합 단백질 (AG-RalB (WT)) 조합; p62(PB1)-Sec5과, AG 단백질과 RalB 단백질 (불활성 변이체)의 융합 단백질 (AG-RalB (S28N))의 조합; p62(PB1)-Sec5과, AG 단백질과 RalB 단백질 (활성 변이체)의 융합 단백질 (AG-RalB (Q72L))의 조합이다.
Sec5 단백질은 RalB 단백질의 GTP 활성화 형태와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 상호작용은 RalB의 불활성 변이체 RalB (S28N)로 저하되지만 RalB의 활성형 변이체 RalB (Q72L)는 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한, RalB 단백질은 C말단이 팔미토일화에 의해 세포 막에 배치되어 있는 것으로 나타났다.
도30은 다음 융합 단백질의 조합을 배양 세포에서 발현시켜 세포 막 부근에서만의 형광을 검출한 결과를 예시하는 현미경 사진이다.
p62(PB1)-Sec5와 AG-RalB (WT)의 조합; p62(PB1)-Sec5와 AG-RalB (Q72L)의 조합; p62(PB1)-Sec5와 AG-RalB (S28N)의 조합; p62(PB1)와 AG-RalB (WT)의 조합이다.
도31은 p62(PB1)－p53과 AG-MDM2를 공동 발현하는 세포 (WT)와, p62(PB1)－p53_W23L과 AG-MDM2을 공동 발현시킨 세포 (W23L)을 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. p53의 23 위치의 아미노산은 p53과 MDM2의 상호작용 계면 부위에 위치해 있고 p53의 W23L 변이체는 상호작용을 저하시킨다.
도32는 칼모듈린 단백질과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (칼모듈린-AG)와, 미오신 경쇄 키니아제 2의 부분 서열 (M13 펩티드)과 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질 (M13펩티드-p62(PB1))과 가진 결합에 의해 발생하는 형광 휘점의 발생 및 소실을, 히스타민 첨가 전에, 첨가 후 90초에 그리고 첨가 후 620초에 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 또한 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다. 또한 칼모듈린과 M13 펩티드와의 상호작용은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)가 리간드 (예를 들면, 히스타민)를 수용했을 때 발생하는 세포내 칼슘 이온 농도의 일시적 상승에 응답하여 발생하는 것을 나타내었다.
도33은 mTOR (FRB 도메인) AG 단백질과 핵 위치 신호 (NLS)로 구성된 융합 단백질 (mTOR (FRB 도메인)－AGNLS)와 FKBP12-p62(PB1)와 가진 결합에 의해 발생하는 형광 휘점의 배치를 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 좌측에서 첫번째 패널은 라파마이신 첨가하기 전의 세포 형광 이미지를 보여주고, 두번째 패널은 라파마이신 첨가 후 세포 형광 이미지를 보여주고, 세번째 패널은 라파마이신 첨가 후 중첩 세포 형광 이미지와 명시야 (bright-field) 시각 이미지가 중첩된 결과를 나타낸다. 도면에서, 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다.
도34는 AG 단백질과 cRaf 단백질의 융합 단백질 (AG-cRaf)와 C말단에서 프레닐화 서열을 가지는, p62(PB1)와 HRas 단백질로 구성된 융합 단백질 (p62(PB1)－HRas)와의 결합에 의해 발생하는 형광 휘점의 위치를 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다.
도35는 Smac 단백질의 한 부분과 p62(PB1)으로 구성된 융합 단백질 (Smac-p62(PB1)), XIAP 단백질의 한 부분과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (XIAP-AG)이 결합에 의해 발생하는 형광 휘점의 위치를 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다.
도36은 p62(PB1)과 BclX(L) 단백질의 한 부분으로 구성된 융합 단백질 (p62(PB1)-BclX(L))과, AG 단백질과 BAD 단백질의 한 부분으로 구성된 융합 단백질 (AG-BAD)의 결합에 의해 발생한 형광 휘점의 위치를 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진을 나타낸다. 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다.
도37은 AG 단백질과 Rac1 단백질로 구성된 융합 단백질 (AG-Rac1)과, p62(PB1)과 p21 결합 도메인으로 구성된 융합 단백질 (p62(PB1)－PBD)의 결합에 의해 발생하는 형광 휘점이 핵에 위치하는 것을 나타낸 현미경 사진이다. 도면에서 우측 하단의 눈금 막대는 5 μm를 나타낸다. 또한 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF)는 Rac1 단백질을 활성형으로 변환한다. 또한 활성형 Rac1 단백질과 PBD는 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한, GEF는 종류에 따라 다르게 배치되어 있다. 이러한 이유 때문에 Rac1 단백질과 PBD 사이의 상호작용은, 종류에 따라 다르게 배치되어 있는 GEF에 따른 세포 내 영역에서 Rac1 단백질과 PBD의 상호작용이 발생한다.
도38은 AG-Rac1과 p62(PB1)－PBD의 결합에 의해 발생하는 형광 휘점이 세포 가장자리에 위치하는 것을 나타내는 현미경 사진이다. 도면에서 하단 패널은 상단 패널의 백색으로 둘러싸여져 있는 영역을 확대한 것이다. 또한 상단 패널의 우측 하단에 있는 눈금 막대는 5 μm를 나타내고 하단 패널의 좌측 상부에 있는 패널 눈금 막대는 1 μm를 나타낸다.
도39는 AG-Rac1과 p62(PB1)이 세포에서 발현된 경우에는 이 단백질은 상호작용하지 않기 때문에 형광 휘점은 세포의 가장자리 등에서 검출되지 않는 것을 나타내는 현미경 사진이다. 도면에서 하단 패널은 상단 패널의 백색으로 둘러싸여져 있는 영역을 확대한 것이다. 또한 상단 패널의 우측 하단에 있는 눈금 막대는 5 μm를 나타내고 하단 패널의 좌측 상부에 있는 눈금 막대는 1 μm를 나타낸다.
도40은 AG-Rac1과 p62(PB1)－PBD를 발현시킨 세포를, 제라닐제라닐기에 대한 억제제인 메바스타틴의 비존재 (-) 또는 존재 (+)하에서 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. 제라닐제라닐기 변형이 저해되면 Rac1는 핵 내에 배치된다. 또한 도면은 동일한 세포를 관찰한 결과를 나타낸 것이고, "A"는 일반적인 반사형 형광 도입 현미경으로 관찰한 것이고 "B"는 세포 막 부근에만 흥분할 수 있는 아크 광원 전반사 형광 현미경 시스템으로 관찰한 것이다.
도41은 AG-Rac1와 RhoGDI-p62(PB1)을 발현시킨 세포를, 제라닐제라닐기 변형에 대한 억제제인 메바스타틴의 비존재 (-) 또는 존재 (+)하에서 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진이다. Rac1 단백질은 Rac1의 제라닐제라닐기를 통해 RhoGDI와 상호작용한다. 또한, 도면에서 동일한 세포에 대한 결과를 나타낸 것으로 "A"는 일반적인 반사형 형광 도입 현미경으로 관찰한 것이고, "B"는, 세포 막 부근에만 흥분하는, 아크 광원 전반사 형광 현미경 시스템에서 관찰한 것이다.
도42는 EGF를 첨가한 후 (+) 또는 비 첨가 (-)일 때, p62(PB1)－KRas(WT) 과 AG-cRaf(R59A)을 발현시킨 세포 (WT), p62(PB1)－KRas(G12D)와 AG-cRaf(R59A)을 발현시킨 세포 (G12D)를 세포 막 부근에서 형광만을 검출한 결과를 예시하는 현미경 사진을 나타낸다. EGF 의존적으로 활성화된 KRas는 cRaf와 상호작용한다. 또한 단백질 간의 상호작용은 cRaf의 위치를 세포질에서 세포 막으로 변화시킨다.
도43은 ABT-737 첨가 후에 p62(PB1)-BclX(L)와 Bak-AG를 공동 발현시킨 세포에서 형광 휘점의 전체 형광 강도의 시간에 따른 변화를 예시하는 그래프이다. BclX(L)과 Bak은 BH3 도메인을 통해 상호작용하지만 단백질 간의 상호작용은 ABT-737 (BH3 모방체)에 의해 경쟁적으로 저해된다.
도44은 ABT-737 첨가 후 p62(PB1)-BclX(L)와 AG-Bax를 공동 발현시킨 세포에서 형광 휘점 총 형광 강도의 시간에 따른 변화를 예시하는 그래프이다. BclX(L) 과 Bax는 BH3 도메인을 통해 상호작용하지만 단백질 간의 상호작용은 ABT-737에 의하여 경쟁적으로 저해된다.
도45은 Nutlin-3 첨가 전후에 p62(PB1)－p53과 AG-MDM2를 안정적으로 발현하는 세포에서 형광 휘점의 전체 형광 강도의 시간에 따른 변화를 예시하는 그래프이다. 그래프의 x축은 Nutlin-3을 첨가한 시간이 0일 때의 시간 (분)을 나타낸다.
도46은 라파마이신 첨가 전후에 mTOR (FRB 도메인)-AG 및 p62(PB1)－FKBP12를 안정적으로 발현하는 세포에서 형광 휘점의 전체 형광 강도의 시간에 따른 변화를 나타내는 그래프이다. 그래프의 x축은 라파마이신을 첨가한 시간이 0일 때 시간 (분)을 나타낸다.
도47은 EGF와 U0126 첨가 전후에 p62(PB1)－ERK_기질과 AG-Pin1(ww)-NES를 발현하는 세포에서 형광 휘점의 총 형광 강도의 시간에 따른 변화를 예시하는 그래프이다. 세포내 ERK가 EGF 자극에 의해서 활성화될 때, ERK 기질 (ERK_기질)은 인산화되고 그 결과, ERK_기질과 Pin1 단백질의 ww 도메인 (Pin1(ww))이 상호작용한다. 또한 MEK 억제제인 U0126를 첨가하면 ERK의 활성이 저하되고 그 결과, ERK 기질이 탈인산화되면서 ERK 기질과 Pin1(ww)와의 상호작용이 종결된다. 그래프의 x축은 EGF를 첨가한 시간이 0일 때 시간 (분)을 나타낸다. 추가로 U0126를 EGF를 첨가한 14분 후에 세포에 첨가하였다.
도48은 EGF 첨가 전에 p62(PB1)－HRas (WT)과 AG-cRaf(R59A)을 발현하는 세포에서 형광 휘점의 총 형광 강도의 시간에 따른 변화를 예시하는 그래프이다. 그래프의 x축은 EGF를 첨가한 시간이 0일 때의 시간 (분)을 나타낸다.
도49는 라파마이신 비존재 (-) 또는 존재 (+)하에서 또는 FK506 비존재 (-) 또는 존재 (+)하에서 AG-mCAB, p62(PB1)－FKBP12과 mTOR (FRB)-KO1을 발현시킨 세포를, 관찰한 결과를 예시하는 현미경 사진을 나타낸다. 라파마이신은 FKBP12 단백질에 결합해서 복합체를 형성하고 또한 이 복합체는 mTOR 단백질의 FRB 도메인 (mTOR (FRB))에 결합한다. 또한 mCAB (칼시뉴린 B의 일부에 융합되는 칼시뉴린 A의 한 부분으로 구성되는 단백질)는 FK506를 통해 FKBP12 단백질과 상호작용한다. 도면에서 "AG" 와 "KO1"는 AG 및 KO1로부터 유래되는 형광을 검출한 결과를 나타낸다.
＜단백질 간의 상호작용을 판정하는 방법＞
본 발명의 단백질 간의 상호작용을 검출하는 방법은 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 방법으로서,
제1의 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과, 제2 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
이러한 세포 내에서 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 결합에 의해 발생하는 형광 휘점을 검출하는 단계;
상기 형광 휘점의 검출에 의해 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 용어 "단백질"은 2개 이상의 아미노산이 펩티드 결합(들)에 의해서 연결되어 있는 분자 및 그것의 변형된 생성물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 전체 길이의 단백질뿐만 아니라 소위 올리고펩티드와 폴리펩티드를 포함하는 개념이다. 단백질 변형은, 예를 들면, 인산화, 글리코실화, 팔미토일화, 프레닐화 (예를 들면, 제라닐제라닐화), 메틸화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 수모화 (SUMOylation), 히드록실화, 아미드화를 포함한다.
본 발명에 따른 "제1 단백질"과 "제2 단백질"은 상호작용을 판정하기 위해서 원하는 단백질을 채택할 수 있다.
본 발명에 따른 "제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용"은 직접적인 상호작용뿐만 아니라 제1의 단백질과 제2 단백질 사이에 다른 분자 (단백질, 핵산, 당, 지질, 저분자 화합물 등)가 삽입되어 있는 복합체를 형성하는 간접적인 상호작용도 포함한다.
본 발명에 따른 "다량체화 능력을 가지는 형광 단백질"은 세포 내에서 p62의 PB1 도메인 (p62(PB1))를 융합시켜 발현시킨 경우, p62(PB1)와의 융합 단백질이 서로 결합한 결과로서, 형광 휘점을 발생시킬 수 있는 형광 단백질이다. 따라서, "다량체화 능력을 가지는 형광 단백질"은 p62(PB1)와 융합하지 않고, 동종다량체를 세포 내에서 형성할 수 있는 형광 단백질 뿐만 아니라, 아래의 실시예에 설명된 바와 같이 단량체 형광 단백질로 일반적으로 알려져 있는 mKO2 등의 형광 단백질도 포함한다. "다량체화 능력을 가지는 형광 단백질"은 예를 들면, Midoriishi-Cyan1 (MiCy1), Kusabira-Orange 1 (KO1), dKeima570 (이량체 Keima570), 이량체 Keima-Red (dKeima, dKeima-Red), Azami-Green (AG), Kaede, Kikume Green-Red (KikGR, KikGR1), 단량체 Kusabira-Orange 1 (mKO1), 단량체 Kusabira-Orange 2 (mKO2), TurboGFP, TurboYFP, ZsGreen, DsRed, HcRed, eqFP578, eqFP611, EosFP, FP484, Renilla GFP, Dendra, IFP1.4, iRFP, 단량체 Keima-Red (mKeima, mKeima-Red), 단량체 Midoriishi-Cyan1 (mMiCy1), 단량체 Kikume Green-Red1 (mKikGR1), Kusabira-Cyan1 (KCy1), 이량체 Azami-Green (AB) (dAG (AB)), 이량체 Azami-Green (AC) (dAG (AC)), TGuv, Momiji, COR3.01, COR5, and DsRed2. mKO2, mKeima, mMiCy1, mKO1, mKikGR1, MiCy1, KCy1, KO1, dKeima, dAG (AB), dAG (AC), TGuv, Momiji, KikGR, AG, COR3.01, COR5 및 DsRed2이 바람직하다. 또한, 본 발명의 방법에서 명료한 형광 휘점을 검출을 용이하게 하는 측면에서, TGuv, Momiji, AG, KikGR, COR3.01, COR5, DsRed2와 같은 동종사량체를 형성할 수 있는 형광 단백질이 바람직하고 특히 바람직하게는 AG이다.
전형적으로 mKO2, AG, KO1, dKeima, KikGR, mKeima, mMiCy1, mKO1, mKikGR1, MiCy1, KCy1, dAG (AB), dAG (AC), TGuv, Momiji, COR3.01, DsRed2과 COR5은 각 SEQ ID NO: 133의 아미노산 서열을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB107915로 확인되는 아미노산을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB128820로 확인되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB209968로 확인되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB193293로 확인되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB209969로 확인된 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 137에서 아미노산을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB128821로 확인된 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 139의 아미노산을 가지는 단백질, Genbank 등록 번호: AB128822로 확인된 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 149의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 172의 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
이러한 형광 단백질의 아미노산 서열은 자연적으로 (즉, 비인공적으로) 변이될 수 있다. 또한 변이체는 인공적으로 도입될 수도 있다. 이러한 변이체는 세포 내에서 형광을 방출하고 동종다량체를 형성할 수 있으면 본 발명에서 채택될 수 있다.
본 발명에 따른 "결합 유도 단백질"은 다음의 실시예 및 도3과 4에서 예시한 바와 같이 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 융합시켜 세포에 발현된 경우에는 이 융합 단백질끼리 결합하여 발생하는 형광 휘점이 발견되는 단량체 Azami Green 1 (mAG1)와 융합시켜 발현시킨 경우에는 분산된 상태로 세포 내에 존재하는 단백질이다.
본 발명에 따른 "결합 유도 단백질"은 바람직하게는 p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, PKCiota의 PB1 도메인, TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1의 SAM 도메인이다. 본 발명의 방법에서 형광 휘점의 검출을 용이하게 하는 점에서, p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1 SAM 도메인이 더욱 바람직하다.
또한, p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, PKCiota의 PB1 도메인, TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1 SAM 도메인은 일반적으로 SEQ ID NO: 4로 확인되는 아미노산으로 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 12에서 특정 아미노산을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 10로 확인되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 14로 확인되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, SEQ ID NO: 18로 확인되는 아미노산의 단백질, SEQ ID NO： 20으로 확인되는 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
이러한 "결합 유도 단백질"의 아미노산 서열은 자연적으로 (즉, 비인공적으로) 변이될 수 있다. 또한 그 변이는 인공적으로 도입될 수도 있다. 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질에 융합될 때 결합체 (형광 휘점)를 형성하는 성질을 가지고 있으면 그 자체로 결합 능력이 없는 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 "제1 융합 단백질"에서, 결합 유도 단백질은 제1 단백질의 N말단 측 또는 C말단 측 중 어느 하나에 융합될 수 있다. 또한 결합 유도 단백질은 제1 단백질에 직접적으로 융합될 수 있거나 혹은 스페이서 단백질을 통해서 간접적으로 융합될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 "제1 융합 단백질"은 또 다른 기능성 단백질로 융합될 수 있다. 이 경우 다른 기능 단백질은 융합 단백질의 N말단 측 C말단 측 중 한쪽 또는 양쪽에 융합될 수 있거나 또는 결합 유도 단백질과 제1 단백질 사이에 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있다. 다른 기능성 단백질은 특히 제한되지 않고 본 발명에 따라 융합 단백질을 바람직하게 제공하려는 기능에 의해 적절하게 선택된다. 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 사용되는 기능성 단백질은 예를 들면 Myc-태그 (tag) 단백질, His-태그 단백질, 헤마글루틴 (HA)-태그 단백질, FLAG-태그 단백질 (상표, Sigma-Aldrich사), 글루타티온 S-전이 효소 (GST) 단백질, 또한 제2 융합 단백질의 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질과 다른 파장 특성을 나타내는 형광 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 "제2 융합 단백질"에 있어서, "제1 융합 단백질"과 마찬가지로 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 제2 단백질의 N말단 측 또는 C말단 측 중 어느 하나에 융합될 수 있다. 또한 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 직접적으로 제2 단백질에 융합될 수 있거나 혹은 스페이서 단백질을 통해서 간접적으로 융합될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 "제2 융합 단백질"은 전술한 다른 기능성 단백질에 융합될 수 있다. 이 경우 위의 "제 융합 단백질"과 마찬가지로 다른 기능성 단백질은 융합 단백질의 N말단 측 C말단 측 중 한쪽 또는 양쪽 모두에서 또는 다량체화 능력을 가진 형광 단백질과 제2 단백질 사이에서 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있다.
본 발명에 따른 "세포"는 특히 제한되지 않지는 않지만 진핵 세포일 수도 있고 원핵 세포일 수도 있다. 예를 들면 "세포"는 동물 세포 (HeLaS3 세포, U2OS 세포 등), 곤충 세포 (Sf9 세포 등), 식물 세포, 효모, 대장균을 포함한다. 또한, 이러한 세포는 in vitro에서 배양된 상태 (예를 들면, 배지에서 또는 배지 상에서 성장하는 세포)일 수 있거나 in vivo로 존재하는 상태 (예를 들면, 제1 융합 단백질을 인코딩하는 DNA와 제2 융합 단백질을 인코딩하는 DNA가 도입된 형질전환 동물의 세포)일 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 세포 내의 발현은 그 목적에 따라 일시적 발현 또는 지속적 발현일 수 있다. 세포 내 융합 단백질은 본 발명에 따른 벡터를 세포로 도입하여 발현될 수 있고, 이하에서 설명하기로 한다. 벡터를 세포로 도입하기 위한 알려진 기술은 예를 들면 동물 세포의 경우에 리포펙션 법, 전기천공법, 인산칼슘 법, DEAE-덱스트란 방법, 바이러스 (아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스 등)를 이용하는 방법을 포함한다. 또한, 곤충 세포에 대해서는 배큘로바이러스를 이용하는 방법을 포함한다. 또한, 식물 세포에 대해서는, 아그로박테리움 법, 전기천공법, 리튬 아세테이트 법 등을 포함한다. 또한 효모에는 아세트산리튬 법, 전기천공법, 스페로플라스트 법이 있다. 또한, 대장균에 대하여는 열 충격 (예를 들면, 염화칼슘, 염화루비듐 법), 전기천공법 등을 포함한다.
본 발명에서 검출하는 "형광 휘점"은 제1 융합 단백질과 제2 단백질과의 결합에 의해 발생한다. 전형적으로, "형광 휘점"은 분산되어 있는 상태로 존재하는, 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질의 형광 강도보다 증대한 형광 강도로, 0.2~5 μm의 영역에 있는 형광 강도를 가진다 (아래의 실시예 및 도1과 도2 참고).
"형광 휘점의 검출"은 예를 들면 다량체화 능력을 가진 형광 단백질에 해당하는 여기 필터와 흡수 필터를 포함하는 형광 현미경을 이용한 관찰 및 IN Cell Analyzer (GE Healthcare사 제조)등의 이미지 세포분석기를 이용한 분석을 통해서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 세포에서 형광 휘점이 검출되는 경우, 제1 단백질과 제2 단백질은 상호작용하는 것으로 판정되는 반면, 형광 휘점이 검출되지 않는 경우에는, 제1 단백질과 제2 단백질은 상호작용하지 않는다고 판정할 수 있다.
＜결합 유도 단백질의 스크리닝 방법＞
본 발명에 따른 결합 유도 단백질은 아래 (a)~(c)를 포함하는 방법을 스크리닝함으로써, 이하에서 실시예에 설명한 바와 같이 선택될 수 있다:
(a) 시험 단백질과 mAG1을 포함하는 융합 단백질을 세포에서 발현시키는 단계;
(b) 시험 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
(c) 단계 (a)에서는 형광 휘점이 검출되지 않지만 단계 (b)에서는 형광 휘점이 발견된 경우에는 시험 단백질을 결합 유도 단백질로 선택하는 단계.
본 발명에 따른 "시험 단백질"은 특히 제한 없이 결합 유도 능력을 검출하기 위한 원하는 단백질을 채택할 수 있다.
"mAG1" (단량체 Azami Green 1)은 전형적으로 SEQ ID NO： 135의 아미노산 서열을 가지는 단백질이다. 또한, 단백질의 아미노산 서열은 자연적으로 (즉, 비인공적으로)변이될 수 있다. 또한 변이는 인공적으로 도입할 수도 있다. 이러한 변이체는 형광을 발할 수 있고, 단량체의 상태로 세포 내에 존재하면 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 유도 단백질의 스크리닝 방법에서 사용되는, 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 "시험 단백질과 mAG1를 포함하는 융합 단백질" 또는 "시험 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 융합 단백질"에 있어서는 mAG1 또는 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 시험 단백질의 N말단 측 또는 C말단 측 중 어느 하나에 융합될 수 있다. 또한, mAG1 또는 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 직접적으로 시험 단백질에 융합될 수 있거나 스페이서 단백질을 통해서 간접적으로 융합될 수 있다. 본 발명에 따른 "시험 단백질은" 전술한 다른 기능성 단백질에 융합될 수 있다. 이 경우 다른 기능 단백질은 융합 단백질의 N말단 측 C말단 측의 한쪽 또는 양쪽 모두에 융합될 수 있거나 또는 mAG1 또는 다량체화 능력을 가진 형광 단백질 및 시험 단백질 사이에서, 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있다.
발명의 스크리닝에 있어서는 mAG1에 융합되고 세포 내에서 발현된 경우에는 형광 휘점이 검출되지 않지만 다량체화 능력을 가진 형광 단백질 융합하여 세포 내에서 발현된 경우에는 형광 휘점이 검출되면 시험 단백질을 결합 유도 단백질로 선택된다.
＜단백질 간의 상호작용의 시간 정보 등을 얻을 수 있는 방법＞
아래의 실시예, 특히 실시예 12에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 형광 휘점의 존재 또는 비존재를 지표로 해서 단백질 간의 상호작용의 발생뿐만 아니라 단백질 간의 상호작용의 소실도 검출할 수 있다. 또한 실시예 19, 24~28 등의 실시예에서 설명한 바와 같이, 시간에 따른 단백질 간의 상호작용의 발생 등을 추적할 수도 있다. 또한 실시예 20-22 등의 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 결합 유도 단백질과 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질의 위치 등에 영향을 받지 않고 세포 내 모든 영역에 있어서 단백질 간의 상호작용을 검출할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 상호작용의 발생 또는 소실, 해당 상호작용의 발생 또는 소실할 때까지의 시간, 또는 해당 상호작용의 지속시간을 감지하기 위해서 형광 휘점을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
전술한 "상호작용의 발생 또는 소실"을 검출하는 데 있어서, 본 발명은 특히 아래의 실시예 21에서 특히 설명한 바와 같이 단백질 간의 상호작용이 발생한 세포 내 영역을 확인할 수도 있다.
추가로, 다음의 실시예 19, 23, 27-29 등의 실시예에 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, "상호작용의 발생 또는 소실"의 감지를 통해 해당 단백질 간의 상호작용에 관여하는, 신호 전달의 발생과 소실, 해당 신호 발생 또는 소실까지의 시간 및 해당 신호 전달의 지속시간을 검색할 수 있으며, 해당 신호 전달이 손상된 세포의 영역을 확인하는 것도 있다.
또한 다음의 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 상호작용이 특정 자극에 응답하여 발생 또는 소실되어도 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 그에 따른 형광 휘점을 검출하는 것으로, 특정 자극에 반응하는 상호작용의 발생 또는 소실, 해당 상호작용의 발생 또는 소실할 때까지의시간을, 또는 해당 상호작용의 지속시간을 감지하기 위해 이러한 형광 휘점을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 "특정 자극"은 단백질 간의 상호작용을 직접적으로 또는 간접적으로 유도 또는 저해할 수 있는 자극이어야 할 필요가 있다. 또한 "특정 자극"은 세포에서 유래한 내인성 인자에 기인하는 자극 (예를 들면, 세포 내 칼슘 이온 농도의 증가 또는 저하, 효소의 활성화 또는 불활성화)일 수 있거나, 세포에 주어진 외부 자극 (예를 들면, 세포 내 수용체의 리간드 (작용제 또는 길항제)의 투여)일 수 있다.
또한 특히 아래의 실시예 19, 24-28에서 설명한 같이, 이러한 본 발명의 방법은 발명에 따른 형광 휘점을 검출함으로써, 특정 자극의 발생 또는 소실, 이러한 자극이 발생 또는 소실될 때까지의 시간 또는 해당 자극의 지속시간을 감지할 수 있다.
또한 아래의 실시예 11, 13 등의 실시예에 설명한 바와 같이 본 발명의 방법은 특정 자극의 정도 (예를 들어 특정 자극이 약물일 때 그 농도)에 따라 단백질 간의 상호작용의 증가 또는 저하를 검출할 수 있다. 따라서, 특정 자극이 약물인 경우에는 단백질 간의 상호작용에 대한 이 약물의 50% 유효 농도 (EC50)와 50% 저해 농도 (IC50)의 의해서 결정될 수 있다.
또한 다음의 실시예 29에서 설명한 바와 같이 본 발명의 방법은 동일한 세포에서 여러 종류의 단백질 간의 상호작용, 특정 자극에 각각 의존적인 여러 가지 단백질 간의 상호작용, 나아가서는 이러한 단백질 간의 상호작용에 관여하는 신호 전달을 확인하고 감지할 수 있다.
＜특정 단백질과 상호작용하는 단백질의 스크리닝 방법＞
아래의 실시예, 특히 실시예 30에서 설명한 같이 본 발명은 모든 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있다. 따라서 본 발명은 특정 단백질과 상호작용하는 단백질을 스크리닝하는 방법으로서,
제1 단백질과 제2 단백질 중 하나는 특정 단백질이며 다른 하나는 시험 단백질이고,
특정 단백질과 상호작용하는 단백질은 본 발명에 따른 형광 휘점의 검출에 의해 선택하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 "시험 단백질"은 특히 제한되지 않는다. 완전히 효율적으로 특정 단백질과 상호작용하는 단백질을 선택한다는 점에서 cDNA 라이브러리에 의해 인코딩하는 단백질 집단은 선호하여 채택될 수 있다.
＜단백질 간의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기의 동정 방법＞
아래의 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 형광 휘점의 형광 강도와 단백질 간의 상호작용의 강도 (strength)는 상호 관련이 있다. 따라서, 본 발명은 단백질 상호작용에 관여하는, 제1 단백질의 아미노산 잔기 또는 제2 단백질의 아미노산 잔기를 동정하기 위한 방법으로서,
제1의 단백질과 제2 단백질 중 하나에 변이가 도입된 단백질을 이용해서 형광 휘점의 강도가, 변이가 도입되어 있지 않은 단백질을 이용한 경우와 비교하여 감쇠된 경우에는, 해당 변이가 도입된 아미노산 잔기가 상호작용에 관여한다고 판정하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 "형광 휘점의 형광 강도"는 하나의 형광 휘점의 형광 강도뿐만 아니라 특정 영역 (예를 들면, 하나의 세포에서 형광 현미경 관찰에의 한 시간에서, 형광 영상)에 존재하는 형광 휘점의 전체 형광 강도를 포함한다.
통상의 기술자는 "제1의 단백질 등에 변이를 도입함으로써 얻어지는 단백질"을 적절하게 알려진 방법을 선택하여 제조할 수 있다. 이러한 알려진 기술로는 예를 들면 부위 특이적 변이 유발 (site-directed mutagenesis)을 포함한다.
＜단백질 간의 상호작용을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법＞
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 있어서 단백질 간의 상호작용의 강도 (strength)는 형광 휘점의 형광 강도를 지표로 하여 파악될 수 있다. 따라서, 본 발명은
시험 화합물의 존재 하에서 제1 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과, 제2 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포에서 발현시키는 단계;
세포 내에서 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점을 검출하는 단계;
형광 휘점의 강도가 시험 화합물의 비존재 하에서 발생하는 형광 휘점의 강도보다 증대하는 경우에는 시험 화합물을 상호작용 유도 물질로 선택하거나 또는 형광 휘점의 강도가 시험 화합물의 비존재 하에서 발생하는 형광 휘점의 강도보다 감쇠하는 경우에는 시험 화합물을 상호작용 억제 물질로 선택하는 과정을 포함하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 시험 화합물은 특히 제한 없이, 예를 들면, 유전자 라이브러리, 합성 저분자량 화합물 라이브러리, 펩티드 라이브러리, 항체, 박테리아 방출 물질, 세포 (미생물, 식물 세포, 동물 세포)의 액체 추출액 및 배양 상청액, 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드, 해양 생물, 식물 또는 동물 유래 추출물, 토양, 임의 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리를 포함한다.
또한 시험 화합물 존재 하에서의 상태는, 예를 들면, 본 발명에 따른 세포는 첨가에 의해서 시험 화합물 등과 접촉하게 되는 상태와, 시험 화합물이 본 발명에 따른 세포에 도입되는 상태를 포함한다.
<본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트＞
본 발명은 전술한 방법에 사용하기 위한 키트를 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 사용 설명서와, 아래 (a)~(j)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질을 포함하는 키트이다:
(a) 결합 유도 단백질을 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 결합 유도 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
(b) 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 형광 단백질 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
(c) mAG1를 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 형광 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
(d) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터;
(e) 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터;
(f) (a)와 (d)중 어느 하나에 따른 벡터와 (b)와 (e)중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 벡터 세트;
(g) (b)에 따른 벡터와 (c)에 따른 벡터를 포함하는 벡터 세트;
(h) 제1의 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포;
(i) 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포;
(j) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터와 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 형질전환 세포.
본 발명에 따른 벡터는 본 발명에 따른 세포에 삽입되어 있는 DNA가 발현 (전사와 번역)하는 데 필요한 조절 서열을 포함할 필요가 있다. 이러한 조절 서열은 예를 들면 프로머터, 인핸서, 소음기, 터미네이터, 폴리(A) 꼬리 및 리보솜 결합 부위 (Shine-Dalgar no (SD)서열)를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 선택 마커 (약제 내성 유전자 등), 리포터 유전자 (루시퍼라아제 유전자, ß-갈락토시다아제 유전자, 클로람페니콜아세틸전달효소 (CAT) 유전자 등)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 이러한 벡터 유형으로는 예를 들면 플라스미드 벡터, 에피솜 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명에 따라 벡터에 의해 인코딩되는 단백질은 전술한 바와 같이, 결합 유도 능력을 가지는 단백질, 다량체화 능력을 가진 형광 단백질, mAG1, 이들 단백질의 융합 단백질이다. 이러한 단백질을 인코딩하는 DNA 발현 효율을 더 향상시킨다는 면에서 단백질을 발현시키는 세포의 종류에 따라 최적화된 코돈을 가지는 DNA (예를 들면 인간화 코돈 DNA)는 본 발명에 따른 벡터에 삽입되어 있을 수 있다.
