CN104105964A

CN104105964A - 蛋白质间相互作用的检测方法

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Publication number: CN104105964A
Application number: CN201280068960.0A
Authority: CN
Inventors: 渡部拓; 关达也; 藤冈亚纪
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2032-12-05
Also published as: EP2790018A4; KR102051159B1; WO2013084950A1; US9494595B2; KR20140099322A; US20140335539A1; CA2857625A1; JPWO2013084950A1; EP2790018A1; DK2790018T3; US9766250B2; SG10201600144YA; JP6163700B2; EP2790018B1; US20170010277A1; SG11201402865XA; CN104105964B

Abstract

用于检测第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的方法，该方法包括：使包含第1蛋白质和装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质、与包含第2蛋白质和有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质在细胞内表达的工序；检测在所述细胞内由第1融合蛋白质与第2融合蛋白质的装配而产生的荧光亮点的工序；以及通过所述荧光亮点的检测来判定第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的工序。

Description

蛋白质间相互作用的检测方法

技术领域

本发明涉及蛋白质间相互作用的检测方法及其应用、以及用于该方法的试剂盒。

背景技术

蛋白质间相互作用的检测方法主要可以分为2组。第一组是以使用被从活细胞分离的状态的蛋白质为特征的方法。例如，表面等离子体共振法(surface plasmon resonance)、蛋白质质谱法(protein mass spectroscopy)、各向异性测定法(anisotropy measurements)。然而，这些方法难以在与实际的细胞内环境同样的环境中检测相互作用。

因此，作为第二组方法，还开发了使用活细胞进行蛋白质间相互作用的检测的方法。作为代表方法，可列举检测报告物的转录活性的酵母双杂交系统(yeast two hybrid)和/或其改变方法。此外，还开发了利用β半乳糖苷酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)等酶的再构成的方法。

然而，这些方法存在不能检测蛋白质间相互作用发生的位置(蛋白质间相互作用的位置信息)、和/或至蛋白质间相互作用发生所需的时间、至该相互作用消失所需的时间和该相互作用的持续时间等(蛋白质间相互作用的时间信息)这样的问题。

另外，作为使用活细胞进行蛋白质间相互作用的检测的方法，还有利用荧光蛋白质的再构成的方法，但由于一次再构成后的荧光蛋白质不解离，因而存在不能检测至蛋白质间相互作用消失所需的时间和该相互作用的持续时间等这样的问题。进而，由于从蛋白质间相互作用发生到发出荧光需要时间，因而还存在不能检测至蛋白质间相互作用发生所需的时间等这样的问题。

进而，还有利用萤光素酶的再构成法的方法。该方法中，萤光素酶的再构成和解离可逆地发生，但由于由再构成后的萤光素酶所产生的发光信号弱，因而为了获得细胞内的位置信息需要延长曝光时间，不能获得周转快的蛋白质间相互作用的位置信息和/或时间信息。

另外，在这些利用荧光蛋白质、萤光素酶等的再构成的方法中，该再构成发生之后才能检测信号，因而还存在例如难以对通过蛋白质间相互作用而定位变化的蛋白质在该相互作用的发生的前后进行追踪这样的问题。

另一方面，作为在活细胞内进行蛋白质间相互作用的检测的方法，开发了检测依赖于分子间的距离的能量转移的荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。该方法虽然具有可获得蛋白质间相互作用发生的位置信息和时间信息这样的优点，但由于该方法中使用的供体荧光蛋白质与接纳体荧光蛋白质的相互位置关系在蛋白质间相互作用的检测中是重要的，因而研究连接这些荧光蛋白质与成为检测对象的蛋白质的连接物(间隔物)的最适化的工序繁杂，系统的构建困难。进而，由于发生激发接纳体荧光蛋白质的交叉激发(cross excitation)、和/或供体荧光蛋白质的荧光泄漏到检测接纳体荧光蛋白质的荧光的滤光器(吸收滤光器)组件中的渗透(bleed through)，因而结果的分析困难。另外，由于使用2色的荧光蛋白质(供体荧光蛋白质和接纳体荧光蛋白质)，因而还存在为了对除了成为检测对象的蛋白质以外的信息进行检测而能够使用的荧光蛋白质有限这样的问题。

近年来，Tobias Meyer等报告了利用细胞内定位(易位，translocation)的蛋白质间相互作用的检测方法(专利文献1)。该方法是使检测相互作用的蛋白质的一方与特异性地结合于细胞内的特定部位的蛋白质融合，使检测相互作用的蛋白质的另一方与荧光蛋白质等融合。然后，使这些融合蛋白质在细胞内表达，以细胞内的特定部位的荧光蛋白质等的信号作为指标检测蛋白质间相互作用。

另外，Nibert等报告了使用使检测相互作用的蛋白质的一方与形成病毒包涵体(viral inclusion body)的蛋白质融合而成的融合蛋白质，以检测相互作用的蛋白质的另一方聚集于病毒包涵体作为指标来检测蛋白质间相互作用的方法(专利文献2)。

然而，这些利用了细胞内定位的蛋白质间相互作用的检测方法由于使检测相互作用的蛋白质的一方强制地(人工地)移动到细胞内的特定部位而将其约束，因而不能在本来蛋白质间相互作用发生的部位、即蛋白质间相互作用所固有的细胞内环境下进行检测，有不能得到蛋白质间相互作用的位置信息等问题。另外，也不能检测定位于与在天然的状态下进行细胞内定位的部位相同的部位的蛋白质彼此的相互作用。

针对该问题，Sara Peterson Bjorn等报告了，在蛋白质本来发挥功能的细胞内环境下使其相互作用之后，对该细胞施加药剂等的刺激，从而诱导包含相互作用的蛋白质的凝集体的形成，以该凝集体的形成来检测蛋白质间相互作用的方法(redistribution-trap method(再分配捕捉法)(专利文献3)。

然而，该方法需要在任意时刻对细胞施加用于诱导凝集体的形成的刺激，为了检测施加刺激之后的继续相互作用的有无，需要除去用于施加刺激的药剂等。因此，在该方法中不能获得蛋白质间相互作用发生所需的时间信息，另外，有不能检测在任意时间任意场所变化(发生、消失、再发生等)的蛋白质间相互作用等问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2000/017221号

专利文献2：国际公开2006/099486号

专利文献3：美国专利7282347号说明书

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术中存在的课题而做出的，其目的是提供能够在蛋白质间相互作用所固有的细胞内环境下检测细胞内的蛋白质间相互作用，并且能够检测蛋白质间相互作用的位置信息和时间信息的方法。

用于解决课题的方法

本发明者们构想，在2种蛋白质(第1蛋白质和第2蛋白质)的相互作用的检测中，利用包含第1蛋白质和装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质、与包含第2蛋白质和有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质。具体地，考虑构建如下体系：在使这2种融合蛋白质在细胞内表达的情况下，如果第1蛋白质与第2蛋白质相互作用，则装配诱导蛋白质彼此的装配作用被诱导，由此融合蛋白质自主地形成装配体，融合蛋白质所含的荧光蛋白质作为荧光亮点被检测到(参照图1和2)。并且考虑，作为所述装配诱导蛋白质，利用具有在与作为单体荧光蛋白质的一种的单体Azami Green 1(monomeric Azami Green 1、mAG1)融合时在细胞内扩散而存在、在与有多聚化能力的荧光蛋白质融合时在细胞内形成荧光亮点(装配体)的性质的蛋白质。

于是，本发明者们首先使融合了mAG1或有多聚化能力的荧光蛋白质的候选蛋白质在细胞内表达，以荧光亮点的形成作为指标进行装配诱导蛋白质的筛选(参照图3和4)。

进行所述筛选的结果弄清楚了，p62的PB1结构域、TFG的PB1结构域、PKCiota的PB1结构域、TEL的SAM结构域、DGKdelta的SAM结构域和端锚聚合酶-1(Tankyrase-1)的SAM结构域可以作为所述装配诱导蛋白质利用。

接着，本发明者们通过将所鉴定的这些蛋白质实际作为这些装配诱导蛋白质，与有多聚化能力的荧光蛋白质组合使用，从而弄清楚了可以以荧光亮点为指标检测任意的蛋白质间相互作用。

通过该方法，可以在蛋白质相互作用所固有的细胞内环境下检测该蛋白质间相互作用，并且还可以检测蛋白质间相互作用的位置信息和时间信息。另外，还可以鉴定参与蛋白质间相互作用的氨基酸残基、筛选调节蛋白质间相互作用的物质。

因此，本发明涉及蛋白质间相互作用的检测方法及其应用、以及用于该方法的试剂盒，更详细地，提供以下的发明。

(1)用于检测第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的方法，该方法包括：

使包含第1蛋白质和装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质、与包含第2蛋白质和有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质在细胞内表达的工序；

检测在所述细胞内由第1融合蛋白质与第2融合蛋白质的装配而产生的荧光亮点的工序；

通过所述荧光亮点的检测来判定第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的工序。

(2)根据(1)所述的方法，为了检测所述相互作用的发生或消失、至该相互作用的发生或消失所需的时间、或该相互作用的持续时间，而检测所述荧光亮点。

(3)根据(1)所述的方法，为了检测对特定刺激进行应答的所述相互作用的发生或消失、至该相互作用的发生或消失所需的时间、或该相互作用的持续时间，而检测所述荧光亮点。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，是用于筛选与特定蛋白质相互作用的蛋白质的方法，第1蛋白质和第2蛋白质的任一方是该特定蛋白质，另一方是被检蛋白质，通过所述荧光亮点的检测来选择与该特定蛋白质相互作用的蛋白质。

(5)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，是用于鉴定参与所述相互作用的第1蛋白质中的氨基酸残基或第2蛋白质中的氨基酸残基的方法，使用在该第1蛋白质和该第2蛋白质的任一方中导入了突变的蛋白质，在所述荧光亮点的强度与使用未导入突变的蛋白质时相比减弱的情况下，判定为导入了该突变的氨基酸残基参与所述相互作用。

(6)用于筛选调节第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的物质的方法，包括：

在被检化合物存在下，使包含第1蛋白质和装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质、与包含第2蛋白质和有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质在细胞内表达的工序；

在所述荧光亮点的荧光强度与在所述被检化合物不存在下产生的荧光亮点的荧光强度相比增大的情况下，选择所述被检化合物作为所述相互作用的诱导物质，在所述荧光亮点的荧光强度与在所述被检化合物不存在下产生的荧光亮点的荧光强度相比减弱的情况下，选择所述被检化合物作为所述相互作用的抑制物质的工序。

(7)根据(1)～(6)的任一项所述的方法，所述装配诱导蛋白质是选自p62的PB1结构域、TFG的PB1结构域、PKCiota的PB1结构域、TEL的SAM结构域、DGKdelta的SAM结构域和端锚聚合酶-1的SAM结构域中的至少一种蛋白质。

(8)用于筛选装配诱导蛋白质的方法，包括：

(a)使包含被检蛋白质和mAG1的融合蛋白质在细胞内表达的工序；

(b)使包含所述被检蛋白质和有多聚化能力的荧光蛋白质的融合蛋白质在细胞内表达的工序；

(c)在(a)所记载的工序中检测不到荧光亮点、(b)所记载的工序中检测到荧光亮点的情况下，选择所述被检蛋白质作为装配诱导蛋白质的工序。

(9)根据(1)～(8)的任一项所述的方法，所述有多聚化能力的荧光蛋白质是选自单体Kusabira-Orange2、Azami-Green、Kusabira-Orange1、二聚体Keima-Red、Kikume Green-Red、单体Keima-Red、单体Midoriishi-Cyan1、单体Kusabira-Orange1、单体Kikume Green-Red1、Midoriishi-Cyan1、Kusabira-Cyan1、二聚体Azami-Green(AB)、二聚体Azami-Green(AC)、TGuv、Momiji、COR3.01、COR5和DsRed2中的至少一种荧光蛋白质。

(10)根据(1)～(9)的任一项所述的方法的试剂盒，包含选自下述(a)～(j)中的至少一种物质和使用说明书，

(a)包含编码装配诱导蛋白质的DNA、和能够插入编码任意蛋白质的DNA使得该任意蛋白质与该装配诱导蛋白质融合而表达的克隆位点的载体；

(b)包含编码有多聚化能力的荧光蛋白质的DNA、和能够插入编码任意蛋白质的DNA使得该任意蛋白质与该荧光蛋白质融合而表达的克隆位点的载体；

(c)包含编码mAG1的DNA、和能够插入编码任意蛋白质的DNA使得该任意蛋白质与该荧光蛋白质融合而表达的克隆位点的载体；

(d)编码第1融合蛋白质的载体；

(e)编码第2融合蛋白质的载体；

(f)包含(a)或(d)所记载的载体和(b)或(e)所记载的载体的载体组；

(g)包含(b)所记载的载体和(c)所记载的载体的载体组；

(h)保持编码第1融合蛋白质的载体的转化细胞；

(i)保持编码第2融合蛋白质的载体的转化细胞；

(j)保持编码第1融合蛋白质的载体和编码第2融合蛋白质的载体的转化细胞。

发明的效果

通过本发明，可以将蛋白质间相互作用在其固有的细胞内环境下进行检测，另外可以检测蛋白质间相互作用的位置信息和时间信息。

附图说明

图1是显示本发明的蛋白质间相互作用的检测方法的概念的图。即，是显示在使包含第1蛋白质(B)和装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质、与包含第2蛋白质(A)和有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质在细胞内表达时，通过检测由所述细胞内的由第1融合蛋白质和第2融合蛋白质的装配体形成所产生的荧光亮点，可以判定第1蛋白质(B)与第2蛋白质(A)的相互作用的图。

图2是显示本发明的蛋白质间相互作用的检测方法的概念的图。即，是显示在第1蛋白质(C)与第2蛋白质(A)不相互作用的情况下，即使使包含第1蛋白质(C)和装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质、与包含第2蛋白质(A)和有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质在细胞内表达，第1融合蛋白质与第2融合蛋白质也不装配，以扩散的状态在所述细胞内各自存在，因而检测不到荧光亮点的图。

图3是显示本发明的装配诱导蛋白质的筛选方法的概念的图。即，是显示本发明的装配诱导蛋白质在与有多聚化能力的荧光蛋白质融合的情况下能够在细胞内形成装配体(荧光亮点)的图。

图4是显示本发明的装配诱导蛋白质的筛选方法的概念的图。即，是显示本发明的装配诱导蛋白质在与单体Azami Green 1(monomeric AzamiGreen 1、mAG1)融合的情况下在细胞内扩散存在的图。