(a), (b) 및 (c)의 "임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위"는, 예를 들어, 하나 이상의 여러 제한 효소 인식 부위를 함유하는 다중 클로닝 부위, TA 클로닝 부위, GATEWAY (등록 상표) 클로닝 부위를 포함한다.
본 발명에 따른 벡터 제조에는 완충액, 안정제, 보존제 및 방부제 등의 다른 성분이 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 형질 전환 세포는 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 벡터를 세포에 도입함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 형질 전환 세포의 제조에는 세포의 보존과 배양에 필요한 배지 및 안정제, 보존제, 방부제 및 소독제 등의 다른 성분을 첨가하거나 결합시킬 수 있다.
본 발명에 따른 "사용 설명서"는 본 발명의 방법에 벡터와 형질 전환 세포를 사용하기 위한 사용 설명서이다. 사용 설명서는 예를 들면, 본 발명의 방법의 실험 방법과 실험 조건, 본 발명의 제조에 대한 정보 (예를 들면, 염기 서열, 클로닝 부위, 벡터 등이 표시되어 있는 벡터 지도와 같은 정보, 형질 전환 세포의 기원과 성질에 대한 정보, 세포의 배양 조건 등)를 포함할 수 있다.
[실시예]
이하에서 본 발명은 실시예를 기초로 해서 더 특정하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 아래의 실시예를 한정하지는 않는다.
(실시예1)
＜결합 유도 단백질 스크리닝 1＞
단백질 간의 상호작용을 감지하기 위한 시스템을 구축하기 위해서는 도1과 도2에서 예시하는 개념을 바탕으로 도3과 도4에 나열된 방법에 의해 본 발명에 따른 "결합 유도 단백질"이라고 하는 단백질의 검색을 수행하였다. 특정하게는, 단량체 Azami Green 1 (mAG1)와 융합한 경우에는 세포 내에서 분산되어 존재하고 (도4 참고), 다른 한편으로는 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 융합시킨 경우에 세포 내에서 형광 휘점 (결합체)을 형성할 수 있는 단백질 (도3 참고)을 스크리닝하였다.
이러한 스크리닝의 대상으로, 우선 PB1 (Phox과 Bem1p) 도메인을 착안하였다. p62의 PB1 (이하에서 "p62(PB1)"라고 불림)과 융합된 mAG1로 구성된 단백질, 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로서 Azami Green (AG)을 융합시킨 단백질을 배양 세포에서 발현시켰다. 이어서, 융합 단백질 간의 결합, 최종적으로는 결합체 형성에 의해 발생하는 형광 휘점의 발생 유무를 후술한 방법에 의해 조사하였다. AG는 동종사량체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 얻어진 결과를 도5에 나타낸다.
(플라스미드 DNA 제조)
mAG1를 융합하기 위한 플라스미드 DNA로서, phmAG1-MCLinker (Amalgaam 유한 회사 제조)를 채택하였다.
반면에, AG를 융합하기 위한 플라스미드 (phAG-MCLinker)의 제조에 있어서는, 먼저 인간화 코돈 Azami Green (AG) 유전자 (SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가지는 영역을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 가짐)를 인공적으로 합성하였다. 인공적으로 합성한 인간화 코돈 AG (hAG) 유전자를 주형으로 하고 아래의 프라이머 세트를 사용해서 PCR 증폭을 수행하였다:
hAG 정방향 프라이머 1; 5'-CTAGCTAGCATTGCCACCATGGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG-3' (SEQ ID NO: 57),
hAG 역방향 프라이머 1; 5'-ACTACCGGTCTTGGCCTGGCTGGGCAGCATGCTGTACC-3' (SEQ ID NO: 58).
이어서 이와 같이 얻어진 증폭 산물을 NheI와 AgeI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker에 삽입하여 phAG-MCLinker를 제조하였다.
또한 phmAG1-p62(PB1)과 phAG-p62(PB1) 제조에 있어서는, 먼저 p62의 PB1 도메인 (SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열의 영역)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO：3의 염기 서열을 가짐)를 이하의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해서 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
p62(PB1) 정방향 프라이머 1;
5'-AAGAATTCGATGGCGTCGCTCACCGTGAAGGCCTACCTTCTGGGC-3' (SEQ ID NO: 59),
p62(PB1) 역방향 프라이머 1;
5'-AATTGGCGGCCGCTTATTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATGTC-3' (SEQ ID NO: 60).
이어서 얻어진 증폭 산물을 EcoRI과 NotI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MCLinker과 phmAG1-MCLinker에 삽입하여 phAG-p62(PB1)과 phmAG1-p62(PB1)를 각각 제조하였다.
(배양 세포에의 유전자 도입)
phAG-p62(PB1)와 phmAG1-p62(PB1)를 도입한 배양 세포로서 HeLaS3 세포를 채택하였다. HeLaS3 세포를 10% FBS (Equitech-Bio Inc사 제조)을 함유한 DMEM 저 포도당 (SIGMA ALDRICH사 제조)에서 배양하였다. 또한, 유전자 도입 전날에 HeLaS3 세포를 35mm 유리 기반 접시 (Asahi Glass사 제조)로 시딩하였다. 또한 유전자 도입 시에는 1 μg의 phAG-p62(PB1) 또는 phmAG1-p62(PB1)을 OptiMEM (Life Technologies사 제조)로 희석하였고 10 μg의 PolyFect (R) 트렌스펙션 시약 (QIAGEN N.V.사 제조)을 첨가하고 교반시켰다. 이어서, 생성물을 배양액 600 μl와 혼합시킨 후, HeLaS3 세포에 첨가하고 22시간 후에 관찰하였다.
(유전자 도입 세포 관찰)
유전자 도입 처리 후에 HeLaS3 세포를 IX-71 도립 현미경 (Olympus사 제조), U-MGFPHQ 필터 (Olympus사 제조), ORCA-ER 디지털 카메라 (Hamamatsu photonics K.K. 제조)를 이용해서, Hanks' Balanced Salt Solutions (Life Technologies사 제조)과 20mM HEPES (Dojindo Laboratories 제조)를 함유하는, pH 7.4의 완충액에서 관찰하였다.
도5에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)을 mAG1를 융합한 경우에는 세포에서 분산된 상태로 존재하였다. 한편으로는, p62(PB1)을 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질인, AG와 융합한 경우에는 형광 휘점은 세포 내에서 검출하여, p62(PB1)와 AG로 구성된 융합 단백질은 결합해서 형광 휘점을 형성하는 것을 나타내었다. 따라서, p62의 PB1 도메인은 그 자체로는 결합 능력을 보유하고 있지 않지만 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질과 융합할 때 결합체 (형광 휘점)를 형성하는 특성을 가지며, p62의 PB1 도메인은 본 발명에 따른 결합 유도 단백질로서 적절히 유용하다는 것을 나타낸다.
(실시예 2)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 1＞
p62의 PB1 도메인이 본 발명에 따른 결합 유도 단백질로서 적합하게 사용가능하다는 것을 입증하기 위해서, 즉 p62의 PB1 도메인을 도1과 도2에서 예시하고 있는 모델에 적용할 수 있다는 것을 입증하기 위해, 약물을 첨가함으로써 상호작용을 유발할 수 있는 단백질을 사용하여 후술한 방법에 의해서 테스트를 수행하였다. 도6-8는 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
실시예2에서 사용하는 mTOR 단백질의 FRB 도메인 ("mTOR(FRB)" 또는 "mTOR (FRB 도메인)"라고도 함)과 FKBP12 단백질은 라파마이신의 존재 하에서 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (Chen J 등, Proc Natl Acad Sci U S A., 1995년 5월 23일, 92권 11호, 4947-4951 페이지 참고).
(플라스미드 DNA 제조)
AG를 융합시키기 위한 플라스미드 (phAG-MNLinker)의 제조에 있어서는, 먼저 인간화 코돈 Azami Green (AG) 유전자를 phAG-MCLinker를 주형으로 하고 다음과 같은 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
hAG 정방향 프라이머 2; 5'-GGACCGGTATGGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG-3' (SEQ ID NO: 61),
hAG 역방향 프라이머 2; 5'-TTTCTAGATCACTTGGCCTGGCTGGGCAGCATGC-3' (SEQ ID NO: 62).
이어서 이와 같이 얻어지는 증폭 산물을 AgeI와 XbaI로 절단하고 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MNLinker (유한 회사 Amalgaam사 제조)에 삽입하여 phAG-MNLinker를 제조하였다.
반면에, p62(PB1)를 융합시키기 위한 플라스미드 (pp62(PB1)－MNLinker)의 제조에 있어서는, 먼저 p62의 PB1 도메인 (SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 가지는 영역)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO：3의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다.
p62(PB1) 정방향 프라이머 2;
5'-GGGACCGGTATGGCGTCGCTCACCGTGAAGGCCTACCTTC-3' (SEQ ID NO: 63),
p62(PB1) 역방향 프라이머 2;
5'-ACCTCTAGATTATTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATG-3' (SEQ ID NO: 64).
이어서 이와 같이 얻어진 증폭 산물을 AgeI와 XbaI로 절단하고 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MNLinker에 삽입하여 pp62(PB1)－MNLinker를 제조하였다.
추가로, p62(PB1)를 융합하기 위한 플라스미드 (pp62(PB1)－MCLinker)의 제조에 있어서는, 먼저 p62의 PB1 도메인 (SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 가지는 영역)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 3 염기 서열을 가짐)을 pp62(PB1)－MNLinker을 주형으로 하고 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
p62(PB1) 정방향 프라이머 3;
5'-TAGCGCTAGCATTGCCACCATGGCGTCGCTCACCGTGAAGGCCTACCTTC-3' (SEQ ID NO: 65),
p62(PB1) 역방향 프라이머 3;
5'-AAAACCGGTTTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATG-3' (SEQ ID NO: 66).
이어서 이와 같이 얻어진 증폭 산물을 NheI와 AgeI로 절단하고 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker에 삽입함으로써, pp62(PB1)－MCLinker를 제조하였다.
또한 pmTOR (FRB 도메인)－hAG 제조에 있어서는, 먼저 mTOR의 FRB 도메인 (mTOR 단백질과 2025∼2114번째 아미노산에서 영역으로서, SEQ ID NO: 22 아미노산 서열을 가짐)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 21의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다.
mTOR(FRB) 정방향 프라이머;
5'-GCCGAATTCGGCCACCATGGAGATGTGGCATGAAGGCCTGGAAGAGGCATCTCG-3' (SEQ ID NO: 67),
mTOR(FRB) 역방향 프라이머;
5'-GGGCTCGAGCCCTGCTTTGAGATTCGTCGGAACACATGATAATAGAGGTCCC-3' (SEQ ID NO: 68).
이어서 이와 같이 얻어진 증폭 산물을 EcoRI와 XhoI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MNLinker에 삽입하여 pmTOR(FRB 도메인)－hAG를 제조하였다. pmTOR(FRB 도메인)－hAG는 mTOR(FRB)와 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mTOR(FRB)-AG"라고도 함)을 인코딩한다.
추가로, pp62(PB1)－FKBP12 제조에 있어서는, 먼저 FKBP12 (총 길이 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 가지는 영역)을 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 23 의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
FKBP12 정방향 프라이머; 5'-GCCGAATTCGATGGGAGTGCAGGTGGAAACC-3' (SEQ ID NO: 69)
FKBP12 역방향 프라이머; 5'-GGGCTCGAGTTATTCCAGTTTTAGAAGCTCCA-3' (SEQ ID NO: 70)
이어서 이와 같이 얻어진 증폭 산물을 EcoRI과 XhoI으로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MCLinker에 삽입함으로써, pp62(PB1)－FKBP12를 제조하였다. pp62(PB1)-FKBP12는 p62(PB1)와 FKBP12 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "p62(PB1)－FKBP12"라고도 함)를 인코딩한다.
반면에 phAG-FKBP12 제조에 있어서는, 먼저 phAG-MCLinker을 NheI와 AgeI로 절단하여 hAG1 유전자를 제조하였다. 이어서 hAG1 유전자를 p62(PB1) 영역을 절단하기 위해서 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)-FKBP12에 삽입하여 phAG-FKBP12를 제조하였다.
또한 phmAG1-FKBP12 제조에 있어서는, 먼저 phmAG1-MCLinker을 NheI와 AgeI로 절단하여 hmAG1 유전자를 제조하였다. 이어서 hmAG1 유전자를 p62(PB1) 영역을 절단하기 위해서 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)-FKBP12에 삽입하여 phmAG1-FKBP12를 제조하였다. phmAG1-FKBP12는 mAG1 단백질과 FKBP12 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-FKBP12"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 pmTOR(FRB 도메인)-p62(PB1) 제조에 있어서는, 먼저 pp62(PB1)－MNLinker를 AgeI와 XbaI로 절단하여 p62(PB1) 유전자를 제조하였다. 이어서 유전자를 hAG 영역을 절단하기 위해서 동일한 제한 효소로 처리한 pmTOR(FRB 도메인)－hAG에 삽입하여 pmTOR(FRB 도메인)-p62(PB1)를 제조하였다. pmTOR(FRB 도메인)-p62(PB1)은 mTOR (FRB)과 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mTOR (FRB)-p62(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합한 것을 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 HeLaS3 세포에 각각 도입하였다:
pmTOR(FRB 도메인)－hAG와 pp62(PB1)－FKBP12 조합;
phAG-FKBP12와 pmTOR(FRB 도메인)-p62(PB1)의 조합;
phmAG1-FKBP12와 pmTOR(FRB 도메인)-p62(PB1)의 조합.
또한, 유전자 도입 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 이어서, 100 nM의 라파마이신 (Merck KGaA사 제조)을 첨가하기 전에 그리고 첨가 300초 후에 형광 이미지를 촬영하였다.
도6에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, mTOR (FRB)-AG는 라파마이신을 첨가하기 전에 분산되어 있는 반면에 (도6의 좌측 패널 참고) 첨가 후에 형광 휘점을 세포에서 발견하였다 (도6의 우측 패널 참고). 또한, 도7에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, AG-FKBP12는 라파마이신을 첨가하기 전에 분산되어 있는 반면 (도7 상단 패널 참고) 형광 휘점을 첨가 후 세포에서 발견하였다 (도7 하단 패널 참고). 따라서, 라파마이신 의존적인 mTOR(FRB)와 FKBP12 단백질의 상호작용에 의해, mTOR(FRB)-AG는 p62(PB1)－FKBP12와 자발적으로 결합하고, AG-FKBP12는 mTOR(FRB)-p62(PB1)와 자발적으로 결합하고 그 결과, 각 형광 휘점이 모두 형성되는 것을 나타내었다.
한편으로는, 도8에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이 mAG1를 형광 단백질로 사용한 경우에는 라파마이신 첨가 후 세포에서 형광 휘점이 검출되지 않았으며 라파마이신 의존적인 결합체의 형성은 관찰되지 않았다. 따라서, 다량체화 능력을 가진 형광 단백질과 결합 유도 단백질을 조합해서 사용하지 않는다면 단백질 간의 상호작용에 의해 결합체가 형성되지 않고 형광 휘점이 검출되지 않는다는 것을 나타내고, 도1과 도2에서 예시하는 모델은 적용가능하다는 것을 입증하였다.
(실시예 3)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 2＞
p62의 PB1 도메인이 도1과 2에서 예시하는 모델에 적용할 수 있다는 것을 입증하기 위해 전술한 mTOR의 FRB 도메인과 FKBP12를 사용하여 후술한 방법으로 테스트를 수행하였다. 도9-11는 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합시키고, 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 HeLaS3 세포에 각각 도입하였다. 이어서, 100 nM의 라파마이신 (Merck KGaA사 제조)을 첨가하기 전에 그리고 첨가 300초 후에 형광 이미지를 촬영하였다.
pmTOR(FRB 도메인)－hAG와 pp62(PB1)－FKBP12 조합;
pmTOR(FRB 도메인)－hmAG1와 pp62(PB1)－FKBP12 조합;
pmTOR(FRB 도메인)－hAG와 pp62(PB1_nc)-FKBP12 조합
(플라스미드 DNA 제조)
pmTOR(FRB 도메인)-hmAG1를 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 pmTOR (FRB 도메인)－hAG로부터 hAG를 인코딩하는 DNA를 절단하고 다른 위치에서 hmAG1를 인코딩하는 DNA를 삽입하여 제조하였다.
또한, pp62 (PB1_nc)-FKBP12를 첨부한 사용 설명서에 따라 다음의 프라이머를 사용해서, pp62(PB1)－FKBP12를 주형으로 하고 AMAP (TM) 여러 부위 특이적 변이 유발 키트 (Amalgaam 유한 회사 제조)를 사용하는 변이를 도입해서 제조하였다.
SEQ ID NO: 154의 DNA 서열을 가지는 프라이머:
5'-GCTTCCAGGCGCACTACCGCGCTGAGCGCGGGGACTTGGTTGCCTTTTC-3'. p62(PB1_nc)는 변이체가 결합 유도능력을 가지지 않도록 하기 위해서, p62(PB1)이 다른 p62(PB1)과 상호작용하는 인터페이스에 2-아미노산의 변이를 도입함으로써 얻어지는 변이체이다.
도9에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 실시예 2에 설명한 결과와 마찬가지로 라파마이신을 첨가하기 전에는 mTOR(FRB)-AG가 분산되어 있는 반면 (도면 상부 패널 참고) 첨가 후에는 세포에서 형광 휘점을 발견하였다 (도면 하단 패널 참고).
한편으로는, 도10에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 실시예 2에 설명한 결과와 마찬가지로 mAG1를 형광 단백질로 이용한 경우에는 라파마이신을 첨가한 후에도 세포 내에서 형광 휘점이 검출되지 않으며 라파마이신 의존적인 결합체의 형성은 관찰되지 않았다.
또한 도11에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)을 대신해서 동종다량체를 형성할 수 없는 변이체인 p62(PB1_nc)를 이용한 경우에는 라파마이신 첨가한 후에도 세포에서 형광 휘점이 검출되지 않으며 라파마이신 의존적인 결합체의 형성이 관찰되지 않았다.
따라서, 다량체화 능력을 가진 형광 단백질과 결합 유도 단백질을 조합해서 사용하지 않는다면 단백질 간의 상호작용에 의해 결합체가 형성되지 않고 형광 휘점이 검출되지 않으며 이것은 도1과 도2에 예시한 모델이 적용가능하다는 것을 입증하는 것이다.
본 발명의 단백질 간의 상호작용을 검출 방법은 형광 휘점이 단백질간의 상호작용이 발생할 때에만 자동적으로 형성된다는 점에서, 단백질 간의 상호작용을 검출하는 종래의 방법과는 완전히 다른 방법이다.
(실시예 4)
<결합 유도 단백질을 위한 스크리닝 2>
p62(PB1)과 유사한 성질을 가지는 결합 유도 단백질을 알아내기 위해서 스크리닝을 실시예1에 기재한 바와 동일한 방법으로 수행하였다.
PB1 도메인 이외의 스크리닝 대상으로 SAM 도메인에 착안하였다.
PB1 도메인과 융합한 mAG1으로 구성된 단백질 또는 단백질로부터 유도한 SAM 도메인 또는 PB1 도메인과 융합한, 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로서 작용하는 AG로 구성된 단백질 또는 단백질로부터 유도한 SAM 도메인을 배양 세포에 발현시켰다. 이어서, 융합 단백질과의 결합과 그 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점 발생 유무를 후술한 방법에 의해서 조사하였다. 도12~15는 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
(플라스미드 DNA 제조)
발현을 위한 유연성 링커 (flexible linker)를 통해서 형광 단백질의 C-말단 측 상에 단백질로부터 유도한 PB1 도메인 또는 SAM 도메인을 융합시키기 위해서, phmAG1-MCLinker를 mAG1을 융합시키기 위한 플라스미드로서 사용하였고 phAG-MCLinker를 AG를 융합하기 위한 플라스미드로서 사용하였다.
특정하게는 phmAG1-MEK5(PB1)과 phAG-MEK5(PB1)을 제조하는 데 있어서 우선 MEK5의 PB1 도메인을 인코딩하는 DNA (MEK5 단백질의 16~109째 아미노산을 가지는 영역으로, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가지고 "MEK5(PB1)"라고도 함) (DNA는 SEQ ID NO:5의 염기 서열을 가짐)를 아래의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해서 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
MEK5(PB1) 정방향 프라이머; 5'-CCGAATTCGGTGCTGGTAATTCGCATCAAGATCCCAAA-3' (SEQ ID NO: 71),
MEK5(PB1) 역방향 프라이머; 5'-TTCTCGAGTTAGCAGGCTCTTGGAAATATCTGCAG-3' (SEQ ID NO: 72).
이어서, 이와 같이 얻은 증폭 산물을 EcoRI와 Xhol로 절단하고 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-McLinker와 phAG-MCLinker로 삽입하여, phmAG1-MEK5(PB1)과 phAG-MEK5(PB1)를 각각 제조하였다. 이러한 플라스미드 DNA는 mAG1 단백질과 MEK5(PB1)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-MEK5(PB1)"라고도 함), AG 단백질과 MEK5(PB1)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-MEK5(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
반면에 phmAG1-Nbr1(PB1)과 phAG-Nbr1(PB1)를 제조하는 데 있어서 우선 Nbr1의 PB1 도메인 (영역은 Nbr1 단백질의 4~85번째 아미노산을 가지며, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 가지고 "Nbr1(PB1)"라고도 함)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 7의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
Nbr1(PB1) 정방향 프라이머; 5'-AAGAATTCGGCAGGTTACTCTAAATGTGACTTTTAAA-3' (SEQ ID NO: 73),
Nbr1(PB1) 역방향 프라이머; 5'-TTCTCGAGTTACCCTTCGTGGACTTGCATCTGCAGTT-3' (SEQ ID NO: 74).
이어서, 이와 같이 얻은 증폭 산물을 EcoRI과 XhoI로 절단하고 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker로 삽입하여 phmAG1-Nbr1(PB1)과 phAG-Nbr1(PB1)를 각각 제조하였다. 이러한 플라스미드 DNA는 mAG1 단백질과 Nbr1(PB1) (융합 단백질은 "mAG1-Nbr1(PB1)"라고도 함)로 구성된 융합 단백질과 AG 단백질과 Nbr1(PB1) (융합 단백질은 "AG-Nbr1(PB1)"라고도 함)로 구성된 융합 단백질을 인코딩한다.
또한 phmAG1-PKCiota(PB1)와 phAG-PKCiota(PB1)를 제조하는 데 있어서는 우선 PKCiota의 PB1 도메인 (영역은 PKCiota 단백질의 16~99번째 아미노산을 가지며 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 가지며 "PKCiota(PB1)"라고도 함)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 9의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해서 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다.
PKCiota(PB1) 정방향 프라이머;
5'-AAGAATTCGCAGGTCCGGGTGAAAGCCTACTACCGCG-3' (SEQ ID NO: 75),
PKCiota(PB1) 역방향 프라이머 18;
5'-TTCTCGAGTTAACAAGGGAACACATGAATCAAGAGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 76).
이어서 얻어진 증폭 산물을 EcoRI과 XhoI으로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker에 삽입하여 phmAG1-PKCiota(PB1)과 phAG-PKCiota(PB1)를 각각 제조하였다. 이러한 플라스미드 DNA는 각 mAG1 단백질과 PKCiota(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-PKCiota(PB1)"라고도 함)과 AG 단백질과 PKCiota(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-PKCiota(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phmAG1-TFG(PB1)과 phAG-TFG(PB1) 제조에 있어서는, 먼저 TFG의 PB1 도메인 (TFG 단백질의 10-91째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 12 아미노산 서열을 가지며 "TFG(PB1)"라고도 함)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 11의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
TFG(PB1) 정방향 프라이머 1;
5'-AACTGCAGCAAAGCTAATCATCAAAGCTCAACTTGGGGA-3' (SEQ ID NO: 77),
TFG(PB1) 역방향 프라이머 1;
5'-TTAAGCTTTTAATTAACAAATAATGTCAGTTTCAGTAT-3' (SEQ ID NO: 78).
이어서 얻어진 증폭 산물을 PstI와 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker에 삽입하여 phmAG1-TFG(PB1)과 phAG-TFG(PB1)를 각각 제조하였다. 플라스미드 DNA는 각 mAG1 단백질과 TFG(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-TFG(PB1)"라고도 함)과, AG 단백질과 TFG(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-TFG(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phmAG1-TEL(SAM)과 phAG-TEL(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 TEL의 SAM 도메인 (TFG 단백질 중 38~124째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 가지며 "TEL(SAM)"라고도 함)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO： 13의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
TEL(SAM) 정방향 프라이머;
5'-AAAAGGATCCGCCACCATGCCTCGAGCGCTCAGGATGGAGGAA-3' (SEQ ID NO: 79),
TEL(SAM) 역방향 프라이머;
5'-AAAAAAGCTTTTACCTCTGCTTCAGAATATGCTGAAGGAGTT-3' (SEQ ID NO: 80).
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker에 삽입하여 phmAG1-TEL(SAM)과 phAG-TEL(SAM)를 각각 제조하였다. 이 플라스미드 DNA는 각 mAG1 단백질과 TEL(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-TEL(SAM)"라고도 함)과 AG 단백질과 TEL(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-TEL(SAM)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phmAG1-EphB2(SAM)과 phAG-EphB2(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 EphB2 SAM 도메인 (EphB2 단백질의 905-981째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 가지며 "EphB2(SAM)"라고도 함))을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 15의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리에서 증폭시켰다:
EphB2(SAM) 정방향 프라이머;
5'-AAAAGGATCCGCCACCATGCTGGACCGCACGATCCCCGA-3' (SEQ ID NO: 81)
EphB2(SAM) 역방향 프라이머;
5'-AAAAAAGCTTTTAAATCTGGTTCATCTGCGCCCG-3' (SEQ ID NO: 82)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker에 삽입하여 phmAG1-EphB2(SAM)과 phAG-EphB2(SAM)를 각각 제조하였다. 이 플라스미드 DNA는 각 mAG1 단백질과 EphB2(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-EphB2(SAM)"라고도 함)과 AG 단백질 EphB2(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-EphB2(SAM)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phmAG1-DGK delta(SAM)과 phAG-DGK delta(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 DGK delta의 SAM 도메인 (DGK delta 단백질의 1097∼1164째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 가지며 "DGK delta(SAM)"라고도 함)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 17의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
DGK delta(SAM) 정방향 프라이머;
5'-AAAAGGTACCGCCACCATGCCGGTTCACCTCTGGGGGACA-3' (SEQ ID NO: 83),
DGK delta(SAM) 역방향 프라이머;
5'-AAAAAAGCTTTTAGCTGCGGCTCAGCTCCTTGAT-3' (SEQ ID NO: 84).
이어서 얻어진 증폭 산물을 KpnI와 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker에 삽입하여 phmAG1-DGK delta(SAM)과 phAG-DGK delta(SAM)를 각각 제조하였다. 이 플라스미드 DNA는 각 mAG1 단백질과 DGK delta(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-DGK delta(SAM)"라고도 함)과, AG 단백질과 DGK delta(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-DGK delta(SAM)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phmAG1-Tankyrase(SAM)과 phAG-Tankyrase(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 Tankyrase의 SAM 도메인 (Tankyrase 단백질의 952-1078째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO： 20의 아미노산 서열을 가지며 "Tankyrase(SAM)"라고도 함)을 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 19 의 염기 서열을 가짐)를 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 증폭시켰다.
Tankyrase(SAM) 정방향 프라이머;
5'-AAAAGGATCCGCCACCATGCTGATAGATGCCATGCCCCCAGA-3' (SEQ ID NO: 85),
Tankyrase(SAM) 역방향 프라이머;
5'-AAAAAAGCTTTTAAATTCGAATGACATTGTATCTGTTGAAGA-3' (SEQ ID NO: 86).
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmAG1-MCLinker과 phAG-MCLinker에 삽입하여 phmAG1-Tankyrase(SAM)과phAG-Tankyrase(SAM)를 각각 제조하였다. 이 플라스미드 DNA는 각 mAG1 단백질과 Tankyrase(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mAG1-Tankyrase(SAM)"라고도 함)과 AG 단백질과 Tankyrase(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-Tankyrase(SAM)"라고도 함)을 인코딩한다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
플라스미드 DNA를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, HeLaS3 세포에 각각 도입하였다. 또한, 유전자 도입 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다.
도13, 14 및 15에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, PKCiota(PB1), TFG(PB1), TEL(SAM), DGK delta(SAM) 및 Tankyrase(SAM)를 mAG1를 융합한 경우에는 분산되고, AG를 융합한 경우에는 형광 휘점 (결합체)을 형성하였다. AG-PKCiota(PB1)을 발현시킨 세포는 형광 휘점을 형성하는 세포와 이를 형성하지 않는 세포 둘다를 포함한다. 반대로, AG 단백질을 포함하는 다른 융합 단백질을 발현시키는 모든 세포에서는 형광 휘점을 발견하였다.
한편으로는, 도12과 도15에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, MEK5(PB1), Nbr1(PB1) 및 EphB2(SAM)을 mAG1와 융합시키거나 AG와 융합시킨 경우에는, 형광 휘점 형성이 관찰되지 않았다.
따라서, TFG(PB1), TEL(SAM), DGK delta(SAM) 및 Tankyrase(SAM)는 본 발명에 따른 결합 유도 단백질로 사용가능하다는 것을 나타내었다.
(실시예 5)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 3＞
실시예 4에서 선택한 결합 유도 단백질이 본 발명의 단백질 간의 상호작용의 판정 방법에 적합하게 사용가능하다는 것을 입증하기 위해서 후술한 테스트를 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 얻어진 결과를 도16에 나타낸다.
(플라스미드 DNA 제조)
pFKBP12-TFG(PB1) 제조에 있어서는, 먼저 TFG(PB1) 유전자를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 phAG-TFG(PB1)로부터 증폭시켰다:
TFG(PB1) 정방향 프라이머 2;
5'-AAACCGGTAAGCTAATCATCAAAGCTCAACTT-3' (SEQ ID NO: 87),
TFG(PB1) 역방향 프라이머 2;
5'-TTTCTAGATTAATTAACAAATAATGTCAGTTTCAGTAT-3' (SEQ ID NO: 88).
이어서 얻어진 증폭 산물을 p62(PB1) 영역을 절단하기 위해 AgeI과 XbaI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pFKBP12-p62(PB1)에 삽입하여 pFKBP12-TFG(PB1)를 제조하였다. pFKBP12-TFG(PB1)은 FKBP12 단백질과 TFG(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "FKBP12-TFG(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
반면에 pFKBP12-TEL(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 TEL(SAM) 유전자를 다음 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 phAG-TEL(SAM)로부터 증폭시켰다:
TEL(SAM) 정방향 프라이머 2;
5'-AAAAACCGGTCCTCGAGCGCTCAGGATGGAGGAA-3' (SEQ ID NO: 89),
TEL(SAM) 역방향 프라이머 2;
5'-AAAATCTAGATTACCTCTGCTTCAGAATATGCTGAAGGAGTT-3' (SEQ ID NO: 90).
이어서 얻어진 증폭 산물을 p62(PB1) 영역을 절단하기 위해서 AgeI과 XbaI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pFKBP12-p62(PB1)에 삽입하여 pFKBP12-TEL(SAM)를 제조하였다. pFKBP12-TEL(SAM)는 FKBP12 단백질과 TEL(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "FKBP12-TEL(SAM)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 pFKBP12-DGK delta(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 DGK delta(SAM) 유전자 다음 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 phAG-DGK delta(SAM)로부터 증폭시켰다
DGK delta(SAM) 정방향 프라이머 2;
5'-AAAAACCGGTCCGGTTCACCTCTGGGGGACAGA-3' (SEQ ID NO: 91),
DGK delta(SAM) 역방향 프라이머 2;
5'-AAAATCTAGATTAGCTGCGGCTCAGCTCCTTGAT-3' (SEQ ID NO: 92).
이어서 얻어진 증폭 산물을 p62(PB1) 영역을 절단하기 위해서 AgeI과 XbaI로 절단하고 동일한 제한 효소로 처리한 pFKBP12-p62(PB1)에 삽입하여 pFKBP12-DGK delta(SAM)를 제조하였다. pFKBP12-DGK delta(SAM)는 FKBP12 단백질과 DGK delta(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "FKBP12-DGKd(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 pFKBP12-Tankyrase(SAM)의 제조에 있어서는, 먼저 Tankyrase(SAM) 유전자를 다음 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 phAG-Tankyrase(SAM)로부터 증폭시켰다:
Tankyrase(SAM) 정방향 프라이머 2;
5'-AAAAACCGGTCTGATAGATGCCATGCCCCCAGA-3' (SEQ ID NO: 93),
Tankyrase(SAM) 역방향 프라이머 2;
5'-AAAATCTAGATTAAATTCGAATGACATTGTATCTGTTGAAGA-3' (SEQ ID NO: 94).
이어서 얻어진 증폭 산물을 p62(PB1) 영역을 절단하기 위해서 AgeI과 XbaI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pFKBP12-p62(PB1)에 삽입하여 pFKBP12-Tankyrase(SAM)를 제조하였다. pFKBP12-Tankyrase(SAM)는 FKBP12 단백질과 Tankyrase(SAM)으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "FKBP12-Tankyrase(SAM)"라고도 함)을 인코딩한다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합시키고, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, HeLaS3 세포에 각각 도입하였다:
pmTOR (FRB 도메인)－hAG와 pFKBP12-TFG(PB1)의 조합;
pmTOR (FRB 도메인)－hAG와 pFKBP12-TEL(SAM)의 조합;
pmTOR (FRB 도메인)－hAG와 pFKBP12-DGK delta(SAM)의 조합;
pmTOR (FRB 도메인)－hAG와 pFKBP12-Tankyrase(SAM)의 조합.
또한, 유전자 도입 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 이어서, 100 nM의 라파마이신 (Merck KGaA사 제조)을 첨가하기 전에 각 배양 세포에서 형광 휘점이 검출되지 않는 것을 확인하였고 첨가 300초 후에 형광 이미지를 촬영하였다.
도16에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 융합 단백질을 발현시킨 경우에도 라파마이신을 첨가하기 전에는 mTOR (FRB 도메인)-AG은 분산하여 존재하고 있는 반면 (예시하지 않음) 첨가 후에도 세포에서 형광 휘점을 발견하였다. 즉 mTOR (FRB 도메인)와 FKBP12 단백질의 라파마이신 의존적인 상호작용에 의해, mTOR (FRB 도메인)-AG를 FKBP12-TEL(SAM)과 자발적으로 결합시켰고, 그 결과 형광 휘점을 형성하는 것을 나타내었다.
따라서, p62(PB1)뿐만 아니라 TEL(SAM) 등 다른 단백질로부터 유래된 다른 종류의 도메인을 결합 유도 단백질로서 단백질 간의 상호작용은 검출할 수 있었다는 것을 나타내었다. 또한, 이러한 결과는 도3과 도4에서 예시한 모델은 본 발명에 따라 결합 유도 단백질을 위한 스크리닝 방법으로서 적용가능하다는 것을 입증하였다.
(실시예 6)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 3＞
AG 단백질 이외의 형광 단백질이 본 발명의 단백질 상호작용의 판정 방법에 있어서, 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로서의 적용 가능 여부를 후술한 방법으로 확인하였다. 얻어진 결과를 도17에 나타낸다.
이와 같이 조사한 형광 단백질은 각각 동종이량체, 동종이량체 및 동종사량체하는 것으로 알려져 있는, Kusabira-Orange 1 (KO1), 이합체 Keima-Red (dKeima) 및 Kikume Green-Red (KikGR)였다.
(플라스미드 DNA 제조)
pmTOR(FRB 도메인)-hKO1의 제조에 있어서는, 먼저 hKO1 유전자를 다음의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 phKO1-MN1 (Amalgaam 유한 회사 제조)로부터 증폭시켰다:
hKO1 정방향 프라이머; 5'-AAAAACCGGTATGGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG-3' (SEQ ID NO: 95),
hKO1 역방향 프라이머; 5'-AAAATCTAGATTAGCAGTGGGCCACGGCGTCCTCC-3' (SEQ ID NO: 96).
이어서 얻어진 증폭 산물을 hAG 영역을 절단하기 위해서 AgeI과 XbaI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pmTOR(FRB 도메인)－hAG에 삽입하여 pmTOR(FRB 도메인)-hKO1를 제조하였다.
반면에 pmTOR(FRB 도메인)-hdKeima-Red의 제조에 있어서는, 먼저 hdKeima 유전자를 phdKeima-Red-MNLinker (Amalgaam 유한 회사 제조)를 AgeI과 XbaI로 절단하여 제조하였다. 이어서 얻어진 hdKeima 유전자를 hAG 영역을 절단하기 위해서 제한 효소로 처리한 pmTOR(FRB 도메인)－hAG에 삽입하여 pmTOR(FRB 도메인)-hdKeima-Red를 제조하였다.
또한 pmTOR(FRB 도메인)-hKikGR1의 제조에 있어서는, 먼저 hKikGR1 유전자를 phKikGR1-MNLinker (Amalgaam 유한 회사 제조)를 AgeI과 XbaI에서 절단하여 제조하였다. 이어서, 얻어진 hKikGR1 유전자를 hAG 영역을 절단하기 위해서, 제한 효소로 처리한 pmTOR(FRB 도메인)－hAG에 삽입하여 pmTOR (FRB 도메인)-phKikGR1를 제조하였다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합시키고, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, HeLaS3 세포에 각각 도입하였다:
pmTOR(FRB 도메인)－hKO1와 pp62(PB1)－FKBP12의 조합;
pmTOR(FRB 도메인)－hdKeima-Red와 pp62(PB1)－FKBP12의 조합;
pmTOR(FRB 도메인)－hKikGR1와 pp62(PB1)－FKBP12의 조합;
pmTOR(FRB 도메인)－hAG와 pp62(PB1)－FKBP12의 조합.
또한, 유전자 도입 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. KO1를 여기 필터 (BP520-540HQ, Olympus사), 색선별 거울 (DM545HQ, Olympus사 제조), 흡수 필터 (BA555-600HQ, Olympus사 제조)을 사용하여 관찰하였다. dKeima를 여기 필터 (440AF21, OMEGA OPTICAL사 제조), 색선별 거울 (455DRLP, OMEGA OPTICAL사 제조), 흡수 필터 (610ALP, OMEGA OPTICAL사 제조)를 사용하여 관찰하였다. 이어서, 100 nM의 라파마이신 (Merck KGaA사 제조)을 첨가하기 전에 그리고 첨가 300초 후에 형광 이미지를 촬영하였다.
도17에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, AG 단백질을 이용한 경우에는 모든 조사한 형광 단백질이 라파마이신을 첨가하기 전에는 형광 단백질을 융합한 mTOR (FRB)는 분산하여 존재하고 있는 반면 첨가한 후에는 형광 휘점 (결합체)을 형성한다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 있어서, AG 단백질 뿐만 아니라 KO1 단백질 등 다량체화 능력을 가지는 다른 형광 단백질을 이용해서도 단백질 간의 상호작용을 판정가능하다는 것을 입증하였다.
(실시예 7)
＜다량체화 능력을 가지는 형광 단백질 스크리닝 1＞
본 발명의 단백질 상호작용의 판정 방법에 있어서, AG, KO1, dKeima 및 KikGR 이외의 형광 단백질이 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로서 적용 가능한지 여부를 후술한 방법으로 확인하였다. 특정하게는, 단량체 Kusabira-Orange 2 (mKO2)와 결합 유도 단백질로서 작용하는 p62(PB1)와 융합하고, 세포 내에서 발현된 경우 도3에 나타낸 결합체 (형광 휘점)가 형성되는지 여부를 조사하였다. 얻어진 결과를 도18에 나타낸다.
우선 실시예1에 기재한 "phmAG1-p62(PB1)과 phAG-p62(PB1)"의 경우와 같이 p62(PB1)을 인코딩하는 DNA를 PCR로 증폭하여 얻어진 증폭 산물을 EcoRI과 NotI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phmKO2-MCLinker (Amalgaam 유한 회사 제조)에 삽입해서 phmKO2-p62(PB1)를 제조하였다. 이어서 phmKO2-p62(PB1)를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, HeLaS3 세포에 도입하였다. 또한, 유전자 도입 세포를 실시예 6에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 얻어진 결과를 도18에 나타낸다.
도18에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, phmKO2-p62(PB1)에 의해서 인코딩되는 단백질 mKO2-p62(PB1) 단백질을 결합시키고 그 결과 형광 휘점을 형성하였다. 따라서, AG, KO1, dKeima 및 KikGR와 같은 동종다량체를 세포 내에서 형성할 수 있는 전술한 형광 단백질 뿐만 아니라 일반적으로 단량체 형광 단백질이라고 알려져 있는 mKO2도 본 발명의 방법에 있어서, 다량체화 능력을 가진 형광 단백질로 사용가능하다는 것을 나타내었다.
(실시예 8)
＜다량체화 능력을 가지는 형광 단백질 스크리닝 2＞
상술한 AG, KO1, dKeima 및 KikGR를 제외한, 세포내에서 동종다량체를 형성될 수 있는 형광 단백질로 알려져 있는 MiCy1, KCy1, dAG (AB) 및 dAG (AC) (동종이량체화 가능한 형광 단백질)뿐만 아니라 TGuv, Momiji, COR3.01, COR5 및 DsRed2 (동종사량체화 가능한 형광 단백질)에 대해서도 본 발명의 단백질 상호작용의 판정 방법에 사용할 수 있는 다음 방법에 의해 확인하였다.
또한 mKO2와 같은 단량체 형광 단백질로 일반적으로 알려져 있지만 본 발명의 방법에 사용가능한 형광 단백질을 찾기 위해 후술한 방법으로 스크리닝을 수행하였다.
(단백질 간의 상호작용의 판정 방법)
실시예 5, 6에 설명한 방법과 동일한 방법으로, 표1에 나타낸 각 형광 단백질 중 하나를 융합시킨 p62(PB1)-FKBP12, FKBP12-DGKd(SAM), FKBP12-TEL(SAM) 또는 FKBP12-Tankyrase(SAM) 및 mTOR (FRB)와, HeLaS3 세포 내에서 발현시켜, 라파마이신을 첨가한 후에 형광 휘점 (결합체) 형성 정도를 평가하였다. mTOR(FRB)와 해당하는 형광 단백질로 구성된 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드 DNA를, 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 적절하게 제조하였다. 또한 FKBP12-Tankyrase(SAM)과 mKO2, mKeima, mMiCy1, mKO1, MiCy1 및 TGuv의 조합에 관해서는 유전자를 293T 세포에 도입함으로써 시험하였다. 특정하게는 293T 세포를 10% FBS (Equitech-Bio사 제조)을 함유는 DMEM 고 포도당 (SIGMA ALDRICH사 제조)에서 배양하였다. 또한 293T 세포를 플라스미드 DNA를 도입하기 6시간 전에 8웰 챔버 (Nunc A/S 제조)상에 시딩하였다. 또한, 유전자 도입 시에는 FKBP12-Tankyrase(SAM)를 인코딩하는 200 ng의 플라스미드의 DNA와, 형광 단백질과 mTOR(FRB)로 구성된 융합 단백질을 인코딩하는 200 ng의 플라스미드 DNA중 하나를 30 μl의 OptiMEM (Life Technologies사 제조)로 희석하고 1.2 μl의 TurboFect 트랜스펙션 시약 (Thermo Scientific사 제조)첨가하고 교반시켰다. 이어서, 생성물을 300 μl의 배양액으로 더 혼합시킨 후 293T 세포에 첨가하고 48시간 후에 관찰하였다. 얻어진 결과를 표1에 나타낸다. 표1에서, "+++"는 형광 휘점이 50% 이상의 HeLaS3 세포에서 관찰한 조합을 나타내고 "++"는 50% 이하 HeLaS3 세포에서 형광 휘점을 관찰한 조합을 나타내고 "+"는 HeLaS3 세포보다 다량의 단백질을 발현시키는 293T 세포에서 형광 휘점을 관찰한 조합을 나타낸 것이다.
Figure 112014062797358-pct00001
표 1에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, 동종다량체를 세포내에서 형성할 수 있는 모든 형광 단백질은 본 발명의 방법에 사용가능하다는 것을 확인하였다. 또한, TEL (SAM)과 Tankyrase (SAM)의 결과에서, 형광 단백질의 다량체화 능력이 증대될수록 단백질 간의 상호작용에 의하여 형광 휘점 (결합체)이 형성되기 쉬운 경향이 있는 것으로 보인다. 또한, 표 1에 나타낸 바와 같이, mKO2 이외의 일반적으로 단량체 형광 단백질이라고 일반적으로 알려져 있는 mKeima, mMiCy1, mKO1 및 mKikGR1가 본 발명의 방법에 사용가능하다는 것을 나타내었다.
(실시예 9)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 5＞
후술한 방법에 의해 결합 유도 단백질로 작용하는 TFG(PB1)와의 조합에서도 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질의 용도를 확인하였고, 실시예 6~8에서 본 발명의 방법에 사용가능한 것을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 얻어진 결과를 표2에 나타낸다.
(단백질 간의 상호작용의 판정 방법)
실시예 5와 6에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, mKikGR1, dAG (AC), Momiji, KikGR, AG, COR3.01, COR5 또는 DsRed2와 융합한 TFG(PB1)와 mTOR (FRB)를, HeLaS3 세포 내에서 발현시켜, 라파마이신 첨가한 후에 형광 휘점 (결합체) 형성 정도를 측정하였다. 또한 실시예 8에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, K01 또또는 dAG (AB)를 융합시킨 TFG(PB1)과 mTOR (FRB)을 293T 세포 내에서 발현시켜, 라파마이신을 첨가한 후 형광 휘점 (결합체) 형성 정도를 측정하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에서, "++"는 50% 이하의 HeLaS3 세포에서 형광 휘점을 관찰한 조합을 나타내고 "＋"는 HeLaS3 세포보다 다량의 단백질을 발현시키는 293T 세포에서 형광 휘점을 관찰한 조합을 나타낸 것이다.
Figure 112014062797358-pct00002
표2에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, 실시예 8에 설명한 단백질 이외의 결합 유도 단백질을 함께 사용하여 다량체화 능력을 가진 형광 단백질 사용이 단백질 간의 상호작용을 판정가능하다는 것을 확인하였다.
(실시예10)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 6＞
본 발명에 따른 형광 휘점 (결합체)은 전술한 바와 같이, 단백질 간의 상호작용에서 유래하는 것이다. 따라서 형광 휘점의 형광 강도는 단백질 간의 상호작용의 강도를 반영하는 것으로 가정한다. 또한, 단백질 간의 상호작용의 판정 방법에 있어서, 해당 상호작용의 강도의 정량화와 비교는 단백질 간의 상호작용의 억제 물질 (억제제) 평가, 단백질 간의 상호작용을 조절하는 인자 평가에 유용하다.
이러한 이유 때문에, 형광 휘점 (결합체)의 형광 강도가 후술한 방법에 의해서 화합물 농도에 의존적으로 변화하는지 여부를 테스트하기 위해 단백질 간의 상호작용을 유도하는 화합물의 농도를 변화시켰다.
(세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포의 관찰과 분석)
pmTOR (FRB 도메인)－hAG와 pFKBP12-p62(PB1)을 동등한 양으로 혼합하고, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 HeLaS3 세포에 도입하였다. 세포를 도입 24시간 후에 수집하였고 20000개의 세포/웰에 96 마이크로웰 광학 저부 플레이트 상에 (Nunc A/S 제조) 시딩하였다. 이어서 시딩 후 24시간에, 5.6 μg/ml로 관측용 완충액으로 희석한 Hoechst 33342 (Dojindo사 제조) 용액을 플레이트에 첨가하고 30분 동안 더 배양하였다. 이어서 플레이트를 D-PBS (-) (Wako Pure Chemical Industries사 제조)로 2회 세척하였다. 이어서, 배지를 소정의 농도로 관측용 완충액으로 희석한 라파마이신으로 대체하였고 15분 후에, 4% 파라포름알데히드/인산 완충액 (4% Wako Pure Chemical Industries사 제조)으로 고정시켰다 (fixed). 사용한 라파마이신의 농도는 0.1 nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1.4 nM, 4.1 nM, 12.3 nM, 37.0 nM, 111.1 nM, 333.3 nM, 1000 nM였다. 이어서, 제조한 시료를 INCell Analyzer 1000 (GE Healthcare 제조)을 이용하여 관찰하였다. 얻어진 결과의 일부를 도19에 나타낸다.
또한 여러 시각에서 형광 이미지를 분석하였다. 소정의 농도로 라파마이신을 첨가한 웰의 이미지의 한 세포당 형광 휘점 (결합체)의 총 휘도 (총 형광 강도)를 계산하여 라파마이신의 농도와의 상관 관계를 분석하였다. 얻어진 결과의 일부를 도20에 나타낸다. 도20에서 X축은 각 웰에 첨가한 라파마이신의 농도를 나타내고 Y축은 한 세포당 형광 휘점 (결합체)의 총 휘도 (총 형광 강도)를 나타내고 점은 측정값을 나타낸다. 또한 Igor (R) (WaveMetrics사 제조)를 이용해서 점을 따라 이어져 있는 적정 곡선 (fitting curve)은 [Dot Intensity/Cells=y, [Canc.(nM)]=x일 때 식: y=base+(max-base)/[1+(xhalf/x)＾rate]에 피팅된 함수를 나타낸다. （base＝0.0028731, max＝01823, rate＝．4516, xhalf＝46.99).
도19와 20에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, mTOR (FRB 도메인)와 FKBP12 단백질의 상호작용을 유도하는 화합물인 라파마이신을 mTOR (FRB 도메인)-AG와 FKBP12-p62(PB1)을 발현시킨 세포에 첨가할 때 형광 휘점의 형광 강도를 첨가한 리파마이신의 농도에 의존적으로 증가한다는 것을 나타내었다. mTOR (FRB 도메인)-AG와 FKBP12-p62(PB1)사이의 결합체가 농도 의존적으로 형성된다는 것을 또한 나타내었다.
(실시예11)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 7＞
본 발명의 방법이 단백질 간의 상호작용에 대한 약물의 50% 유효 농도 (EC50)와 50% 저해 농도 (IC50)를 결정하는 데 사용가능한지 여부를 후술한 방법으로 평가하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
실시예 2에서 설명한 pmTOR (FRB 도메인)－hAG와 pFucci-S/G2/M Green-Hyg (Amalgaam 유한 회사 제조)를 사용해서, 약제 내성 유전자를 히그로마이신 B 내성 유전자로 변형하기 위해서, 종래의 방법에 따라 pmTOR (FRB 도메인)-hAG_Hyg를 제조하였다.
(안정 발현 세포 주 제조)
실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, 실시예2에서 설명한 pmTOR (FRB 도메인)－hAG_Hyg과 pp62(PB1)-FKBP12을 HeLaS3 세포 주에 도입하고 배양하였다.
또한, 플라스미드 DNA를 HeLaS3 세포 주에 도입한 후 24시간에, 배지를 600 μg/mL의 G418 (Wako Pure Chemical사 제조)와 150 μg/mL의 히그로마이신 (Nacalai Tesque사 제조)를 함유하는 배지로 교체하였다. 이어서, 한 주 동안 이러한 배지를 배양한 후에 생존한 세포를 콜로니 픽업 방법으로 복제하였다.
(유전자 도입 세포의 관찰과 분석)
복제된 세포 주를 96웰 플레이트에 시딩하였다. 이어서 그 다음날에 PBS로 2회 세척한 후에, Hoechst 33342 (Dojindo사 제조)를 함유한 관측용 완충액을 각 웰에 시딩된 세포 주에 첨가하고 이어서 핵염색을 위해 15분 동안 37℃에서 배양하였다.
또한 이러한 세포 주를 관찰용 완충액으로 2회 세척한 후 임의의 농도에서 라파마이신 또는 라파마이신과 FK506를 함유하는 관측용 완충액을 각 웰에 첨가하고 20분 동안 배양하였다.
첨가한 라파마이신의 농도는 0.39 nM, 0.78 nM, 1.56 nM, 3.13 nM, 6.25 nM, 12.50 nM, 25.00 nM, 50.00 nM, 100.00 nM, 200.00 nM, 400.00 nM 또는 800.00 nM이였다. 또한, FK506는 FKBP12과 라파마이신와의 상호작용을 경쟁적으로 저해하는 물질로 알려져 있다. 이러한 실시예에서는 0.008 μM, 0.016 μM, 0.031 μM, 0.063 μM, 0.125 μM, 0.250 μM, 0.500 μM, 1.000 μM, 2.000 μM, 4.000 μM, 8.000 μm 또는 16.000 μm가 되도록 FK506을 20 nM의 라파마이신을 함유하는 완충액으로 희석한 후 각 웰에 첨가하였다.
다양한 약제를 첨가하여 배양한 후에 4% 파라포름알데히드 인산 완충액 (Wako Pure Chemical사 제조)를 각 웰에 첨가하고 이어서 15분 동안 실온에서 배양하였다. 그 결과, 이러한 세포 주를 고정시켰다. 이어서 이러한 세포 주를 관찰용 완충액으로 3회 세척한 후, 각 웰당 형광 현미경을 사용하여 3가지 시야의 이미지를 얻었다. 이어서, 각각의 형광 이미지를 iCY （de Chaumont F 등, Nature Methods, 6월 28일, 9호, 7권, 690∼696 페이지 참고)을 사용하여 분석하였고 세포당 형광 휘점 (결합체)의 총 휘도 (총 형광 강도)을 계산해서 첨가한 약물의 농도와의 상관 관계를 분석하였다. 도21은 라파마이신을 첨가할 때에만 얻어지는 결과를 나타낸 것이고 도22는 라파마이신과 FK506를 첨가함으로써 얻어지는 결과를 나타낸다.
도21과 22에서, X축은 세포주에 첨가한 약물 농도를 나타내고 Y축은 한 세포당 형광 휘점 (결합체)의 총 휘도 (총 형광 강도)를 나타낸다. 또한 점을 따라 이어져 있는 적정 곡선은 Igor (R) (WaveMetrics사 제조)를 사용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도21에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, mTOR(FRB 도메인)과 FKBP12 단백질과의 상호작용을 유도하는 화합물 라파마이신을 mTOR(FRB 도메인)-AG와 p62(PB1)-FKBP12을 안정적으로 발현시키는 세포에 첨가할 때, 첨가한 라파마이신 농도에 의존적으로 형광 휘점의 형광 강도가 증가하는 것을 나타내었다. mTOR(FRB 도메인)-AG와 p62(PB1)－FKBP12 사이의 결합체가 농도 의존적으로 형성되는 것을 나타내었다. 또한 도21에 나타낸 적정 곡선을 기준으로 f(x)=max+(min-max)/(1+(x/EC50)＾hill)에 따른 계산에 의해서 라파마이신과 KFBP12 상호작용을 위한 FK506의 IC50과 최종적으로 mTOR(FRB 도메인)과 FKBP12 사이의 단백질 간의 상호작용에 대하여 라파마이신 EC50는 3.36 nM이었다.
다른 한편으로는, 도22에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, FK506를 라파마이신 존재 하에서 첨가할 때 첨가한 FK506 농도에 의존적으로 형광 휘점의 형광 강도가 저하되는 것을 나타내었다. mTOR(FRB 도메인)-AG와 p62(PB1)－FKBP12와의 결합체의 형성은 농도 의존적으로 억제하는 것을 나타내었다. 또한 도22에 나타낸 적정 곡선을 기준으로 f(x)=min+(max-min)/(1+(x/IC50)＾hill)에 의한 계산에 의해서 라파마이신과 FKBP12와의 상호작용, 최종적으로 mTOR (FRB 도메인)과 FKBP12 단백질 간의 상호작용에 대해 FK506의 IC50는 0.68 μm였다.
(실시예 12)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 8＞
실시예10과 11에서와 동일한 목적을 위해서 결합체 (형광 휘점)를 구성하고 있는 융합 단백질이 본 발명의 방법에 있어서 단백질 간의 상호작용에 특이한 억제제에 의해 분산되는지 여부와, 형광 휘점의 형광 강도가 억제 농도를 변화시킴으로써 억제제 농도에 의존적으로 변하는 것인지 여부를 후술한 방법으로 테스트하였다.
이러한 테스트에서 검색 대상은 p53 단백질과 MDM2 단백질의 상호작용이었고 그 상호작용에 대한 억제제로 알려져 있는 Nutlin-3을 실시예12에 사용하였다 (Vassilev LT 등, Science, 2004년 2월 6일, 303호, 5659, 844∼848 페이지 참고).
(플라스미드 DNA 제조)
pp62(PB1)－p53 제조에 있어서는 우선 p53의 일부 (p53 단백질 중 1~70째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열의 영역)을 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 25 의 염기 서열을 가짐을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 U2OS 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
p53 정방향 프라이머;
5'-AAGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCG-3' (SEQ ID NO: 97),
p53 역방향 프라이머48;
5'-TTGCGGCCGCTTAAGCAGCCTCTGGCATTCTGGGAGCTTCATC-3' (SEQ ID NO: 98)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 NotI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MCLinker에 삽입함으로써, pp62(PB1)－p53을 제조하였다.
또한, phAG-MDM2 제조에 있어서는, 먼저 MDM2의 일부 (MDM2 단백질 중 7~125째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열의 영역을 가짐)를 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 27의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해서 U2OS 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
MDM2 정방향 프라이머;
5'-AAGGATCCATGTGCAATACCAACATGTCTGTACCTACTGATGGTGC-3' (SEQ ID NO: 99),
MDM2 역방향 프라이머;
5'-TTCTCGAGTTAACCTGAGTCCGATGATTCCTGCTGATTG-3' (SEQ ID NO: 100).
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 XhoI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MCLinker에 삽입하여 phAG-MDM2를 제조하였다.
(세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포의 관찰과 분석)
pp62(PB1)－p53과 phAG-MDM2를 동등한 양으로 혼합하고, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 HeLaS3 세포에 도입하였다. 배양 용액을 도입 24시간 후에 버리고 0.19 μM의 Nutlin-3를 함유한 1.5ml의 관측용 완충액을 산물에 첨가하였다. 형광 이미지를 15분 후에 촬영하였다. 이어서, 관찰용 완충액을 버리고 0.77 μM의 Nutlin-3가 함유된 1.5 ml의 관측용 완충액을 산물에 첨가하였다. 15분 후에 다시 형광 이미지를 촬영하였다. 4.8 μM과 12 μM의 Nutlin-3을 사용하여 동일한 과정을 수행하였다. 얻어진 결과를 도23에 나타낸다. 또한 소정의 농도로 Nutlin-3를 첨가한 세포의 형광 이미지에서의 형광 휘점 (결합체)의 총 휘도를 계산해서 Nutlin-3의 농도와의 상관 관계를 예시하는 그래프로 작성하였다. 얻어진 결과를 도24에 나타낸다. 도24에서 X축은 세포에 첨가한 Nutlin-3의 농도를 나타내고 Y축은 형광 이미지 (1개의 시야)당 형광 휘점의 총 휘도 (총 형광 강도)를 나타낸다.
도23에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)－p53이 세포 내에서 발현할 때 형광 휘점을 검출하였다. 또한 p53과 MDM2와의 상호작용에 대한 첨가된 억제제 (Nutlin-3)의 농도가 계속 증가한 결과로서, 형광 휘점 (결합체)를 동일한 시야에서 점차 사라져가는 것을 관찰하였고, 해당 결합체를 구성하고 있는 융합 단백질을 분산하는 것을 확인하였다. 또한 도24에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 시야 내의 형광 휘점의 형광 휘도는 억제제의 농도에 의존적으로 저하되었다.
(실시예13)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 9＞
실시예11에서와 같이, 본 발명의 방법이 단백질 간의 상호작용에 특이한 억제제 IC50를 결정하는 데 사용 가능 여부를 후술한 방법으로 평가하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
우선 실시예12에서 설명한 phAG-MDM2과 pFucci-S/G2/M Green-Hyg (Amalgaam 유한 회사 제조)를 사용해서, 약제 내성 유전자를 G418 내성 유전자에서 히그로마이신 B 내성 유전자를 변형하기 위해서 phAG-MDM2_Hyg를 종래 방법에 따라 제조하였다.
(안정 발현 세포 주 제조)
다음에 실시예 12에서 설명한 phAG-MDM2_Hyg과 pp62(PB1)－p53을 CHO-K1 세포 주에 도입하였다. CHO-K1 세포를 10% FBS (Equitech-Bio사 제조)을 함유한 NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM (SIGMA ALDRICH사 제조)에서 배양하였다.
이어서, 플라스미드 DNA를 CHO-K1 세포 주에 도입한 후 24시간에, 배지를 100 μg/ml의 G418 (Wako Pure Chemical사 제조)와 200 μg/ml의 히그로마이신 (Nacalai Tesque사 제조)를 함유하는 배지를 대체하였다. 또한 한 주 동안 배양시킨 후에 생존한 세포를 한계 희석법으로 단일 복제하였다.
(유전자 도입 세포의 관찰과 분석)
실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, 단일 복제한 세포주 상에서 핵 염색 후에 임의의 농도에서 Nutlin-3 (CALBIOCHEM사 제조)를 임의의 농도로 함유한 관측용 완충액을 각 웰에 첨가하고 20분 동안 배양하였다. 최종 농도를 0.2 μM, 0.3 μM, 0.6 μM, 0.9 μM, 1.6 μM, 2.6 μM, 4.3 μM, 7.2 μM, 12.0 μM 또는 20.0 μm로 해서 Nutlin-3를 제조하여 첨가하였다.
이어서 세포주를 실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 고정시켰다. 각 웰의 이미지를 형광 현미경으로 얻었고 각 형광 이미지를 iCY를 이용해서 분석하였다. 세포 당 형광 휘점의 전체 휘도를 계산해서, 첨가한 Nutlin-3의 농도와의 상관 관계를 분석하였다. 얻어진 결과를 도25에 나타낸다. 도25에서 X축은 세포 주에 첨가한 약제의 농도를 나타내고 Y축은 세포당 형광 휘점 (결합체)의 총 휘도 (총 형광 강도)를 나타내고 점은 측정값을 나타낸다. 또한 점을 따라 연결되어 있는 적정 곡선은 Igor (R)를 사용한 분석 결과를 나타낸다.
p62(PB1)－p53과 AG-MDM2를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포에서 p53과 MDM2와의 단백질 간의 상호작용에 기여할 수 있는 형광 휘점 (결합체)를 실시예 12에서와 같이 관측하였다. 또한 도25에 나타낸 바와 같이 이러한 결합체의 형광 휘도는 억제제인 Nutlin-3의 농도에 의존적으로 저하되었다. 또한 도25에 나타낸 적정 곡선을 기준으로 f(x)=min+(max-min)/(1+(x/IC50)＾hill)에 따른 계산에 의해 p53 및 MDM2와 단백질 간의 상호작용에 대한 Nutlin-3의 IC50는 8.9 μm였다.
실시예10-13에 설명한 결과는 본 발명에 따른 형광 휘점의 형광 휘도가 단백질 간의 상호작용의 강도를 반영한 것으로 단백질 간의 상호작용을 정량화할 수 있는 것으로 입증하였다. 또한, 결합체의 형성이 가역성이라는 것도 또한 나타내었다. 정량화는 고정 세포를 사용함으로써 (도20 참고) 그리고 살아있는 세포에서 라이브 영상법을 사용함으로써 (도24 참고), 실시가능하다는 것을 나타내었다. 또한, 실시예11과 13에서 설명한 바와 같이 본 발명은 약 단백질 간의 상호작용을 위한 약물의 농도 의존적으로 촉진 반응과 저해 반응 둘다를 검출할 수 있고 약물의 EC50과 IC50의 계산을 가능하게 한다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 단백질 간의 상호작용의 판정 방법은 단백질 간의 상호작용을 조절하는 물질의 평가와 스크리닝에 적용가능하다는 것을 나타내었다.
(실시예14)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 10＞
p50과 p65는 NFκB를 구성하는, 이종이량체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 또한, NFκB는 염증성 사이토카인의 발현 조절을 담당하는 전사 인자로 핵 내에서 기능한다. 그러나, IκBα와의 상호작용은 세포질에 NFκB를 포함해서 전사 기능을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Marc D. Jacobs 등, Cell, 1998년 12월 11일, 95권, 749~758 페이지 참고). 따라서, p50과 p65의 과잉 발현은 내인성 IκBα와의 화학량론 균형을 방해해서, 이종이량체가 주로 핵에 배치되어 있다. 다른 한편으로는 IκBα가 과잉발현된다면 IκBα를 더 포함하는 이종삼량체는 세포질에 유지된다.
이러한 이유 때문에, 이 실시예에서는 본 발명의 방법이 IκBα의 유무에 따라, p50과 p65를 함유하는 복합체의 세포 내 위치 변화의 검출이 가능한지 여부를 후술한 방법으로 시험하였다.
우선, pp62(PB1)－p50과 phAG-p65를 실시예2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. pp62(PB1)－p50과 phAG-p65에는 각 SEQ ID NO: 156과 158의 아미노산 서열의 영역을 가지는 인코딩하는 DNA (각 SEQ ID NO: 155과 157)은 pp62(PB1)-p50과 phAG-p65에 삽입되어 있다..