图5是显示使在p62的PB1结构域(p62(PB1))融合了mAG1的蛋白质(mAG1-p62(PB1))、和在p62(PB1)融合了作为有多聚化能力的荧光蛋白质的Azami Green(AG)的蛋白质(AG-p62(PB1))在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图6是显示使包含mTOR蛋白质的FRB结构域和AG蛋白质的融合蛋白质、与包含p62(PB1)和FKBP12的融合蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。此外，已知mTOR蛋白质的FRB结构域(mTOR(FRB))与FKBP12蛋白质在雷帕霉素(rapamycin)的存在下相互作用。

图7是显示使包含mTOR蛋白质的FRB结构域和p62(PB1)的融合蛋白质、与包含AG蛋白质和FKBP12的融合蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。

图8是显示使包含mTOR蛋白质的FRB结构域和p62(PB1)的融合蛋白质、与包含mAG1蛋白质和FKBP12的融合蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。

图9是显示使包含mTOR蛋白质的FRB结构域和AG蛋白质的融合蛋白质(mTOR-AG)、与包含p62(PB1)蛋白质和FKBP12的融合蛋白质(p62(PB1)-FKBP12)在培养细胞内表达，在雷帕霉素不存在下(-)或存在下(+)，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图10是显示使包含mTOR蛋白质的FRB结构域和mAG1蛋白质的融合蛋白质(mTOR-mAG1)、与包含p62(PB1)蛋白质和FKBP12的融合蛋白质(p62(PB1)-FKBP12)在培养细胞内表达，在雷帕霉素不存在下(-)或存在下(+)，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图11是显示使包含mTOR蛋白质的FRB结构域和AG蛋白质的融合蛋白质(mTOR-AG)、与包含丧失了均多聚体能力的p62(PB1)蛋白质突变体和FKBP12的融合蛋白质(p62(PB1_nc)-FKBP12)在培养细胞内表达，在雷帕霉素不存在下(-)或存在下(+)，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图12是显示使在MEK5的PB1结构域(MEK5(PB1))或Nbr1的PB1结构域(Nbr1(PB1))融合了mAG1蛋白质或AG蛋白质(有多聚化能力的荧光蛋白质)的蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图13是显示使在PKCiota的PB1结构域(PKCiota(PB1))或TFG的PB1结构域(TFG(PB1))融合了mAG1蛋白质或AG蛋白质的蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图14是显示使在TEL的SAM结构域(TEL(SAM))或DGKdelta(DGKd)的SAM结构域(DGKdelta(SAM))融合了mAG1蛋白质或AG蛋白质的蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图15是显示使在端锚聚合酶的SAM结构域(Tankyrase(SAM))或EphB2的SAM结构域(EphB2(SAM))融合了mAG1蛋白质或AG蛋白质的蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图16是显示使下述融合蛋白质的组合在培养细胞内表达，在雷帕霉素存在下分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片，

包含mTOR蛋白质的FRB结构域和AG蛋白质的融合蛋白质(mTOR(FRB domain)-AG)、与包含FKBP12蛋白质和TFG(PB1)的融合蛋白质(FKBP12-TFG(PB1))的组合，

mTOR(FRB domain)-AG、与包含FKBP12蛋白质和TEL(SAM)的融合蛋白质(FKBP12-TEL(SAM))的组合，

mTOR(FRB domain)-AG、与包含FKBP12蛋白质和DGKdelta(SAM)的融合蛋白质(FKBP12-DGKd(SAM))的组合，

mTOR(FRB domain)-AG、与包含FKBP12蛋白质和Tankyrase(SAM)的融合蛋白质(FKBP12-Tankyrase(SAM))的组合。

图17是显示对于能否通过使用KO1、dKeima、KikGR、AG作为本发明的有多聚化能力的荧光蛋白质，以荧光亮点的形成来检测依赖于雷帕霉素的、mTOR(FRB)与FKBP12蛋白质的相互作用进行分析而得的结果的显微镜照片。

图18是显示使在p62(PB1)融合了单体Kusabira-Orange2(monomericKusabira-Orange2、mKO2)的蛋白质在培养细胞内表达，分析荧光亮点的产生的有无而得的结果的显微镜照片。

图19是显示对于由mTOR(FRB domain)-AG与FKBP12-p62(PB1)装配而产生的荧光亮点的荧光强度是否依赖于雷帕霉素浓度进行分析而得的结果的显微镜照片。

图20是显示对于由mTOR(FRB domain)-AG与FKBP12-p62(PB1)装配而产生的荧光亮点的荧光强度是否依赖于雷帕霉素浓度进行分析而得的结果的图。

图21是显示对于由mTOR(FRB domain)-AG与p62(PB1)-FKBP12装配而产生的荧光亮点的荧光强度是否依赖于雷帕霉素浓度进行分析而得的结果的图。

图22是显示对于在雷帕霉素存在下，由mTOR(FRB domain)-AG与p62(PB1)-FKBP12装配而产生的荧光亮点的荧光强度是否依赖于FK506浓度而被抑制进行分析而得的结果的图。此外，FK506通过竞争性地抑制FKBP12蛋白质与雷帕霉素的相互作用，来抑制mTOR蛋白质的FRB结构域(mTOR(FRB))与FKBP12蛋白质的相互作用。

图23是显示使包含p62(PB1)和p53的一部分的融合蛋白质(p62(PB1)-p53)、与包含AG蛋白质和MDM2的融合蛋白质(AG-MDM2)在培养细胞内表达，在Nutlin-3存在下分析荧光亮点的荧光强度而得的结果的显微镜照片。此外，Nutlin-3作为针对p53蛋白质与MDM2蛋白质的相互作用的抑制剂而抑制。另外，图中左下的比例尺表示10μm。

图24是显示对于由p62(PB1)-p53与AG-MDM2装配而产生的荧光亮点的荧光强度是否依赖于Nutlin-3浓度而被抑制进行分析而得的结果的图。

图25是显示对于由p62(PB1)-p53与AG-MDM2装配而产生的荧光亮点的荧光强度是否依赖于Nutlin-3浓度而被抑制进行分析而得的结果的图。

图26是显示对表达p62(PB1)-p50和AG-p65的细胞(IκBα(-))、与表达p62(PB1)-p50、AG-p65和IκBα的细胞(IκBα(+))进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，p50与p65形成异二聚体而定位于核内，进而通过与IκBα相互作用而变得定位于细胞质。另外，图中“AG”表示对来源于AG的荧光进行检测而得的结果，“利用抗IκBα抗体的免疫染色”表示对施加了该免疫染色的细胞进行观察而得的结果，“叠加”表示将所述“AG”、所述“利用抗IκBα抗体的免疫染色”和对用Hoechst33342将核进行了染色的细胞进行观察而得的结果叠加而得的结果。

图27是显示对于由p62(PB1)-p50与AG-p65装配而产生的荧光亮点的细胞内定位是否根据IκBα向该细胞的导入量(pIκBα添加量)而变化进行分析而得的结果的图。

图28是显示对共表达p62(PB1)-CDK4和AG-p21的细胞(AG-p21+PB1-CDK4)、与共表达p62(PB1)-CDK4、AG-p21和CyclinD1(细胞周期蛋白D1)的细胞(AG-p21+PB1-CDK4+CyclinD1)进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，p21、与由CDK4和CyclinD1形成的复合体相互作用。另外，图中“AG”表示对来源于AG的荧光进行检测而得的结果，“利用抗CyclinD1抗体的免疫染色”表示对施加了该免疫染色的细胞进行观察而得的结果，“叠加”表示将所述“AG”、与所述“利用抗CyclinD1抗体的免疫染色”进行叠加而得的结果。

图29是显示使下述融合蛋白质的组合在培养细胞内表达，对荧光亮点的荧光强度和定位进行分析而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示20μm，

包含p62(PB1)和Sec5蛋白质的一部分的融合蛋白质(p62(PB1)-Sec5)、与包含AG蛋白质和RalB蛋白质(野生型)的融合蛋白质(AG-RalB(WT))的组合，

p62(PB1)-Sec5、与包含AG蛋白质和RalB蛋白质(非活性型突变型)的融合蛋白质(AG-RalB(S28N))的组合，

p62(PB1)-Sec5、与包含AG蛋白质和RalB蛋白质(活性型突变型)的融合蛋白质(AG-RalB(Q72L))的组合，

此外，已知Sec5蛋白质与RalB蛋白质的GTP活化型相互作用。另外，已知在RalB的非活性型突变体RalB(S28N)中，其相互作用减少，在RalB的活性型突变体RalB(Q72L)中，其相互作用增大。进而对于RalB蛋白质，还明确了通过其C末端被棕榈酰化而定位于细胞膜。

图30是显示使下述融合蛋白质的组合在培养细胞内表达，仅对细胞膜附近的荧光进行检测而得的结果的显微镜照片。

p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(WT)的组合

p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(Q72L)的组合

p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(S28N)的组合

p62(PB1)与AG-RalB(WT)的组合。

图31是显示对共表达p62(PB1)-p53和AG-MDM2的细胞(WT)、与共表达p62(PB1)-p53_W23L和AG-MDM2的细胞(W23L)进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，p53的23位的氨基酸位于p53与MDM2的相互作用界面部位，p53中的W23L突变使该相互作用减弱。

图32是显示对于通过包含钙调蛋白(Calmodulin)蛋白质和AG蛋白质的融合蛋白质(Calmodulin-AG)、与包含肌球蛋白轻链激酶2的部分序列(M13肽)和p62(PB1)的融合蛋白质(M13peptide-p62(PB1))的装配而产生荧光亮点的产生和消失，在组胺(Histamine)添加前、添加后90秒后、添加后620秒后进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。另外，已经明确，钙调蛋白与M13肽的相互作用，是对G蛋白偶联受体(GPCR)在接受配基(例如，Histamine)时产生的细胞内钙离子浓度的瞬间上升进行应答而发生。

图33是显示对于由包含mTOR(FRB domain)、AG蛋白质和核定位信号(NLS)的融合蛋白质(mTOR(FRB domain)-AGNLS)、与FKBP12-p62(PB1)的装配而产生的荧光亮点的定位进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，左数第1的面板显示雷帕霉素添加前的细胞的荧光图像，第2的面板显示雷帕霉素添加后的细胞的荧光图像，第3的面板显示雷帕霉素添加后的细胞的荧光图像与明视野像叠加而成的结果。另外，图中右下的比例尺表示5μm。

图34是显示对于由包含p62(PB1)和HRas蛋白质且C末端具有异戊烯化(prenylation)序列的融合蛋白质(p62(PB1)-HRas)、与包含AG蛋白质和cRaf蛋白质的融合蛋白质(AG-cRaf)的装配而产生的荧光亮点的定位进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。

图35是显示对于由包含p62(PB1)和Smac蛋白质的一部分的融合蛋白质(Smac-p62(PB1))、与包含XIAP蛋白质的一部分和AG蛋白质的融合蛋白质(XIAP-AG)装配而产生的荧光亮点的定位进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。

图36是显示对于由包含p62(PB1)和BclX(L)蛋白质的一部分的融合蛋白质(p62(PB1)-BclX(L))、与包含AG蛋白质和BAD蛋白质的一部分的融合蛋白质(AG-BAD)装配而产生的荧光亮点的定位进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。

图37是显示由包含AG蛋白质和Rac1蛋白质的融合蛋白质(AG-Rac1)、与包含p62(PB1)和p21结合结构域的融合蛋白质(p62(PB1)-PBD)的装配而产生的荧光亮点定位于核内的显微镜照片。此外，图中右下的比例尺表示5μm。另外，Rac1蛋白质通过鸟苷酸转换因子(GEF)而转换成活性型。并且，已知活性型的Rac1蛋白质与PBD相互作用。进而，GEF的定位根据其种类不同而不同，因此Rac1蛋白质与PBD的相互作用在与根据种类不同而不同的GEF的定位相应的细胞内的区域发生。

图38是显示由AG-Rac1与p62(PB1)-PBD的装配而产生的荧光亮点定位于细胞的边缘的显微镜照片。此外图中，下部面板是将上部面板内的用白线包围的区域扩大而得的。另外，上部面板内右下的比例尺表示5μm，下部面板内左上的比例尺表示1μm。

图39是显示在使AG-Rac1与p62(PB1)在细胞内表达的情况下，由于这些蛋白质不相互作用，因而在细胞的边缘等检测不到荧光亮点的显微镜照片。此外图中，下部面板是将上部面板内的用白线包围的区域扩大而得的。另外，上部面板内右下的比例尺表示5μm，下部面板内左上的比例尺表示1μm。

图40是显示对表达AG-Rac1和p62(PB1)-PBD的细胞，在作为针对香叶基香叶基基修饰的抑制剂的美伐他汀(mevastatin)不存在下(-)或存在下(+)进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，通过抑制香叶基香叶基基修饰，Rac1定位于核内。另外，图中，对于同一细胞，“A”表示用通常的落射型倒置荧光显微镜观察而得的结果，“B”表示用仅能激发细胞膜附近的电弧光源全反射荧光显微镜系统观察而得的结果。

图41是显示对表达AG-Rac1和RhoGDI-p62(PB1)的细胞，在作为针对香叶基香叶基基修饰的抑制剂的美伐他汀不存在下(-)或存在下(+)进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，Rac1蛋白质介由其香叶基香叶基基而与RhoGDI相互作用。另外，图中，对于同一细胞，“A”表示用通常的落射型倒置荧光显微镜观察而得的结果，“B”表示用仅能激发细胞膜附近的电弧光源全反射荧光显微镜系统观察而得的结果。

图42是显示对表达p62(PB1)-KRas(WT)和AG-cRaf(R59A)的细胞(WT)、与表达p62(PB1)-KRas(G12D)和AG-cRaf(R59A)的细胞(G12D)，在添加EGF后(+)或不添加EGF(-)下，仅检测这些细胞的细胞膜附近的荧光而得的结果的显微镜照片。此外，依赖于EGF而被活化的KRas、与cRaf相互作用。另外，通过该蛋白质间相互作用，cRaf的定位从细胞质变为细胞膜。

图43是显示共表达p62(PB1)-BclX(L)与Bak-AG的细胞中的荧光亮点的总荧光强度在ABT-737添加后的经时变化的图。此外，BclX(L)与Bak介由BH3结构域而相互作用，但该蛋白质间相互作用被ABT-737(BH3模仿药)而竞争性抑制。

图44是显示共表达p62(PB1)-BclX(L)与AG-Bax的细胞中的荧光亮点的总荧光强度在ABT-737添加后的经时变化的图。此外，BclX(L)与Bax介由BH3结构域而相互作用，但该蛋白质间相互作用被ABT-737而竞争性抑制。

图45是显示稳定地表达p62(PB1)-p53和AG-MDM2的细胞中的荧光亮点的总荧光强度在Nutlin-3添加前后的经时变化的图。此外，图的x轴表示以Nutlin-3添加时为0的时间(分钟)。