반면에 pIκBα를 Genbank 등록 번호: NP_065390.1에 명시한 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 이용하여, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
이어서, HeLaS3 세포를 8웰 챔버 (Nunc A/S 제조)에서 4웰에 시딩하고 그 다음날에 플라스미드 DNA를 이들 세포에 도입하였다. 유전자 도입에는 각 100 ng의 pp62(PB1)－p50과 phAG-p65를 OptiMEM (Life Technologies사 제조)를 첨가하고 pIκBα를 사용하기 위해 다른 양으로 더 첨가하였다. pIκBα의 첨가량은 0 ng (첨가하지 않음) 또는 100 ng이었다. 또한 첨가한 플라스미드 DNA의 전체 양을 통일하기 위해 300 ng 또는 0 ng의 pmKeima-Red-S1 (Amalgaam 유한 회사 제)를 첨가하였다. 이어서 1.5 μl의 폴리펙트 (R) 트랜스펙션 시약을 OptiMEM에 첨가하고 교반하였다. 또한 200 μl의 배양액을 혼합한 후에 생성물을 HeLaS3 세포에 첨가하였다. 이어서 유전자 도입 후 22시간에, 세포를 15분 동안 실온에서 4% 파라포름알데히드 인산 완충액 (Wako Pure Chemical사 제조)으로 고정시켰다. 세포막을 5분 동안 0.2% TritonX-100/PBS로 용해한 후에 anti-IκBα 항체 (Cell Signaling Technology사 제조)을 이용해서 면역 염색을 하였다. 또한, 핵을 Hoechst 33342를 이용해서 염색하였다. 이어서 면역 염색한 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 얻어진 결과를 도26 나타낸다. 또한 항 IκBα 항체로 면역염색한 결과를 나타내는 이미지 (도면에서 좌측의 2 패널)과 Hoechst 333242로 염색한 핵의 결과를 나타내는 이미지인, AG 유래 형광 중첩 이미지 (도면 좌측 2 패널)의 결과를 나타낸 것이다.
도26에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, IκBα를 도입하지 않는 세포 내에서는, p50과 p65로부터 형성된 이종이량체가 핵 내에 형성된 것을 확인하였다. 다른 한편으로는 IκBα를 도입했을 때 AG 유래 형광 이미지 (도면 좌측 하단 패널 참고)에서 검출된 형광 휘점과 동일한 위치에서 IκBα 유래 신호가 감지되었고 (도면 중앙 하단 패널 참고), p50과 p65를 함유한 복합체가 IκBα를 포함한다는 것을 확인하였다. 또한 IκBα의 존재 하에서는, p50과 p65를 함유하는 복합체의 위치를 핵 내부에서 세포질 내부로 변화하는 것을 본 발명의 방법에 의해 확인하였다.
(실시예15)
＜단백질 간의 상호작용을 판정 11＞
이 실시예에서는 실시예14에서 검출한 p50과 p65를 함유하는 복합체를 이용해서, IκBα의 정량적인 균형에 따라 복합체의 세포 내 위치 변화를 본 발명의 방법에 의해 정량적으로 검출할 수 있는지 여부를 후술한 방법으로 시험하였다.
우선, HeLaS3 세포를 8웰 챔버 (Nunc A/S사 제조)에서 4웰 상에 시딩하였다. 그 다음날에 실시예13에서 설명한 pp62(PB1)－p50, phAG-p65 및 pIκBα를 이들 세포에 도입하였다. 유전자 도입에는 각 100 ng의 pp62(PB1)－p50과 phAG-p65를 OptiMEM (Life Technologies사 제조)에 첨가하였고 pIκBα를 사용하기 위해 다른 양으로 첨가하였다. pIκBα의 첨가량은 (0) 첨가하지 않음, (1) 33 ng, (2) 100 ng 또는 (3) 300 ng였다. 또한 플라스미드 DNA의 전체 양을 통일하기 위해 pmKeima-Red-S1 (Amalgaam 유한 회사 제조)를 (0) 300 ng, (1) 267 ng, (2) 200 ng, (3) 0 ng를 첨가하였다. 이어서 1.5 μl의 폴리펙트 (R) 트랜스펙션 시약을 각각 OptiMEM에 첨가하고 교반시켰다. 또한 200 μl의 배양액과 혼합한 후에 HeLaS3 세포에 첨가하고, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 22시간 후에 관찰하였다.
(0)~(3) 조건에서 플라스미드 DNA를 도입한 150개 이상의 세포를 촬영한 후에, 형광 휘점의 위치에 따라 세포를 (A)~(C)의 세 가지 그룹으로 분류하였다. 특정하게는, 세포는 (A) 형광 휘점이 세포질에만 발견되는 경우; (B) 세포질과 핵 내에서 발견되는 경우; (C) 핵에서만 발견되는 세포로 구분된다. 이어서, 각 그룹의 세포 수%를 계산하여 그래프로 작성하였다. 얻어진 결과를 도27에 나타낸다.
도27에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, 세포질에서 검출된 형광 휘점%가 IκBα 양에 의존적으로 증가하였다. 따라서 본 발명은 형광 휘점 위치에 따라 세포를 그룹화하고 각 그룹에서 세포수를 비교하는 방법을 제공할 수 있다. 또한 실시예14에서 설명한 바와 같이 발명의 방법에 따르면, 직접 검색하는 제1 단백질과 제2 단백질 (예를 들면, p50과 p65) 상호작용의 배치를 통해 제3의 단백질 (예를 들면, IκBα)가 해당 상호작용에 미치는 영향, 제 3의 단백질의 발현량도 수치화할 수 있는 것도 밝혀졌다.
(실시예16)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 12＞
세포의 핵에서 p21이 CDK4와 Cyclin D1로 이루어진 복합체를 인식하고 이들과 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (LaBaer J 등, Genes Dev. 1997년 4월 1일, 11권 7호 847-862 페이지 참고). 또한 CDK4와 Cyclin D1로 이루어진 복합체에 의해 촉진되지 않는 한 이러한 이종삼량체 형성은 세포 주기 진행 (G1기에서 S기로의 전이)을 저해하는 것으로 나타났다.
이러한 이유 때문에 실시예에서는 실시예14와 15 마찬가지로 세 가지 유형의 다른 단백질로 구성된 복합체 형성이 본 발명에 의해 검출될 수 있는지 여부를 후술한 방법으로 테스트하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
pp62(PB1)-CDK4, phAG-p21 및 pCyclin D1을 각각 Genbank 등록 번호: NP_000066.1, NP＿000380.1과 NP_444284.1에 명시된 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열에 근거로 해서 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
(배양 세포에의 유전자 도입, 세포 면역 염색 및 세포의 관찰)
HeLaS3 세포를 플라스미드 DNA를 도입한 배양 세포로서 사용하였다. 또한, HeLaS3 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 배양하였다. 또한, 유전자 도입에 있어서는 8웰 챔버 (Nunc A/S사 제조)의 두개의 웰 상에 HeLaS3 세포를 시딩하고 그 다음날에, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 다음의 조합에서의 각 130ng의 플라스미드 DNA를 1 μl의 트랜스펙션 시약을 사용하여 HeLaS3 세포에 도입하였다:
pp62(PB1)-CDK4와 phAG-p21와, pCyclin D1의 조합;
pp62(PB1)-CDK4와 phAG-p21와, phmKGC-MN (Amalgaam 유한 회사 제조)의 조합 (phmKGC-MN는 플라스미드의 전체 양을 통일하기 위하여 첨가하였다).
이어서 유전자 도입 24시간 후, 세포를 15분 동안 실온에서 4% 파라포름알데히드 인산 완충액 (Wako Pure Chemical Industries사 제조)으로 고정시켰다. 세포막을 5분 동안 0.2% TritonX-100/PBS로 용해한 후에 면역염색을 항 Cyclin D1 항체 (주식회사 의학 생물학 연구소 제조) 4 μg/ml를 사용하여 수행하였다. 면역 염색된 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 얻어진 결과를 도28에 나타낸다.
도28에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)-CDK4와 AG-p21를 발현시킨 경우에만 여러 세포에 명확한 결합체 (형광 휘점)는 관찰되지 않았다. 그러나, p62(PB1)-CDK4와 AG-p21와 함께 Cyclin D1을 강제적으로 발현시킨 경우에는 이러한 이종삼량체 형성에 필요한 성분의 발현을 화학량론으로 맞출 수는 거의 모든 세포에 있는 명료한 형광 휘점을 관찰하였다. 또한 Cyclin D1의 면역염색 이미지는 Cyclin D1이 관찰한 형광 휘점에 위치되어 있는 것을 확인하였다.
따라서 실시예14와 15에 설명한 결과와 마찬가지로 삼량체 이상의 다량체의 복합체의 형성에서 단백질 간의 상호작용을 본 발명에 의해 감지될 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 두 가지 타입의 단백질 (실시예14와 15에서의 p50과 p65, 실시예16에서의 CDK4과 p21)이 상술한 "임의의 분자" (실시예14와 15의 IκBα, 실시예16의 Cyclin D1)를 포함하는 복합체를 형성하는 것으로 가정했을 때 이 두 가지 단백질을 각각 "결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과 다량체화 능력을 가진 형광 단백질을 포함하여 제2 융합 단백질"로서 세포 내에 발현되고, cDNA 발현 라이브러리에 의해 인코딩되는 단백질이 세포 내에 발현되면 본 발명은 형광 휘점 (예를 들면, 형광 휘점의 발생 또는 소실, 형광 휘점의 위치의 변화)를 지표로 해서 전술한 "임의의 분자" (복합체의 구성 인자)를 조사할 수 있다.
또한 실시예14-16에 설명된 바와 같이 본 발명은 형광 휘점을 지표로 해서 복합체의 구성 요인 (실시예14와 15에서는 IκBα, 실시예16에서 Cyclin D1)의 발현 양을 분석하기 위해서 최종적으로는 발현 양을 이용함으로써 복합체에 의해 조절되는 세포 주기 및 위의 복합체가 응답하는 스트레스 등의 세포의 상태를 분석할 수 있다.
(실시예17)
＜단백질 상호작용의 판정 13＞
실시예10-13에 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 형광 휘점의 형광 강도가 단백질 간의 상호작용의 강도를 반영하는 것을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 단백질 간의 상호작용 검출 방법은 본 발명에 따른 형광 휘점의 형광 강도를 지표로해서 상호작용에 중요한 아미노산을 아마도 확인할 수 있다. 이러한 이유 때문에 테스트를 단백질 간의 상호작용 저하 또는 강화에 관여하는 것으로 알려져 있는 아미노산 변이를 이용해서 후술한 방법으로 수행하였다.
이 테스트에서의 검색 대상은 Sec5 단백질과 RalB 단백질의 상호작용이었다. Sec5 단백질은 GTP 활성화 형태로 RalB 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (Moskalenko S 등, Nat Cell Biol. 2002년 1월, 4권, 1호, 66~72 페이지 참고). RalB의 불활성형 변이체 RalB (S28N)로 그 상호작용이 저하되지만 RalB의 활성형 변이체 RalB (Q72L)에서는 증대하는 것으로 알려져 있다 (Shipitsin M, Mol Cell Biol. 2004년 7월, 24권, 13호, 5746-5756 페이지 참고). 또한 막 앵커형 단백질인 RalB 단백질은 C말단의 팔미토일화에 의해 세포 막에 위치하는 것으로 나타났다.
(플라스미드 DNA 제조)
pp62(PB1)－Sec5 제조에 있어서는, 먼저 Sec5의 일부 (Sec5 단백질의 1~99째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 가짐)를 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 29 의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 증폭시켰다:
Sec5 정방향 프라이머; 5'-CCCGGATCCATGTCTCGATCACGACAACCC-3' (SEQ ID NO: 101)
Sec5 역방향 프라이머; 5'-GGGAAGCTTTTATTAGCCTATTTTCTCAGGTTTGAGTA-3' (SEQ ID NO: 102)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MCLinker에 삽입해서 pp62(PB1)－Sec5를 제조하였다. pp62(PB1)-Sec5은 p62(PB1)와 일부의 Sec5 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "p62(PB1)－Sec5"라고도 함)을 인코딩한다.
반면에 phAG-RalB (WT)제조에 있어서는, 먼저 RalB (SEQ ID NO: 32 아미노산을 가지는 단백질)를 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 31의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
RalB 정방향 프라이머; 5'-CCCGGATCCATGGCTGCCAACAAGAGTAAG-3' (SEQ ID NO: 103),
RalB 역방향 프라이머; 5'-GGGAAGCTTTTATCATAGTAAGCAACATCTTTC-3' (SEQ ID NO: 104).
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MCLinker에 삽입하여 phAG-RalB (WT)를 제조하였다. phAG-RalB(WT)는 AG 단백질과 RalB 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-RalB(WT)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phAG-RalB(Q72L)를 phAG-RalB(WT)를 주형으로 하고 AMAP(TM) 여러 부위 특이적 변이 도입 키트 (Amalgaam 유한 회사 제)를 사용하여 첨부한 사용 설명서에 따라서 다음의 프라이머를 사용하여 변이를 도입하였다:
RalB(Q72L) 프라이머; 5'-CTGGACACCGCTGGGCTAGAGGACTACGCAGCCA-3' (SEQ ID NO: 105).
RalB(Q72L) 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 34에 나타낸다. 또한, 단백질을 인코딩하는 DNA의 염기 서열을 SEQ ID NO: 33에 나타낸다. 또한 phAG-RalB(Q72L)은 AG 단백질과 RalB(Q72L) 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-RalB(Q72L)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한 phAG-RalB(S28N)를 phAG-RalB(WT)를 주형으로 하고 AMAP (TM) 다중 부위 특이 변이 유발 키트를 사용하고 첨부한 사용 설명서에 따라서 다음의 프라이머를 사용하여 변이를 도입하였다:
RalB(S28N) 프라이머; 5'-CAGCGGAGGCGTTGGCAAGAACGCCCTGACGCTTCAGTTCA-3' (SEQ ID NO: 106).
RalB(S28N) 단백질의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 36에 나타낸다. 또한, 해당 단백질을 인코딩하는 DNA의 염기 서열을 SEQ ID NO: 35에 나타낸다. phAG-RalB (S28N)은 AG 단백질과 RalB (S28N) 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-RalB (S28N)"라고도 함)을 인코딩한다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합한 것을, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, HeLaS3 세포에 각각 도입하였다:
pp62(PB1)-Sec5와 phAG-RalB(WT)의 조합;
pp62(PB1)-Sec5와 phAG-RalB(Q72L)의 조합;
pp62(PB1)-Sec5와 phAG-RalB(S28N)의 조합;
pp62(PB1)와 phAG-RalB(WT)의 조합.
또한, 유전자 도입 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 얻어진 결과를 도29에 나타낸다. 또한, 세포 막 부근에만 흥분할 수 있는 아크 광원 전반사 형광 현미경 시스템 (Olympus사 제조, IX71-ARCEVA)을 이용해 이미지를 얻었였다. 얻어진 결과를 도30에 나타낸다.
도29에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 팔미토일화된 C말단을 가지는 RalB 단백질이 세포 막에 위치되어 있기 때문에 야생형의 RalB 단백질 (RalB(WT))을 발현시킨 경우에는 Sec5 단백질과의 상호작용에서 유래하는 형광 휘점을 세포막 부근에서 발견하였다. 한편으로는, 세포 내에서 p62(PB1)-Sec5과 AG-RalB (S28N)을 공동 발현시킨 형광 휘점이 감지되지 않았다. 상술한 바와 같이 RalB의 불활성 변이체 RalB(S28N)는 Sec5 단백질의 상호작용을 저하시킨다는 것을 확인하였다. 또한, p62(PB1)-Sec5과 AG-RalB (Q72L)을 공동 발현시킨 세포에서는 p62(PB1)-Sec5와 AG-RalB(WT)를 공동 발현시킨 세포에서보다 높은 형광 강도 (휘도)를 가지는 형광 휘점을 검출하였다. 상술한 바와 같이 RalB의 활성형 변이체 RalB(Q72L)는 Sec5 단백질의 상호작용을 강화한다는 것도 확인하였다.
또한 도30에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)-Sec5와 AG-RalB(WT)을 공동 발현하는 세포에서 결합체를 관찰하였다. 도30에 나타낸 결과는 세포 막 부근에서만 흥분시킬 수 있는 관찰 시스템을 사용한 결과이다. 따라서 도29에 나타낸 결과와 마찬가지로 세포 막 부근에서 야생형의 RalB 단백질과 Sec5 단백질의 상호작용을 본 발명의 방법에 의해 감지할 수 있다는 것을 입증하였다.
또한 도30에 나타낸된 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)-Sec5와 AG-RalB(Q72L)을 공동 발현하는 세포에서는 더 상당한 결합체의 형성을 관찰하였다. 다른 한편으로는, p62(PB1)-Sec5과 AG-RalB(S28N)을 공동 발현시킨 세포에서는 결합체가 관찰되지 않았다. 따라서 도29에 나타난 결과와 마찬가지로 본 발명의 방법은 RalB(S28N)에 의한 Sec5 단백질과의 상호작용 저하, RalB(Q72L)에 의한 상호작용의 강화를 검출할 수 있는 것을 입증하였다.
(실시예18)
＜단백질 상호작용의 판정 14＞
실시예17에서와 같이 단백질 간의 상호작용 저하에 관여하는 것으로 알려져 있는 아미노산 변이를 이용하여 후술한 방법에 의해 테스트하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
pp62(PB1)-p53_W23L를 SEQ ID NO: 159의 염기 서열 (5'-ACATTTTCAGACCTATTGAAACTACTTCCTGAAAACAACGT-3')을 가지는 프라이머를 사용해서 실시예17에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 실시예12에서 설명한 pp62(PB1)－p53에 변이를 도입함으로써 제조하였다.
p53의 위치 23의 아미노산은 p53과 MDM2와의 상호작용 계면 부위에 위치하고 있다. 또한 p53의 "W23L" 변이는 상호작용의 저하를 가져오는 변이로 알려져 있다 (문헌 Zondlo SC, Biochemistry., 2006년 10월 3일, 45권, 39호, 11945~11, 957페이지 참고).
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, 플라스미드 DNA 조합을 동등 한 양으로 혼합한 것을 세포에 도입하였고 세포를 관찰하였다. 얻어진 결과를 도31에 나타낸다.
pp62(PB1)－p53와 phAG-MDM2의 조합;
pp62(PB1)-p53_W23L와 phAG-MDM2의 조합.
도31에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)－p53과 AG-MDM2를 공동 발현하는 세포에서는 형광 휘점 (결합체의 형성)을 상당히 관찰하였다 (도면에서 좌측 패널). 한편으로는, p62(PB1)-p53_W23L와 AG-MDM2를 공동 발현시킨 세포에서는 결합체가 관찰되지 않았다 (도면 우측 패널).
따라서 실시예 17과 18에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 단백질 간의 상호작용 검출 방법은 본 발명에 따른 형광 휘점의 형광 휘도를 지표로 해서 상호작용에 중요한 아미노산을 확인할 수 있는 것으로 나타났다. 특히 본 발명의 방법은 변이를 상호작용의 계면에 도입하고 상호작용의 유무를 검출함으로써 단백질 간의 상호작용에 관여하는 아미노산을 아주 쉽게 특정화할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법을 사용해서 알라닌 검사와 같은 단백질로 변이를 도입하기 위해 결합함으로써, 단백질 상호작용에 중요한 부위 (핫 스팟)를 아주 쉽게 검색할 수 있다.
(실시예19)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 15＞
전술한 바와 같이, 본 발명의 단백질 간의 상호작용의 검출 방법은 단백질 간의 상호작용이 실시간으로 발생 및 소실할 때 정량적으로 측정하는 것이 가능하다는 것을 나타내었다. 따라서 발명의 방법이 신호에 응답하여 발생하는 단백질 간의 상호작용을 통해 세포 내에서 내인성 신호 전달이 시간에 따라 어떻게 변화하는지를 검출할 수 있는지 여부에 상관없이 테스트를 수행하였다.
특정하게는 이 테스트에서 검출 대상으로 하는 단백질 간의 상호작용은, 칼모듈린과 미오신 경쇄 키나아제 2의 부분 서열 (M13 펩티드)와의 상호작용이었다. 상호작용은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)이 리간드를 수용했을 때 발생하는 세포내 칼슘 이온 농도의 일시적 증가 (제2 메신저)에 응답하여 발생한다는 것을 나타내었다 (Miyawaki A 등, Nature, 1997년 8월 28일, 388권, 6645, 882-887 페이지 참고). 따라서 상호작용을 통해 세포 내 시간에 따른 칼슘 이온 농도의 변화를 감지할 수 있는지 여부를 후술한 방법으로 시험하였다. 얻어진 결과를 도32에 나타낸다.
(플라스미드 DNA 제조)
p칼모듈린-hAG 제조에 있어서는, 먼저 칼모듈린 (SEQ ID NO: 38의 아미노산의 단백질)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 37의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
칼모듈린 정방향 프라이머；
5'-TTGGATCCGCCACCATGGACCAACTGACAGAAGAGCAGATTGC-3' (SEQ ID NO: 107)
칼모듈린 역방향 프라이머;
5'-AAGAATTCCCCTTTGCTGTCATCATTTGTACAAACTCTTC-3' (SEQ ID NO: 108)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI와 EcoRI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MNLinker에 삽입하여 p칼모듈린-hAG를 제조하였다. p칼모듈린-hAG는 칼모듈린 단백질과 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "칼모듈린-AG"라고도 함)을 인코딩한다.
반면에 pM13펩티드-p62(PB1)제조에 있어서는, 먼저 미오신 경쇄 키나아제2 일부 (미오신 경쾌 키나아제 2 단백질의 566-591째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 가짐)를 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 39의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
M13 펩티드 정방향 프라이머;
5'-TTGGATCCGCCACCATGAAGAGGCGCTGGAAGAAAAACTTCATTGC-3' (SEQ ID NO: 109)
M13 역방향 프라이머;
5'-CCGAATTCCCCAGTGCCCCGGAGCTGGAGATCTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 110)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 EcoRI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MNLinker에 삽입하여 pM13펩티드-p62(PB1)를 제조하였다. pm13펩티드-p62(PB1)는 M13 펩티드와 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "M13펩티드-p62(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
p칼모듈린-hAG와 pM13펩티드-p62(PB1)를 동등한 양으로 혼합하여 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 HeLaS3 세포에 도입하였다. 이어서 200 μM의 히스타민 (Wako Pure Chemical Industries사 제조)을 첨가하고 시간에 따라 형광 이미지를 촬영하였다. 히스타민이 HeLaS3 세포에서도 발현하는, GPCR 중 하나인 H1 수용체의 리간드로 기능한다는 것을 나타내었다.
도32에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, 리간드 (히스타민)을 첨가하였고칼모듈린-AG는 세포내로 분산하여 존재하고 있었다. 반면에 리간드를 첨가한 후 90초에는 형광 휘점을 감지해서 M13펩티드-p62(PB1)과의 결합체의 형성을 확인하였다. 그럼에도 불구하고 세포질에 있는 칼슘 이온의 농도가 저하된 후 490초에는 형광 휘점 (결합체)은 사라졌다.
따라서, 본 발명의 단백질 간의 상호작용의 판정 방법을 사용하는 것은 H1 수용체로부터 신호 전달에 의해서 일시적으로 증가한 칼슘 이온 농도의 실시간 측정이 가능하다는 것을 나타내었다.
또한 실시예19의 결과로부터 본 발명은 단백질 간의 일시적인 상호작용을 판정가능하게 하고 본 발명은 단백질 간의 상호작용을 발생시키는 제2 메신저와 같은 내인성 요인; 제2 메신저 등이 기여하는 신호 전달; 그리고 신호 전달을 유도하는 세포외 리간드와 같은 외부 자극의 감지와 스크리닝에 적용가능하다는 것을 나타내었다.
(실시예 20)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 16＞
WO2000-017221 A, WO2006-099486 A에 나타내는 단백질 간의 상호작용을 판정하는 종래의 방법에 있어서, 단백질 간의 상호작용에 의해 발생하는 복합체를 구성하는 단백질 중 하나를 강제로 (인공적으로) 세포내의 특정 영역에 제한되어 있다. 따라서 검출은 상호작용에 특이한 세포내 환경에서 불가능하였다. 그러나, 본 발명은 단백질 간의 상호작용 판정 방법에 있어서 상호작용이 발생할 때에만 형광 휘점 (결합체)이 자발적으로 형성된다. 따라서 종래의 방법에서의 문제를 해결할 수 있는 것으로 예측된다. 이러한 이유 때문에 본 발명이 세포 내의 모든 영역에서 상호작용을 판정할 수 있는지 여부를 후술한 방법으로 시험하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
pmTOR(FRB 도메인)-AGNLS의 제조에 있어서는, 먼저 AGNLS 유전자를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 pNP-AG (Amalgaam 유한 회사 제조)로부터 증폭시켰다:
AGNLS 정방향 프라이머;
5'-AAACCGGTATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAG-3' (SEQ ID NO: 111)
AGNLS 역방향 프라이머;
5'-AATCTAGATTATTTATCCTTTTCCTTTTTACTCTTCTTCTTAGCTACTTC-3' (SEQ ID NO: 112)
이어서 얻어진 증폭 산물을 AgeI과 XbaI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pmTOR(FRB 도메인)－hAG에 삽입하여 hAG 영역을 절단하였다. 그 결과, pmTOR(FRB 도메인)-AGNLS를 제조하였다. pmTOR(FRB 도메인)-AGNLS는 mTOR(FRB 도메인)과 AG 단백질과 핵 배치 신호 (NLS)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "mTOR(FRB 도메인)－AGNLS"라고도 함)을 인코딩한다. 또한, mTOR(FRB 도메인)-AGNLS는 세포의 핵 내에 위치하고 있는데 이것은 mTOR (FRB 도메인)-AG의 C말단에 핵 배치 신호를 융합하기 때문이다.
반면에 pp62(PB1)－HRas의 제조에 있어서는 우선 HRas 단백질을 인코딩하는 DNA를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭하였다. 이와 같이 얻어진 증폭 산물을 EcoRI과 XhoI로 절단하였다.
HRas 정방향 프라이머；
5'-AAGAATTCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGGCAAGAGTGC-3' (SEQ ID NO: 113)
HRas 역방향 프라이머；
5'-TTCTCGAGACCTCCGGAGACGTTCAGCTTCCGCAGCTTGTGCTGCCGGATCTCACGCACCAAC-3' (SEQ ID NO: 114).
또한, KRas 단백질로부터 유래된 프레닐화 서열을 다음의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. 얻어진 증폭 산물을 XhoI과 NotI로 절단하였다.
KRas 정방향 프라이머;
5'-AACTCGAGAAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTG-3' (SEQ ID NO: 115)
KRas 역방향 프라이머;
5'-TTGCGGCCGCTTACATAATTACACACTTTGTCTTTGACTTCTTTTTCTTCTTTTTACCAT-3' (SEQ ID NO: 116).
이어서, 이러한 식으로 제조한 2개의 DNA 단편을 EcoRI과 NotI로 처리한 pp62(PB1)－MCLinker에 삽입하여 pp62(PB1)－HRas(WT)를 제조하였다.
또한, 구성적 활성형 변이체인 HRas과 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질을 인코딩하는 pp62(PB1)－HRas를 pp62(PB1)－HRas(WT)를 주형으로 하고 AMAP(TM) 여러 부위 특이적 변이 유발 키트 (Amalgaam 유한 회사 제조)를 사용하고 첨부한 사용 설명서에 따라서 다음의 프라이머를 사용해서 변이를 도입하여 제조하였다:
HRas 변이체 프라이머; 5'-GCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGGCAAGAGTGCGC-3' (SEQ ID NO: 117).
pp62(PB1)－HRas는 p62(PB1)와 KRas 단백질 유래의 프레닐화 서열을 첨가한 C말단을 가지는 HRas를 인코딩하는 DNA (단백질은 SEQ ID NO: 42 아미노산 서열을 가짐)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 41의 염기 서열을 가짐)와의 융합에 의해서 얻어지는 단백질을 인코딩한다. 또한 융합 단백질은 프레닐화 서열을 가지고 있기 때문에 세포내에서 번역 후 지질 변형을 거쳐서 세포 막에 배치되어 있다.
phAG-cRaf 제조에 있어서는, 먼저 cRaf의 일부 (cRaf 단백질 중 51-131째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 가짐)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 43 의 염기 서열을 가짐)를 HeLaS3 세포를 주형으로 하는 cDNA 라이브러리와 다음의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다:
cRaf 정방향 프라이머;
5'-AAGGTACCCCTTCTAAGACAAGCAACACTATCCGTGTTTTCTTGCCGAACAAGCAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 118)
cRaf 역방향 프라이머 71;
5'-TTAAGCTTTTACAGGAAATCTACTTGAAGTTCTTCTCCAATCAAAGACGCAG-3' (SEQ ID NO: 119)
이어서 얻어진 증폭 산물을 KpnI와 HindIII로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MCLinker에 삽입하여 phAG-cRaf를 제조하였다. phAG-cRaf는 AG 단백질과 cRaf 단백질의 일부로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-cRaf" 라고 불림)이다. 또한, cRaf 단백질의 일부는 HRas 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (Mochizuki N 등, Nature, 2001년 6월 28일, 411, 6841호, 1065-1068 페이지 참고).
또한 pSmac-p62(PB1)의 제조에 있어서는, 먼저 Smac의 한 부분 (Smac 단백질 의 1-10째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 가짐)과 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질을 인코딩하는 DNA를, 다음의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 pp62(PB1)-MNL로부터 증폭시켰다:
Smac 정방향 프라이머；
5'-AGGATCCGCCACCATGGCCGTGCCCATCGCCCAGAAATCAGAGAATTCGG-3' (SEQ ID NO: 120)
p62(PB1) 역방향 프라이머; 2,
5'-ACCTCTAGATTATTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATG-3' (SEQ ID NO: 64)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 XbaI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MNL에 삽입하여 링커와 p62(PB1)을 절단하였다. 따라서, pSmac-p62(PB1)를 제조하였다. pSmac-p62(PB1)는 Smac의 한 부분과 p62(PB1)로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "Smac-p62(PB1)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한, pXIAP-hAG의 제조에 있어서는, 먼저 XIAP의 일부 (XIAP 단백질의 243∼356째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 가짐)를 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 47의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
XIAP 정방향 프라이머；
5'-TTGGATCCGCCACCATGGCTGTGAGTTCTGATAGGAATTTCCCAAATTC-3' (SEQ ID NO: 121)
XIAP 역방향 프라이머；
5'-TTGAATTCTCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAAGTGAATGAG-3' (SEQ ID NO: 122)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 EcoRI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MNLinker에 삽입하여 pXIAP-hAG를 제조하였다. pXIAP-hAG는 XIAP와 AG 단백질로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "XIAP-AG"라고도 함)을 인코딩한다. 또한, Smac의 일부와 XIAP의 일부가 세포질 내에서 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (Liu Z등, Nature, 2000년 12월 21 ~28일, 408권 6815호, 1004~1008 페이지 참고).
또한, pp62(PB1)-BclX(L)의 제조에 있어서는, 먼저 BclX(L)의 일부 (BclX(L) 단백질 중 1-209째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 가짐)를 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 49의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
BclX(L) 정방향 프라이머;
5'-TTCTCGAGGATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTTGAC-3' (SEQ ID NO: 123)
BclX(L) 역방향 프라이머;
5'-CTAAGCGGCCGCTTAGCGTTCCTGGCCCTTTCGGCTCTCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 124)
이어서 얻어진 증폭 산물을 XhoI과 NotI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MCLinker에 삽입하여 pp62(PB1)-BclX(L)를 제조하였다. pp62(PB1)-BclX(L)는 p62(PB1)와 BclX(L)의 한 부분으로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "p62(PB1)-BclX(L)"라고도 함)을 인코딩한다.
또한, phAG-BAD의 제조에 있어서는, 먼저 BAD의 일부 (BAD 단백질 103~127 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 52 아미노산 서열을 가짐)를 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 51의 염기 서열을 가짐)를 다음의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다:
BAD 정방향 프라이머 1;
5'-GCAGCACAGCGCTATGGCCGCGAGCTCCGGAGGATGAGTGACGAGTTTGT-3' (SEQ ID NO: 125),
BAD 정방향 프라이머 2;
5'-TTGGATCCAACCTCTGGGCAGCACAGCGCTATGGCCGCGAGCTCCGGAGG-3' (SEQ ID NO: 126),
BAD 역방향 프라이머;
5'-TTGAATTCTTACTTCTTAAAGGAGTCCACAAACTCGTCACTCATCCTCCG-3' (SEQ ID NO: 127).
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 EcoRI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MCLinker에 삽입하여 phAG-BAD를 제조하였다. AG 단백질과 BAD의 일부로 구성된 융합 단백질 (융합 단백질은 "AG-BAD"라고도 함)를 인코딩한다. 또한 위의 BclX(L)의 일부와 BAD의 일부는 세포질 내에서 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (Sattler M 등, Science, 1997년 2월 14일, 275권 5302호, 983-986 페이지 참고).
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합에 동등한 양을 혼합한 것을, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, HeLaS3 세포에 각각 도입하였다
pFKBP12-p62(PB1)와 pmTOR (FRB 도메인)-AGNLS의 조합;
pp62(PB1)－HRas와 phAG-cRaf의 조합;
pSmac-p62(PB1)와 pXIAP-hAG의 조합;
pp62(PB1)-BclX(L)와 phAG-BAD의 조합.
또한, 유전자 도입 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 그러나, pFKBP12-p62(PB1)와 pmTOR (FRB 도메인)-AGNLS를 도입한 세포에 대해서는 100 nM의 라파마이신을 첨가한 후 300초에 형광 이미지와 위상차 이미지를 촬영하였다. 얻어진 결과를 도33-36에게 나타낸다.
도33에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, mTOR (FRB 도메인)-AGNLS와 FKBP12-p62(PB1)이 세포 내에서 발현된 때 mTOR (FRB 도메인)-AGNLS, C말단에서 핵 배치 신호 서열이 있기 때문에 세포의 핵 내에서 분산하여 배치하였다 (도면33 좌측 패널 참고). 또한 라파마이신을 첨가하여 FKBP12-p62(PB1)과 mTOR (FRB 도메인)－AGNLS의 결합에 의해서 발생하는 형광 휘점을 핵 내에서 발견하였다 (도33 우측 2 패널 참고).
또한 도34에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, C말단에서 프레닐화 ㅅ서성서열을 가지는 p62(PB1)-HRas와 AG-cRaf가 프레닐화 서열에 의해 세포에서 발현될 때 p62(PB1)－HRas와 AG-cRaf의 결합에 의해서 발생한 형광 휘점을 세포 막에서 발견하였다.
또한 도35에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, Smac-p62(PB1)과 XIAP-AG 이 세포에 발현될 때, Smac-p62(PB1)와 XIAP-AG의 결합에 의해서 발생한 형광 휘점을 세포질에서 발견하였고 세포질 내에서 발생하는 것으로 알려져 있는, Smac 단백질과 XIAP 단백질과의 상호작용을 반영한 것이다.
추가로 도36에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)-BclX(L)와 AG-BAD이 세포에 발현될 때, p62(PB1)-BclX(L)과 AG-BAD의 결합에 의해서 발생한 형광 휘점을 세포질 내에서 발견하였고 세포질 내에서 발생하는 것으로 알려져 있는, (L) 단백질과 BAD 단백질과의 상호작용을 반영한 것이다.
(실시예 21)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 17＞
실시예 20에서와 같이 대상 단백질에 관련된 세포내 환경에서 단백질 간의 상호작용을 본 발명의 방법을 사용행서 판정할 수 있는지 여부를 후술한 방법으로 테스트하였다.
실시예 21에서는 검출 대상은 Rac1 단백질과 PBD (p21 결합 도메인)와의 단백질 간의 상호작용이었다. Rac1 단백질은 저분자량 G 단백질이고 Tiam1, Trio, VAV1 와 같은 구아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (GEF)은 불활성형 GDP 결합 형태로부터 활성형 GTP 결합 형태로 Rac2 단백질을 변형한다. 또한 활성형 Rac1 단백질과 Cdc42/Rac 이펙터 단백질 (p21 활성화 키나아제 1: PAK1)의 PBD가 서로 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한, GEF는 종류에 따라 다르게 위치되어 있어서, 핵 내부에서, 세포의 가장자리 (세포 막 부근)등에 위치하기도 한다. 이러한 이유 때문에 Rac1 단백질은 세포 내에 어느 곳에서나 존재하지만 Rac1 단백질의 활성화와, 활성형 Rac1 단백질과 PBD와의 상호작용은 그 종류에 따라 다르게 배치되어 있는 GEF에 따라 세포 내 영역에서 발생하는 것이다 (Benard V등, J Biol Chem. 1999년 5월 7일, 274권 19호, 13198~13204 페이지 참고).
(플라스미드 DNA 제조)
phAG-Rac1 제조에 있어서는, 먼저 Rac1 단백질 (단백질은 SEQ ID NO: 54의 아미노산 서열을 가짐)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 53의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
Rac1 정방향 프라이머； 5'-GAGAATTCGATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTGG-3' (SEQ ID NO: 128)
Rac1 역방향 프라이머； 5'-GGCTCGAGTTACAACAGCAGGCATTTTCTCTTCC-3' (SEQ ID NO: 129).
이어서 얻어진 증폭 산물을 EcoRI과 XhoI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 phAG-MNLinker에 삽입하여 phAG-Rac1를 제조하였다.
반면에 pp62(PB1)－PBD 제조에 있어서는, 먼저 PBD(PAK1 단백질의 67∼150째 아미노산을 가지는 영역은 SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열을 가짐)을 인코딩하는 DNA (DNA는 SEQ ID NO: 55의 염기 서열을 가짐)을 다음의 프라이머 세트를 이용하는 PCR에 의해 HeLaS3 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다:
PBD 정방향 프라이머;
5'-TTGGATCCAAGAAAGAGAAAGAGCGGCCAGAGATTTCTCTCCC-3' (SEQ ID NO: 130)
PBD 역방향 프라이머;
5'-CCGAATTCTTACGCTGACTTATCTGTAAAGCTCATGTATTTCTGGC-3' (SEQ ID NO: 131)
이어서 얻어진 증폭 산물을 BamHI과 EcoRI로 절단하여 동일한 제한 효소로 처리한 pp62(PB1)－MCLinker에 삽입하여 pp62(PB1)－PBD를 제조하였다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합한 것을, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, U2OS 세포에 각각 도입하였다:
phAG-Rac1와 pp62(PB1)－PBD의 조합;
phAG-Rac1와 pp62(PB1)－MNLinker의 조합.
얻어진 결과를 도37-39에 나타낸다.
도37과 38에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, AG-Rac1와 p62(PB1)－PBD를 세포 내에서 발현할 때, AG-Rac1와 p62(PB1)－PBD의 결합에 의해서 발생한 형광 휘점을 핵 (도37)에서 그리고 세포의 가장자리 (도38)에서 발견하였다.
한편으로는, 도39에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, AG-Rac1와 PBD를 융합하지 않은 p62(PB1)을 세포 내에서 발현할 때, 형광 휘점은 발견되지 않았다.
상기의 결과는 세포 내의 여러 영역에서 동일한 단백질 간의 상호작용을 판정할 수 있다는 것을 나타내었다. 따라서, 단백질 간의 상호작용에 의해 발생하는 복합체를 구성하고 있는 단백질을 강제로 (인공적으로) 세포내의 특정 영역에 한정하지 않고, 단백질의 위치에 따라 특이한 세포내 환경에서 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있었다는 것을 나타내었다.
또한 단백질 간의 상호작용의 판정에 의해서 본 발명은 활성형 (GTP 결합 형태) Rac1 단백질을 판정할 수 있다는 것을 나타내었다. 또한 활성형의 GTP 결합 형태에 대한 변환을 검출함으로써 세포 내 효소 GEF의 위치와 활성을 감지할 수 있다는 것을 입증하였고 따라서 단백질 간의 상호작용에 따른 내인성 요소의 활성을 검출할 수 있었다는 것을 본 발명의 방법에 의해 나타내었다.
(실시예 22)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 18＞
실시예 21에서 설명한 바와 같이 활성형 Rac1 단백질과 Cdc42/Rac 이펙터 단백질 (p21 활성화 키나아제 1: PAK1)의 PBD가 상호작용하는 것을 나타내었다.
또한 Rac1 단백질 위치는 Rac1 단백질의 C말단 상에 제라닐제라닐기 변형 (프레닐화)에 의해 변화하는 것으로 알려져 있다. 또한 Rac1 단백질이 Rac1 단백질의 제라닐제라닐 기를 통해서 RhoGDI와 상호작용하는 것도 알려져 있다.
따라서 본 발명의 방법이 이러한 단백질 간의 상호작용의 위치 변화를 감지할 수 있는지를 후술한 방법으로 확인하였다.
우선 pRhoGDI-p62(PB1)를 Genbank 등록 번호: NP_004300로 확인되는 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열에 근거로 해서 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. 또한 phAG-Rac1과 pp62(PB1)－PBD는 실시예 21에서 설명한 바와 같다.
이어서 아래 플라스미드 DNA 조합을 동등한 양으로 혼합한 것을, 실시예 2와 같은 방법으로 세포에 도입하였다:
phAG-Rac1와 pp62(PB1)－PBD의 조합;
phAG-Rac1와 pRhoGDI-p62(PB1)의 조합.
이어서 유전자 도입 후 6시간동안 배양한 후에 제라닐제라닐기 변형에 대한 억제제인 메바스타틴 (Enzo Life Sciences사 제조)을 최종 농도 10 μm이 되도록 첨가하고 15시간 동안 더 배양하여 관찰하였다. 도40은 AG-Rac1과 p62(PB1)－PBD를 공동 발현시킨 세포에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도41은 AG-Rac1와 RhoGDI-p62(PB1)을 공동 발현시킨 세포에 대한 결과를 나타낸 것이다. 동일한 세포는 도40과 41에서 나타내고: (A)는 일반적인 반사형 형광 도입 현미경을 이용해서 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 촬영한 것이고 (B)는 아크 광원 전반사 형광 현미경 시스템을 이용해서 실시예17에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 촬영한 것이다.
도40의 2개의 상부 패널에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 정상적인 상태에서는, 핵 내부와 외부 모두에서 발생하는 Rac1와 PBD와의 단백질 간의 상호작용은 즉 Rac1가 활성화 상태로 존재하는 것을 본 발명의 방법에 의해 확인하였다.
제라닐제라닐기 변형이 메바스타틴과 같은 약물로 억제된다면 Rac1은 핵 내에 위치하는 것으로 알려져 있다. 이 결과에 대해 본 발명은 도40의 하단 2개의 패널에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이 Rac1와 PBD와의 상호작용은 메바스타틴 처리에 의해 변화해서, 그 상호작용이 핵에서만 발생하도록 하는 것을 확인하였다. 또한 이러한 상호작용의 판정을 통해 제라닐제라닐기 변형이 없을 때에도 Rac1이 활성화 상태로 존재하는 것을 본 발명의 방법에 의해 확인하였다.
반면에 Rac1와 RhoGDI와의 상호작용에 관하여 도41의 상단 2 패널에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, 정상적인 상태에서는 Rac1과 RhoGDI와의 단백질 간의 상호작용이 핵 외부에서 발생하는 것을 본 발명에 방법에 의해 확인하였다.
한편으로는, 도41의 하단 두 패널에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, Rac1이 상술한 메바스타틴 처리에 의해서 핵 내에서만 위치하는 것을 확인하였고 또한 Rac1의 제라닐제라닐기 변형이 억제되기 때문에 Rac1과 RhoGD1와의 상호작용은 저하된다.
따라서, 본 발명은 세포 내의 여러 영역에서 단백질 간의 상호작용이 외부 자극에 의해 변화하는 모습을 발견할 수 있는 것이 확인하였다. 또한, 단백질 간의 상호작용에 영향을 미치는 단백질의 변형 (예를 들면, Rac1-RhoGDI의 상호작용에 관한 Rac1의 제라닐제라닐기 변형)을 감지할 수 있는 것을 확인하였다.
(실시예 23)
KRas와 cRaf와의 상호작용은 세포 증식, 분화 등에 중요한 신호 전달 중 하나이다. 또한 이러한 단백질 간의 상호작용은 상피 세포 성장 인자 (EGF)에 의해 활성화된 EGF 수용체로부터의 Grb2-SOS를 통한 신호 전달의 결과로서 KRas가 활성화되는 것에 의해 발생하는 것을 나타내었다. 또한, 단백질 간의 이러한 상호작용이 cRaf 위치를 세포질에서 세포 막으로 변화하는 것도 알려져 있다.
상술한 바와 같이 KRas와 cRaf와의 상호작용이 EGF에 의존하기 때문에 EGF 비존재 하에서는 상호작용이 발생하지 않는다. 그러나 KRas의 변이체 중에서 EGF 비존재 하에서도 cRaf와 상호작용할 수 있는 구성적인 활성형 변이체 (예, KRasG12D)도 있다. 또한 이러한 변이체들은 여러 가지 암에서 발견되고 있다. 따라서, 효과적인 암 치료법의 개발 등에 있어서 KRas 또는 변이와 cRaf의 결합체 형성과 결합체의 위치와 같은 단백질 간의 상호작용에 대한 위치 정보와 시간 정보를 검색하는 것이 중요하다.
이러한 이유 때문에 본 발명은 질병 관련 변이를 가지는 단백질과 야생형 단백질의, 단백질 간의 상호작용의 차이를 감지할 수 있는지 후술한 방법으로 시험하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
pp62(PB1)－KRas(WT)를 Genbank 등록 번호: NP_004976로 확인되는 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 근거로 해서 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
pp62(PB1)－KRas(G12D)에 대해서 SEQ ID NO: 160의 DNA 서열 (5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGACGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTG-3')을 가지는 프라이머를 사용하여 실시예17에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 pp62(PB1)－KRas(WT)로 변이를 도입하였다.
phAG-cRaf(R59A)를 SEQ ID NO: 162의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID NO: 161)을 지표로 해서 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. cRaf인 Harvey CD 등, Science. 2008년 7월 4일 321권, 5885호, 136-140 페이지에서 설명한 방법을 참고로 해서 단백질의 변이체 (cRaf(R59A))를 실시예에서 사용하였다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
플라스미드 DNA를 다음의 조합의 동등한 양으로 혼합하여 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 Cos-7 세포로 도입하였다.
pp62(PB1)－KRas(WT)와 phAG-cRaf(R59A)의 조합;
pp62(PB1)－KRas(G12D)와 phAG-cRaf(R59A)의 조합.
세포를 세포 막 부근에서만 흥분하는, 아크 광원 전반사 형광 현미경 시스템 (Olympus사 제조, IX71-ARCEVA)을 사용해서 관찰하였다. 또한 pp62(PB1)－KRas(WT)와 phAG-cRaf(R59A)와의 조합에 대해서, EGF를 첨가하지 않았을 때 이미지를 얻었다. 그 이후에, EGF (SIGMA사 제조)을 세포를 최종 농도 50ng/ml 첨가하고 30분 동안 37℃로 유지하였다. 이어서 생성물을 다시 관측하였다. 얻어진 결과를 도42에 나타낸다.
도42에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, p62(PB1)－KRas(WT)와 AG-cRaf(R59A)을 공동 발현시킨 세포에서는 외부에서 자극이 없는 상태 (EGF 비첨가)에서는 형광 휘점 (결합체의 형성)이 관찰되지 않았다. 반면에 EGF를 첨가함에 따라 세포 막에서의 결합체의 형성을 관찰하였다. 한편으로는, pp62(PB1)－KRas(G12D)와 phAG-cRaf(R59A)와 함께 외부에서 자극이 없는 상태에서도 세포 막에서 결합체의 형성을 관찰하였다.
따라서, 본 발명은 질병과 관련된 변이에 의해 발생하는 단백질 간의 상호작용의 차이 (외부 자극에 대한 의존성 등)를 명확하게 파악할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은질환 관련 단백질 등의 세포내 동태와 기능분석에 있어서 효과적이다.
(실시예 24)
＜단백질 간의 상호작용 판정 20＞
실시예19에서 설명한 바와 같이 본 발명은 단백질 간의 상호작용의 시간에 따른 변화를 감지할 수 있는지를 후술한 방법으로 확인하였다.
실시예 24에서 대상으로 하는 단백질 간의 상호작용은, BclX(L)와 Bak의 상호작용, BclX(L)과 Bax와의 상호작용이었다. Bak와 Bax 모두는 BH3 도메인을 통해서 BclX(L)와 상호작용하는 것으로 나타났다. BclX(L)와 Bak BH3 도메인과의 해리 상수는 340 nM이고 BclX(L)와 Bax BH3 도메인과의 해리 상수는 13 μM (Sattler M등, Science. 1997년 2월 14일, 275권 5302호, 983-986 페이지 참고)인 것으로 나타났다. 또한 이러한 단백질 간의 상호작용은 ABT-737 (BH3 모방체)에 의해 경쟁적으로 저해되는 것으로 알려져 있다.
(플라스미드 DNA 제조)
pBak-hAG를 SEQ ID NO: 164의 아미노산 서열을 가지는 영역을 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 163)을 이용해서 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. phAG-Bax는 SEQ ID NO: 166의 아미노산 서열을 가지는 영역을 인코딩하는 DNA (SEQ ID NO: 165)을 이용하여, 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. 또한, pp62(PB1)-BclX(L)는 실시예 20에서 설명한 바와 같다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
아래의 조합으로 플라스미드 DNA를 동등한 양으로 혼합하였고 유전자를 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 293개의 세포에 도입하였다:
pp62(PB1)-BclX(L)과 pBak-hAG의 조합;
pp62(PB1)-BclX(L)과 phAG-Bax의 조합.
이어서 이들 플라스미드 DNA를 도입한 293개의 세포에 ABT-737(Samta Cruz Biotechnology사 제조)를 최종 농도 15 μm로 첨가하였고 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 p62(PB1)-BclX(L)와 Bak-AG를 공동 발현시킨 세포를 30분 마다, 그리고 p62(PB1)-BclX(L)와 AG-Bax를 공동 발현시킨 세포에 대해 5분 마다 이미지를 얻었다. 얻은 이미지를 근거로 해서 실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 분석하였고 시간에 대한 형광 휘점 (결합체)의 총 형광의 휘도를 나타낸 그래프를 작성하였다. 그래프의 x축은 첨가한 약물이 0일 때 ㅅ시간(분)을 나타내고 y축은 형광 휘점 (결합체)의 총 형광 휘도를 나타낸다. 도43은 p62(PB1)-BclX(L)와 Bak-AG를 공동 발현시킨 세포에 대한 결과를 나타낸 것이고 도44는 p62(PB1)-BclX(L)와 AG-Bax를 공동 발현시킨 세포에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도43과 44에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, BclX(L)와 Bak의 상호작용, BclX(L)과 Bax와의 상호작용 모두에서, 이러한 단백질 간의 상호작용에 의존적으로 발생하는 결합체의 총 형광 휘도는 ABT-737을 첨가하여 시간에 따라 저하되었다. 따라서, 본 발명에은 형광 휘점을 감지해서 단백질 간의 상호작용의 소실될 때까지의 시간을 검출가능하다는 것을 입증하였다.
또한 전체 형광 휘도가 중간값이 되었을 때의 시간은 BclX(L)과 Bak의 경우에 약 80분이었고 BclX(L)과 Bax 경우에는 약 35분이었다. 결합체의 저하율은 BclX(L)과 Bax (해리 상수: 13 μM)보다 작은 해리 상수 (해리 상수: 340 nM)를 가지는 BclX(L)과 Bak에서 느리기 때문에 상술한 바와 같이 본 발명에 의해 단백질 간의 상호작용의 강도를 평가할 수 있는 것을 확인하였다.
(실시예 25)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 21＞
실시예 24에서 설명한 바와 같이 본 발명은 단백질 간의 상호작용이 발생할 때 시간에 따른 변화를 감지할 수 있는지 후술한 방법으로 확인하였다.
우선 실시예13에서 설명한 p62(PB1)－p53과 AG-MDM2를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포를, 35 mm의 유리 기반 접시 (Asahi Glass사 제조)에 시딩하였다. 그 다음날에 Nutlin-3 (CALBIOCHEM사 제조)을 최종 농도 10 μm에 첨가하여 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 첨가하기 2분 전에 그리고 15초마다 이미지를 얻었다. 얻은 이미지는 실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법을 사용함으로써 결합체의 총 형광 휘도를 분석하는 데 사용하였고 시간에 대한 총 형광 휘도를 나타내어 그래프를 작성하였다. 얻어진 결과를 도45에 나타낸다.
도45에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, Nutlin-3 (CALBIOCHEM사 제조) 를 첨가하자마자 결합체의 총 형광 휘도가 저하되었다. 중간 값에 도달한 시간은 약 3분경이었다. 따라서, 본 발명은 형광 휘점을 감지함으로써 단백질 간의 상호작용이 소실될 때까지의 시간과 그 과정을 찾을 수 있는 것을 확인하였다.
(실시예 26)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 22＞
상술한 바와 같이 발명은 단백질 간의 상호작용이 발생할 때 시간에 따른 변화를 감지할 수 있는지 후술한 방법으로 확인하였다.
우선 실시예11에서 설명한 mTOR(FRB 도메인)-AG과 p62(PB1)－FKBP12를 안정적으로 발현하는 HeLaS3 세포에 라파마이신을 최종 농도 20 nM로 첨가하였고 실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 분석하였다. 얻어진 결과를 도46에 나타낸다.
도46에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, 라파마이신을 첨가한 후에 시간에 따라 결합체 형성을 유도하였다. 중간값에 도달한 시간은 약 3분경이었다. 따라서, 본 발명에 따르면, 형광 휘점을 감지함으로써 단백질 간의 상호작용이 발생하는 시간과 그 과정을 찾을 수 있는 것을 확인하였다.
(실시예 27)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 23＞
세포 내의 ERK가 EGF 자극에 의해 활성화될 때 ERK 기질 (ERK_기질)이 인산화되고, 그 결과로, ERK_기질과 Pin1 단백질 (Pin1(ww))의 ww 도메인은 상호작용하는 것으로 나타났다. 또한 MEK 억제제인 U0126를 첨가하면 ERK의 활성이 저하되고 그 결과 ERK 기질은 ERK 기질과 Pin1(ww)와의 상호작용이 소실되면서 탈인산화되는 것으로 알려져 있다.
이 실시예에서는, 본 발명이 ERK의 활성화를 통해서 EGF에 의해 간접적으로 유도된 ERK 기질과 Pin1(ww)와의 상호작용의 검출을 가능하게 하고; 본 발명은 ERK의 불활성화를 통해 U0126에 의해 간접적으로 억제된 ERK 기질과 Pin1(ww)와의 상호작용을 검출가능하고; 본 발명은 시간에 따라 EGF 자극에 의존적인 신호 전달을 검출할 수 있는지를 후술한 방법으로 확인하였다.
(플라스미드 DNA 제조)
이 실시예에서는 EGF 자극에 의존적인 ERK 기질과 Pin1(ww)와의 상호작용을 판정하기 위해서 pp62(PB1)-ERK_기질-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES를 FRET을 이용하여 상호작용 검출 시스템 (Christopher D. Harvey 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008년 12월 9일, 105권, 49호, 19, 264-19269 페이지 참고)을 참고로 해서 제조하였다. 특정하게는, pp62(PB1)-ERK_기질-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES를 SEQ ID NO: 168의 아미노산 서열을 가지는 영역을 인코딩하는 화학적으로 합성한 DNA (SEQ ID NO: 167)을 사용해서, 실시예2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
SEQ ID NO: 168의 아미노산 서열에 있어서는 1~102 위치의 아미노산 서열은 p62(PB1)의 아미노산 서열을 나타낸다. 103-128 위치의 아미노산 서열은 링커 서열을 나타낸다. 129∼138 위치의 아미노산 서열은 ERK 기질인 인간 Cdc25C의 43-52 위치의 아미노산 서열을 나타내고 139~142 위치의 아미노산 서열은 ERK 도킹 부위의 아미노산 서열을 나타낸다. 146~164 위치의 아미노산 서열은 P2A 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 165∼390 위치의 아미노산 서열은 AG의 아미노산 서열을 나타낸다. 391-416 위치의 아미노산 서열은 링커 서열을 나타낸다. 417~470 위치의 아미노산 서열은 Pin1(ww)의 아미노산 서열을 나타낸다. 471~482 위치의 아미노산 서열은 MEK의 핵 출력 신호 (NES)의 아미노산 서열을 나타낸다.
또한, p62(PB1)-ERK_기질과 AG-Pin1(ww)-NES 사이에 삽입되어 있는 P2A 펩티드는 porcine teschovirus에서 유래한 CHYSEL (시스 작용성 가수분해 효소 인자)서열이다. 단백질이 번역될 때 아미노산 서열 (ATNFSLLKQAGDVEENPGP)의 말단에서 프롤린 전방에서의 절단이 일어나면서 리보솜 스키핑 (skipping)이 발생한다 (Donnelly ML 등, J Gen Virol. 2001년 5월 82권 5호 1013~1025 페이지 참고). 따라서, pp62(PB1)-ERK_기질-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES를 세포에 도입하는 경우에는, p62(PB1)-ERK_기질의 C말단에 융합된 P2A 펩티드의 일부를 가지는 생성물과 AG-Pin1(ww)-NES의 N말단에 융합된 P2A 펩티드의 일부를 가지는 생성물로 절단된다. 이 두 가지는 세포 내에서 발현된다.
(배양 세포에의 유전자 도입 및 유전자 도입 세포 관찰)
pp62(PB1)-ERK_기질-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 293개의 세포에 유전자 도입하였다. 그 다음날에 EGF (SIGMA사 제조)을 최종 농도 50 ng/ml로 세포에 추가하였다. 14분 후에 U0126를 최종 농도 10 μm로 세포에 첨가하였다. 반면에 세포 관찰을 EGF을 첨가하기 2분 전에 시작하여 관찰한 이미지를 15초 마다 얻었다. 얻은 이미지를 실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 형광 휘점 (결합체)의 총 형광 휘도를 분석하는데 사용하였고 시간에 대한 총 형광 휘도를 나타내어서 그래프를 작성하였다. 얻어진 결과를 도47에 나타낸다.
도47에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, EGF를 첨가한 후, p62(PB1)-ERK_기질과 AG-Pin1(ww)-NES를 발현하는 세포에서는 형광 휘점 (결합체)이 시간에 따라 뚜렷하게 관찰되었다. 그러나 U0126를 첨가한 후에는 첨가제로 인해 내인성 ERK의 불활성화에 따라 반응하는 ERK 기질 탈인산화 촉진을 나타내서 형광 휘점이 천천히 감소하였다.
ERK 기질과 Pin1(ww)의 상호작용을 나타내는 형광 휘점 (결합체)의 총 형광 강도의 시간에 따른 변화는 Christopher D. Harvey 등, Proc Natl Acad Sci U S A., 2008년 12월 9일, 105권, 49호, 19, 264-19269 페이지 ERK 기질-Pin1(ww)의 상호작용을 FRET을 이용하여 측정한 결과와 상당히 동일하였다.
이러한 식으로 본 발명에 따르면, 형광 휘점을 검출해서 특정 자극에 의해 간접적으로 유래되거나 또는 저해되는 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 시간에 따른 신호 전달을 검출할 수 있다.
(실시예 28)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 24＞
상술한 바와 같이 실시예 20에 설명한 HRas과 cRaf의 상호작용을 근거로 해서 본 발명은 단백질 간의 상호작용이 발생할 때 시간에 따른 변화를 검출가능하다는 것을 확인하였다.
특정하게는 실시예 20에서 설명한 pp62(PB1)－HRas(WT)과 실시예 23에서 설명한 phAG-cRaf(R59A)을 실시예 23에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 세포에 도입하였다. EGF (SIGMA사 제조)을 최종 농도 50ng/ml로 첨가하였다. 세포 막 부근에서만 형광 신호를 감지할 수 있는 측정 장치를 사용하여 관찰하였다. 관찰은 EGF를 첨가하기 5분 전에 시작하여 첨가 후에는 30분 동안 5분 간격으로 계속하였다. 30분 후에 관찰하였다. 얻어진 이미지 데이터에 근거하여, 실시예11에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 분석해서, 시간에 대한 형광 휘점 (결합체)의 총 형광의 휘도를 나타낸 그래프를 작성하였다. 그래프의 x축은 첨가한 EGF가 0일 때의 시간 (분)을 나타내고 y축은 형광 휘점 (결합체)의 총 형광의 휘도를 나타낸다. 얻어진 결과를 도48에 나타내었다.
도48에 나타낸 결과에서 명백한 바와 같이, EGF 첨가함으로써 발생한 HRas과 cRaf와의 상호작용을 시간에 따라 효과적으로 검출하였다.
또한 상술한 바와 같이 cRaf가 EGF를 첨가한 세포의 EGF 수용체에서 Grb2-SOS 복합체를 통해 신호가 발생하는 결과로 활성화된 HRas과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 도48에 나타낸 결과에서 발명에 의해 세포 내 신호 전달 경로 (Grb2-SOS 복합체를 통한 신호 전달 경로 등)가 세포에 주어진 외부 자극 (EGF 등)에 응답하여 활성화 과정을 시간에 따라 추적하는 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 29)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 25＞
상술한 바와 같이 라파마이신은 FKBP12 단백질에 결합하고, 이 복합체 mTOR 단백질의 FRB 도메인 (mTOR (FRB))에 더 결합하는 것을 나타내었다. mTOR 단백질은 단백질 합성과 세포 증식에 관여하는 신호 전달을 활성화하는 기능이 있는 세린/트레오닌이 키나아제이다. 기능은 FKBP12 단백질과 라파마이신의 복합체 형성에 의해 저해되는 것으로 나타났다.
또한, FKBP12 단백질은 촉매 하위 단위 A (칼시뉴린 A)과 조정 하위 단위 B (칼시뉴린 B)로 구성된 단백질 포스파타아제 (칼시뉴린)과 FK506를 통해 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 칼시뉴린은 T 세포 등의 신호 전달에 있어서 매우 중요한 기능을 가지는 효소이다. 기능이 FKBP12 단백질과 FK506의 복합체 형성에 의해 저해되는 것을 나타내었다.
따라서, 이 실시예에서는, FKBP12, mTOR (FRB), 칼시뉴린 A와 칼시뉴린 B를 공동 발현한 하나의 세포 내에서 라파마이신에 의존적으로 발생하는 FKBP12와 mTOR (FRB)의 복합체; FK506 의존적으로 발생하는 FKBP12, 칼시뉴린 A와 칼시뉴린 B의 복합체를, 최종적으로 이들 복합체가 관여하는 신호 전달 저해를 발명에 의해 감지 확인할 수 있는지 여부를 후술한 방법으로 시험하였다.
세포에서 발현되는 "칼시뉴린 A와 칼시뉴린 B"인, 칼시뉴린 B 일부가 융합된 칼시뉴린 A의 일부로 구성된, mCAB 단백질을 사용하였다 (Clemons PA 등, Chem Biol. 2002년 1월, 9권, 1호, 49-61 페이지 참고).
우선 phAG-mCAB, pp62(PB1)－FKBP12과 pmTOR (FRB)-hKO1를 HeLaS3 세포에 도입하였다. phAG-mCAB를 SEQ ID NO: 170의 아미노산 서열을 가지는 영역을 인코딩하는 인공적으로 합성한 DNA (SEQ ID NO: 169)을 이용하여, 실시예 2에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. pp62(PB1)-FKBP12는 실시예 2에서 설명한 바와 같다. pmTOR(FRB)-hKO1 (pmTOR(FRB 도메인)－hKO1)는 실시예6에서 설명한 바와 같다.
또한 HeLaS3 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 배양하였다. 또한, 유전자 도입에 있어서는 HeLaS3 세포를 8웰 챔버 (Nunc A/S사 제조)중 두 웰 상에 시딩하였다. 그 다음날에, 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로, 플라스미드 DNA 각 130ng를 트랜스펙션 시약 1 μl를 사용하여 HeLaS3 세포에 도입하였다.
24시간 후에 유전자 도입한 세포를 실시예1에서 설명한 방법과 동일한 방법으로 관찰하였다. 세포에 라파마이신 또는 FK506을 최종 농도 500 nM가 되도록 첨가하고 15분 후에 관찰하였다. 얻어진 결과는 도49에 나타낸다.
도49에 나타난 결과에서 명백한 바와 같이, AG-mCAB, p62(PB1)－FKBP12과 mTOR (FRB)-KO1을 발현시킨 세포에 라파마이신을 첨가해서, mTOR (FRB)와 FKBP12와의 상호작용이 KO1 유래된 형광 신호를 방출하는 형광 휘점 형태로 관찰되었다. 한편으로는, FK506을 첨가함으로써 mCAB와 FKBP12와의 상호작용이 AG 유래된 형광 신호를 방출하는 형광 휘점 형태로 관찰하였다.
따라서 본 발명에 의해 하나의 세포에서 여러 종류의 단백질 간의 상호작용, 특히 하나의 세포에서 다른 자극에 의존하는 여러 단백질 간의 상호작용을 판정할 수 있는 것을 확인하였다.
또한 본 발명은 하나의 세포에서 신호 전달에 관련된 여러 단백질 간의 상호작용을 검출하는 것에 의해, 하나의 세포에서 여러 종류의 신호를 감지 및 확인하는 방법을 제공할 수 있다.
또한 이 실시예에 설명한 바와 같이 살아있는 세포에서 단백질 간의 상호작용을 검출하는 또 다른 방법인 FRET과 달리, 수용체와 공여체의 조건을 충족하는 형광 단백질을 선택할 필요가 없고 또한 수용체 형광 단백질을 발하는 교차 여기와, 수용체 형광 단백질의 형광을 검출하는 필터 (흡수 필터)세트를 통해서 공여체 형광 단백질의 형광을 누출시키는 표면 추출 (bleed-through)을 고려할 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 있어서, 다른 파장 특성을 가지는 여러 형광 단백질을 쉽게 선택하고 조합하여 사용할 수 있다.
(실시예 30)
＜단백질 간의 상호작용의 판정 26＞
실시예 2에서 설명한 방법으로 결합 유도 단백질로서 p62(PB1), 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질로서 AG 단백질을 이용함으로써 표3에 나타낸 알려진 단백질 간의 상호작용을 본 발명의 방법에 의해 검출할 수 있는지를 테스트하였다.
Figure 112014062797358-pct00003
그 결과, 예시하고 있지는 않지만 모든 조합에서 형광 휘점 형태로 단백질 간의 상호작용이 판정가능하다는 것을 확인하였다. 본 발명은 단백질 간의 상호작용 판정을 위한 일반적으로 수용가능한 방법이라는 것을 입증하였다.
[산업상 이용가능성]
상술한 바와 같이, 본 발명은 특정한 세포내 환경에서 단백질 간의 상호작용을 판정하고 단백질 간의 상호작용에 관한 위치 정보와 시간 정보를 검색할 수 있다. 또한 본 발명은 단백질 간의 상호작용의 강도는 형광 휘점의 형광 강도와 관련이 있다. 따라서 이 방법은 형광 휘점을 지표로 해서 단백질 간의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 동정하고 단백질 간의 상호작용 조절 물질을 스크리닝하는 데 이용가능하다.