图46是显示稳定地表达mTOR(FRB domain)-AG和p62(PB1)-FKBP12的细胞中的荧光亮点的总荧光强度在雷帕霉素添加前后的经时变化的图。此外，图的x轴表示以雷帕霉素添加时为0的时间(分钟)。

图47是显示表达p62(PB1)-ERK_substrate和AG-Pin1(ww)-NES的细胞中的荧光亮点的总荧光强度在EGF和U0126添加前后的经时变化的图。此外，如果通过EGF刺激而细胞内的ERK被活化，则ERK底物(ERK_substrate)被磷酸化，其结果是ERK_substrate与Pin1蛋白质的ww结构域(Pin1(ww))相互作用。进而，如果添加作为MEK抑制剂的U0126，则ERK的活性降低，结果ERK底物受到去磷酸化，ERK底物与Pin1(ww)的相互作用被解除。图的x轴表示以EGF添加时为0的时间(分钟)。另外，U0126向细胞的添加在添加EGF起的14分钟后进行。

图48是显示表达p62(PB1)-HRas(WT)和AG-cRaf(R59A)的细胞中的荧光亮点的总荧光强度在EGF添加前后的经时变化的图。此外，图的x轴表示以EGF添加时为0的时间(分钟)。

图49是显示对表达AG-mCAB、p62(PB1)-FKBP12和mTOR(FRB)-KO1的细胞，在雷帕霉素不存在下(-)或存在下(+)、或FK506不存在下(-)或存在下(+)进行观察而得的结果的显微镜照片。此外，雷帕霉素与FKBP12蛋白质结合而形成复合体，进而该复合体与mTOR蛋白质的FRB结构域(mTOR(FRB))结合。另外，mCAB(钙调神经磷酸酶A的一部分与钙调神经磷酸酶B的一部分融合而成的蛋白质)与FKBP12蛋白质介由FK506而相互作用。图中，“AG”和“KO1”表示分别检测来源于AG和KO1的荧光而得的结果。

具体实施方式

＜用于检测蛋白质间相互作用的方法＞

本发明的用于检测蛋白质间相互作用的方法，

是用于检测第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的方法，该方法包括：

在本发明中，“蛋白质”是指2个以上的氨基酸通过肽键结合而成的分子及其修饰体。因此，是不仅包含全长蛋白质，还包含所谓寡肽和/或多肽的概念。作为蛋白质的修饰，可列举例如，磷酸化、糖基化、棕榈酰化、异戊烯化(例如，香叶基香叶基化)、甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化、羟基化、酰胺化。

作为本发明的“第1蛋白质”和“第2蛋白质”，可以使用想要检测相互作用的所期望的蛋白质。

本发明的“第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用”不仅包含直接相互作用，还包含如在第1蛋白质与第2蛋白质之间介由其他分子(蛋白质、核酸、糖、脂质、低分子化合物等)形成复合体这样的间接相互作用。

本发明的“有多聚化能力的荧光蛋白质”，是使其在细胞内与p62的PB1结构域(p62(PB1))融合而表达的情况下，该与p62(PB1)的融合蛋白质能够彼此装配，产生荧光亮点的荧光蛋白质。因此，“有多聚化能力的荧光蛋白质”不仅包含即使不与p62(PB1)融合也能在细胞内形成均多聚体的荧光蛋白质，还包含如后述的实施例所示的、一般被认为是单体荧光蛋白质的mKO2等荧光蛋白质。作为该“有多聚化能力的荧光蛋白质”，可列举例如，Midoriishi-Cyan1(MiCy1)、Kusabira-Orange1(KO1)、dKeima570(二聚体Keima570)、demeric Keima-Red(二聚体Keima-Red、dKeima、dKeima-Red)、Azami-Green(AG)、Kaede、Kikume Green-Red(KikGR、KikGR1)、monomeric Kusabira-Orange1(单体Kusabira-Orange1、mKO1)、monomeric Kusabira-Orange2(单体Kusabira-Orange2、mKO2)、TurboGFP、TurboYFP、ZsGreen、DsRed、HcRed、eqFP578、eqFP611、EosFP、FP484、Renilla GFP、Dendra、IFP1.4、iRFP、monomeric Keima-Red(单体Keima-Red、mKeima、mKeima-Red)、monomeric Midoriishi-Cyan1(单体Midoriishi-Cyan1、mMiCy1)、monomeric Kikume Green-Red1(单体Kikume Green-Red1、mKikGR1)、Kusabira-Cyan1(KCy1)、dimericAzami-Green(AB)(二聚体Azami Green(AB)、dAG(AB))、dimericAzami-Green(AC)(二聚体Azami Green(AC)、dAG(AC))、TGuv、Momiji、COR3.01、COR5和DsRed2，优选为mKO2、mKeima、mMiCy1、mKO1、mKikGR1、MiCy1、KCy1、KO1、dKeima、dAG(AB)、dAG(AC)、TGuv、Momiji、KikGR、AG、COR3.01、COR5和DsRed2。另外，本发明的方法中，从容易检测到明确的荧光亮点的观点考虑，更优选为TGuv、Momiji、AG、KikGR、COR3.01、COR5、DsRed2等能够形成均四聚体的荧光蛋白质，特别优选为AG。

此外，mKO2、AG、KO1、dKeima、KikGR、mKeima、mMiCy1、mKO1、mKikGR1、MiCy1、KCy1、dAG(AB)、dAG(AC)、TGuv、Momiji、COR3.01、DsRed2和COR5典型地分别为包含序列号：133所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB107915所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB128820所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB209968所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB193293所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB209969所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：137所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB128821所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：139所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含Genbank登录号：AB128822所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：141所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：143所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：145所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：147所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：149所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：151所记载的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：153所记载的氨基酸序列的蛋白质和包含序列号：172所记载的氨基酸序列的蛋白质。

这些荧光蛋白质的氨基酸序列可以在自然界(即，非人工地)突变。另外，也可以人为地导入突变。这样的突变体只要能发出荧光、且能在细胞内形成均多聚体，则也可以在本发明中使用。

本发明的“装配诱导蛋白质”如后述的实施例、以及图3和4所示，是在使其融合有多聚化能力的荧光蛋白质而在细胞内表达的情况下，能检测到该融合蛋白质彼此装配而产生的荧光亮点，在使其与单体AzamiGreen 1(monomeric Azami Green 1、mAG1)融合而表达的情况下，以扩散的状态在细胞内存在的蛋白质。

作为本发明的“装配诱导蛋白质”，优选为p62的PB1结构域、TFG的PB1结构域、PKCiota的PB1结构域、TEL的SAM结构域、DGKdelta的SAM结构域和端锚聚合酶-1的SAM结构域，从在本发明的方法中更容易检测荧光亮点的观点出发，更优选为p62的PB1结构域、TFG的PB1结构域、TEL的SAM结构域、DGKdelta的SAM结构域和端锚聚合酶-1的SAM结构域。

另外，p62的PB1结构域、TFG的PB1结构域、PKCiota的PB1结构域、TEL的SAM结构域、DGKdelta的SAM结构域和端锚聚合酶-1的SAM结构域典型地分别是包含序列号：4所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：12所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：10所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：14所特定的氨基酸序列的蛋白质、包含序列号：18所特定的氨基酸序列的蛋白质和包含序列号：20所特定的氨基酸序列的蛋白质。

这些“装配诱导蛋白质”的氨基酸序列可以在自然界(即，非人工地)突变。另外，也可以人为地导入突变。这样的突变体即使其自身没有装配能力，但只要具有在与有多聚化能力的荧光蛋白质融合的情况下形成装配体(荧光亮点)的性质，就可以在本发明中使用。

本发明的“第1融合蛋白质”中，装配诱导蛋白质可以在第1蛋白质的N末端侧、C末端侧的任一侧融合。进而，可以直接与第1蛋白质融合，也可以介由间隔物蛋白质而间接融合。另外，本发明的“第1融合蛋白质”中也可以融合有其他功能性蛋白质。此时，其他功能性蛋白质可以在融合蛋白质的N末端侧、C末端侧的任一侧或两侧、或装配诱导蛋白质与第1蛋白质之间直接或间接地融合。作为其他功能性蛋白质不特别限制，可根据想要赋予本发明的融合蛋白质的功能而适宜选择。例如，作为为了使融合蛋白质的纯化容易而使用的功能性蛋白质，可列举Myc-标签(tag)蛋白质、His-标签蛋白质、血凝素(HA)-标签蛋白质、FLAG-标签蛋白质(注册商标、Sigma-Aldrich社)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白质、以及与第2融合蛋白质中的有多聚化能力的荧光蛋白质显示不同的波长特性的荧光蛋白质。

本发明的“第2融合蛋白质”中，与所述“第1融合蛋白质”同样地，有多聚化能力的荧光蛋白质可以在第2蛋白质的N末端侧、C末端侧的任一侧融合。另外，可以直接与第2蛋白质融合，也可以介由所述间隔物蛋白质而间接地融合。进而，本发明的“第2融合蛋白质”中还可以融合有所述其他功能性蛋白质。此时，与所述“第1融合蛋白质”同样地，其他功能性蛋白质可以在融合蛋白质的N末端侧、C末端侧的任一侧或两侧、或有多聚化能力的荧光蛋白质与第2蛋白质之间直接或间接地融合。

作为本发明的“细胞”不特别限制，既可以是真核细胞也可以是原核细胞，可列举例如，动物细胞(HeLaS3细胞、U2OS细胞等)、昆虫细胞(Sf9细胞等)、植物细胞、酵母、大肠杆菌。另外，该细胞既可以是在体外培养的状态(例如，在培养基中或培养基上生长发育的细胞)，也可以是在体内存在的状态(例如，导入有编码第1融合蛋白质的DNA和编码第2融合蛋白质的DNA的转基因动物内的细胞)。

本发明的融合蛋白质在所述细胞内的表达根据目的，既可以是瞬时性的表达，也可以是恒常的表达。融合蛋白质在细胞中的表达通过将后述的本发明的载体导入所述细胞中来进行。作为在细胞中导入载体的公知方法，对动物细胞可列举脂质体转染法、电穿孔法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、利用病毒(腺病毒、慢病毒、腺相关病毒等)的方法。另外，对昆虫细胞可列举利用杆状病毒的方法。进而，对植物细胞可列举农杆菌法、电穿孔法、基因枪法等。另外，对酵母可列举乙酸锂法、电穿孔法、原生质体法。进而，对大肠杆菌可列举热激法(例如，氯化钙法、氯化铷法)、电穿孔法等。

本发明中检测的“荧光亮点”是通过第1融合蛋白质与第2蛋白质的装配而产生的，典型地是具有比以扩散状态存在的有多聚化能力的荧光蛋白质的荧光强度高的荧光强度的0.2～5μm的区域(参照后述的实施例、以及图1和2)。

“荧光亮点的检测”可以通过例如，利用具备与有多聚化能力的荧光蛋白质对应的激发滤光器和吸收滤光器的荧光显微镜的观察、利用IN CellAnalyzer(GEヘルスケア社制)等的成像位点仪的分析来进行。

在本发明的方法中，如果在细胞检测到所述荧光亮点，则可以判定为第1蛋白质与第2蛋白质相互作用，如果检测不到所述荧光亮点，则可以判定为第1蛋白质与第2蛋白质不相互作用。

＜装配诱导蛋白质的筛选方法＞

本发明的装配诱导蛋白质如后述的实施例所示，可以通过包括下述(a)～(c)所记载的工序的筛选方法来选择，

(c)在(a)所记载的工序中未检测到荧光亮点、(b)所记载的工序中检测到荧光亮点的情况下，选择所述被检蛋白质作为装配诱导蛋白质的工序。

作为本发明的“被检蛋白质”不特别限制，可以使用想要检测装配诱导能力的所期望的蛋白质。

此外，“mAG1”(单体Azami Green 1、monomeric Azami Green 1)典型地是包含序列号：135所记载的氨基酸序列的蛋白质。另外，蛋白质的氨基酸序列可以在自然界(即，非人工地)突变。进而，也可以人为地导入突变。这样的突变体只要能发出荧光、并能以单体的状态在细胞内存在，就也可以在本发明中使用。

作为在本发明的装配诱导蛋白质的筛选方法中使用的、有多聚化能力的荧光蛋白质，如前所述。

本发明的“包含被检蛋白质和mAG1的融合蛋白质”或“包含被检蛋白质和有多聚化能力的荧光蛋白质的融合蛋白质”中，mAG1或有多聚化能力的荧光蛋白质可以在被检蛋白质的N末端侧、C末端侧的任一侧融合。另外，既可以直接与被检蛋白质融合，也可以介由所述间隔物蛋白质而间接融合。本发明的“被检蛋白质”中也可以融合有所述其他功能性蛋白质。此时，其他功能性蛋白质可以在融合蛋白质的N末端侧、C末端侧的任一侧或两侧、或mAG1或有多聚化能力的荧光蛋白质与被检蛋白质之间直接或间接地融合。

在本发明的筛选中，选择与mAG1融合而在细胞内表达的情况下检测不到荧光亮点、在与有多聚化能力的荧光蛋白质融合而在细胞内表达的情况下检测到荧光亮点的被检蛋白质作为装配诱导蛋白质。

＜用于获得蛋白质间相互作用的时间信息等的方法＞

如后述的实施例、特别是实施例12所示，本发明的方法以本发明的荧光亮点的存在或不存在为指标，不仅可以检测蛋白质间相互作用的发生，还可以检测蛋白质间相互作用的消失。另外，如实施例19、24～28等所示，还可以经时地追踪该蛋白质间相互作用的发生等。进而如实施例20～22等所示，还可以在不受装配诱导蛋白质和/或有多聚化能力的荧光蛋白质的定位等影响的条件下，在本发明中在细胞内的任意区域检测蛋白质间相互作用。

因此，本发明可以提供通过检测本发明的荧光亮点，来检测蛋白质间相互作用的发生或消失、至该相互作用的发生或消失所需的时间、或该相互作用的持续时间的方法。

关于这样的“蛋白质间相互作用的发生或消失”的检测，在本发明中，特别如后述的实施例21所示，还可以特定蛋白质间相互作用发生的细胞内的区域。

另外，如后述的实施例19、23、27～29等所示，根据本发明，通过该“蛋白质间相互作用的发生或消失”的检测，可以检测与该蛋白质间相互作用相关的信号传递的发生和消失、至该信号传递的发生或消失所需的时间以及该信号传递的持续时间，进而还可以特定该信号传递所发生的细胞内的区域。

另外，如后述的实施例所示，即使第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用是对特定刺激进行应答而发生或消失的，也可以在本发明中检测。因此，本发明还提供为了通过检测本发明的荧光亮点而检测对特定刺激进行应答的蛋白质间相互作用的发生或消失、至该相互作用的发生或消失所需的时间、或该相互作用的持续时间，而检测所述荧光亮点的方法。