따라서 본 발명의 단백질 간의 상호작용 판정 방법 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 키트는 in vivo 여러 신호 전달, 여러 생물학적 반응 제어의 유도를 통해서, 최종적으로는 질환 메커니즘의 규명을 통해서 약제학적 생성물 개발에 이용가능하다.
[서열 목록 프리 텍스트 (Free Text)]
SEQ ID NO: 1과 2
＜223＞ 인간화 코돈 Azami Green (AG)
SEQ ID NO: 3과 4
＜223＞ p62의 PB1 도메인
SEQ ID NO: 5과 6
＜223＞ MEK5의 PB1 도메인
SEQ ID NO: 7과 8
＜223＞ Nbr1의 PB1 도메인
SEQ ID NO: 9과 10
＜223＞ PKCiota의 PB1 도메인
SEQ ID NO: 11과 12
＜223＞ TFG의 PB1 도메인
SEQ ID NO: 13과 14
＜223＞ TEL의 SAM 도메인
SEQ ID NO: 15과 16
＜223＞ EphB2의 SAM 도메인
SEQ ID NO: 17과 18
＜223＞ DGK delta의 SAM 도메인
SEQ ID NO: 19와 20
＜223＞ Tankyrase-1 SAM 도메인
SEQ ID NO: 21과 22
＜223＞ mTOR의 FRB 도메인
SEQ ID NO: 23과 24
＜223＞ FKBP12
SEQ ID NO: 25과 26
＜223＞ p53
SEQ ID NO: 27과 28
＜223＞ MDM2
SEQ ID NO: 29과 30
＜223＞ Sec5
SEQ ID NO: 31과 32
＜223＞ RalB
SEQ ID NO: 33과 34
＜223＞ RalB 단백질 Q72L 변이체
SEQ ID NO: 35과 36
＜223＞ RalB 단백질 S28N 변이체
SEQ ID NO: 37와 38
＜223＞ 칼모듈린
SEQ ID NO: 39과 40
＜223＞ M13 펩티드
SEQ ID NO: 41과 42
＜223＞ HRas
SEQ ID NO: 43과 44
＜223＞ cRaf
SEQ ID NO: 45와 46
＜223＞ Smac
SEQ ID NO: 47과 48
＜223＞ XIAP
SEQ ID NO: 49과 50
＜223＞ BclX（L）
SEQ ID NO: 51과 52
＜223＞ BAD
SEQ ID NO: 53과 54
＜223＞ Rac1
SEQ ID NO: 55와 56
＜223＞ PBD
SEQ ID NO: 57
＜223＞ 인공적으로 합성된 hAG 정방향 프라이머 1 서열
SEQ ID NO: 58
＜223＞ 인공적으로 합성된 hAG 역방향 프라이머 1 서열
SEQ ID NO: 59
＜223＞ 인공적으로 합성된 p62(PB1) 정방향 프라이머 1 서열
SEQ ID NO: 60
＜223＞ 인공적으로 합성된 p62(PB1) 역방향 프라이머 1 서열
SEQ ID NO: 61
＜223＞ 인공적으로 합성된 hAG 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 62
＜223＞ 인공적으로 합성된 hAG 역방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 63
＜223＞ 인공적으로 합성된 p62(PB1) 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 64
＜223＞ 인공적으로 합성된 p62(PB1) 역방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 65
＜223＞ 인공적으로 합성된 p62(PB1) 정방향 프라이머 3 서열
SEQ ID NO: 66
＜223＞ 인공적으로 합성된 p62(PB1) 역방향 프라이머 3 서열
SEQ ID NO: 67
＜223＞ 인공적으로 합성된 mTOR(FRB) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 68
＜223＞ 인공적으로 합성된 mTOR(FRB) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 69
＜223＞ 인공적으로 합성된 FKBP12 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 70
＜223＞ 인공적으로 합성된 FKBP12 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 71
＜223＞ 인공적으로 합성된 MEK(PB1) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 72
＜223＞ 인공적으로 합성된 MEK(PB1) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 73
＜223＞ 인공적으로 합성된 Nbr1(PB1) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 74
＜223＞ 인공적으로 합성된 Nbr1(PB1) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 75
＜223＞ 인공적으로 합성된 PKCiota(PB1) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 76
＜223＞ 인공적으로 합성된 PKCiota(PB1) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 77
＜223＞ 인공적으로 합성된 TFG(PB1) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 78
＜223＞ 인공적으로 합성된 TFG(PB1) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 79
＜223＞ 인공적으로 합성된 TEL(SAM) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 80
＜223＞ 인공적으로 합성된 TEL(SAM) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 81
＜223＞ 인공적으로 합성된 EphB2(SAM) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 82
＜223＞ 인공적으로 합성된 EphB2(SAM) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 83
＜223＞ 인공적으로 합성된 DGK delta(SAM) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 84
＜223＞ 인공적으로 합성된 DGK delta(SAM) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 85
＜223＞ 인공적으로 합성된 Tankyrase(SAM) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 86
＜223＞ 인공적으로 합성된 Tankyrase(SAM) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 87
＜223＞ 인공적으로 합성된 TFG(PB1) 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 88
＜223＞ 인공적으로 합성된 TFG(PB1) 역방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 89
＜223＞ 인공적으로 합성된 TEL(SAM) 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 90
＜223＞ 인공적으로 합성된 TEL(SAM) 역방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 91
＜223＞ 인공적으로 합성된 DGK delta(SAM) 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 92
＜223＞ 인공적으로 합성된 DGK delta(SAM) 역방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 93
＜223＞ 인공적으로 합성된 Tankyrase(SAM) 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 94
＜223＞ 인공적으로 합성된 Tankyrase(SAM) 역방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 95
＜223＞ 인공적으로 합성된 hKO1 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 96
＜223＞ 인공적으로 합성된 hKO1 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 97
＜223＞ 인공적으로 합성된 p53 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 98
＜223＞ 인공적으로 합성된 p53 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 99
＜223＞ 인공적으로 합성된 MDM2 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 100
＜223＞ 인공적으로 합성된 MDM2 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 101
＜223＞ 인공적으로 합성된 Sec5 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 102
＜223＞ 인공적으로 합성된 Sec5 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 103
＜223＞ 인공적으로 합성된 RalB 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 104
＜223＞ 인공적으로 합성된 RalB 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 105
＜223＞ 인공적으로 합성된 RalB(Q72L) 변이 프라이머 서열
SEQ ID NO: 106
＜223＞ 인공적으로 합성된 RalB(S28N) 변이 프라이머 서열
SEQ ID NO: 107
＜223＞ 인공적으로 합성된 칼모듈린 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 108
＜223＞ 인공적으로 합성된 칼모듈린 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 109
＜223＞ 인공적으로 합성된 M13 펩티드 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 110
＜223＞ 인공적으로 합성된 M13 펩티드 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 111
＜223＞ 인공적으로 합성된 AGNLS 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 112
＜223＞ 인공적으로 합성된 AGNLS 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 113
＜223＞ 인공적으로 합성된 HRas 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 114
＜223＞ 인공적으로 합성된 HRas 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 115
＜223＞ 인공적으로 합성된 KRas 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 116
＜223＞ 인공적으로 합성된 KRas 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 117
＜223＞ 인공적으로 합성된 HRas 변이 프라이머 서열
SEQ ID NO: 118
＜223＞ 인공적으로 합성된 cRaf 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 119
＜223＞ 인공적으로 합성된 cRaf 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 120
＜223＞ 인공적으로 합성된 Smac 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 121
＜223＞ 인공적으로 합성된 XIAP 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 122
＜223＞ 인공적으로 합성된 XIAP 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 123
＜223＞ 인공적으로 합성된 BclX(L) 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 124
＜223＞ 인공적으로 합성된 BclX(L) 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 125
＜223＞ 인공적으로 합성된 BAD 정방향 프라이머 1 서열
SEQ ID NO: 126
＜223＞ 인공적으로 합성된 BAD 정방향 프라이머 2 서열
SEQ ID NO: 127
＜223＞ 인공적으로 합성된 BAD 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 128
＜223＞ 인공적으로 합성된 Rac1 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 129
＜223＞ 인공적으로 합성된 Rac1 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 130
＜223＞ 인공적으로 합성된 PBD 정방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 131
＜223＞ 인공적으로 합성된 PBD 역방향 프라이머 서열
SEQ ID NO: 132
＜223＞ 단량체 KO (Kusabira-Orange)의 염기 서열
SEQ ID NO: 133
＜223＞ 단량체 KO (Kusabira-Orange)의 아미노산 서열
SEQ ID NO: 134과 135
＜223＞ 인간화 코돈 mAG1
SEQ ID NO: 136과 137
＜223＞ mMiCy1
SEQ ID NO: 138와 139
＜223＞ mKikGR1
SEQ ID NO: 140과 141
＜223＞ KCy1
SEQ ID NO: 142과 143
＜223＞ dAG（AB）
SEQ ID NO: 144과 145
＜223＞ dAG（AC）
SEQ ID NO: 146와 147
＜223＞ TGuv
SEQ ID NO: 148과 149
＜223＞ Momiji
SEQ ID NO: 150과 151
＜223＞ COR3.01
SEQ ID NO: 152과 153
＜223＞ DsRed2
SEQ ID NO: 154, 159와 160
＜223＞ 인공적으로 합성된 프라이머 서열
SEQ ID NO: 155, 157, 161, 163, 165, 167, 169
＜223＞ 인공적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 서열
SEQ ID NO: 156, 158, 162, 164, 166, 168과 170
＜223＞ 인공적으로 합성된 폴리펩티드 서열
SEQ ID NO: 171, 172
＜223＞ COR5
SEQUENCE LISTING <110> Amalgaam Co., Ltd. <120> Detection Method of Protein-Protein Interaction <130> IBPF12-538WO <150> JP2011/266103 <151> 2011-12-05 <160> 172 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> humanized codon Azami Green <220> <221> CDS <222> (1)..(678) <223> hAG <400> 1 atg gtg agc gtg atc aag ccc gag atg aag atc aag ctg tgc atg agg 48 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys Leu Cys Met Arg 1 5 10 15 ggc acc gtg aac ggc cac aac ttc gtg atc gag ggc gag ggc aag ggc 96 Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly Glu Gly Lys Gly 20 25 30 aac ccc tac gag ggc acc cag atc ctg gac ctg aac gtg acc gag ggc 144 Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn Val Thr Glu Gly 35 40 45 gcc ccc ctg ccc ttc gcc tac gac atc ctg acc acc gtg ttc cag tac 192 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Val Phe Gln Tyr 50 55 60 ggc aac agg gcc ttc acc aag tac ccc gcc gac atc cag gac tac ttc 240 Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile Gln Asp Tyr Phe 65 70 75 80 aag cag acc ttc ccc gag ggc tac cac tgg gag agg agc atg acc tac 288 Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr 85 90 95 gag gac cag ggc atc tgc acc gcc acc agc aac atc agc atg agg ggc 336 Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser Met Arg Gly 100 105 110 gac tgc ttc ttc tac gac atc agg ttc gac ggc gtg aac ttc ccc ccc 384 Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Val Asn Phe Pro Pro 115 120 125 aac ggc ccc gtg atg cag aag aag acc ctg aag tgg gag ccc agc acc 432 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 gag aag atg tac gtg agg gac ggc gtg ctg aag ggc gac gtg aac atg 480 Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val Asn Met 145 150 155 160 gcc ctg ctg ctg gag ggc ggc ggc cac tac agg tgc gac ttc aag acc 528 Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Thr 165 170 175 acc tac aag gcc aag aag gac gtg agg ctg ccc gac tac cac ttc gtg 576 Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Val Arg Leu Pro Asp Tyr His Phe Val 180 185 190 gac cac agg atc gag atc ctg aag cac gac aag gac tac aac aag gtg 624 Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val 195 200 205 aag ctg tac gag aac gcc gtg gcc agg tac agc atg ctg ccc agc cag 672 Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met Leu Pro Ser Gln 210 215 220 gcc aag 678 Ala Lys 225 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized codon Azami Green <400> 2 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys Leu Cys Met Arg 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly Glu Gly Lys Gly 20 25 30 Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Val Phe Gln Tyr 50 55 60 Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile Gln Asp Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser Met Arg Gly 100 105 110 Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Val Asn Phe Pro Pro 115 120 125 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val Asn Met 145 150 155 160 Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Thr 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Val Arg Leu Pro Asp Tyr His Phe Val 180 185 190 Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val 195 200 205 Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met Leu Pro Ser Gln 210 215 220 Ala Lys 225 <210> 3 <211> 306 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(306) <223> p62(PB1) <400> 3 atg gcg tcg ctc acc gtg aag gcc tac ctt ctg ggc aag gag gac gcg 48 Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala 1 5 10 15 gcg cgc gag att cgc cgc ttc agc ttc tgc tgc agc ccc gag cct gag 96 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 gcg gaa gcc gag gct gcg gcg ggt ccg gga ccc tgc gag cgg ctg ctg 144 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu 35 40 45 agc cgg gtg gcc gcc ctg ttc ccc gcg ctg cgg cct ggc ggc ttc cag 192 Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln 50 55 60 gcg cac tac cgc gat gag gac ggg gac ttg gtt gcc ttt tcc agt gac 240 Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp 65 70 75 80 gag gaa ttg aca atg gcc atg tcc tac gtg aag gat gac atc ttc cga 288 Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg 85 90 95 atc tac att aaa gag aaa 306 Ile Tyr Ile Lys Glu Lys 100 <210> 4 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> p62(PB1) <400> 4 Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln 50 55 60 Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp 65 70 75 80 Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg 85 90 95 Ile Tyr Ile Lys Glu Lys 100 <210> 5 <211> 282 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(282) <223> MEK5(PB1) <400> 5 gtg ctg gta att cgc atc aag atc cca aat agt ggc gcg gtg gac tgg 48 Val Leu Val Ile Arg Ile Lys Ile Pro Asn Ser Gly Ala Val Asp Trp 1 5 10 15 aca gtg cac tcc ggg ccg cag tta ctc ttc agg gat gtg ctg gat gtg 96 Thr Val His Ser Gly Pro Gln Leu Leu Phe Arg Asp Val Leu Asp Val 20 25 30 ata ggc cag gtt ctg cct gaa gca aca act aca gca ttt gaa tat gaa 144 Ile Gly Gln Val Leu Pro Glu Ala Thr Thr Thr Ala Phe Glu Tyr Glu 35 40 45 gat gaa gat ggt gat cga att aca gtg aga agt gat gag gaa atg aag 192 Asp Glu Asp Gly Asp Arg Ile Thr Val Arg Ser Asp Glu Glu Met Lys 50 55 60 gca atg ctg tca tat tat tat tcc aca gta atg gaa cag caa gta aat 240 Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Tyr Ser Thr Val Met Glu Gln Gln Val Asn 65 70 75 80 gga cag tta ata gag cct ctg cag ata ttt cca aga gcc tgc 282 Gly Gln Leu Ile Glu Pro Leu Gln Ile Phe Pro Arg Ala Cys 85 90 <210> 6 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> MEK5(PB1) <400> 6 Val Leu Val Ile Arg Ile Lys Ile Pro Asn Ser Gly Ala Val Asp Trp 1 5 10 15 Thr Val His Ser Gly Pro Gln Leu Leu Phe Arg Asp Val Leu Asp Val 20 25 30 Ile Gly Gln Val Leu Pro Glu Ala Thr Thr Thr Ala Phe Glu Tyr Glu 35 40 45 Asp Glu Asp Gly Asp Arg Ile Thr Val Arg Ser Asp Glu Glu Met Lys 50 55 60 Ala Met Leu Ser Tyr Tyr Tyr Ser Thr Val Met Glu Gln Gln Val Asn 65 70 75 80 Gly Gln Leu Ile Glu Pro Leu Gln Ile Phe Pro Arg Ala Cys 85 90 <210> 7 <211> 246 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(246) <223> Nbr1(PB1) <400> 7 cag gtt act cta aat gtg act ttt aaa aat gaa att caa agc ttt ctg 48 Gln Val Thr Leu Asn Val Thr Phe Lys Asn Glu Ile Gln Ser Phe Leu 1 5 10 15 gtt tct gat cca gaa aat aca act tgg gct gat atc gaa gct atg gta 96 Val Ser Asp Pro Glu Asn Thr Thr Trp Ala Asp Ile Glu Ala Met Val 20 25 30 aaa gtt tca ttt gat ctg aat act att caa ata aaa tac ctg gat gag 144 Lys Val Ser Phe Asp Leu Asn Thr Ile Gln Ile Lys Tyr 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Ile Thr His 1 5 10 15 ttt gaa cct tcc atc tcc ttt gag ggc ctt tgc aat gag gtt cga gac 96 Phe Glu Pro Ser Ile Ser Phe Glu Gly Leu Cys Asn Glu Val Arg Asp 20 25 30 atg tgt tct ttt gac aac gaa cag ctc ttc acc atg aaa tgg ata gat 144 Met Cys Ser Phe Asp Asn Glu Gln Leu Phe Thr Met Lys Trp Ile Asp 35 40 45 gag gaa gga gac ccg tgt aca gta tca tct cag ttg gag tta gaa gaa 192 Glu Glu Gly Asp Pro Cys Thr Val Ser Ser Gln Leu Glu Leu Glu Glu 50 55 60 gcc ttt aga ctt tat gag cta aac aag gat tct gaa ctc ttg att cat 240 Ala Phe Arg Leu Tyr Glu Leu Asn Lys Asp Ser Glu Leu Leu Ile His 65 70 75 80 gtg ttc cct tgt 252 Val Phe Pro Cys <210> 10 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> PKCiota(PB1) <400> 10 Gln Val Arg Val Lys Ala Tyr Tyr Arg Gly Asp Ile Met Ile Thr His 1 5 10 15 Phe Glu Pro Ser Ile Ser Phe Glu Gly Leu Cys Asn Glu Val Arg Asp 20 25 30 Met Cys Ser Phe Asp Asn Glu Gln Leu Phe Thr Met Lys Trp Ile Asp 35 40 45 Glu Glu Gly Asp Pro Cys Thr Val Ser Ser Gln Leu Glu Leu Glu Glu 50 55 60 Ala Phe 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Leu Leu Thr Lys Glu Asp 50 55 60 ttt cgc tat cga tct cct cat tca ggt gat gtg ctc tat gaa ctc ctt 240 Phe Arg Tyr Arg Ser Pro His Ser Gly Asp Val Leu Tyr Glu Leu Leu 65 70 75 80 cag cat att ctg aag cag agg 261 Gln His Ile Leu Lys Gln Arg 85 <210> 14 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> TEL(SAM) <400> 14 Pro Arg Ala Leu Arg Met Glu Glu Asp Ser Ile Arg Leu Pro Ala His 1 5 10 15 Leu Arg Leu Gln Pro Ile Tyr Trp Ser Arg Asp Asp Val Ala Gln Trp 20 25 30 Leu Lys Trp Ala Glu Asn Glu Phe Ser Leu Arg Pro Ile Asp Ser Asn 35 40 45 Thr Phe Glu Met Asn Gly Lys Ala Leu Leu Leu Leu Thr Lys Glu Asp 50 55 60 Phe Arg Tyr Arg Ser Pro His Ser Gly Asp Val Leu Tyr Glu Leu Leu 65 70 75 80 Gln His Ile Leu Lys Gln Arg 85 <210> 15 <211> 231 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(231) <223> EphB2(SAM) <400> 15 ctg gac cgc acg atc ccc gac tac acc agc ttt aac acg gtg gac gag 48 Leu Asp Arg Thr Ile Pro Asp Tyr Thr Ser Phe Asn Thr Val Asp Glu 1 5 10 15 tgg ctg gag gcc atc aag atg ggg cag tac aag gag agc ttc gcc aat 96 Trp Leu Glu Ala Ile Lys Met Gly Gln Tyr Lys Glu Ser Phe Ala Asn 20 25 30 gcc ggc ttc acc tcc ttt gac gtc gtg tct cag atg atg atg gag gac 144 Ala Gly Phe Thr Ser Phe Asp Val Val Ser Gln Met Met Met Glu Asp 35 40 45 att ctc cgg gtt ggg gtc act ttg gct ggc cac cag aaa aaa atc ctg 192 Ile Leu Arg Val Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys Ile Leu 50 55 60 aac agt atc cag gtg atg cgg gcg cag atg aac cag att 231 Asn Ser Ile Gln Val Met Arg Ala Gln Met Asn Gln Ile 65 70 75 <210> 16 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> EphB2(SAM) <400> 16 Leu Asp Arg Thr Ile Pro Asp Tyr Thr Ser Phe Asn Thr Val Asp Glu 1 5 10 15 Trp Leu Glu Ala Ile Lys Met Gly Gln Tyr Lys Glu Ser Phe Ala Asn 20 25 30 Ala Gly Phe Thr Ser Phe Asp Val Val Ser Gln Met Met Met Glu Asp 35 40 45 Ile Leu Arg Val Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys Ile Leu 50 55 60 Asn Ser Ile Gln Val Met Arg Ala Gln Met Asn Gln Ile 65 70 75 <210> 17 <211> 204 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> 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gaa cag att aca cta gat gtg ttg gct gat atg ggt cat gaa 336 Glu Thr Glu Gln Ile Thr Leu Asp Val Leu Ala Asp Met Gly His Glu 100 105 110 gag ttg aaa gaa ata ggc atc aat gca tat ggg cac cgc cac aaa tta 384 Glu Leu Lys Glu Ile Gly Ile Asn Ala Tyr Gly His Arg His Lys Leu 115 120 125 atc aaa gga gta gaa aga ctc tta ggt gga caa caa ggc acc aat cct 432 Ile Lys Gly Val Glu Arg Leu Leu Gly Gly Gln Gln Gly Thr Asn Pro 130 135 140 tat ttg act ttt cac tgt gtt aat cag gga acg att ttg ctg gat ctt 480 Tyr Leu Thr Phe His Cys Val Asn Gln Gly Thr Ile Leu Leu Asp Leu 145 150 155 160 gct cca gaa gat aaa gaa tat cag tca gtg gaa gaa gag atg caa agt 528 Ala Pro Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Ser Val Glu Glu Glu Met Gln Ser 165 170 175 act att cga gaa cac aga gat ggt ggt aat gct ggc ggc atc ttc aac 576 Thr Ile Arg Glu His Arg Asp Gly Gly Asn Ala Gly Gly Ile Phe Asn 180 185 190 aga tac aat gtc att cga att 597 Arg Tyr Asn Val Ile Arg Ile 195 <210> 20 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Tankyrase(SAM) <400> 20 Leu Ile Asp Ala Met Pro Pro Glu Ala Leu Pro Thr Cys Phe Lys Pro 1 5 10 15 Gln Ala Thr Val Val Ser Ala Ser Leu Ile Ser Pro Ala Ser Thr Pro 20 25 30 Ser Cys Leu Ser Ala Ala Ser Ser Ile Asp Asn Leu Thr Gly Pro Leu 35 40 45 Ala Glu Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser Asn Ala Gly Asp Gly Ala Ala 50 55 60 Gly Thr Glu Arg Lys Glu Gly Glu Val Ala Gly Leu Asp Met Asn Ile 65 70 75 80 Ser Gln Phe Leu Lys Ser Leu Gly Leu Glu His Leu Arg Asp Ile Phe 85 90 95 Glu Thr Glu Gln Ile Thr Leu Asp Val Leu Ala Asp Met Gly His Glu 100 105 110 Glu Leu Lys Glu Ile Gly Ile Asn Ala Tyr Gly His Arg His Lys Leu 115 120 125 Ile Lys Gly Val Glu Arg Leu Leu Gly Gly Gln Gln Gly Thr Asn Pro 130 135 140 Tyr Leu Thr Phe His Cys Val Asn Gln Gly Thr Ile Leu Leu Asp Leu 145 150 155 160 Ala Pro Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Ser Val Glu Glu Glu Met Gln Ser 165 170 175 Thr Ile Arg Glu His Arg Asp Gly Gly Asn Ala Gly Gly Ile Phe Asn 180 185 190 Arg Tyr Asn Val Ile Arg Ile 195 <210> 21 <211> 270 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(270) <223> mTOR(FRB) <400> 21 gag atg tgg cat gaa ggc ctg gaa gag gca tct cgt ttg tac ttt ggg 48 Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly 1 5 10 15 gaa agg aac gtg aaa ggc atg ttt gag gtg ctg gag ccc ttg cat gct 96 Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala 20 25 30 atg atg gaa cgg ggc ccc cag act ctg aag gaa aca tcc ttt aat cag 144 Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln 35 40 45 gcc tat ggt cga gat tta atg gag gcc caa gag tgg tgc agg aag tac 192 Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr 50 55 60 atg aaa tca ggg aat gtc aag gac ctc acc caa gcc tgg gac ctc tat 240 Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr 65 70 75 80 tat cat gtg ttc cga cga atc tca aag cag 270 Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln 85 90 <210> 22 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> mTOR(FRB) <400> 22 Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly 1 5 10 15 Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala 20 25 30 Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln 35 40 45 Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr 50 55 60 Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr 65 70 75 80 Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln 85 90 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> FKBP12 <400> 23 atg gga gtg cag gtg gaa acc atc tcc cca gga gac ggg cgc acc ttc 48 Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 ccc aag cgc ggc cag acc tgc gtg gtg cac tac acc ggg atg ctt gaa 96 Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu 20 25 30 gat gga aag aaa ttt gat tcc tcc cgg gac aga aac aag ccc ttt aag 144 Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 ttt atg cta ggc aag cag gag gtg atc cga ggc tgg gaa gaa ggg gtt 192 Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val 50 55 60 gcc cag atg agt gtg ggt cag aga gcc aaa ctg act ata tct cca gat 240 Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp 65 70 75 80 tat gcc tat ggt gcc act ggg cac cca ggc atc atc cca cca cat gcc 288 Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala 85 90 95 act ctc gtc ttc gat gtg gag ctt cta aaa ctg gaa 324 Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> FKBP12 <400> 24 Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu 20 25 30 Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val 50 55 60 Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala 85 90 95 Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 25 <211> 210 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(210) <223> p53 <400> 25 atg gag gag ccg cag tca gat cct agc gtc gag ccc cct ctg agt cag 48 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 gaa aca ttt tca gac cta tgg aaa cta ctt cct gaa aac aac gtt ctg 96 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 tcc ccc ttg ccg tcc caa gca atg gat gat ttg atg ctg tcc ccg gac 144 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 gat att gaa caa tgg ttc act gaa gac cca ggt cca gat gaa gct ccc 192 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 aga atg cca gag gct gct 210 Arg Met Pro Glu Ala Ala 65 70 <210> 26 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> p53 <400> 26 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala 65 70 <210> 27 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> MDM2 <400> 27 atg tgc aat acc aac atg tct gta cct act gat ggt gct gta acc acc 48 Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr 1 5 10 15 tca cag att cca gct tcg gaa caa gag acc ctg gtt aga cca aag cca 96 Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro 20 25 30 ttg ctt ttg aag tta tta aag tct gtt ggt gca caa aaa gac act tat 144 Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr 35 40 45 act atg aaa gag gtt ctt ttt tat ctt ggc cag tat att atg act aaa 192 Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys 50 55 60 cga tta tat gat gag aag caa caa cat att gta tat tgt tca aat gat 240 Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp 65 70 75 80 ctt cta gga gat ttg ttt ggc gtg cca agc ttc tct gtg aaa gag cac 288 Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His 85 90 95 agg aaa ata tat acc atg atc tac agg aac ttg gta gta gtc aat cag 336 Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln 100 105 110 cag gaa tca tcg gac tca ggt 357 Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly 115 <210> 28 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> MDM2 <400> 28 Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr 1 5 10 15 Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro 20 25 30 Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr 35 40 45 Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys 50 55 60 Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp 65 70 75 80 Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His 85 90 95 Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln 100 105 110 Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly 115 <210> 29 <211> 297 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(297) <223> Sec5 <400> 29 atg tct cga tca cga caa ccc ccc ctt gtg acc ggc atc tct cca 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Gly Glu Asn Leu Gly 20 25 30 Thr Gly Pro Thr Asp Leu Ile Gly Leu Thr Ile Cys Gly His Asn Cys 35 40 45 Leu Leu Thr Ala Glu Trp Met Ser Ala Ser Lys Ile Val Cys Arg Val 50 55 60 Gly Gln Ala Lys Asn Asp Lys Gly Asp Ile Ile Val Thr Thr Lys Ser 65 70 75 80 Gly Gly Arg Gly Thr Ser Thr Val Ser Phe Lys Leu Leu Lys Pro Glu 85 90 95 Lys Ile Gly <210> 31 <211> 621 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(621) <223> RalB <400> 31 atg gct gcc aac aag agt aag ggc cag agc tcc ttg gcc ctc cac aag 48 Met Ala Ala Asn Lys Ser Lys Gly Gln Ser Ser Leu Ala Leu His Lys 1 5 10 15 gtg atc atg gtt ggc agc gga ggc gtt ggc aag tca gcc ctg acg ctt 96 Val Ile Met Val Gly Ser Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Leu 20 25 30 cag ttc atg tat gac gag ttt gta gaa gac tat gaa cct acc aaa gct 144 Gln Phe Met Tyr Asp Glu Phe Val Glu Asp Tyr Glu Pro Thr Lys Ala 35 40 45 gac agt tat aga aag aaa gtg gtt ctt gat ggg gaa gaa gtt cag ata 192 Asp Ser Tyr Arg Lys Lys Val Val Leu Asp Gly Glu Glu Val Gln Ile 50 55 60 gat att ctg gac acc gct ggg caa gag gac tac gca gcc att cga gat 240 Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr Ala Ala Ile Arg Asp 65 70 75 80 aac tac ttt cgg agt ggg gaa ggg ttt ctt ctt gtg ttc tca atc aca 288 Asn Tyr Phe Arg Ser Gly Glu Gly Phe Leu Leu Val Phe Ser Ile Thr 85 90 95 gaa cat gaa tcc ttt aca gca act gcc gaa ttc agg gaa cag att ctc 336 Glu His Glu Ser Phe Thr Ala Thr Ala Glu Phe Arg Glu Gln Ile Leu 100 105 110 cgt gtg aag gct gaa gaa gat aaa att cca ctg ctc gtc gtg gga aac 384 Arg Val Lys Ala Glu Glu Asp Lys Ile Pro Leu Leu Val Val Gly Asn 115 120 125 aag tct gac cta gag gag cgg agg cag gtg cct gtg gag gag gcc agg 432 Lys Ser Asp Leu Glu Glu Arg Arg Gln Val Pro Val Glu Glu Ala Arg 130 135 140 agt aaa gcc gaa gag tgg ggc gtg cag tac gtg gag acg tca gcg aag 480 Ser Lys Ala Glu Glu Trp Gly Val Gln Tyr Val Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 acc cgg gcc aac gtg gac aag gtg ttc ttt gac cta atg aga gaa atc 528 Thr Arg Ala Asn Val Asp Lys Val Phe Phe Asp Leu Met Arg Glu Ile 165 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Glu Ala Arg 130 135 140 Ser Lys Ala Glu Glu Trp Gly Val Gln Tyr Val Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 Thr Arg Ala Asn Val Asp Lys Val Phe Phe Asp Leu Met Arg Glu Ile 165 170 175 Arg Thr Lys Lys Met Ser Glu Asn Lys Asp Lys Asn Gly Lys Lys Ser 180 185 190 Ser Lys Asn Lys Lys Ser Phe Lys Glu Arg Cys Cys Leu Leu 195 200 205 <210> 33 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RalB Protein Q72L mutant <220> <221> CDS <222> (1)..(621) <223> RalB(Q72L) <400> 33 atg gct gcc aac aag agt aag ggc cag agc tcc ttg gcc ctc cac aag 48 Met Ala Ala Asn Lys Ser Lys Gly Gln Ser Ser Leu Ala Leu His Lys 1 5 10 15 gtg atc atg gtt ggc agc gga ggc gtt ggc aag tca gcc ctg acg ctt 96 Val Ile Met Val Gly Ser Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Leu 20 25 30 cag ttc atg tat gac gag ttt gta gaa gac tat gaa cct acc aaa gct 144 Gln Phe Met Tyr Asp Glu Phe Val Glu Asp Tyr Glu Pro Thr Lys Ala 35 40 45 gac agt tat aga aag aaa gtg gtt ctt gat ggg gaa gaa gtt cag ata 192 Asp Ser Tyr Arg Lys Lys Val Val Leu Asp Gly Glu Glu Val Gln Ile 50 55 60 gat att ctg gac acc gct ggg cta gag gac tac gca gcc att cga gat 240 Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Asp Tyr Ala Ala Ile Arg Asp 65 70 75 80 aac tac ttt cgg agt ggg gaa ggg ttt ctt ctt gtg ttc tca atc aca 288 Asn Tyr Phe Arg Ser Gly Glu Gly Phe Leu Leu Val Phe Ser Ile Thr 85 90 95 gaa cat gaa tcc ttt aca gca act gcc gaa ttc agg gaa cag att ctc 336 Glu His Glu Ser Phe Thr Ala Thr Ala Glu Phe Arg Glu Gln Ile Leu 100 105 110 cgt gtg aag gct gaa gaa gat aaa att cca ctg ctc gtc gtg gga aac 384 Arg Val Lys Ala Glu Glu Asp Lys Ile Pro Leu Leu Val Val Gly Asn 115 120 125 aag tct gac cta gag gag cgg agg cag gtg cct gtg gag gag gcc agg 432 Lys Ser Asp Leu Glu Glu Arg Arg Gln Val Pro Val Glu Glu Ala Arg 130 135 140 agt aaa gcc gaa gag tgg ggc gtg cag tac gtg gag acg tca gcg aag 480 Ser Lys Ala Glu Glu Trp Gly Val Gln Tyr Val Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 acc cgg gcc aac gtg gac aag gtg ttc ttt gac cta atg aga gaa atc 528 Thr Arg Ala Asn Val Asp Lys Val Phe 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atg aga gaa atc 528 Thr Arg Ala Asn Val Asp Lys Val Phe Phe Asp Leu Met Arg Glu Ile 165 170 175 aga aca aag aag atg tca gaa aac aaa gac aag aat ggc aag aaa agc 576 Arg Thr Lys Lys Met Ser Glu Asn Lys Asp Lys Asn Gly Lys Lys Ser 180 185 190 agc aag aac aag aaa agt ttt aaa gaa aga tgt tgc tta cta tga 621 Ser Lys Asn Lys Lys Ser Phe Lys Glu Arg Cys Cys Leu Leu 195 200 205 <210> 36 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RalB Protein S28N mutant <400> 36 Met Ala Ala Asn Lys Ser Lys Gly Gln Ser Ser Leu Ala Leu His Lys 1 5 10 15 Val Ile Met Val Gly Ser Gly Gly Val Gly Lys Asn Ala Leu Thr Leu 20 25 30 Gln Phe Met Tyr Asp Glu Phe Val Glu Asp Tyr Glu Pro Thr Lys Ala 35 40 45 Asp Ser Tyr Arg Lys Lys Val Val Leu Asp Gly Glu Glu Val Gln Ile 50 55 60 Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr Ala Ala Ile Arg Asp 65 70 75 80 Asn Tyr Phe Arg Ser Gly Glu Gly Phe Leu Leu Val Phe Ser Ile Thr 85 90 95 Glu His Glu Ser Phe Thr Ala Thr Ala Glu Phe Arg Glu Gln Ile Leu 100 105 110 Arg Val Lys Ala Glu Glu Asp Lys Ile Pro Leu Leu Val Val Gly Asn 115 120 125 Lys Ser Asp Leu Glu Glu Arg Arg Gln Val Pro Val Glu Glu Ala Arg 130 135 140 Ser Lys Ala Glu Glu Trp Gly Val Gln Tyr Val Glu Thr Ser Ala Lys 145 150 155 160 Thr Arg Ala Asn Val Asp Lys Val Phe Phe Asp Leu Met Arg Glu Ile 165 170 175 Arg Thr Lys Lys Met Ser Glu Asn Lys Asp Lys Asn Gly Lys Lys Ser 180 185 190 Ser Lys Asn Lys Lys Ser Phe Lys Glu Arg Cys Cys Leu Leu 195 200 205 <210> 37 <211> 441 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(441) <223> Calmodulin <400> 37 gac caa ctg aca gaa gag cag att gca gag ttc aaa gaa gcc ttc tca 48 Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser 1 5 10 15 tta ttc gac aag gat ggg gac ggc acc atc acc aca aag gaa ctt ggc 96 Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly 20 25 30 acc gtt atg agg tcg ctt gga caa aac cca acg gaa gca gaa ttg cag 144 Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln 35 40 45 gat atg atc aat gaa gtc gat gct gat ggc aat gga acg att tac ttt 192 Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Tyr Phe 50 55 60 cct gaa ttt ctt act atg atg gct aga aaa atg aag gac aca gac agc 240 Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser 65 70 75 80 gaa gag gaa atc cga gaa gca ttc cgt gtt ttt gac aag gat ggg aac 288 Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn 85 90 95 ggc tac atc agc gct gct gaa tta cgt cac gtc atg aca aac ctc ggg 336 Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly 100 105 110 gag aag tta aca gat gaa gaa gtt gat gaa atg ata agg gaa gca gat 384 Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp 115 120 125 atc gat ggt gat ggc caa gta aac tat gaa gag ttt gta caa atg atg 432 Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met 130 135 140 aca gca aag 441 Thr Ala Lys 145 <210> 38 <211> 147 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Calmodulin <400> 38 Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly 20 25 30 Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln 35 40 45 Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Tyr Phe 50 55 60 Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly 100 105 110 Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp 115 120 125 Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met 130 135 140 Thr Ala Lys 145 <210> 39 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(78) <223> M13 peptide <400> 39 aag agg cgc tgg aag aaa aac ttc att gcc gtc agc gct gcc aac cgg 48 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 ttc aag aag atc tcc agc tcc ggg gca ctg 78 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 40 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> M13 peptide <400> 40 Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu 20 25 <210> 41 <211> 594 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(594) <223> HRas <400> 41 atg acg gaa tat aag ctg gtg gtg gtg ggc gcc gtc ggt gtg ggc aag 48 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 agt gcg ctg acc atc cag ctg atc cag aac cat ttt gtg gac gaa tac 96 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 gac ccc act ata gag gat tcc tac cgg aag cag gtg gtc att gat ggg 144 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 gag acg tgc ctg ttg gac atc ctg gat acc gcc ggc cag gag gag tac 192 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 agc gcc atg cgg gac cag tac atg cgc acc ggg gag ggc ttc ctg tgt 240 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 gtg ttt gcc atc aac aac acc aag tct ttt gag gac atc cac cag tac 288 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr 85 90 95 agg gag cag atc aaa cgg gtg aag gac tcg gat gac gtg ccc atg gtg 336 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val 100 105 110 ctg gtg ggg aac aag tgt gac ctg gct gca cgc act gtg gaa tct cgg 384 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg 115 120 125 cag gct cag gac ctc gcc cga agc tac ggc atc ccc tac atc gag acc 432 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr 130 135 140 tcg gcc aag acc cgg cag gga gtg gag gat gcc ttc tac acg ttg gtg 480 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 cgt gag atc cgg cag cac aag ctg cgg aag ctg aac gtc tcc gga ggt 528 Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Val Ser Gly Gly 165 170 175 ctc gag aag atg agc aaa gat ggt aaa aag aag aaa aag aag tca aag 576 Leu Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys 180 185 190 aca aag tgt gta att atg 594 Thr Lys Cys Val Ile Met 195 <210> 42 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> HRas <400> 42 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Val Ser Gly Gly 165 170 175 Leu Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys 180 185 190 Thr Lys Cys Val Ile Met 195 <210> 43 <211> 243 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(243) <223> cRaf <400> 43 cct tct aag aca agc aac act atc cgt gtt ttc ttg ccg aac aag caa 48 Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Arg Val Phe Leu Pro Asn Lys Gln 1 5 10 15 aga aca gtg gtc aat gtg cga aat gga atg agc ttg cat gac tgc ctt 96 Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu His Asp Cys Leu 20 25 30 atg aaa gca ctc aag gtg agg ggc ctg caa cca gag tgc tgt gca gtg 144 Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys Ala Val 35 40 45 ttc aga ctt ctc cac gaa cac aaa ggt aaa aaa gca cgc tta gat tgg 192 Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu Asp Trp 50 55 60 aat act gat gct gcg tct ttg att gga gaa gaa ctt caa gta gat ttc 240 Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu Gln Val Asp Phe 65 70 75 80 ctg 243 Leu <210> 44 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> cRaf <400> 44 Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Arg Val Phe Leu Pro Asn Lys Gln 1 5 10 15 Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu His Asp Cys Leu 20 25 30 Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys Ala Val 35 40 45 Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu Asp Trp 50 55 60 Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu Gln Val Asp Phe 65 70 75 80 Leu <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <223> Smac <400> 45 atg gcc gtg ccc atc gcc cag aaa tca gag 30 Met Ala Val Pro Ile Ala Gln Lys Ser Glu 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Smac <400> 46 Met Ala Val Pro Ile Ala Gln Lys Ser Glu 1 5 10 <210> 47 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <223> XIAP <400> 47 gct gtg agt tct gat agg aat ttc cca aat tca aca aat ctt cca aga 48 Ala Val Ser Ser Asp Arg Asn Phe Pro Asn Ser Thr Asn Leu Pro Arg 1 5 10 15 aat cca tcc atg gca gat tat gaa gca cgg atc ttt act ttt ggg aca 96 Asn Pro Ser Met Ala Asp Tyr Glu Ala Arg Ile Phe Thr Phe Gly Thr 20 25 30 tgg ata tac tca gtt aac aag gag cag ctt gca aga gct gga ttt tat 144 Trp Ile Tyr Ser Val Asn Lys Glu Gln Leu Ala Arg Ala Gly Phe Tyr 35 40 45 gct tta ggt gaa ggt gat aaa gta aag tgc ttt cac tgt gga gga ggg 192 Ala Leu Gly Glu Gly Asp Lys Val Lys Cys Phe His Cys Gly Gly Gly 50 55 60 cta act gat tgg aag ccc agt gaa gac cct tgg gaa caa cat gct aaa 240 Leu Thr Asp Trp Lys Pro Ser Glu Asp Pro Trp Glu Gln His Ala Lys 65 70 75 80 tgg tat cca ggg tgc aaa tat ctg tta gaa cag aag gga caa gaa tat 288 Trp Tyr Pro Gly Cys Lys Tyr Leu Leu Glu Gln Lys Gly Gln Glu Tyr 85 90 95 ata aac aat att cat tta act cat tca ctt gag gag tgt ctg gta aga 336 Ile Asn Asn Ile His Leu Thr His Ser Leu Glu Glu Cys Leu Val Arg 100 105 110 act act 342 Thr Thr <210> 48 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> XIAP <400> 48 Ala Val Ser Ser Asp Arg Asn Phe Pro Asn Ser Thr Asn Leu Pro Arg 1 5 10 15 Asn Pro Ser Met Ala Asp Tyr Glu Ala Arg Ile Phe Thr Phe Gly Thr 20 25 30 Trp Ile Tyr Ser Val Asn Lys Glu Gln Leu Ala Arg Ala Gly Phe Tyr 35 40 45 Ala Leu Gly Glu Gly Asp Lys Val Lys Cys Phe His Cys Gly Gly Gly 50 55 60 Leu Thr Asp Trp Lys Pro Ser Glu Asp Pro Trp Glu Gln His Ala Lys 65 70 75 80 Trp Tyr Pro Gly Cys Lys Tyr Leu Leu Glu Gln Lys Gly Gln Glu Tyr 85 90 95 Ile Asn Asn Ile His Leu Thr His Ser Leu Glu Glu Cys Leu Val Arg 100 105 110 Thr Thr <210> 49 <211> 627 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(627) <223> BclX(L) <400> 49 atg tct cag agc aac cgg gag ctg gtg gtt gac ttt ctc tcc tac aag 48 Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys 1 5 10 15 ctt tcc cag aaa gga tac agc tgg agt cag ttt agt gat gtg gaa gag 96 Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu 20 25 30 aac agg act gag gcc cca gaa ggg act gaa tcg gag atg gag acc ccc 144 Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro 35 40 45 agt gcc atc aat ggc aac cca tcc tgg cac ctg gca gac agc ccc gcg 192 Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala 50 55 60 gtg aat gga gcc act ggc cac agc agc agt ttg gat gcc cgg gag gtg 240 Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val 65 70 75 80 atc ccc atg gca gca gta aag caa gcg ctg agg gag gca ggc gac gag 288 Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu 85 90 95 ttt gaa ctg cgg tac cgg cgg gca ttc agt gac ctg aca tcc cag ctc 336 Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu 100 105 110 cac atc acc cca ggg aca gca tat cag agc ttt gaa cag gta gtg aat 384 His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn 115 120 125 gaa ctc ttc cgg gat ggg gta aac tgg ggt cgc att gtg gcc ttt ttc 432 Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe 130 135 140 tcc ttc ggc ggg gca ctg tgc gtg gaa agc gta gac aag gag atg cag 480 Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln 145 150 155 160 gta ttg gtg agt cgg atc gca gct tgg atg gcc act tac ctg aat gac 528 Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp 165 170 175 cac cta gag cct tgg atc cag gag aac ggc ggc tgg gat act ttt gtg 576 His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val 180 185 190 gaa ctc tat ggg aac aat gca gca gcc gag agc cga aag ggc cag gaa 624 Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu 195 200 205 cgc 627 Arg <210> 50 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> BclX(L) <400> 50 Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys 1 5 10 15 Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu 20 25 30 Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala 50 55 60 Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val 65 70 75 80 Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu 85 90 95 Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu 100 105 110 His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn 115 120 125 Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe 130 135 140 Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln 145 150 155 160 Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp 165 170 175 His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val 180 185 190 Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu 195 200 205 Arg <210> 51 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(75) <223> BAD <400> 51 aac ctc tgg gca gca cag cgc tat ggc cgc gag ctc cgg agg atg agt 48 Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser 1 5 10 15 gac gag ttt gtg gac tcc ttt aag aag 75 Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys 20 25 <210> 52 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> BAD <400> 52 Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser 1 5 10 15 Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys 20 25 <210> 53 <211> 579 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(579) <223> Rac1 <400> 53 atg cag gcc atc aag tgt gtg gtg gtg gga gac gga gct gta ggt aaa 48 Met Gln Ala Ile Lys Cys Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys 1 5 10 15 act tgc cta ctg atc agt tac aca acc aat gca ttt cct gga gaa tat 96 Thr Cys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Thr Asn Ala Phe Pro Gly Glu Tyr 20 25 30 atc cct act gtc ttt gac aat tat tct gcc aat gtt atg gta gat gga 144 Ile Pro Thr Val Phe Asp Asn Tyr Ser Ala Asn Val Met Val Asp Gly 35 40 45 aaa ccg gtg aat ctg ggc tta tgg gat aca gct gga caa gaa gat tat 192 Lys Pro Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr 50 55 60 gac aga tta cgc ccc cta tcc tat ccg caa aca gat gtg ttc tta att 240 Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Thr Asp Val Phe Leu Ile 65 70 75 80 tgc ttt tcc ctt gtg agt cct gca tca ttt gaa aat gtc cgt gca aag 288 Cys Phe Ser Leu Val Ser Pro Ala Ser Phe Glu Asn Val Arg Ala Lys 85 90 95 tgg tat cct gag gtg cgg cac cac tgt ccc aac act ccc atc atc cta 336 Trp Tyr Pro Glu Val Arg His His Cys Pro Asn Thr Pro Ile Ile Leu 100 105 110 gtg gga act aaa ctt gat ctt agg gat gat aaa gac acg atc gag aaa 384 Val Gly Thr Lys Leu Asp Leu Arg Asp Asp Lys Asp Thr Ile Glu Lys 115 120 125 ctg aag gag aag aag ctg act ccc atc acc tat ccg cag ggt cta gcc 432 Leu Lys Glu Lys Lys Leu Thr Pro Ile Thr Tyr Pro Gln Gly Leu Ala 130 135 140 atg gct aag gag att ggt gct gta aaa tac ctg gag tgc tcg gcg ctc 480 Met Ala Lys Glu Ile Gly Ala Val Lys Tyr Leu Glu Cys Ser Ala Leu 145 150 155 160 aca cag cga ggc ctc aag aca gtg ttt gac gaa gcg atc cga gca gtc 528 Thr Gln Arg Gly Leu Lys Thr Val Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ala Val 165 170 175 ctc tgc ccg cct ccc gtg aag aag agg aag aga aaa tgc ctg ctg ttg 576 Leu Cys Pro Pro Pro Val Lys Lys Arg Lys Arg Lys Cys Leu Leu Leu 180 185 190 taa 579 <210> 54 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Rac1 <400> 54 Met Gln Ala Ile Lys Cys Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys 1 5 10 15 Thr Cys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Thr Asn Ala Phe Pro Gly Glu Tyr 20 25 30 Ile Pro Thr Val Phe Asp Asn Tyr Ser Ala Asn Val Met Val Asp Gly 35 40 45 Lys Pro Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr 50 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cca gag cag tgg gcc cgc ttg ctt cag aca tca aat atc act aag 144 Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile Thr Lys 35 40 45 tcg gag cag aag aaa aac ccg cag gct gtt ctg gat gtg ttg gag ttt 192 Ser Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu Glu Phe 50 55 60 tac aac tcg aag aag aca tcc aac agc cag aaa tac atg agc ttt aca 240 Tyr Asn Ser Lys Lys Thr Ser Asn Ser Gln Lys Tyr Met Ser Phe Thr 65 70 75 80 gat aag tca gct 252 Asp Lys Ser Ala <210> 56 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> PBD <400> 56 Lys Lys Glu Lys Glu Arg Pro Glu Ile Ser Leu Pro Ser Asp Phe Glu 1 5 10 15 His Thr Ile His Val Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Glu Phe Thr Gly 20 25 30 Met Pro Glu Gln Trp Ala Arg Leu Leu Gln Thr Ser Asn Ile Thr Lys 35 40 45 Ser Glu Gln Lys Lys Asn Pro Gln Ala Val Leu Asp Val Leu Glu Phe 50 55 60 Tyr Asn Ser Lys Lys Thr Ser Asn Ser Gln Lys Tyr Met Ser Phe Thr 65 70 75 80 Asp Lys Ser Ala <210> 57 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized hAG forward primer 1 sequence <400> 57 ctagctagca ttgccaccat ggtgagcgtg atcaagcccg ag 42 <210> 58 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized hAG reverse primer 1 sequence <400> 58 actaccggtc ttggcctggc tgggcagcat gctgtacc 38 <210> 59 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized p62(PB1) forward primer 1 sequence <400> 59 aagaattcga tggcgtcgct caccgtgaag gcctaccttc tgggc 45 <210> 60 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized p62(PB1) reverse primer 1 sequence <400> 60 aattggcggc cgcttatttc tctttaatgt agattcggaa gatgtc 46 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized hAG forward primer 2 sequence <400> 61 ggaccggtat ggtgagcgtg atcaagcccg ag 32 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized hAG reverse primer 2 sequence <400> 62 tttctagatc acttggcctg gctgggcagc atgc 34 <210> 63 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized p62(PB1) forward primer 2 sequence <400> 63 gggaccggta tggcgtcgct caccgtgaag gcctaccttc 40 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized p62(PB1) reverse primer 2 sequence <400> 64 acctctagat tatttctctt taatgtagat tcggaagatg 40 <210> 65 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized p62(PB1) forward primer 3 sequence <400> 65 tagcgctagc attgccacca tggcgtcgct caccgtgaag gcctaccttc 50 <210> 66 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized p62(PB1) reverse primer 3 sequence <400> 66 aaaaccggtt ttctctttaa tgtagattcg gaagatg 37 <210> 67 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized mTOR(FRB) forward primer sequence <400> 67 gccgaattcg gccaccatgg agatgtggca tgaaggcctg gaagaggcat ctcg 54 <210> 68 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized mTOR(FRB) reverse primer sequence <400> 68 gggctcgagc cctgctttga gattcgtcgg aacacatgat aatagaggtc cc 52 <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized FKBP12 forward primer sequence <400> 69 gccgaattcg atgggagtgc aggtggaaac c 31 <210> 70 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized FKBP12 reverse primer sequence <400> 70 gggctcgagt tattccagtt ttagaagctc ca 32 <210> 71 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized MEK(PB1) forward primer sequence <400> 71 ccgaattcgg tgctggtaat tcgcatcaag atcccaaa 38 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized MEK(PB1) reverse primer sequence <400> 72 ttctcgagtt agcaggctct tggaaatatc tgcag 35 <210> 73 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Nbr1 (PB1) forward primer sequence <400> 73 aagaattcgg caggttactc taaatgtgac ttttaaa 37 <210> 74 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Nbr1 (PB1) reverse primer sequence <400> 74 ttctcgagtt acccttcgtg gacttgcatc tgcagtt 37 <210> 75 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized PKCiota(PB1) forward primer sequence <400> 75 aagaattcgc aggtccgggt gaaagcctac taccgcg 37 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized PKCiota(PB1) reverse primer sequence <400> 76 ttctcgagtt aacaagggaa cacatgaatc aagagttcag 40 <210> 77 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TFG(PB1) forward primer 1 sequence <400> 77 aactgcagca aagctaatca tcaaagctca acttgggga 39 <210> 78 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TFG(PB1) reverse primer 1 sequence <400> 78 ttaagctttt aattaacaaa taatgtcagt ttcagtat 38 <210> 79 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TEL(SAM) forward primer sequence <400> 79 aaaaggatcc gccaccatgc ctcgagcgct caggatggag gaa 43 <210> 80 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TEL(SAM) reverse primer sequence <400> 80 aaaaaagctt ttacctctgc ttcagaatat gctgaaggag tt 42 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized EphB2 (SAM) forward primer sequence <400> 81 aaaaggatcc gccaccatgc tggaccgcac gatccccga 39 <210> 82 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized EphB2 (SAM) reverse primer sequence <400> 82 aaaaaagctt ttaaatctgg ttcatctgcg cccg 34 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized DGKdelta(SAM) forward primer sequence <400> 83 aaaaggtacc gccaccatgc cggttcacct ctgggggaca 40 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized DGKdelta(SAM) reverse primer sequence <400> 84 aaaaaagctt ttagctgcgg ctcagctcct tgat 34 <210> 85 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Tankyrase(SAM) forward primer sequence <400> 85 aaaaggatcc gccaccatgc tgatagatgc catgccccca ga 42 <210> 86 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Tankyrase(SAM) reverse primer sequence <400> 86 aaaaaagctt ttaaattcga atgacattgt atctgttgaa ga 42 <210> 87 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TFG (PB1) forward primer 2 sequence <400> 87 aaaccggtaa gctaatcatc aaagctcaac tt 32 <210> 88 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TFG (PB1) reverse primer 2 sequence <400> 88 tttctagatt aattaacaaa taatgtcagt ttcagtat 38 <210> 89 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TEL (SAM) forwarad primer 2 sequence <400> 89 aaaaaccggt cctcgagcgc tcaggatgga ggaa 34 <210> 90 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized TEL (SAM) reverse primer 2 sequence <400> 90 aaaatctaga ttacctctgc ttcagaatat gctgaaggag tt 42 <210> 91 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized DGKdelta(SAM) forward primer 2 sequence <400> 91 aaaaaccggt ccggttcacc tctgggggac aga 33 <210> 92 <211> 34 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caccatgaag aggcgctgga agaaaaactt cattgc 46 <210> 110 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized M13 peptide reverse primer sequence <400> 110 ccgaattccc cagtgccccg gagctggaga tcttcttg 38 <210> 111 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized AGNLS forward primer sequence <400> 111 aaaccggtat ggtgagtgtg attaaaccag ag 32 <210> 112 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized AGNLS reverse primer sequence <400> 112 aatctagatt atttatcctt ttccttttta ctcttcttct tagctacttc 50 <210> 113 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized HRas forward primer sequence <400> 113 aagaattcga tgacggaata taagctggtg gtggtgggcg ccgtcggtgt gggcaagagt 60 gc 62 <210> 114 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized HRas reverse primer sequence <400> 114 ttctcgagac ctccggagac gttcagcttc cgcagcttgt gctgccggat ctcacgcacc 60 aac 63 <210> 115 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized KRas forward primer sequence <400> 115 aactcgagaa gatgagcaaa gatggtaaaa agaagaaaaa gaagtcaaag acaaagtgtg 60 <210> 116 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized KRas reverse primer sequence <400> 116 ttgcggccgc ttacataatt acacactttg tctttgactt ctttttcttc tttttaccat 60 <210> 117 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized HRas mutant primer sequence <400> 117 gctggtggtg gtgggcgccg tcggtgtggg caagagtgcg c 41 <210> 118 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized cRaf forward primer sequence <400> 118 aaggtacccc ttctaagaca agcaacacta tccgtgtttt cttgccgaac aagcaaagaa 60 <210> 119 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized cRaf reverse primer sequence <400> 119 ttaagctttt acaggaaatc tacttgaagt tcttctccaa tcaaagacgc ag 52 <210> 120 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Smac forward primer sequence <400> 120 aggatccgcc accatggccg tgcccatcgc ccagaaatca gagaattcgg 50 <210> 121 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized XIAP forward primer sequence <400> 121 ttggatccgc caccatggct gtgagttctg ataggaattt cccaaattc 49 <210> 122 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized XIAP reverse primer sequence <400> 122 ttgaattctc agtagttctt accagacact cctcaagtga atgag 45 <210> 123 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized BclX(L) forward primer sequence <400> 123 ttctcgagga tgtctcagag caaccgggag ctggtggttg ac 42 <210> 124 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized BclX(L) reverse primer sequence <400> 124 ctaagcggcc gcttagcgtt cctggccctt tcggctctcg gctg 44 <210> 125 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized BAD forward primer 1 sequence <400> 125 gcagcacagc gctatggccg cgagctccgg aggatgagtg acgagtttgt 50 <210> 126 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized BAD forward primer 2 sequence <400> 126 ttggatccaa cctctgggca gcacagcgct atggccgcga gctccggagg 50 <210> 127 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized BAD reverse primer sequence <400> 127 ttgaattctt acttcttaaa ggagtccaca aactcgtcac tcatcctccg 50 <210> 128 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Rac1 forward primer sequence <400> 128 gagaattcga tgcaggccat caagtgtgtg gtgg 34 <210> 129 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized Rac1 reverse primer sequence <400> 129 ggctcgagtt acaacagcag gcattttctc ttcc 34 <210> 130 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized PBD forward primer sequence <400> 130 ttggatccaa gaaagagaaa gagcggccag agatttctct ccc 43 <210> 131 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized PBD reverse primer sequence <400> 131 ccgaattctt acgctgactt atctgtaaag ctcatgtatt tctggc 46 <210> 132 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> base sequence of a monomeric version pf KO(Kusabira-Orange) <220> <221> CDS <222> (1)..(654) <223> <400> 132 atg gtg agc gtg atc aag ccc gag atg aag atg agg tac tac atg gac 48 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 ggc tcc gtc aat ggg cat gag ttc aca atc gag ggt gag ggc aca ggc 96 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly 20 25 30 aga cct tac gag gga cat cag gag atg aca ctg cgc gtc aca atg gcc 144 Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala 35 40 45 gag ggc ggg cca atg cct ttc gcc ttc gac ctg gtg tcc cac gtg ttc 192 Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe 50 55 60 tgt tac ggc cac aga gtt ttt acc aag tac cca gaa gag atc cca gac 240 Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp 65 70 75 80 tat ttc aag cag gcc ttt cct gag ggc ctg tcc tgg gag agg tcc ctg 288 Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu 85 90 95 gag 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Lys Leu Glu Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Met 165 170 175 Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Lys Glu Ile Leu Glu Met Pro Gly Asp 180 185 190 His Tyr Ile Gly His Arg Leu Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr 195 200 205 Glu Gln Val Glu Asp Ala Val Ala His Ser 210 215 <210> 134 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> humanized mAG1 <220> <221> CDS <222> (1)..(678) <223> <400> 134 atg gtg agc gtg atc aag ccc gag atg aag atc aag ctg tgc atg agg 48 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys Leu Cys Met Arg 1 5 10 15 ggc acc gtg aac ggc cac aac ttc gtg atc gag ggc gag ggc aag ggc 96 Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly Glu Gly Lys Gly 20 25 30 aac ccc tac gag ggc acc cag atc ctg gac ctg aac gtg acc gag ggc 144 Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn Val Thr Glu Gly 35 40 45 gcc ccc ctg ccc ttc gcc tac gac atc ctg acc acc gtg ttc cag tac 192 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Val Phe Gln Tyr 50 55 60 ggc aac agg gcc ttc acc aag tac ccc gcc gac atc cag gac tac ttc 240 Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile Gln Asp Tyr Phe 65 70 75 80 aag cag acc ttc ccc gag ggc tac cac tgg gag agg agc atg acc tac 288 Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr 85 90 95 gag gac cag ggc atc tgc acc gcc acc agc aac atc agc atg agg ggc 336 Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser Met Arg Gly 100 105 110 gac tgc ttc ttc tac gac atc agg ttc gac ggc acc aac ttc ccc ccc 384 Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Thr Asn Phe Pro Pro 115 120 125 aac ggc ccc gtg atg cag aag aag acc ctg aag tgg gag ccc agc acc 432 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 gag aag atg tac gtg gag gac ggc gtg ctg aag ggc gac gtg aac atg 480 Glu Lys Met Tyr Val Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val Asn Met 145 150 155 160 agg ctg ctg ctg gag ggc ggc ggc cac tac agg tgc gac ttc aag acc 528 Arg Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Thr 165 170 175 acc tac aag gcc aag aag gag gtg agg ctg ccc gac gcc cac aag atc 576 Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Glu Val Arg Leu Pro Asp Ala His Lys Ile 180 185 190 gac cac agg atc gag atc ctg aag cac gac aag gac tac aac aag gtg 624 Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val 195 200 205 aag ctg tac gag aac gcc gtg gcc agg tac tcc atg ctg ccc agc cag 672 Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met Leu Pro Ser Gln 210 215 220 gcc aag 678 Ala Lys 225 <210> 135 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized mAG1 <400> 135 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys Leu Cys Met Arg 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly Glu Gly Lys Gly 20 25 30 Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Val Phe Gln Tyr 50 55 60 Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile Gln Asp Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser Met Arg 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cag acc tcc gag ctg gtg 144 Val Gly Thr Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Lys Gln Thr Ser Glu Leu Val 35 40 45 atc atc aag ccc aag ggc aag ccc ctg ccc ttc tcc ttc gac atc ctg 192 Ile Ile Lys Pro Lys Gly Lys Pro Leu Pro Phe Ser Phe Asp Ile Leu 50 55 60 tcc acc gtg ttc cag tac ggc aac agg tgc ttc acc aag tac ccc gcc 240 Ser Thr Val Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Cys Phe Thr Lys Tyr Pro Ala 65 70 75 80 gac atg ccc gac tac ttc aag cag gcc ttc ccc gac ggc atg tcc tac 288 Asp Met Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly Met Ser Tyr 85 90 95 gag agg tcc ttc ctg ttc gag gac ggc ggc gtg gcc acc gcc agc tgg 336 Glu Arg Ser Phe Leu Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Ala Ser Trp 100 105 110 agc atc cgc ctg gag ggc aac tgc ttc atc cac aac tcc atc tac cac 384 Ser Ile Arg Leu Glu Gly Asn Cys Phe Ile His Asn Ser Ile Tyr His 115 120 125 ggc acc aac ttc ccc gcc gac ggc ccc gtg atg aag aag cag acc atc 432 Gly Thr Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Gln Thr Ile 130 135 140 ggc tgg gac aag tcc tcc gag aag atg agc gtg gcc aag gag gtg ctg 480 Gly Trp Asp Lys Ser Ser Glu Lys Met Ser Val Ala Lys Glu Val Leu 145 150 155 160 agg ggc gac gtg acc cag ttc ctg ctg ctg gag ggc ggc ggc tac cag 528 Arg Gly Asp Val Thr Gln Phe Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly Tyr Gln 165 170 175 agg tgc cag ctg cac tcc acc tac aag acc gag aag ccc gtg gcc atg 576 Arg Cys Gln Leu His Ser Thr Tyr Lys Thr Glu Lys Pro Val Ala Met 180 185 190 ccc ccc agc cac gtg gtg gag cac cag atc gtg agg acc gac ctg ggc 624 Pro Pro Ser His Val Val Glu His Gln Ile Val Arg Thr Asp Leu Gly 195 200 205 cag acc gcc aag ggc ttc aag gtg aag ctg gag gag cac gcc gag gcc 672 Gln Thr Ala Lys Gly Phe Lys Val Lys Leu Glu Glu His Ala Glu Ala 210 215 220 cac gtg aac ccc ctg aag gtg aag 696 His Val Asn Pro Leu Lys Val Lys 225 230 <210> 137 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mMiCy1 <400> 137 Met Val Ser Tyr Ser Lys Gln Gly Ile Ala Gln Glu Met Arg Thr Lys 1 5 10 15 Tyr Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly 20 25 30 Val Gly Thr Gly 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Asn Asn Ile Thr Met Lys Lys 100 105 110 gac ggc agc aac act ttt gtc aat gaa att cga ttt gat ggt aca aac 384 Asp Gly Ser Asn Thr Phe Val Asn Glu Ile Arg Phe Asp Gly Thr Asn 115 120 125 ttt cct gcc aat ggt cca gtt atg cag agg aag acc gtc aaa tgg gag 432 Phe Pro Ala Asn Gly Pro Val Met Gln Arg Lys Thr Val Lys Trp Glu 130 135 140 cca tcc act gag aaa atg tat gtg cgt gat gga gtg ctg aag ggt gat 480 Pro Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp 145 150 155 160 gtt gaa atg gct ctg ttg ctt gaa gga ggt ggc cat tac cga tgt gac 528 Val Glu Met Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp 165 170 175 ttc aga act act tac aaa gca aag aag gtt gtc cag ttg cca gac tat 576 Phe Arg Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Val Val Gln Leu Pro Asp Tyr 180 185 190 cac tac gtg gat cat caa atg gag ata aca agc cat gac aag gat tac 624 His Tyr Val Asp His Gln Met Glu Ile Thr Ser His Asp Lys Asp Tyr 195 200 205 aac aag gtt aag gcg tat gaa cat gct aag gct tat tcc ggg acc tac 672 Asn Lys Val Lys Ala Tyr 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aga gcc ctt act aaa tat cct gac gat atc ccc gac tat ttc 240 Gly Asn Arg Ala Leu Thr Lys Tyr Pro Asp Asp Ile Pro Asp Tyr Phe 65 70 75 80 aaa caa tgc ttt cct gga ggc tat tca tgg gaa aga aag ttt gag ttc 288 Lys Gln Cys Phe Pro Gly Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Lys Phe Glu Phe 85 90 95 gaa gat ggc ggg ttg gcg ata gcc aaa gcg gaa ata agc ctt aaa gga 336 Glu Asp Gly Gly Leu Ala Ile Ala Lys Ala Glu Ile Ser Leu Lys Gly 100 105 110 aac tgc ttc gaa cac aaa tcc acc att gaa ggc act ttt ccc gat agc 384 Asn Cys Phe Glu His Lys Ser Thr Ile Glu Gly Thr Phe Pro Asp Ser 115 120 125 agt cct att atg caa aac aag acg cta gga tgg gaa cca tcc acc gag 432 Ser Pro Ile Met Gln Asn Lys Thr Leu Gly Trp Glu Pro Ser Thr Glu 130 135 140 aag atg acc gtc cgc