本发明的“特定刺激”只要是能够直接或间接地诱导或抑制蛋白质间相互作用的刺激即可，另外还可以是由细胞内所产生的内源性因子引起的刺激(例如，细胞内钙离子浓度的增减、酶的活化或钝化)，也可是对细胞施加的来自外部的刺激(例如，针对受体的配基(激动剂或拮抗物)向细胞的施与)。

另外，特别是如后述的实施例19、24～28所示，在所述本发明的方法中，还可以通过检测本发明的荧光亮点，来检测特定刺激的发生或消失、至该刺激的发生或消失所需的时间、或该刺激的持续时间。

进而，如后述的实施例11和13等所示，在本发明的方法中，还可以检测与特定刺激的程度(例如，在特定刺激为药剂的情况下，是其浓度)相应的蛋白质间相互作用的增减。因此，在特定刺激为药剂的情况下，可以通过本发明来确定该药剂针对蛋白质间相互作用的50％效应浓度(EC50)和50％抑制浓度(IC50)。

另外，如后述的实施例29所示，在本发明的方法中，可以在同一细胞中对多种蛋白质间相互作用、分别依赖于特定刺激的多种蛋白质间相互作用、以及与这些蛋白质间相互作用有关的信号传递进行判别、检测。

＜与特定蛋白质相互作用的蛋白质的筛选方法＞

如后述的实施例、特别是实施例30所示，在本发明中，可以检测任意蛋白质间相互作用。因此，本发明可以提供用于筛选与特定蛋白质相互作用的蛋白质的方法，所述方法中，通过以第1蛋白质和第2蛋白质的任一方为该特定蛋白质，以另一方为被检蛋白质，从而通过本发明的荧光亮点的检测来选择与该特定蛋白质相互作用的蛋白质。

作为本发明的“被检蛋白质”不特别限制。从能够全面且效率良好地选择与特定蛋白质相互作用的蛋白质的观点考虑，可以适合使用由cDNA文库所编码的蛋白质群。

＜参与蛋白质间相互作用的氨基酸残基的鉴定方法＞

如后述的实施例所示，在本发明中，荧光亮点的荧光强度与蛋白质间相互作用的强弱相关。因此，通过本发明，可以提供用于鉴定参与蛋白质相互作用的第1蛋白质中的氨基酸残基或第2蛋白质中的氨基酸残基的方法，该方法中，使用在该第1蛋白质和该第2蛋白质的任一方中导入了突变的蛋白质，在所述荧光亮点的强度与使用未导入突变的蛋白质时相比减弱的情况下，判定导入了该突变的氨基酸残基参与所述相互作用。

本发明的“荧光亮点的荧光强度”不仅包含一个荧光亮点的荧光强度，还包含在一定区域内(例如，一个细胞内、荧光显微镜观察中的一个视野内、一个荧光图像内)中存在的荧光亮点的总荧光强度。

“在第1蛋白质等中导入了突变的蛋白质”的制备可以选择只要是本领域技术人员就适宜公知的方法来进行。作为所述公知的方法，可列举定点诱变(site-directed mutagenesis)法。

＜调节蛋白质间相互作用的物质的筛选方法＞

如前所述，在本发明的方法中，可以以荧光亮点的荧光强度为指标来掌握蛋白质间相互作用的强弱。因此，通过本发明，可以提供一种方法，包括：

在所述荧光亮点的荧光强度比在所述被检化合物不存在下产生的荧光亮点的荧光强度增大的情况下，选择所述被检化合物作为所述相互作用的诱导物质，在所述荧光亮点的荧光强度比在所述被检化合物不存在下产生的荧光亮点的荧光强度减弱的情况下，选择所述被检化合物作为所述相互作用的抑制物质的工序。

作为在本发明的筛选方法中使用的被检化合物不特别限制，可列举例如，基因文库的表达产物、合成低分子化合物文库、肽文库、抗体、细菌释放物质、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)的提取液和培养上清、纯化或部分纯化多肽、来源于海洋生物、植物或动物的提取物、土壤、随机噬菌体肽展示文库。

另外，作为被检化合物存在下的状态，可列举例如，通过被检化合物向培养基的添加等形成的被检化合物与本发明的细胞接触的状态、和/或被检化合物被导入了本发明的细胞内的状态。

＜用于本发明的方法的试剂盒＞

本发明可以提供用于上述方法的试剂盒。本发明的试剂盒是包含选自下述(a)～(j)中的至少一种物质和使用说明书试剂盒。

(d)编码第1融合蛋白质的载体；

(e)编码第2融合蛋白质的载体；

(g)包含(b)所记载的载体和(c)所记载的载体的载体组；

(h)保持编码第1融合蛋白质的载体的转化细胞；

(i)保持编码第2融合蛋白质的载体的转化细胞；

作为本发明的载体，只要包含在本发明的细胞中表达(转录和翻译)所插入的DNA所需的控制序列即可。作为所述控制序列，可列举启动子、增强子、沉默子、终止子、多聚A尾、核糖体结合序列(Shine-Dalgarno(SD)序列)。进而，本发明的载体中还可以含有选择标志物(药剂耐性基因等)、报告物基因(萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因等)。另外，作为这样的本发明的载体的形态，可列举例如，质粒载体、附加体载体、病毒载体。

本发明的载体所编码的蛋白质如前所述，是装配诱导能蛋白质、有多聚化能力的荧光蛋白质、mAG1、和与这些蛋白质的融合蛋白质，但从进一步提高编码所述蛋白质的DNA的表达效率的观点考虑，也可以将根据表达该蛋白质的细胞的种类而将密码子最适化而得的DNA(例如，密码子被人源化的DNA)插入本发明的载体。

作为所述(a)、(b)和(c)所记载的“能够插入编码任意蛋白质的DNA的克隆位点”，可列举例如，包含1个或多个限制性酶识别位点的多克隆位点、TA克隆位点、GATEWAY(注册商标)克隆位点。

本发明的载体的标准品中还可以添加缓冲液、稳定剂、保存剂、防腐剂等其他成分。

本发明的转化细胞如前所述，可以通过将本发明的载体导入细胞来制备。另外，本发明的转化细胞的标准品中还可以添加或附带该细胞的保存、培养所需的培养基、稳定剂、保存剂、防腐剂等其他成分。

本发明的“使用说明书”是为了将所述载体和/或转化细胞用于本发明的方法的说明书。说明书可以包含例如，本发明的方法的实验方法和/或实验条件、和关于本发明的标准品的信息(例如，显示了载体的碱基序列和/或克隆位点等的载体图谱等信息、转化细胞的来源、性质、该细胞的培养条件等信息)。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。

(实施例1)

＜装配诱导蛋白质的筛选1＞

在构建用于检测蛋白质间相互作用的体系时，基于图1和图2所记载的概念，通过图3和图4所记载的方法来探索作为本发明的“装配诱导蛋白质”发挥功能的蛋白质。即，进行在与单体Azami Green 1(monomericAzami Green 1、mAG1)融合的情况下在细胞内扩散而存在(参照图4)、另一方面在与有多聚化能力的荧光蛋白质融合的情况下能在细胞内形成荧光亮点(装配体)的蛋白质(参照图3)的筛选。

作为所述筛选的对象，首先着眼于PB1(Phox and Bem1p)结构域，使在p62的PB1结构域(以后也称为“p62(PB1)”)融合了mAG1的蛋白质、和在p62(PB1)融合了作为有多聚化能力的荧光蛋白质的Azami Green(AG)的蛋白质在培养细胞内表达，通过以下所示的方法，调查各个融合蛋白质的装配、以及由装配体形成所产生的荧光亮点的产生的有无。此外，已知AG进行均四聚化。所得的结果示于图5。

(质粒DNA的制备)

作为用于融合mAG1的质粒DNA，使用phmAG1-MCLinker(Amalgaam有限会社制)。

另外，在用于融合AG的质粒(phAG-MCLinker)的制作中，首先，人工合成密码子人源化后的Azami Green(AG)基因(编码包含序列号：2所记载的氨基酸序列的区域的DNA(包含序列号：1所记载的碱基序列的DNA)。以使用下述引物组人工合成而得的、密码子人源化后的AG(hAG)基因作为模板通过PCR进行扩增。

hAG正向引物1：

5’-CTAGCTAGCATTGCCACCATGGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG-3’(序列号：57)

hAG反向引物1：

5’-ACTACCGGTCTTGGCCTGGCTGGGCAGCATGCTGTACC-3’(序列号：58)

然后，将所得的扩增产物用NheI和AgeI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker中，从而制作phAG-MCLinker。

进而，在phmAG1-p62(PB1)和phAG-p62(PB1)的制作中，首先，从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码p62的PB1结构域(包含序列号：4所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：3所记载的碱基序列的DNA)。

p62(PB1)正向引物1：

5’-AAGAATTCGATGGCGTCGCTCACCGTGAAGGCCTACCTTCTGGGC-3’(序列号：59)

p62(PB1)反向引物1：

5’-AATTGGCGGCCGCTTATTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATGTC-3’(序列号：60)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和NotI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MCLinker和phmAG1-MCLinker中，从而分别制作phAG-p62(PB1)和phmAG1-p62(PB1)。

(向培养细胞的基因导入)

作为导入phAG-p62(PB1)和phmAG1-p62(PB1)的培养细胞，使用HeLaS3细胞。此外，HeLaS3细胞用含有10％FBS(EQUITECH社制)的DMEM低葡萄糖(DMEM Low glucose、SIGMA ALDRICH社制)培养。另外，将所述HeLaS3细胞在基因导入的前一天接种于35mm玻璃基盘(旭硝子社制)。然后，基因导入时在OptiMEM(Life Technologies社制)中稀释phAG-p62(PB1)或phmAG1-p62(PB1)1μg，添加ポリフェクト(注册商标)转染试剂(PolyFect(R)Transfection Reagent、QIAGEN社制)10μl，进行搅拌。接着，进一步与培养液600μl混合，然后添加到HeLaS3细胞中，22小时后观察。

(基因导入细胞的观察)

实施了基因导入处理的HeLaS3细胞，在包含汉克斯平衡盐液(Hanks’Balanced Salt Solutions、Life Technologies社制)和20mM HEPES(同仁化学社制)的pH7.4缓冲液中，使用IX-71倒置显微镜(オリンパス社制)、U-MGFPHQ滤光器(オリンパス社制)、ORCA-ER数码相机(浜松ホトニクス社制)进行观察。

如由图5所示的结果可以明确的那样，p62(PB1)在融合了mAG1的情况下在细胞内以扩散状态存在。另一方面，在融合了作为有多聚化能力的荧光蛋白质的AG的情况下，在细胞内检测到荧光亮点，明确了包含p62(PB1)和AG的融合蛋白质彼此装配，形成荧光亮点。因此，明确了p62的PB1结构域是其自身没有装配能力，但在与有多聚化能力的荧光蛋白质融合的情况下形成装配体(荧光亮点)的性质，启示了可以适合作为本发明的装配诱导蛋白质使用。

(实施例2)

＜蛋白质间相互作用的检测1＞

为了证实p62的PB1结构域可以适合作为本发明的装配诱导蛋白质使用，即为了证实p62的PB1结构域可以在图1和2所记载的模型中适用，使用可以通过药剂添加而诱发相互作用的蛋白质，通过以下所示的方法进行试验。所得的结果示于图6～8。

此外，已知实施例2中使用的mTOR蛋白质的FRB结构域(也称为“mTOR(FRB)”或“mTOR(FRB domain)”)与FKBP12蛋白质在雷帕霉素(rapamycin)的存在下相互作用(参照Chen J等、Proc Natl Acad Sci U SA.、1995年5月23日、92卷11号、4947～4951页)。

(质粒DNA的制备)

在用于融合AG的质粒(phAG-MNLinker)的制作中，首先使用下述引物组，以phAG-MCLinker作为模板，通过PCR扩增密码子人源化后的Azami Green(AG)基因。

hAG正向引物2：

5’-GGACCGGTATGGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG-3’(序列号：61)

hAG反向引物2：

5’-TTTCTAGATCACTTGGCCTGGCTGGGCAGCATGC-3’(序列号：62)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MNLinker(Amalgaam有限会社制)中，从而制作phAG-MNLinker。

另外，在用于融合p62(PB1)的质粒(pp62(PB1)-MNLinker)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码p62的PB1结构域(包含序列号：4所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：3所记载的碱基序列的DNA)。

p62(PB1)正向引物2：

5’-GGGACCGGTATGGCGTCGCTCACCGTGAAGGCCTACCTTC-3’(序列号：63)

p62(PB1)反向引物2：

5’-ACCTCTAGATTATTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATG-3’(序列号：64)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MNLinker中，从而制作pp62(PB1)-MNLinker。

进而，在用于融合p62(PB1)的质粒(pp62(PB1)-MCLinker)的制作中，首先以pp62(PB1)-MNLinker作为模板，使用下述引物组，通过PCR扩增编码p62的PB1结构域(包含序列号：4所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：3所记载的碱基序列的DNA)。

p62(PB1)正向引物3：

5’-TAGCGCTAGCATTGCCACCATGGCGTCGCTCACCGTGAAGGCCTACCTTC-3’(序列号：65)

p62(PB1)反向引物3：

5’-AAAACCGGTTTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATG-3’(序列号：66)

然后，将所得的扩增产物用NheI和AgeI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-MCLinker。

另外，在pmTOR(FRB domain)-hAG的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码mTOR的FRB结构域(包含mTOR蛋白质的2025～2114氨基酸的区域、包含序列号：22所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：21所记载的碱基序列的DNA)。

mTOR(FRB)正向引物：

5’-GCCGAATTCGGCCACCATGGAGATGTGGCATGAAGGCCTGGAAGAGGCATCTCG-3’(序列号：67)

mTOR(FRB)反向引物：

5’-GGGCTCGAGCCCTGCTTTGAGATTCGTCGGAACACATGATAATAGAGGTCCC-3’(序列号：68)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MNLinker中，从而制作pmTOR(FRBdomain)-hAG。此外，pmTOR(FRB domain)-hAG编码包含mTOR(FRB)和AG蛋白质的融合蛋白质(也称为“mTOR(FRB)-AG”)。

进而，在pp62(PB1)-FKBP12的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码FKBP12(全长、包含序列号：24所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：23所记载的碱基序列的DNA)。

FKBP12正向引物：

5’-GCCGAATTCGATGGGAGTGCAGGTGGAAACC-3’(序列号：69)

FKBP12反向引物：

5’-GGGCTCGAGTTATTCCAGTTTTAGAAGCTCCA-3’(序列号：70)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的pp62(PB1)-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-FKBP12。此外，pp62(PB1)-FKBP12编码包含p62(PB1)和FKBP12蛋白质的融合蛋白质(也称为“p62(PB1)-FKBP12”)。

另外，在phAG-FKBP12的制作中，首先将phAG-MCLinker用NheI和AgeI切断，从而制备hAG1基因。接着，在用相同的限制性酶处理而切出了p62(PB1)区域的pp62(PB1)-FKBP12中，插入hAG1基因，从而制作phAG-FKBP12。

进而，在phmAG1-FKBP12的制作中，首先将phmAG1-MCLinker用NheI和AgeI切断，从而制备hmAG1基因。接着，在用相同的限制性酶处理而切出了p62(PB1)区域的pp62(PB1)-FKBP12中插入hmAG1基因，从而制作phmAG1-FKBP12。此外，phmAG1-FKBP12编码包含mAG1蛋白质和FKBP12蛋白质的融合蛋白质(也称为“mAG1-FKBP12”)。

进而，在pmTOR(FRB domain)-p62(PB1)的制作中，首先将pp62(PB1)-MNLinker用AgeI和XbaI切断，从而制备p62(PB1)基因。接着，插入到用相同的限制性酶处理而切出了hAG区域的pmTOR(FRBdomain)-hAG中，从而制作pmTOR(FRB domain)-p62(PB1)。此外，pmTOR(FRB domain)-p62(PB1)编码包含mTOR(FRB)和p62(PB1)的融合蛋白质(也称为“mTOR(FRB)-p62(PB1)”)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

以下述质粒DNA的组合进行等量混合，将所得的物质通过与实施例1所记载的方法同样的方法分别导入HeLaS3细胞。

pmTOR(FRB domain)-hAG与pp62(PB1)-FKBP12的组合

phAG-FKBP12与pmTOR(FRB domain)-p62(PB1)的组合

phmAG1-FKBP12与pmTOR(FRB domain)-p62(PB1)的组合

另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例1所记载的方法同样的方法进行。然后，在100nM雷帕霉素(メルク社制)添加前和添加300秒后拍摄荧光图像。

如由图6所示的结果而明确的那样，在雷帕霉素添加前mTOR(FRB)-AG扩散存在(参照图6左侧的面板)，但在添加后的细胞中检测到荧光亮点(参照图6右侧的面板)。另外，如由图7所示的结果而明确的那样，在雷帕霉素添加前AG-FKBP12扩散存在(参照图7上部的面板)，但在添加后的细胞中检测到荧光亮点(参照图7下部的面板)。因此明确了，通过依赖于雷帕霉素的mTOR(FRB)与FKBP12蛋白质的相互作用，mTOR(FRB)-AG与p62(PB1)-FKBP12自发地装配，另外AG-FKBP12与mTOR(FRB)-p62(PB1)自发地装配，分别形成荧光亮点。

另一方面，如由图8所示的结果而明确的那样，在作为荧光蛋白质使用mAG1的情况下，雷帕霉素添加后的细胞中检测不到荧光亮点，观察不到依赖于雷帕霉素的装配体的形成。因此明确了，如果不组合使用有多聚化能力的荧光蛋白质与装配诱导蛋白质，则不能通过蛋白质间相互作用而形成装配体，检测不到荧光亮点，证实了图1和2所记载的模型可以实施。

(实施例3)

＜蛋白质间相互作用的检测2＞

为了证实p62的PB1结构域可以在图1和2所记载的模型中适用，使用所述mTOR的FRB结构域与FKBP12，通过以下所示的方法进行试验。所得的结果示于图9～11。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

以下述质粒DNA的组合进行等量混合，将所得的物质通过与实施例2所记载的方法同样的方法分别导入HeLaS3细胞。然后，在100nM雷帕霉素(メルク社制)添加前和添加300秒后拍摄荧光图像。

pmTOR(FRB domain)-hAG与pp62(PB1)-FKBP12的组合

pmTOR(FRB domain)-hmAG1与pp62(PB1)-FKBP12的组合

pmTOR(FRB domain)-hAG与pp62(PB1_nc)-FKBP12的组合。

(质粒DNA的制备)

pmTOR(FRB domain)-hmAG1如下制备：通过与实施例2所记载的方法同样的方法，从pmTOR(FRB domain)-hAG切出编码hAG的DNA，代替地插入编码hmAG1的DNA。

另外，pp62(PB1_nc)-FKBP12如下制备：以pp62(PB1)-FKBP12作为模板，使用AMAP多定点突变导入试剂盒(AMAP(TM)Multi Site-directedMutagenesis Kit、Amalgaam有限会社制)，按照附带的使用说明书，通过下述引物导入突变。

由序列号：154所记载的DNA序列组成的引物：5’-GCTTCCAGGCGCACTACCGCGCTGAGCGCGGGGACTTGGTTGCCTTTTC-3’。此外，p62(PB1_nc)是在p62(PB1)彼此的相互作用发生的界面导入2个氨基酸的突变，解除了装配诱导能力的突变体。

如由图9所示的结果而明确的那样，与实施例2所示的结果同样地，在雷帕霉素添加前mTOR(FRB)-AG扩散存在(参照图中上部面板)，但在添加后的细胞中检测到荧光亮点(参照图中下部面板)。

另一方面，图10所示的结果而明确的那样，与实施例2所示的结果同样地，在作为荧光蛋白质使用mAG1的情况下，即使在雷帕霉素添加后的细胞中也检测不到荧光亮点，观察不到依赖于雷帕霉素的装配体的形成。

进而，如由图11所示的结果而明确的那样，在使用作为不能形成均多聚体的突变体的p62(PB1_nc)代替p62(PB1)的情况下，也即使在雷帕霉素添加后的细胞中也检测不到荧光亮点，观察不到依赖于雷帕霉素的装配体的形成。

因此明确了，如果不组合使用有多聚化能力的荧光蛋白质与装配诱导蛋白质，则不能通过蛋白质间相互作用而形成装配体，检测不到荧光亮点，证实了图1和2所记载的模型可以实施。

此外，所述本发明的蛋白质间相互作用的检测方法，在只要在蛋白质间相互作用发生时就自发地形成荧光亮点的方面，是与现有的蛋白质间相互作用的检测方法完全不同的方法。

(实施例4)

＜装配诱导蛋白质的筛选2＞

为了发现与p62(PB1)有同样的性质的装配诱导蛋白质，通过与实施例1所记载的方法同样的方法进行筛选。

作为这样的筛选的对象，除了PB1结构域之外，着眼于SAM结构域，使在来源于各蛋白质的PB1结构域或SAM结构域融合了mAG1的蛋白质、或在来源于各蛋白质的PB1结构域或SAM结构域融合了作为有多聚化能力的荧光蛋白质的AG的蛋白质在培养细胞内表达，通过以下所示的方法调查各个融合蛋白质的装配、以及由装配所产生的荧光亮点的产生的有无。所得的结果示于图12～15。

(质粒DNA的制备)

为了使来源于各蛋白质的PB1结构域或SAM结构域在荧光蛋白质的C末端侧介由柔性连接物融合而表达，作为用于融合mAG1的质粒使用phmAG1-MCLinker，作为用于融合AG的质粒使用phAG-MCLinker。

即，在phmAG1-MEK5(PB1)和phAG-MEK5(PB1)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码MEK5的PB1结构域(包含MEK5蛋白质的16～109氨基酸的区域、包含序列号：6所记载的氨基酸序列的区域、也称为“MEK5(PB1)”)的DNA(包含序列号：5所记载的碱基序列的DNA)；

MEK5(PB1)正向引物：

5’-CCGAATTCGGTGCTGGTAATTCGCATCAAGATCCCAAA-3’(序列号：71)

MEK5(PB1)反向引物：

5’-TTCTCGAGTTAGCAGGCTCTTGGAAATATCTGCAG-3’(序列号：72)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-MEK5(PB1)和phAG-MEK5(PB1)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和MEK5(PB1)的融合蛋白质(也称为“mAG1-MEK5(PB1)”)、以及包含AG蛋白质和MEK5(PB1)的融合蛋白质(也称为“AG-MEK5(PB1)”)。

另外，在phmAG1-Nbr1(PB1)和phAG-Nbr1(PB1)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码Nbr1的PB1结构域(包含Nbr1蛋白质的4～85氨基酸区域、包含序列号：8所记载的氨基酸序列的区域、也称为“Nbr1(PB1)”)的DNA(包含序列号：7所记载的碱基序列的DNA)。

Nbr1(PB1)正向引物：

5’-AAGAATTCGGCAGGTTACTCTAAATGTGACTTTTAAA-3’(序列号：73)

Nbr1(PB1)反向引物：

5’-TTCTCGAGTTACCCTTCGTGGACTTGCATCTGCAGTT-3’(序列号：74)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-Nbr1(PB1)和phAG-Nbr1(PB1)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和Nbr1(PB1)的融合蛋白质(也称为“mAG1-Nbr1(PB1)”)、以及包含AG蛋白质和Nbr1(PB1)的融合蛋白质(也称为“AG-Nbr1(PB1)”)。

进而，在phmAG1-PKCiota(PB1)和phAG-PKCiota(PB1)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码PKCiota的PB1结构域(包含PKCiota蛋白质的16～99氨基酸的区域、包含序列号：10所记载的氨基酸序列的区域、也称为“PKCiota(PB1)”)的DNA(包含序列号：9所记载的碱基序列的DNA)。

PKCiota(PB1)正向引物：

5’-AAGAATTCGCAGGTCCGGGTGAAAGCCTACTACCGCG-3’(序列号：75)

PKCiota(PB1)反向引物18：

5’-TTCTCGAGTTAACAAGGGAACACATGAATCAAGAGTTCAG-3’(序列号：76)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-PKCiota(PB1)和phAG-PKCiota(PB1)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和PKCiota(PB1)的融合蛋白质(也称为“mAG1-PKCiota(PB1)”)、以及包含AG蛋白质和PKCiota(PB1)的融合蛋白质(也称为“AG-PKCiota(PB1)”)。

另外，在phmAG1-TFG(PB1)和phAG-TFG(PB1)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码TFG的PB1结构域(包含TFG蛋白质的10～91氨基酸的区域、包含序列号：12所记载的氨基酸序列的区域、也称为“TFG(PB1)”)的DNA(包含序列号：11所记载的碱基序列的DNA)。

TFG(PB1)正向引物1：

5’-AACTGCAGCAAAGCTAATCATCAAAGCTCAACTTGGGGA-3’(序列号：77)

TFG(PB1)反向引物1：

5’-TTAAGCTTTTAATTAACAAATAATGTCAGTTTCAGTAT-3’(序列号：78)

然后，将所得的扩增产物用PstI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-TFG(PB1)和phAG-TFG(PB1)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和TFG(PB1)的融合蛋白质(也称为“mAG1-TFG(PB1)”)、以及包含AG蛋白质和TFG(PB1)的融合蛋白质(也称为“AG-TFG(PB1)”)。

进而，在phmAG1-TEL(SAM)和phAG-TEL(SAM)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码TEL的SAM结构域(包含TFG蛋白质的38～124氨基酸的区域、包含序列号：14所记载的氨基酸序列的区域、也称为“TEL(SAM)”)的DNA(包含序列号：13所记载的碱基序列的DNA)。

TEL(SAM)正向引物：

5’-AAAAGGATCCGCCACCATGCCTCGAGCGCTCAGGATGGAGGAA-3’(序列号：79)

TEL(SAM)反向引物：

5’-AAAAAAGCTTTTACCTCTGCTTCAGAATATGCTGAAGGAGTT-3’(序列号：80)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而制作phmAG1-TEL(SAM)和phAG-TEL(SAM)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和TEL(SAM)的融合蛋白质(也称为“mAG1-TEL(SAM)”)、以及包含AG蛋白质和TEL(SAM)的融合蛋白质(也称为“AG-TEL(SAM)”)。

另外，在phmAG1-EphB2(SAM)和phAG-EphB2(SAM)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码EphB2的SAM结构域(包含EphB2蛋白质的905～981氨基酸的区域、包含序列号：16所记载的氨基酸序列的区域、也称为“EphB2(SAM)”)的DNA(包含序列号：15所记载的碱基序列的DNA)。

EphB2(SAM)正向引物：

5’-AAAAGGATCCGCCACCATGCTGGACCGCACGATCCCCGA-3’(序列号：81)

EphB2(SAM)反向引物：

5’-AAAAAAGCTTTTAAATCTGGTTCATCTGCGCCCG-3’(序列号：82)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-EphB2(SAM)和phAG-EphB2(SAM)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和EphB2(SAM)的融合蛋白质(也称为“mAG1-EphB2(SAM)”)、以及包含AG蛋白质和EphB2(SAM)的融合蛋白质(也称为“AG-EphB2(SAM)”)。

进而，在phmAG1-DGKdelta(SAM)和phAG-DGKdelta(SAM)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码DGKdelta的SAM结构域(包含DGKdelta蛋白质的1097～1164氨基酸的区域、包含序列号：18所记载的氨基酸序列的区域、也称为“DGKdelta(SAM)”)的DNA(包含序列号：17所记载的碱基序列的DNA)。

DGKdelta(SAM)正向引物：

5’-AAAAGGTACCGCCACCATGCCGGTTCACCTCTGGGGGACA-3’(序列号：83)

DGKdelta(SAM)反向引物：

5’-AAAAAAGCTTTTAGCTGCGGCTCAGCTCCTTGAT-3’(序列号：84)

然后，将所得的扩增产物用KpnI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-DGKdelta(SAM)和phAG-DGKdelta(SAM)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和DGKdelta(SAM)的融合蛋白质(也称为“mAG1-DGKdelta(SAM)”)、以及包含AG蛋白质和DGKdelta(SAM)的融合蛋白质(也称为“AG-DGKdelta(SAM)”)。

另外，在phmAG1-Tankyrase(SAM)和phAG-Tankyrase(SAM)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码端锚聚合酶的SAM结构域(包含端锚聚合酶蛋白质的952～1078氨基酸的区域、包含序列号：20所记载的氨基酸序列的区域、也称为“Tankyrase(SAM)”)的DNA(包含序列号：19所记载的碱基序列的DNA)。

Tankyrase(SAM)正向引物：

5’-AAAAGGATCCGCCACCATGCTGATAGATGCCATGCCCCCAGA-3’(序列号：85)

Tankyrase(SAM)反向引物：

5’-AAAAAAGCTTTTAAATTCGAATGACATTGTATCTGTTGAAGA-3’(序列号：86)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmAG1-MCLinker和phAG-MCLinker中，从而分别制作phmAG1-Tankyrase(SAM)和phAG-Tankyrase(SAM)。此外，这些质粒DNA分别编码包含mAG1蛋白质和Tankyrase(SAM)的融合蛋白质(也称为“mAG1-Tankyrase(SAM)”)、以及包含AG蛋白质和Tankyrase(SAM)的融合蛋白质(也称为“AG-Tankyrase(SAM)”)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

质粒DNA通过与实施例1所记载的方法同样的方法分别导入HeLaS3细胞。另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例1所记载的方法同样的方法来进行。