gac gga tca atg aag ggt gat gat gcg gcc tac 480 Lys Met Thr Val Arg Asp Gly Ser Met Lys Gly Asp Asp Ala Ala Tyr 145 150 155 160 ctc aaa ttg gtg gga ggc ggc aat cac aaa tgc tac ttt aca act acc 528 Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Tyr Phe Thr Thr Thr 165 170 175 tac aca gcg aag aaa aag att cct aac ctg cca gga agc cat ttc att 576 Tyr Thr Ala Lys Lys Lys Ile Pro Asn Leu Pro Gly Ser His Phe Ile 180 185 190 ggc cat cgc atc tcc agt gtc gtc gag ggc act aaa att aaa gtg atg 624 Gly His Arg Ile Ser Ser Val Val Glu Gly Thr Lys Ile Lys Val Met 195 200 205 gaa gat gca att gct cat ctt tac cct ttt aat ggc agc 663 Glu Asp Ala Ile Ala His Leu Tyr Pro Phe Asn Gly Ser 210 215 220 <210> 141 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> KCy1 <400> 141 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Val Glu Gly Glu Gly Thr Gly 20 25 30 Arg Pro Tyr Glu Gly Lys His Lys Ile Thr Leu Asp Val Thr Lys Gly 35 40 45 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser Tyr 50 55 60 Gly Asn Arg Ala Leu Thr Lys Tyr Pro Asp Asp Ile Pro Asp Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Gln Cys Phe Pro Gly Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Lys Phe Glu Phe 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Leu Ala Ile Ala Lys Ala Glu Ile Ser Leu Lys Gly 100 105 110 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Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Thr Asn Phe Pro Pro 115 120 125 aat ggt ccg gtt atg cag aag aag act ctt aaa tgg gag cca tcc act 432 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 gag aaa atg tac gta cgt gat gga gtg ctg aag ggt gat gtt aac atg 480 Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val Asn Met 145 150 155 160 gct ctg ttg ctt gaa gga ggt ggc cat tat cga tgt gat ttc aaa act 528 Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Thr 165 170 175 act tac aaa gca aag aag gat gtc cgt ttg cca gac tat cac ttt gtg 576 Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Val Arg Leu Pro Asp Tyr His Phe Val 180 185 190 gac cac cgc att gag att ttg aag cat gac aaa gat tac aac aag gtc 624 Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val 195 200 205 aag ctc tat gag aat gcc gtt gct cgc tat tct atg ctg ccg agt cag 672 Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met Leu Pro Ser Gln 210 215 220 gcc aag 678 Ala Lys 225 <210> 145 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> dAG(AC) <400> 145 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys Leu Cys Met Arg 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly Glu Gly Lys Gly 20 25 30 Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn Val Thr Glu Gly 35 40 45 Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Val Phe Gln Tyr 50 55 60 Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile Gln Asp Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser Met Arg Gly 100 105 110 Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Thr Asn Phe Pro Pro 115 120 125 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val Asn Met 145 150 155 160 Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Thr 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Val Arg Leu Pro Asp Tyr His Phe Val 180 185 190 Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val 195 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Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ala Leu Thr Phe 85 90 95 gaa gat gga ggg ttt gct tca tca agc tcg cac atc agt gtc cgt ggc 336 Glu Asp Gly Gly Phe Ala Ser Ser Ser Ser His Ile Ser Val Arg Gly 100 105 110 aac tgc ttc ttc tac gac gtc aaa tat cat ggc gta aac ttc cct tcc 384 Asn Cys Phe Phe Tyr Asp Val Lys Tyr His Gly Val Asn Phe Pro Ser 115 120 125 aat gga cca att atg caa aga aag aca atc ggc tgg caa cca tcc aca 432 Asn Gly Pro Ile Met Gln Arg Lys Thr Ile Gly Trp Gln Pro Ser Thr 130 135 140 gag aaa ttg tac atc gga gag gga acg ctg aag ggt gat gat acg atg 480 Glu Lys Leu Tyr Ile Gly Glu Gly Thr Leu Lys Gly Asp Asp Thr Met 145 150 155 160 ttc ctc aag ctc gaa gga ggg gga act cat aaa tgc cac gtc cta acc 528 Phe Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Thr His Lys Cys His Val Leu Thr 165 170 175 act tac aaa acg aag aaa gat gtc cag atg cca gac agc cac ttc att 576 Thr Tyr Lys Thr Lys Lys Asp Val Gln Met Pro Asp Ser His Phe Ile 180 185 190 gac cat cgt ctc ctg acc agc cac ctt gat aag gaa tgc aac aac gtg 624 Asp His 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Gly Asp Asp Thr Met 145 150 155 160 Phe Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Thr His Lys Cys His Val Leu Thr 165 170 175 Thr Tyr Lys Thr Lys Lys Asp Val Gln Met Pro Asp Ser His Phe Ile 180 185 190 Asp His Arg Leu Leu Thr Ser His Leu Asp Lys Glu Cys Asn Asn Val 195 200 205 Glu Leu Arg Glu His Ala Val Ala Arg Asn Ser Ser Leu Pro Ser Arg 210 215 220 <210> 148 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Momiji <220> <221> CDS <222> (1)..(687) <223> <400> 148 atg gtg agc gtg atc aag gac gag atg aag gtg aac ctg cgc atg gag 48 Met Val Ser Val Ile Lys Asp Glu Met Lys Val Asn Leu Arg Met Glu 1 5 10 15 ggc agc gtg aac ggc cac gac ttc gtg atc gac ggc ctg ggc tcc ggc 96 Gly Ser Val Asn Gly His Asp Phe Val Ile Asp Gly Leu Gly Ser Gly 20 25 30 aag ccc aag gag ggc acc cag acc atc gag ctg aag gtg gtg aag ggc 144 Lys Pro Lys Glu Gly Thr Gln Thr Ile Glu Leu Lys Val Val Lys Gly 35 40 45 ggc ccc ctg ccc ttc gcc tac gac atc ctg acc acc gcc ttc cac tac 192 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr 50 55 60 ggc aac agg gtg ttc gcc aag tac ccc aag gac atc ccc aac tac ttc 240 Gly Asn Arg Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Asp Ile Pro Asn Tyr Phe 65 70 75 80 gag cag tcc ttc ccc gag ggc tac tcc tgg gag agg agc atg atc ttc 288 Glu Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met Ile Phe 85 90 95 gag gac ggc ggc atc tgc atc gcc agg aac gac atc act atg gac ggc 336 Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Arg Asn Asp Ile Thr Met Asp Gly 100 105 110 ggc acc ttc tac aac aag gtg agg ttc tac ggc gtg aac ttc ccc ccc 384 Gly Thr Phe Tyr Asn Lys Val Arg Phe Tyr Gly Val Asn Phe Pro Pro 115 120 125 aac ggc ccc gtg atg cag aag aag acc cag aag tgg gag cag tcc acc 432 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Gln Lys Trp Glu Gln Ser Thr 130 135 140 gag aag atg tac gcc agg gac ggc gtg ctg acc ggc gac atc aac atg 480 Glu Lys Met Tyr Ala Arg Asp Gly Val Leu Thr Gly Asp Ile Asn Met 145 150 155 160 gcc ctg ctg ctg aag ggc ggc ggc cac tac agg tgc gac ttc agg acc 528 Ala Leu Leu Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr 165 170 175 acc tac aag gcc aag gag aag ggc gtc aag ctg ccc ggc tac cac ttc 576 Thr Tyr Lys Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Leu Pro Gly Tyr His Phe 180 185 190 atc gac cac tgc atc gag atc ctg agc cac agg aac gac tac aac aac 624 Ile Asp His Cys Ile Glu Ile Leu Ser His Arg Asn Asp Tyr Asn Asn 195 200 205 gtg acc ctg ttc gag cac gcc gtg gcc agg tcc ggc ctg caa gac aag 672 Val Thr Leu Phe Glu His Ala Val Ala Arg Ser Gly Leu Gln Asp Lys 210 215 220 gag aag cag cag cag 687 Glu Lys Gln Gln Gln 225 <210> 149 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Momiji <400> 149 Met Val Ser Val Ile Lys Asp Glu Met Lys Val Asn Leu Arg Met Glu 1 5 10 15 Gly Ser Val Asn Gly His Asp Phe Val Ile Asp Gly Leu Gly Ser Gly 20 25 30 Lys Pro Lys Glu Gly Thr Gln Thr Ile Glu Leu Lys Val Val Lys Gly 35 40 45 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr 50 55 60 Gly Asn Arg Val Phe Ala Lys Tyr Pro Lys Asp Ile Pro Asn Tyr Phe 65 70 75 80 Glu Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser Trp Glu Arg Ser Met Ile Phe 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Ile Cys Ile Ala Arg Asn Asp Ile Thr Met Asp Gly 100 105 110 Gly Thr Phe Tyr Asn Lys Val Arg Phe Tyr Gly Val Asn Phe Pro Pro 115 120 125 Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Gln Lys Trp Glu Gln Ser Thr 130 135 140 Glu Lys Met Tyr Ala Arg Asp Gly Val Leu Thr Gly Asp Ile Asn Met 145 150 155 160 Ala Leu Leu Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Leu Pro Gly Tyr His Phe 180 185 190 Ile Asp His Cys Ile Glu Ile Leu Ser His Arg Asn Asp Tyr Asn Asn 195 200 205 Val Thr Leu Phe Glu His Ala Val Ala Arg Ser Gly Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Glu Lys Gln Gln Gln 225 <210> 150 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COR3.01 <220> <221> CDS <222> (1)..(696) <223> <400> 150 atg gcc ctg agc aag cac ggc ctg acc aag aac atg acc acc aag tac 48 Met Ala Leu Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Asn Met Thr Thr Lys Tyr 1 5 10 15 agg atg gag ggc tgc gtg gac ggc cac aag ttc gtg atc acc ggc gac 96 Arg Met Glu Gly 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Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Thr 130 135 140 aac tgg gag ccc agc tgc gag aag atc acc ccc atc ctg aac gag ggc 480 Asn Trp Glu Pro Ser Cys Glu Lys Ile Thr Pro Ile Leu Asn Glu Gly 145 150 155 160 atc ctg aag ggc gac gtg acc atg ttc ctg ctg ctg aag gac ggc ggc 528 Ile Leu Lys Gly Asp Val Thr Met Phe Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 agg tac agg tgc cag ttc gac acc gtg tac aag gcc aag gcc gac gcc 576 Arg Tyr Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ala Asp Ala 180 185 190 aag aag atg ccc gag tgg cac ttc atc cag cac gag ctg acc agg gag 624 Lys Lys Met Pro Glu Trp His Phe Ile Gln His Glu Leu Thr Arg Glu 195 200 205 gac agg agc gac gcc aag cac cag aag tgg agg ctg gtg gag aac gcc 672 Asp Arg Ser Asp Ala Lys His Gln Lys Trp Arg Leu Val Glu Asn Ala 210 215 220 atc gcc tac agg agc acc ctg ccc 696 Ile Ala Tyr Arg Ser Thr Leu Pro 225 230 <210> 151 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> COR3.01 <400> 151 Met Ala Leu Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Asn Met Thr Thr Lys Tyr 1 5 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caa gct gat gtg cac cga caa gtg gcc att gtg ttc cgg acc 192 Phe Ser Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr 50 55 60 cct ccc tac gca gac ccc agc ctg cag gct cct gtg cgt gtc tcc atg 240 Pro Pro Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln Ala Pro Val Arg Val Ser Met 65 70 75 80 cag ctg cgg cgg cct tcc gac cgg gag ctc agt gag ccc atg gaa ttc 288 Gln Leu Arg Arg Pro Ser Asp Arg Glu Leu Ser Glu Pro Met Glu Phe 85 90 95 cag tac ctg cca gat aca gac gat cgt cac cgg att gag gag aaa cgt 336 Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg 100 105 110 aaa agg aca tat gag acc ttc aag agc atc atg aag aag agt cct ttc 384 Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe 115 120 125 agc gga taa 393 Ser Gly 130 <210> 158 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polypeptide sequence <400> 158 Thr Ala Glu Leu Lys Ile Cys Arg Val Asn Arg Asn Ser Gly Ser Cys 1 5 10 15 Leu Gly Gly Asp Glu Ile Phe Leu Leu Cys Asp Lys Val Gln Lys Glu 20 25 30 Asp Ile Glu Val Tyr Phe Thr Gly Pro Gly Trp Glu Ala Arg Gly Ser 35 40 45 Phe Ser Gln Ala Asp Val His Arg Gln Val Ala Ile Val Phe Arg Thr 50 55 60 Pro Pro Tyr Ala Asp Pro Ser Leu Gln Ala Pro Val Arg Val Ser Met 65 70 75 80 Gln Leu Arg Arg Pro Ser Asp Arg Glu Leu Ser Glu Pro Met Glu Phe 85 90 95 Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg 100 105 110 Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe 115 120 125 Ser Gly 130 <210> 159 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 159 acattttcag acctattgaa actacttcct gaaaacaacg t 41 <210> 160 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 160 cttgtggtag ttggagctga cggcgtaggc aagagtgcct tg 42 <210> 161 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polynucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(243) <223> <400> 161 cct tct aag aca agc aac act atc gct gtt ttc ttg ccg aac aag caa 48 Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Ala Val Phe Leu Pro Asn Lys Gln 1 5 10 15 aga aca gtg gtc aat gtg cga aat gga atg agc ttg cat gac tgc ctt 96 Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu His Asp Cys Leu 20 25 30 atg aaa gca ctc aag gtg agg ggc ctg caa cca gag tgc tgt gca gtg 144 Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys Ala Val 35 40 45 ttc aga ctt ctc cac gaa cac aaa ggt aaa aaa gca cgc tta gat tgg 192 Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu Asp Trp 50 55 60 aat act gat gct gcg tct ttg att gga gaa gaa ctt caa gta gat ttc 240 Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu Gln Val Asp Phe 65 70 75 80 ctg 243 Leu <210> 162 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polypeptide sequence <400> 162 Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Ala Val Phe Leu Pro Asn Lys Gln 1 5 10 15 Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu His Asp Cys Leu 20 25 30 Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys Ala Val 35 40 45 Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu Asp Trp 50 55 60 Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu Gln Val Asp Phe 65 70 75 80 Leu <210> 163 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polynucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <223> <400> 163 ggg cag gtg gga cgg cag ctc gcc atc atc ggg gac gac atc aac cga 48 Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg 1 5 10 15 <210> 164 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polypeptide sequence <400> 164 Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg 1 5 10 15 <210> 165 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polynucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(63) <223> <400> 165 cag gat gcg tcc acc aag aag ctg agc gag tgt ctc aag cgc atc ggg 48 Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly 1 5 10 15 gac gaa ctg gac agt 63 Asp Glu Leu Asp Ser 20 <210> 166 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polypeptide sequence <400> 166 Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly 1 5 10 15 Asp Glu Leu Asp Ser 20 <210> 167 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polynucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1449) <223> <400> 167 atg gcg tcg ctc acc gtg aag gcc tac ctt ctg ggc aag gag gac gcg 48 Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala 1 5 10 15 gcg cgc gag att cgc cgc ttc agc ttc tgc tgc agc ccc gag cct gag 96 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 gcg gaa gcc gag gct gcg gcg ggt ccg gga ccc tgc gag cgg ctg ctg 144 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu 35 40 45 agc cgg gtg gcc gcc ctg ttc ccc gcg ctg cgg cct ggc ggc ttc cag 192 Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln 50 55 60 gcg cac tac cgc gat gag gac ggg gac ttg gtt gcc ttt tcc agt gac 240 Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp 65 70 75 80 gag gaa ttg aca atg gcc atg tcc tac gtg aag gat gac atc ttc cga 288 Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg 85 90 95 atc tac att aaa gag aaa acc ggt aat tcc gct gac ggc ggc gga gga 336 Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Thr Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly 100 105 110 tcg ggt ggt agt ggt ggt tca gga gga gga tcg acc caa gga gga tcc 384 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Gln Gly Gly Ser 115 120 125 cca gat gtc cct aga act cca gtg ggc aaa ttc cag ttc cca gga agc 432 Pro Asp Val Pro Arg Thr Pro Val Gly Lys Phe Gln Phe Pro Gly Ser 130 135 140 gga gct act aac ttc agc ctg ctg aag cag gct gga gac gtg gag gag 480 Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu 145 150 155 160 aac cct gga cct atg gtg agc gtg atc aag ccc gag atg aag atc aag 528 Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys 165 170 175 ctg tgc atg agg ggc acc gtg aac ggc cac aac ttc gtg atc gag ggc 576 Leu Cys Met Arg Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly 180 185 190 gag ggc aag ggc aac ccc tac gag ggc acc cag atc ctg gac ctg aac 624 Glu Gly Lys Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn 195 200 205 gtg acc gag ggc gcc ccc ctg ccc ttc gcc tac gac atc ctg acc acc 672 Val Thr Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr 210 215 220 gtg ttc cag tac ggc aac agg gcc ttc acc aag tac ccc gcc gac atc 720 Val Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile 225 230 235 240 cag gac tac ttc aag cag acc ttc ccc gag ggc tac cac tgg gag agg 768 Gln Asp Tyr Phe Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg 245 250 255 agc atg acc tac gag gac cag ggc atc tgc acc gcc acc agc aac atc 816 Ser Met Thr Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile 260 265 270 agc atg agg ggc gac tgc ttc ttc tac gac atc agg ttc gac ggc gtg 864 Ser Met Arg Gly Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Val 275 280 285 aac ttc ccc ccc aac ggc ccc gtg atg cag aag aag acc ctg aag tgg 912 Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp 290 295 300 gag ccc agc acc gag aag atg tac gtg agg gac ggc gtg ctg aag ggc 960 Glu Pro Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly 305 310 315 320 gac gtg aac atg gcc ctg ctg ctg gag ggc ggc ggc cac tac agg tgc 1008 Asp Val Asn Met Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys 325 330 335 gac ttc aag acc acc tac aag gcc aag aag gac gtg agg ctg ccc gac 1056 Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Val Arg Leu Pro Asp 340 345 350 tac cac ttc gtg gac cac agg atc gag atc ctg aag cac gac aag gac 1104 Tyr His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp 355 360 365 tac aac aag gtg aag ctg tac gag aac gcc gtg gcc agg tac agc atg 1152 Tyr Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met 370 375 380 ctg ccc agc cag gcc aag acc ggt aat tcc gct gac ggc ggc gga gga 1200 Leu Pro Ser Gln Ala Lys Thr Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly 385 390 395 400 tcg ggt ggt agt ggt ggt tca gga gga gga tcg acc caa gga gga tcc 1248 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Gln Gly Gly Ser 405 410 415 atg gcg gac gag gag aag ctg ccg ccc ggc tgg gag aag cgc atg agc 1296 Met Ala Asp Glu Glu Lys Leu Pro Pro Gly Trp Glu Lys Arg Met Ser 420 425 430 cgc agc tca ggc cga gtg tac tac ttc aac cac atc act aac gcc agc 1344 Arg Ser Ser Gly Arg Val Tyr Tyr Phe Asn His Ile Thr Asn Ala Ser 435 440 445 cag tgg gag cgg ccc agc ggc aac agc agc agt ggt ggc aaa aac ggg 1392 Gln Trp Glu Arg Pro Ser Gly Asn Ser Ser Ser Gly Gly Lys Asn Gly 450 455 460 cag ggg gag cct gcc agg ctt cag aag aaa ctc gag gaa ctt gag ctt 1440 Gln Gly Glu Pro Ala Arg Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu 465 470 475 480 gat gag taa 1449 Asp Glu <210> 168 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polypeptide sequence <400> 168 Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln 50 55 60 Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp 65 70 75 80 Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg 85 90 95 Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Thr Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Gln Gly Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Val Pro Arg Thr Pro Val Gly Lys Phe Gln Phe Pro Gly Ser 130 135 140 Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu 145 150 155 160 Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys 165 170 175 Leu Cys Met Arg Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly 180 185 190 Glu Gly Lys Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn 195 200 205 Val Thr Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr 210 215 220 Val Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile 225 230 235 240 Gln Asp Tyr Phe Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg 245 250 255 Ser Met Thr Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile 260 265 270 Ser Met Arg Gly Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Val 275 280 285 Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp 290 295 300 Glu Pro Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly 305 310 315 320 Asp Val Asn Met Ala Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys 325 330 335 Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Val Arg Leu Pro Asp 340 345 350 Tyr His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp 355 360 365 Tyr Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met 370 375 380 Leu Pro Ser Gln Ala Lys Thr Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Gln Gly Gly Ser 405 410 415 Met Ala Asp Glu Glu Lys Leu Pro Pro Gly Trp Glu Lys Arg Met Ser 420 425 430 Arg Ser Ser Gly Arg Val Tyr Tyr Phe Asn His Ile Thr Asn Ala Ser 435 440 445 Gln Trp Glu Arg Pro Ser Gly Asn Ser Ser Ser Gly Gly Lys Asn Gly 450 455 460 Gln Gly Glu Pro Ala Arg Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu 465 470 475 480 Asp Glu <210> 169 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polynucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <223> <400> 169 atg ctc gaa cca tac tgg ctt cca aat ttc atg gat gtt ttt act tgg 48 Met Leu Glu Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp 1 5 10 15 tcc ctt cca ttt gtt ggg gaa aaa gtg act gag atg ctg gta aat gtc 96 Ser Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val 20 25 30 ctc aac atc tgc tca gat gat gaa cta ggg tca gaa gaa gat gga ttt 144 Leu Asn Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Gly Ser Glu Glu Asp Gly Phe 35 40 45 gat ggt gca aca gct gca gcc cgg aaa gag gtc gag gag gca agt tat 192 Asp Gly Ala Thr Ala Ala Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Ala Ser Tyr 50 55 60 cct ttg gaa atg tgc tca cac ttt gat gcg gat gaa att aaa agg cta 240 Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu 65 70 75 80 gga aag aga ttt aag aag ctt gat ttg gac aat tct ggt tct ttg agt 288 Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser 85 90 95 gtg gaa gag ttc atg tct ctg cct gag tta caa cag aat cct tta gta 336 Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val 100 105 110 cag cga gta ata gat ata ttc gac aca gat ggg aat gga gaa gta gac 384 Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp 115 120 125 ttt aaa gaa ttc att gag ggc gtc tct cag ttc agt gtc aaa gga gat 432 Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp 130 135 140 aag gag cag aaa ttg agg ttt gct ttc cgt atc tat gac atg gat aaa 480 Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys 145 150 155 160 gat ggc tat att tcc aat ggg gaa ctc ttc cag gta ttg aag atg atg 528 Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe Gln Val Leu Lys Met Met 165 170 175 gtg ggg aac aat ctg aaa gat aca cag tta cag caa att gta gac aaa 576 Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys 180 185 190 acc ata ata aat gca gat aag gat gga gat gga aga ata tcc ttt gaa 624 Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu 195 200 205 gaa ttc tgt gct gtt gta ggt ggc cta gat atc cac aaa aag atg gtg 672 Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu Asp Ile His Lys Lys Met Val 210 215 220 gta gat gtg tga 684 Val Asp Val 225 <210> 170 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized polypeptide sequence <400> 170 Met Leu Glu Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp 1 5 10 15 Ser Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val 20 25 30 Leu Asn Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Gly Ser Glu Glu Asp Gly Phe 35 40 45 Asp Gly Ala Thr Ala Ala Ala Arg Lys Glu Val Glu Glu Ala Ser Tyr 50 55 60 Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu 65 70 75 80 Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser 85 90 95 Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val 100 105 110 Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp 115 120 125 Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys 145 150 155 160 Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe Gln Val Leu Lys Met Met 165 170 175 Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys 180 185 190 Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu 195 200 205 Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu Asp Ile His Lys Lys Met Val 210 215 220 Val Asp Val 225 <210> 171 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COR5 <220> <221> CDS <222> (1)..(696) <223> <400> 171 atg gcc ctg agc aag cac ggc ctg acc aag aac atg acc acc aag tac 48 Met Ala Leu Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Asn Met Thr Thr Lys Tyr 1 5 10 15 agg atg gag ggc tgc gtg gac ggc cac aag ttc gtg atc acc ggc gac 96 Arg Met Glu Gly Cys Val Asp Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly Asp 20 25 30 ggc atc ggc gac ccc ttc gag ggc aag cag acc agc atc gac ctg tgc 144 Gly Ile Gly Asp Pro Phe Glu Gly Lys Gln Thr Ser Ile Asp Leu Cys 35 40 45 gtg gtg gag ggc ggc ccc ctg ccc ttc agc gag gac atc ctg agc acc 192 Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Glu Asp Ile Leu Ser Thr 50 55 60 gtg ttc gac tac ggc aac agg gtg ttc acc aag tac ccc cag gac ctg 240 Val Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Gln Asp Leu 65 70 75 80 gtg gac tac ttc aag aac agc tgc ccc gcc ggc tac acc tgg cag agg 288 Val Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Gln Arg 85 90 95 agc ttc ctg ttc gag gac ggc gcc gtg tgc acc gcc agc gcc gac atc 336 Ser Phe Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Thr Ala Ser Ala Asp Ile 100 105 110 agg gtg agc gtg gag gag aac tgc ttc tac cac gag agc aag ttc cac 384 Arg Val Ser Val Glu Glu Asn Cys Phe Tyr His Glu Ser Lys Phe His 115 120 125 ggc gtg aac ttc ccc gcc gac ggc cca gtg atg aag aag atg acc acc 432 Gly Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Thr 130 135 140 aac tgg gag ccc agc tgc gag aag atc acc ccc atc ctg aac gag ggc 480 Asn Trp Glu Pro Ser Cys Glu Lys Ile Thr Pro Ile Leu Asn Glu Gly 145 150 155 160 atc ctg aag ggc gac gtg acc atg ttc ctg ctg ctg aag gac ggc ggc 528 Ile Leu Lys Gly Asp Val Thr Met Phe Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 agg tac agg tgc cag ttc gac acc gtg tac aag gcc aag gcc gac gcc 576 Arg Tyr Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ala Asp Ala 180 185 190 aag gat atg ccc gag atg cac ttc atc cag cac gag ctg acc agg gag 624 Lys Asp Met Pro Glu Met His Phe Ile Gln His Glu Leu Thr Arg Glu 195 200 205 gac agg agc gac gcc aag cac cag aag tgg agg ctg gtg gag agc gcc 672 Asp Arg Ser Asp Ala Lys His Gln Lys Trp Arg Leu Val Glu Ser Ala 210 215 220 atc gcc tac agg agc acc ccg ccc 696 Ile Ala Tyr Arg Ser Thr Pro Pro 225 230 <210> 172 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> COR5 <400> 172 Met Ala Leu Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Asn Met Thr Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Cys Val Asp Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly Asp 20 25 30 Gly Ile Gly Asp Pro Phe Glu Gly Lys Gln Thr Ser Ile Asp Leu Cys 35 40 45 Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Glu Asp Ile Leu Ser Thr 50 55 60 Val Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Gln Asp Leu 65 70 75 80 Val Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Gln Arg 85 90 95 Ser Phe Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Thr Ala Ser Ala Asp Ile 100 105 110 Arg Val Ser Val Glu Glu Asn Cys Phe Tyr His Glu Ser Lys Phe His 115 120 125 Gly Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Thr 130 135 140 Asn Trp Glu Pro Ser Cys Glu Lys Ile Thr Pro Ile Leu Asn Glu Gly 145 150 155 160 Ile Leu Lys Gly Asp Val Thr Met Phe Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 Arg Tyr Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ala Asp Ala 180 185 190 Lys Asp Met Pro Glu Met His Phe Ile Gln His Glu Leu Thr Arg Glu 195 200 205 Asp Arg Ser Asp Ala Lys His Gln Lys Trp Arg Leu Val Glu Ser Ala 210 215 220 Ile Ala Tyr Arg Ser Thr Pro Pro 225 230

Claims (10)

  1. 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 판정하는 방법으로서,
    제1 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질과, 제2 단백질과 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
    상기 세포 내의 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 결합에 의해서 형성되는 형광 휘점을 검출하는 단계; 그리고
    상기 형광 휘점의 검출에 의해 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 판정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 결합 유도 단백질은 p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, PKCiota의 PB1 도메인, TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1의 SAM 도메인로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 상호작용의 발생 또는 소실, 상기 상호작용이 발생 또는 소실할 때까지의 시간 또는 상호작용의 지속시간을 검출하기 위해서 상기 형광 휘점을 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    특정 자극에 응답하는 상호작용의 발생 또는 소실, 해당 상호작용의 발생 또는 소실할 때까지의 시간, 또는 해당 상호 작용의 지속시간을 검출하기 위해서 상기 형광 휘점을 검출하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 방법에 있어서,
    특정한 단백질과 상호작용하는 단백질을 스크리닝하기 위한 방법으로서,
    제1 단백질과 제2 단백질 중 어느 하나가 해당 특정한 단백질이며, 다른 하나는 시험 단백질이고, 그리고
    상기 형광 휘점을 검출하는 것에 의해 해당 특정한 단백질과 상호작용하는 단백질을 선택하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 상호작용에 관여하는 제1 단백질 중 어느 하나의 아미노산 잔기 및 제2 단백질 중 아미노산 잔기를 동정하기 위한 방법으로서,
    해당 제1의 단백질과 해당 제2 단백질 중 어느 하나에 변이가 도입된 단백질을 이용하여 상기 형광 휘점의 강도가 변이가 도입되어 있지 않은 단백질을 이용한 경우와 비교해서 감쇠한 경우는, 변이가 도입된 아미노산 잔기가 상기 상호작용에 관여한다고 판정하는 방법.
  6. 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 조절하는 물질을 스크리닝하기 위한 방법으로서,
    시험 화합물의 존재하에서 제1 단백질과 결합 유도 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질, 및 제2 단백질과 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계;
    상기 세포 내에서 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질과의 결합에 의해서 형성되는 형광 휘점을 검출하는 단계; 그리고
    상기 형광 휘점의 형광 강도가 상기 시험 화합물의 비존재하에서 발생하는 형성되는 형광 휘점의 형광 강도보다 증대하는 경우, 상기 시험 화합물을 상기 상호작용의 유도물질로서 선택하거나, 또는 상기 형광 휘점의 형광 강도가 상기 시험 화합물의 비존재하에서 발생하는 형광 휘점의 형광 강도보다 감쇠하는 경우는 상기 시험 화합물을 상기 상호작용의 억제물질로서 선택하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 결합 유도 단백질은 p62의 PB1 도메인, TFG의 PB1 도메인, PKCiota의 PB1 도메인, TEL의 SAM 도메인, DGK delta의 SAM 도메인 및 Tankyrase-1의 SAM 도메인로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질은 단량체 Kusabira-Orange 2, Azami-Green, Kusabira-Orange 1, 이량체 Keima-Red, Kikume Green-Red, 단량체 Keima-Red, 단량체 Midoriishi-Cyan1, 단량체 Kusabira-Orange 1, 단량체 Kikume Green-Red1, Midoriishi－Cyan1, Kusabira－Cyan1,이량체 Azami－Green（AB), 이량체 Azami－Green（AC, TGuv, Momiji, COR3.01, COR5 및 DsRed2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형광 단백질인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 키트로서, 하기의 (a) 내지 (j)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질 및 사용 설명서를 포함하는 키트:
    (a) 결합 유도 단백질을 인코딩하는 DNA와, 발현되면 결합 유도 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
    (b) 다량체화 능력을 가지는 형광 단백질을 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 형광 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
    (c) mAG1을 인코딩하는 DNA와, 발현되면 해당 형광 단백질과 융합하도록 임의의 단백질을 인코딩하는 DNA의 삽입을 가능하게 하는 클로닝 부위를 포함하는 벡터;
    (d) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터;
    (e) 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터;
    (f) (a)와 (d) 중 어느 하나에 따른 벡터와 (b)와 (e) 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 벡터 세트;
    (g) (b)에 따른 벡터와 (c)에 따른 벡터를 포함하는 벡터 세트;
    (h) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포;
    (i) 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포;
    (j) 제1 융합 단백질을 인코딩하는 벡터와 제2 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하는 형질 전환 세포.






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