如由图13、14和15所示的结果而明确的那样，PKCiota(PB1)、TFG(PB1)、TEL(SAM)、DGKdelta(SAM)和Tankyrase(SAM)在融合了mAG1的情况下扩散，在融合了AG的情况下形成荧光亮点(装配体)。此外，在表达AG-PKCiota(PB1)的细胞中，形成荧光亮点的细胞与不形成荧光亮点的细胞混合存在，但对于表达包含AG蛋白质的其他融合蛋白质的细胞，在全部细胞中检测到荧光亮点。

另一方面，如由图12和15所示的结果而明确的那样，MEK5(PB1)、Nbr1(PB1)和EphB2(SAM)无论在融合了mAG1的情况下还是融合了AG的情况下，都不能观察到荧光亮点的形成。

因此明确了，TFG(PB1)、TEL(SAM)、DGKdelta(SAM)和Tankyrase(SAM)可以作为本发明的装配诱导蛋白质利用。

(实施例5)

＜蛋白质间相互作用的检测3＞

为了证实实施例4中选择的装配诱导蛋白质可以适合在本发明的蛋白质间相互作用的检测方法中使用，通过以下所示的与实施例2所记载的方法同样的方法进行试验。所得的结果示于图16。

(质粒DNA的制备)

在pFKBP12-TFG(PB1)的制作中，首先从phAG-TFG(PB1)，使用下述引物组，通过PCR扩增TFG(PB1)基因。

TFG(PB1)正向引物2：

5’-AAACCGGTAAGCTAATCATCAAAGCTCAACTT-3’(序列号：87)

TFG(PB1)反向引物2：

5’-TTTCTAGATTAATTAACAAATAATGTCAGTTTCAGTAT-3’(序列号：88)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了p62(PB1)区域的pFKBP12-p62(PB1)中，从而制作pFKBP12-TFG(PB1)。此外，pFKBP12-TFG(PB1)编码包含FKBP12蛋白质和TFG(PB1)的融合蛋白质(也称为“FKBP12-TFG(PB1)”)。

另外，在pFKBP12-TEL(SAM)的制作中，首先从phAG-TEL(SAM)，使用下述引物组，通过PCR扩增TEL(SAM)基因。

TEL(SAM)正向引物2：

5’-AAAAACCGGTCCTCGAGCGCTCAGGATGGAGGAA-3’(序列号：89)

TEL(SAM)反向引物2：

5’-AAAATCTAGATTACCTCTGCTTCAGAATATGCTGAAGGAGTT-3’(序列号：90)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了p62(PB1)区域的pFKBP12-p62(PB1)中，从而制作pFKBP12-TEL(SAM)。此外，pFKBP12-TEL(SAM)编码包含FKBP12蛋白质和TEL(SAM)的融合蛋白质(也称为“FKBP12-TEL(SAM)”)。

进而，在pFKBP12-DGKdelta(SAM)的制作中，首先从phAG-DGKdelta(SAM)，使用下述引物组，通过PCR扩增DGKdelta(SAM)基因。

DGKdelta(SAM)正向引物2：

5’-AAAAACCGGTCCGGTTCACCTCTGGGGGACAGA-3’(序列号：91)

DGKdelta(SAM)反向引物2：

5’-AAAATCTAGATTAGCTGCGGCTCAGCTCCTTGAT-3’(序列号：92)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了p62(PB1)区域的pFKBP12-p62(PB1)中，从而制作pFKBP12-DGKdelta(SAM)。此外，pFKBP12-DGKdelta(SAM)编码包含FKBP12蛋白质和DGKdelta(SAM)的融合蛋白质(也称为“FKBP12-DGKd(PB1)”)。

另外，在pFKBP12-Tankyrase(SAM)的制作中，首先从phAG-Tankyrase(SAM)，使用下述引物组，通过PCR扩增Tankyrase(SAM)基因。

Tankyrase(SAM)正向引物2：

5’-AAAAACCGGTCTGATAGATGCCATGCCCCCAGA-3’(序列号：93)

Tankyrase(SAM)反向引物2：

5’-AAAATCTAGATTAAATTCGAATGACATTGTATCTGTTGAAGA-3’(序列号：94)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了p62(PB1)区域的pFKBP12-p62(PB1)中，从而制作pFKBP12-Tankyrase(SAM)。此外，pFKBP12-Tankyrase(SAM)编码包含FKBP12蛋白质和Tankyrase(SAM)的融合蛋白质(也称为“FKBP12-Tankyrase(SAM)”)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

pmTOR(FRB domain)-hAG与pFKBP12-TFG(PB1)的组合

pmTOR(FRB domain)-hAG与pFKBP12-TEL(SAM)的组合

pmTOR(FRB domain)-hAG与pFKBP12-DGKdelta(SAM)的组合

pmTOR(FRB domain)-hAG与pFKBP12-Tankyrase(SAM)的组合。

另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例1所记载的方法同样的方法来进行。然后，确认在添加100nM雷帕霉素(メルク社制)前在各培养细胞中检测不到荧光亮点，在其添加300秒后拍摄荧光图像。

如由图16所示的结果可以明确的那样，在表达任一融合蛋白质的情况下，在雷帕霉素添加前mTOR(FRB domain)-AG扩散存在(未图示)，但在添加后的任一细胞中都检测到荧光亮点。即，明确了通过依赖于雷帕霉素的mTOR(FRB domain)与FKBP12蛋白质的相互作用，mTOR(FRBdomain)-AG与FKBP12-TEL(SAM)等自发地装配，形成荧光亮点。

因此明确了，不仅使用p62(PB1)，使用TEL(SAM)等来源于其他蛋白质的其他种类的结构域作为装配诱导蛋白质，也可以检测蛋白质间相互作用。另外，通过所述结果证实了，作为本发明的装配诱导蛋白质的筛选方法，图3和4所记载的模型可以实施。

(实施例6)

＜蛋白质间相互作用的检测3＞

通过以下所示的方法，来验证在本发明的蛋白质相互作用的检测方法中，作为有多聚化能力的荧光蛋白质，是否可以应用除了AG蛋白质以外的荧光蛋白质。所得的结果示于图17。

此外，验证的荧光蛋白质是Kusabira Orange1(KO1)、二聚体Keima-Red(dKeima)和Kikume Green-Red(KikGR)，已知分别均二聚体化、均二聚体化和均四聚体化。

(质粒DNA的制备)

在pmTOR(FRB domain)-hKO1的制作中，首先从phKO1-MN1(Amalgaam有限会社制)，使用下述引物组，通过PCR扩增hKO1基因。

hKO1正向引物：

5’-AAAAACCGGTATGGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG-3’(序列号：95)

hKO1反向引物：

5’-AAAATCTAGATTAGCAGTGGGCCACGGCGTCCTCC-3’(序列号：96)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了hAG区域的pmTOR(FRB domain)-hAG中，从而制作pmTOR(FRB domain)-hKO1。

另外，在pmTOR(FRB domain)-hdKeima-Red的制作中，首先通过将phdKeima-Red-MNLinker(Amalgaam有限会社制)用AgeI和XbaI切断来制备hdKeima基因。然后，将所得的hdKeima基因插入到用相同的限制性酶处理而切出了hAG区域的pmTOR(FRB domain)-hAG中，从而制作pmTOR(FRB domain)-hdKeima-Red。

进而，在pmTOR(FRB domain)-hKikGR1的制作中，首先通过将phKikGR1-MNLinker(Amalgaam有限会社制)用AgeI和XbaI切断来制备hKikGR1基因。然后，将所得的hKikGR1基因插入到用相同的限制性酶处理而切出了hAG区域的pmTOR(FRB domain)-hAG中，从而制作pmTOR(FRB domain)-phKikGR1。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

pmTOR(FRB domain)-hKO1与pp62(PB1)-FKBP12的组合

pmTOR(FRB domain)-hdKeima-Red与pp62(PB1)-FKBP12的组合

pmTOR(FRB domain)-hKikGR1与pp62(PB1)-FKBP12的组合

pmTOR(FRB domain)-hAG与pp62(PB1)-FKBP12的组合。

另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例1所记载的方法同样的方法来进行。此外，KO1的观察使用激发滤光器(BP520-540HQ、Olympus社)、双色镜(DM545HQ、Olympus社制)、吸收滤光器(BA555-600HQ、Olympus社制)。dKeima的观察使用激发滤光器(440AF21、OMEGAOPTICAL社制)、双色镜(455DRLP、OMEGA OPTICAL社制)、吸收滤光器(610ALP、OMEGA OPTICAL社制)。然后，在100nM雷帕霉素(メルク社制)添加前和添加300秒后拍摄荧光图像。

如由图17所示的结果而明确的那样，与使用AG蛋白质的情况相同，在所试验的全部荧光蛋白质中，在雷帕霉素添加前，融合了各荧光蛋白质的mTOR(FRB)扩散存在，但在雷帕霉素添加后，形成荧光亮点(装配体)。因此证实了，在本发明中，不仅使用AG蛋白质，即使使用KO1蛋白质等其他有多聚化能力的荧光蛋白质，也可以检测蛋白质间相互作用。

(实施例7)

＜有多聚化能力的荧光蛋白质的筛选1＞

通过以下所示的方法来验证在本发明的蛋白质相互作用的检测方法中，作为有多聚化能力的荧光蛋白质，是否可以应用除了AG、KO1、dKeima和KikGR以外的荧光蛋白质。即，调查在使单体Kusabira-Orange2(monomeric Kusabira-Orange2、mKO2)与作为装配诱导蛋白质的p62(PB1)融合，在细胞内表达的情况下，是否形成如图3所示的装配体(荧光亮点)。所得的结果示于图18。

首先，与实施例1所记载的“phmAG1-p62(PB1)和phAG-p62(PB1)”同样地，通过PCR扩增编码p62(PB1)的DNA，将所得的扩增产物用EcoRI和NotI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phmKO2-MCLinker(Amalgaam有限会社制)中，从而制作phmKO2-p62(PB1)。然后，将phmKO2-p62(PB1)通过与实施例1所记载的方法同样的方法导入HeLaS3细胞。另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例6所记载的方法同样的方法来进行。所得的结果示于图18。

如由图18所示的结果而明确的那样，由phmKO2-p62(PB1)所编码的蛋白质mKO2-p62(PB1)彼此装配，形成荧光亮点。因此明确了，不仅前述的AG、KO1、dKeima和KikGR这样的能够在细胞内形成均多聚体的荧光蛋白质，连一般被认为是单体荧光蛋白质的mKO2也可以在本发明的方法中作为有多聚化能力的荧光蛋白质利用。

(实施例8)

＜有多聚化能力的荧光蛋白质的筛选2＞

除了所述AG、KO1、dKeima和KikGR以外，对于作为能够在细胞内形成均多聚体的荧光蛋白质已知的MiCy1、KCy1、dAG(AB)和dAG(AC)(能均二聚体化的荧光蛋白质)以及TGuv、Momiji、COR3.01、COR5和DsRed2(能均四聚体化的荧光蛋白质)，也通过下述方法确认了能够在本发明的蛋白质相互作用的检测方法中利用。

另外，为了发现虽然是mKO2这样的一般被认为是单体荧光蛋白质、但能够在本发明的方法中利用荧光蛋白质，通过下述方法进行筛选。

(蛋白质间相互作用的检测方法)

通过与实施例5和6所记载的方法同样的方法，使p62(PB1)-FKBP12、FKBP12-DGKd(SAM)、FKBP12-TEL(SAM)或FKBP12-Tankyrase(SAM)、与融合了表1所记载的各荧光蛋白质的mTOR(FRB)，在HeLaS3细胞内表达，评价雷帕霉素添加后的荧光亮点(装配体)的形成的程度。此外，编码包含mTOR(FRB)和各荧光蛋白质的融合蛋白质的质粒DNA通过与实施例2所记载的方法同样的方法适宜制备。另外，对于FKBP12-Tankyrase(SAM)，关于mKO2、mKeima、mMiCy1、mKO1、MiCy1和TGuv的组合，在293T细胞中进行基因导入而试验。即，将293T细胞用含有10％FBS(EQUITECH社制)的DMEM高葡萄糖(DMEM Highglucose、SIGMA ALDRICH社制)培养。另外，在导入所述质粒DNA的6小时之前，将293T细胞接种于8孔室(nunc社制)。然后，在基因导入时，在30μl的OptiMEM(Life Technologies社制)中稀释编码FKBP12-Tankyrase(SAM)的质粒DNA 200ng、与编码包含所述荧光蛋白质和mTOR(FRB)的融合蛋白质的质粒DNA各200ng，添加TurboFect转染试剂(TurboFect Transfection Reagent、Thermo Scientific社制)1.2μl，进行搅拌。接着，进一步混合培养液300μl，然后添加到293T细胞中，在48小时后进行观察。所得的结果示于表1。表1中，将在5成以上的HeLaS3细胞中观察到荧光亮点的组合用“+++”表示，将在5成以下的HeLaS3细胞中观察到荧光亮点的组合用“++”表示，将在与HeLaS3细胞相比蛋白质表达量高的293T细胞中观察到荧光亮点的组合用“+”表示。

表1

如由表1所示的结果而明确的那样，确认了能够在细胞内形成均多聚体的荧光蛋白质均能够在本发明的方法中利用。另外，由TEL(SAM)和Tankyrase(SAM)的结果来看，有荧光蛋白质的多聚化能力越高，越容易由蛋白质间相互作用而形成荧光亮点(装配体)的倾向。进而，如表1所示，明确了除了mKO2以外，一般被认为是单体荧光蛋白质的mKeima、mMiCy1、mKO1和mKikGR1也可以在本发明的方法中利用。

(实施例9)

＜蛋白质间相互作用的检测5＞

对于通过实施例6～8而确认了可以在本发明的方法中利用的有多聚化能力的荧光蛋白质，通过以下所示的方法确认了与作为装配诱导蛋白质的TFG(PB1)组合使用，也可以检测蛋白质间相互作用。所得的结果示于表2。

(蛋白质间相互作用的检测方法)

通过与实施例5和6所记载的方法同样的方法，使TFG(PB1)、与融合了mKikGR1、dAG(AC)、Momiji、KikGR、AG、COR3.01、COR5或DsRed2的mTOR(FRB)在HeLaS3细胞内表达，评价雷帕霉素添加后的荧光亮点(装配体)的形成的程度。另外，通过与实施例8所记载的方法同样的方法，使TFG(PB1)、与融合了KO1或dAG(AB)的mTOR(FRB)在293T细胞内表达，评价雷帕霉素添加后的荧光亮点(装配体)的形成的程度。所得的结果示于表2。表2中，将在5成以下的HeLaS3细胞中观察到荧光亮点的组合用“++”表示，将在与HeLaS3细胞相比蛋白质表达量高的293T细胞中观察到荧光亮点的组合用“+”表示。

表2

如由表2所示的结果而明确的那样，对于有多聚化能力的荧光蛋白质，确认了组合使用除了实施例8所示的蛋白质以外的装配诱导蛋白质，也可以检测蛋白质间相互作用。

(实施例10)

＜蛋白质间相互作用的检测6＞

本发明的荧光亮点(装配体)如前所述，起因于蛋白质间相互作用。因此，认定荧光亮点的荧光强度反映蛋白质间相互作用的强弱。另外，在蛋白质间相互作用的检测方法中，可以定量化地比较该相互作用的强弱，这对于蛋白质间相互作用的抑制物质(抑制剂)的评价、调节蛋白质间相互作用的因子的评价是有用的。

因此，使诱导蛋白质间相互作用的化合物的浓度变化，对于荧光亮点(装配体)的荧光强度是否依赖于化合物的浓度而变化，通过以下所示的方法进行试验。

(向细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察和分析)

将pmTOR(FRB domain)-hAG与pFKBP12-p62(PB1)等量混合，通过与实施例1所记载的方法同样的方法导入HeLaS3细胞。导入后24小时后，回收细胞，以20000细胞数/孔接种于96孔底透微孔板(Nunc社制)中。然后，在播种24小时后，在板中添加将Hoechst33342(Dojindo社制)以观察用缓冲液稀释至5.6μg/ml而得的溶液，进一步培养30分钟。然后，用D-PBS(-)(和光纯药工业社制)将板洗涤2次。接着，置换成将雷帕霉素稀释至各浓度的观察用缓冲液，15分钟后，用4％低聚甲醛·磷酸缓冲液(4％Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution、和光纯药工业社制)固定。此外，雷帕霉素的浓度分别以0.1nM、0.2nM、0.5nM、1.4nM、4.1nM、12.3nM、37.0nM、111.1nM、333.3nM、1000nM使用。然后，将制作的样品使用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare社制)进行观察。所得的结果的一部分示于图19。

另外，分析多个视野中的荧光图像，计算拍摄以各浓度添加了雷帕霉素的孔而得的图像的每1个细胞的荧光亮点(装配体)的总亮度(总荧光强度)，分析与雷帕霉素的浓度的相关。所得的结果的一部分示于图20。此外，图20中，X轴表示各孔中添加的雷帕霉素的浓度，Y轴表示每一个细胞的荧光亮点(装配体)的总亮度(总荧光强度)，圆点表示实测值。另外，附着于圆点的拟合曲线(曲线)表示使用Igor(R)(WaveMetrics，Inc制)，作为[DotIntensity/Cells]＝y、[Canc.(nM)]＝x，拟合为式：y＝base+(max-base)/[1+(xhalf/x)＾rate]而得的函数。(base＝0.0028731、max＝0.1823、rate＝1.4516、xhalf＝46.99)。

如由图19和20所示的结果而明确的那样，对表达mTOR(FRBdomain)-AG和FKBP12-p62(PB1)的细胞，添加诱导mTOR(FRB domain)与FKBP12蛋白质的相互作用的化合物雷帕霉素，结果明确了荧光亮点的荧光强度依赖于添加的雷帕霉素的浓度而增加，还显示mTOR(FRBdomain)-AG与FKBP12-p62(PB1)的装配体依赖于该浓度而形成。

(实施例11)

＜蛋白质间相互作用的检测7＞

通过以下所示的方法来评价本发明的方法是否可以在药剂针对蛋白质间相互作用的50％效应浓度(EC50)和50％抑制浓度(IC50)的确定中利用。

(质粒DNA的制备)

使用实施例2所记载的pmTOR(FRB domain)-hAG和pFucci-S/G2/MGreen-Hyg(Amalgaam有限会社制)，按照既定方法制作将药剂耐性基因替换为了潮霉素B耐性基因的pmTOR(FRB domain)-hAG_Hyg。

(稳定表达细胞株的制作)

通过与实施例1所记载的方法同样的方法，将所述pmTOR(FRBdomain)-hAG_Hyg、与实施例2所记载的pp62(PB1)-FKBP12导入HeLaS3细胞株，进行培养。

另外，在将所述质粒DNA导入HeLaS3细胞株24小时后，交换为含有600μg/mL G418(和光纯药制药社)和150μg/mL潮霉素(nacalai tesque社制)的培养基。然后，将用培养基培养一周培养而残存的细胞通过集落提取法而克隆化。

(基因导入细胞的观察和分析)

将所述克隆化的细胞株接种于96孔板。然后，在第二天用PBS清洗2次后，在接种于各孔的细胞株中添加包含Hoechst33342(Dojindo社制)的观察用缓冲液，在37℃孵育15分钟，从而进行核染色。

进而，将这些细胞株用观察用缓冲液清洗2次后，将任意的浓度的雷帕霉素、或包含雷帕霉素和FK506的观察用缓冲液添加到各孔中，孵育20分钟。

此外，雷帕霉素的添加浓度为0.39nM、0.78nM、1.56nM、3.13nM、6.25nM、12.50nM、25.00nM、50.00nM、100.00nM、200.00nM、400.00nM或800.00nM。另外，FK506作为竞争性地抑制FKBP12与雷帕霉素的相互作用的物质而已知，在本实施例中，用包含20nM雷帕霉素的缓冲液稀释为0.008μM、0.016μM、0.031μM、0.063μM、0.125μM、0.250μM、0.500μM、1.000μM、2.000μM、4.000μM、8.000μM或16.000μM，在各孔中添加。

添加各种药剂并孵育后，在各孔中添加4％低聚甲醛·磷酸缓冲液(4％Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution、和光纯药工业社制)，在室温孵育15分钟，从而固定这些细胞株。然后，将这些细胞株用观察用缓冲液洗涤3次后，对于各孔用荧光显微镜获得3个视野的图像。接着，将各个荧光图像使用iCY(参照de Chaumont F等、Nature Methods、6月28日、9号、7卷、690～696页)进行分析，计算每1个细胞的荧光亮点(装配体)的总亮度(总荧光强度)，分析与各种药剂的添加浓度的相关。仅添加了雷帕霉素的结果示于图21，添加了雷帕霉素和FK506的结果示于图22。

此外，图21和22中，X轴表示在细胞株中添加的药剂浓度，Y轴表示每一个细胞的荧光亮点(装配体)的总亮度(总荧光强度)，圆点表示实测值。另外，附着于圆点的拟合曲线(曲线)表示使用Igor(R)(WaveMetrics，Inc制)分析而得的结果。

如由图21所示的结果而明确的那样，对稳定表达mTOR(FRBdomain)-AG与p62(PB1)-FKBP12的细胞，添加诱导mTOR(FRB domain)与FKBP12蛋白质的相互作用的化合物雷帕霉素，结果明确了，荧光亮点的荧光强度依赖于添加的雷帕霉素的浓度而增加，显示mTOR(FRBdomain)-AG与p62(PB1)-FKBP12的装配体依赖于该浓度而形成。进而，基于图21所示的拟合曲线，通过f(x)＝max+(min-max)/(1+(x/EC50)＾hill)，可以算出雷帕霉素针对mTOR(FRB domain)与FKBP12的蛋白质间相互作用的EC50为3.36nM。

另一方面，如由图22所示的结果而明确的那样，在雷帕霉素存在下添加FK506，结果明确了，荧光亮点的荧光强度依赖于添加的FK506的浓度而减少，显示了依赖于该浓度而抑制mTOR(FRB domain)-AG与p62(PB1)-FKBP12的装配体的形成。进而，基于图22所示的拟合曲线，通过f(x)＝min+(max-min)/(1+(x/IC50)＾hill)，可以选出FK506针对雷帕霉素与FKBP12的相互作用、进而针对mTOR(FRB domain)与FKBP12的蛋白质间相互作用的IC50为0.68μM。

(实施例12)

＜蛋白质间相互作用的检测8＞

为了与实施例10和11同样的目的，对于本发明的方法中，是否通过对蛋白质间相互作用为特异性的抑制剂而构成装配体(荧光亮点)的融合蛋白质分散，另外改变该抑制剂的浓度，荧光亮点的荧光强度是否依赖于该抑制剂的浓度而变化，通过以下所示的方法进行试验。

此外，所述试验中作为检测对象的是p53蛋白质与MDM2蛋白质的相互作用，另外在实施例12中使用作为该相互作用的抑制剂已知的Nutlin-3(参照Vassilev LT等、Science、2004年2月6日、303号、5659卷、844～848页)。

(质粒DNA的制备)

在pp62(PB1)-p53的制作中，首先从U2OS细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码p53的一部分(包含p53蛋白质的1～70氨基酸的区域、包含序列号：26所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：25所记载的碱基序列的DNA)。

p53正向引物：

5’-AAGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCG-3’(序列号：97)

p53反向引物48：

5’-TTGCGGCCGCTTAAGCAGCCTCTGGCATTCTGGGAGCTTCATC-3’(序列号：98)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和NotI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的pp62(PB1)-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-p53。

另外，在phAG-MDM2的制作中，首先从U2OS细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码MDM2的一部分(包含MDM2蛋白质的7～125氨基酸的区域、包含序列号：28所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：27所记载的碱基序列的DNA)。

MDM2正向引物：

5’-AAGGATCCATGTGCAATACCAACATGTCTGTACCTACTGATGGTGC-3’(序列号：99)

MDM2反向引物：

5’-TTCTCGAGTTAACCTGAGTCCGATGATTCCTGCTGATTG-3’(序列号：100)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MCLinker中，从而制作phAG-MDM2。

(向细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察和分析)

将pp62(PB1)-p53与phAG-MDM2等量混合，通过与实施例1所记载的方法同样的方法导入HeLaS3细胞。导入24小时后，除去培养液，加入含0.19μM Nutlin-3的观察用缓冲液1.5ml，15分钟后拍摄荧光图像。然后，除去观察用缓冲液，加入含0.77μM Nutlin-3的观察用缓冲液1.5ml，15分钟后再次拍摄荧光图像。对于4.8μM、12μM Nutlin-3也实施同样的工序。所得的结果示于图23。另外，计算拍摄以各浓度添加了Nutlin-3的细胞而得的荧光图像中的荧光亮点(装配体)的总亮度，将与Nutlin-3的浓度的相关作图。所得的结果示于图24。此外，图24中，X轴表示在细胞中添加的Nutlin-3的浓度，Y轴表示每一个荧光图像(一个视野)的荧光亮点的总亮度(总荧光强度)。

如由图23所示的结果而明确的那样，如果使p62(PB1)-p53与AG-MDM2在细胞内表达，则检测到荧光亮点。然后，在同一视野中，使针对p53与MDM2的相互作用的抑制剂(Nutlin-3)的添加浓度阶段性地上升，结果观察到荧光亮点(装配体)缓缓消失，确认了构成该装配体的融合蛋白质分散开。另外，如由图24所示的结果而明确的那样，视野内的荧光亮点的荧光亮度依赖于抑制剂的浓度而减少。

(实施例13)

＜蛋白质间相互作用的检测9＞

与实施例11同样地，通过以下所示的方法来评价本发明的方法能否在对蛋白质间相互作用为特异性的抑制剂的IC50的确定中利用。

(质粒DNA的制备)

首先，使用实施例12所记载的phAG-MDM2和pFucci-S/G2/MGreen-Hyg(Amalgaam有限会社制)，按照既定方法制作将药剂耐性基因从G418耐性基因替换为潮霉素B耐性基因而得的phAG-MDM2_Hyg。

(稳定表达细胞株的制作)

接下来，将所述phAG-MDM2_Hyg、与实施例12所记载的pp62(PB1)-p53导入CHO-K1细胞株。此外，将CHO-K1细胞用含有10％FBS(EQUITECH社制)的NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(SIGMAALDRICH社制)进行培养。

然后，在将所述质粒DNA导入CHO-K1细胞株24小时后，交换为含有100μg/ml G418(和光纯药制药社)和200μg/ml潮霉素(nacalai tesque社制)的培养基。然后，将用该培养基培养一周培养而残存细胞，通过临界稀释法进行单克隆化。

(基因导入细胞的观察和分析)

将所述单克隆化而得的细胞株通过与实施例11所记载的方法同样的方法进行核染色后，在各孔中添加包含任意的浓度的Nutlin-3(CALBIOCHEM社制)的观察用缓冲液，孵育20分钟。此外，Nutlin-3调制成终浓度0.2μM、0.3μM、0.6μM、0.9μM、1.6μM、2.6μM、4.3μM、7.2μM、12.0μM、20.0μM而添加。

接着，通过与实施例11所记载的方法同样的方法固定细胞株，对于各孔用荧光显微镜获得图像，使用iCY分析各个荧光图像，计算每1个细胞的荧光亮点的总亮度，分析与Nutlin-3的添加浓度的相关。所得的结果示于图25。此外，图25中，X轴表示在细胞株中添加的药剂浓度，Y轴表示每一个细胞的荧光亮点(装配体)的总亮度(总荧光强度)，圆点表示实测值。另外，附着于该圆点的拟合曲线(曲线)表示使用Igor(R)分析而得的结果。

虽未图示，但与实施例12同样地，在p62(PB1)-p53和AG-MDM2稳定表达的CHO-K1细胞中，也观察到由p53与MDM2的蛋白质间相互作用引起的荧光亮点(装配体)。另外，如图25所示，这些装配体的荧光亮度依赖于作为抑制剂的Nutlin-3的浓度而减少。进而，基于图25所示的拟合曲线，通过f(x)＝min+(max-min)/(1+(x/IC50)＾hill)，可以算出Nutlin-3针对p53与MDM2的蛋白质间相互作用的IC50为8.9μM。

以上，由实施例10～13所示的结果，证实了本发明的荧光亮点的荧光亮度反映蛋白质间相互作用的强弱，可以将蛋白质间相互作用定量化。进而，还明确了装配体的形成是可逆的，显示了所述定量化无论使用固定细胞(参照图20)，还是使用利用活细胞中的活体成像的方法(参照图24)均可实施。另外，通过本发明，如实施例11和13所示，可以检测药剂针对蛋白质间相互作用的依赖于浓度的促进反应和抑制反应，进而明确了，可以算出药剂的EC50和IC50。因此显示，本发明的蛋白质间相互作用的检测方法可以在调节蛋白质间相互作用的物质的评价和筛选中应用。

(实施例14)

＜蛋白质间相互作用的检测10＞

已知p50与p65形成异二聚体，构成NFκB。进而已知，NFκB作为承担炎症性细胞因子的表达调节的转录因子而在核内发挥功能，但通过与IκBα相互作用而被保持在细胞质中，其转录功能被抑制(参照MarcD.Jacobs等、Cell、1998年12月11日、95卷、749～758页)。因此，在使p50与p65过表达的情况下，不符合与内源性的IκBα的化学计量学平衡，所述异二聚体主要定位于核内。另一方面，通过使IκBα过表达，还包含IκBα的异三聚体被保持在细胞质中。

因此，在本实施例中，对于能否通过本发明的方法来检测相应于IκBα的有无的包含p50和p65的复合体在细胞内的定位的变化，通过以下所示的方法进行试验。

首先，通过与实施例2所记载的方法同样的方法分别制备pp62(PB1)-p50和phAG-p65。pp62(PB1)-p50和phAG-p65分别插入有编码包含序列号：156和158所记载的氨基酸序列的区域的DNA(分别为序列号：155和157)。

另外，pIκBα使用编码Genbank登录号：NP_065390.1所特定的氨基酸序列的DNA序列，通过与实施例1所记载的方法同样的方法来制作。

然后，将HeLaS3细胞接种于8孔室(nunc社制)中的4孔，第二天，将所述质粒DNA导入这些细胞。基因导入使用在OptiMEM(LifeTechnologies社制)中分别添加pp62(PB1)-p50和phAG-p65各100ng、进一步使pIκBα的量而添加而得的物质。此外，pIκBα的添加量为0ng(无添加)或100ng，进一步为了统一质粒DNA的总添加量，添加pmKeima-Red-S1(Amalgaam有限会社制)300ng或0ng。接着，在这些OptiMEM中分别添加ポリフェクト(注册商标)转染试剂各1.5μl，进行搅拌。进一步与培养液200μl混合后，添加到HeLaS3细胞中。然后，进行该基因导入22小时后，通过4％低聚甲醛·磷酸缓冲液(4％Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution、和光纯药工业社制)在室温进行细胞固定15分钟，用0.2％TritonX-100/PBS将细胞膜进行可溶化5分钟，然后使用抗IκBα抗体(Cell Signaling Technology社制)进行免疫染色。进一步将核使用Hoechst33342进行染色。然后，通过与实施例1所记载的方法同样的方法观察免疫染色后的细胞。所得的结果示于图26。此外，图中“叠加”表示将获得了来源于AG的荧光的图像(图中左侧的2个面板)、显示利用抗IκBα抗体的免疫染色的结果的图像(图中正中的2个面板)与显示利用Hoechst33342的核染色的结果的图像叠加而得的结果。

如由图26所示的结果而明确的那样，在不导入IκBα的细胞中，确认了包含p50和p65的异二聚体在核内形成。另一方面，导入了IκBα时，在与获得了来源于AG的荧光的图像(参照图中，左下的面板)中检测的荧光亮点相同的场所检测到来源于IκBα的信号(参照图中，正中下的面板)，确认了包含p50和p65的复合体中含有IκBα。进而，在IκBα存在下，包含p50和p65的复合体的定位从所述核内变化到细胞质内，也可以通过本发明的方法来确认。

(实施例15)

＜蛋白质间相互作用的检测11＞

在本实施例中，对于能否经由在实施例14中也进行了检测的包含p50和p65的复合体，通过本发明的方法定量地检测相应于IκBα的量的平衡的该复合体在细胞内的定位的变化，通过以下所示的方法进行试验。

首先，将HeLaS3细胞接种于8孔室(nunc社制)中的4孔中。然后，第二天，将实施例13所记载的pp62(PB1)-p50、phAG-p65、pIκBα导入这些细胞。基因导入使用在OptiMEM(Life Technologies社制)中分别添加pp62(PB1)-p50和phAG-p65各100ng，进一步使pIκBα的量变化而添加而得的物质。此外，pIκBα的添加量为(0)无添加、(1)33ng、(2)100ng或(3)300ng，进一步为了统一质粒DNA的总添加量，将pmKeima-Red-S1(Amalgaam有限会社制)在(0)中添加300ng、在(1)中添加267ng、在(2)中添加200ng、在(3)中添加0ng。接着，在这些OptiMEM中分别添加ポリフェクト(注册商标)转染试剂各1.5μl，进行搅拌。进一步与培养液200μl混合后，添加于HeLaS3细胞，22小时后，与实施例1所记载的方法同样的方法进行观察。

将在所述(0)～(3)的条件下导入了质粒DNA的细胞分别拍摄150个以上，按照荧光亮点的定位分类为(A)～(C)的3个组。即，(A)仅在细胞质中检测到荧光亮点的细胞、(B)在细胞质和核内检测到荧光亮点的细胞、(C)仅在核内检测到荧光亮点的细胞。然后，算出各组所含的细胞数的比例，进行作图。所得的结果示于图27。

如由图27所示的结果而明确的那样，依赖于IκBα的量而在细胞质中检测到的荧光亮点的比例增加。这样通过本发明，可以提供按照荧光亮点的定位将细胞分组，比较各组所含的细胞数的方法。进而，如实施例14所示，通过本发明的方法，还可以介由作为直接检测对象的第1蛋白质和第2蛋白质(例如，p50和p65)的相互作用的定位，将第3的蛋白质(例如，IκBα)对该相互作用的影响、和/或第3的蛋白质的表达量也进行定量化。

(实施例16)

＜蛋白质间相互作用的检测12＞

已知在细胞的核内，p21识别包含CDK4和CyclinD1的复合体，进行相互作用(参照LaBaer J等、Genes Dev.、1997年4月1日、11卷7号847～862页)。并且还明确了，通过所述异三聚体的形成，被包含CDK4和CyclinD1的复合体所促进的细胞周期的进行(从G1期向S期移动)被抑制。

因此，在本实施例中，与实施例14和15同样地，对于能否通过本发明来检测包含3种不同蛋白质的复合体的形成，通过以下所示的方法进行试验。

(质粒DNA的制备)

pp62(PB1)-CDK4、phAG-p21和pCyclinD1分别基于编码Genbank登录号：NP_000066.1、NP_000380.1和NP_444284.1所特定的氨基酸序列的DNA序列，通过与实施例1所记载的方法同样的方法来制作。

(向培养细胞的基因导入、细胞免疫染色、以及细胞的观察)

作为导入所述质粒DNA的培养细胞使用HeLaS3细胞。另外，HeLaS3细胞通过与实施例1所记载的方法同样的方法来培养。进而，在基因导入中，在8孔室(nunc社制)的2孔中接种HeLaS3细胞，在第二天，通过与实施例1所记载的方法同样的方法，以下述组合，分别将130ng的质粒DNA使用转染试剂1μl导入HeLaS3细胞。

pp62(PB1)-CDK4、phAG-p21与pCyclinD1的组合、

pp62(PB1)-CDK4、phAG-p21与phmKGC-MN(Amalgaam有限会社制)的组合(此外，为了统一质粒的总量而添加phmKGC-MN)。

然后，在导入基因24小时后，用4％低聚甲醛·磷酸缓冲液(4％Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution、和光纯药工业社制)在室温进行15分钟细胞固定，用0.2％TritonX-100/PBS将细胞膜可溶化5分钟，然后使用抗CyclinD1抗体(株式会社医学生物学研究所制)4μg/ml，进行免疫染色。免疫染色的细胞通过与实施例1所记载的方法同样的方法来观察。所得的结果示于图28。

如由图28所示的结果而明确的那样，仅表达p62(PB1)-CDK4和AG-p21，在大量的细胞中观察不到明确的装配体(荧光亮点)。但是，在除了p62(PB1)-CDK4和AG-p21之外还强制表达CyclinD1的情况下，可以在化学计量学上凑齐所述异三聚体的形成所需的要素的表达，可以在几乎全部的细胞中观察到明确的荧光亮点。进而还确认了，CyclinD1定位于从CyclinD1的免疫染色像观察到的荧光亮点。

因此，与实施例14和15所示的结果同样地，确认了可以通过本发明来检测三聚体以上的复合体的形成中的蛋白质间相互作用。

另外，通过本发明，在这样预测二种蛋白质(实施例14和15中为p50和p65、实施例16中为CDK4和p21)进一步包含“某分子”(实施例14和15中为IκBα、实施例16中为CyclinD1)而形成复合体的情况下，可以将这二种蛋白质分别作为“包含装配诱导蛋白质的第1融合蛋白质”和“包含有多聚化能力的荧光蛋白质的第2融合蛋白质”而使其在细胞中表达，进一步使由cDNA表达文库编码的蛋白质在该细胞中表达，从而以荧光亮点(例如，荧光亮点的产生·消失、荧光亮点的定位的变化)作为指标，探索所述“某分子”(复合体的构成因子)。

另外，如实施例14～16所示，通过本发明，可以以荧光亮点为指标分析复合体的构成因子(实施例14和15中为IκBα、实施例16中为CyclinD1)的表达量，进而还可以通过该表达量来分析由所述复合体控制的细胞周期和/或由所述复合体应答的胁迫等这样的细胞所面临的状态。

(实施例17)

＜蛋白质相互作用的检测13＞

如实施例10～13所示，明确了本发明的荧光亮点的荧光强度反映蛋白质间相互作用的强弱。因此设想，在本发明的蛋白质间相互作用的检测方法中，还可以以本发明的荧光亮点的荧光强度作为指标，鉴定对相互作用重要的氨基酸。因此，通过以下所示的方法来进行使用已知与蛋白质间相互作用的减弱或增强有关的氨基酸突变的试验。

此外，在所述试验中作为检测对象的是Sec5蛋白质与RalB蛋白质的相互作用，已知Sec5蛋白质与RalB蛋白质的GTP活化型相互作用(参照Moskalenko S等、Nat Cell Biol.、2002年1月、4卷、1号、66～72页)。已知在RalB的非活性型突变体RalB(S28N)中该相互作用减弱，在RalB的活性型突变体RalB(Q72L)中该相互作用增强(参照Shipitsin M等、MolCell Biol.、2004年7月、24卷、13号、5746～5756页)。进而，关于作为膜锚定型蛋白质的RalB蛋白质，还明确了通过其C末端被棕榈酰化而定位于细胞膜。

(质粒DNA的制备)

在pp62(PB1)-Sec5的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码Sec5的一部分(包含Sec5蛋白质的1～99氨基酸的区域、包含序列号：30所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：29所记载的碱基序列的DNA)。

Sec5正向引物；

5’-CCCGGATCCATGTCTCGATCACGACAACCC-3’(序列号：101)

Sec5反向引物:

5’-GGGAAGCTTTTATTAGCCTATTTTCTCAGGTTTGAGTA-3’(序列号：102)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的pp62(PB1)-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-Sec5。此外，pp62(PB1)-Sec5编码p62(PB1)与Sec5的部分蛋白质的融合蛋白质(也称为“p62(PB1)-Sec5”)。

另外，在phAG-RalB(WT)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码RalB(包含序列号：32所记载的氨基酸序列的蛋白质)的DNA(包含序列号：31所记载的碱基序列的DNA)。

RalB正向引物：

5’-CCCGGATCCATGGCTGCCAACAAGAGTAAG-3’(序列号：103)

RalB反向引物：

5’-GGGAAGCTTTTATCATAGTAAGCAACATCTTTC-3’(序列号：104)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MCLinker中，从而制作phAG-RalB(WT)。此外，phAG-RalB(WT)编码AG蛋白质与RalB蛋白质的融合蛋白质(也称为“AG-RalB(WT)”)。

进而，phAG-RalB(Q72L)的制作，以phAG-RalB(WT)作为模板，使用AMAP多定点突变导入试剂盒(AMAP(TM)Multi Site-directedMutagenesis Kit、Amalgaam有限会社制)，按照附带的使用说明书，通过下述引物来导入突变。

RalB(Q72L)引物：

5’-CTGGACACCGCTGGGCTAGAGGACTACGCAGCCA-3’(序列号：105)。

此外，RalB(Q72L)蛋白质的氨基酸序列示于序列号：34。另外，编码该蛋白质的DNA的碱基序列示于序列号：33。进而，phAG-RalB(Q72L)编码AG蛋白质与RalB(Q72L)蛋白质的融合蛋白质(也称为“AG-RalB(Q72L)”)。

另外，phAG-RalB(S28N)的制作，以phAG-RalB(WT)作为模板，使用AMAP(TM)Multi Site-directed Mutagenesis Kit，按照附带的使用说明书，通过下述引物来导入突变。

RalB(S28N)引物：

5’-CAGCGGAGGCGTTGGCAAGAACGCCCTGACGCTTCAGTTCA-3’(序列号：106)。

此外，RalB(S28N)蛋白质的氨基酸序列示于序列号：36。另外，编码该蛋白质的DNA的碱基序列示于序列号：35。phAG-RalB(S28N)编码AG蛋白质与RalB(S28N)蛋白质的融合蛋白质(也称为“AG-RalB(S28N)”)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

pp62(PB1)-Sec5与phAG-RalB(WT)的组合

pp62(PB1)-Sec5与phAG-RalB(Q72L)的组合

pp62(PB1)-Sec5与phAG-RalB(S28N)的组合

pp62(PB1)与phAG-RalB(WT)的组合。

另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例1所记载的方法同样的方法来进行。所得的结果示于图29。进而，使用仅能激发细胞膜附近的电弧光源全反射荧光显微镜系统(オリンパス社制、IX71-ARCEVA)获得图像。所得的结果示于图30。

如由图29所示的结果而明确的那样，由于C末端被棕榈酰化的RalB蛋白质定位于细胞膜，因而在使野生型的RalB蛋白质(RalB(WT))表达的情况下，在细胞膜附近检测到来源于与Sec5蛋白质的相互作用的荧光亮点。另一方面，在共表达p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(S28N)的细胞中，检测到荧光亮点，如前所述，确认了在RalB的非活性型突变体RalB(S28N)中，与Sec5蛋白质的相互作用减弱。另外，在共表达p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(Q72L)的细胞中，检测到与共表达p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(WT)的细胞相比荧光强度(亮度)更高的荧光亮点，如前所述，还确认了在RalB的活性型突变体RalB(Q72L)中，与Sec5蛋白质的相互作用增强。

另外，如由图30所示的结果而明确的那样，在共表达p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(WT)的细胞中观察到装配体。图30所示的结果，是使用仅能激发细胞膜附近的观察系统得到的结果。因此，与图29所示的结果同样地，证实了可以通过本发明的方法来检测细胞膜附近的野生型的RalB蛋白质与Sec5蛋白质的相互作用。

另外，如由图30所示的结果而明确的那样，在共表达p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(Q72L)的细胞中观察到更显著的装配体的形成。另一方面，在共表达p62(PB1)-Sec5与AG-RalB(S28N)的细胞中，观察不到装配体。因此，与图29所示的结果同样地，证实了可以通过本发明的方法来检测RalB(S28N)中与Sec5蛋白质的相互作用的减弱、和RalB(Q72L)中该相互作用的增强。

(实施例18)

＜蛋白质相互作用的检测14＞

与实施例17同样地，通过以下所示的方法来进行使用了已知与蛋白质间相互作用的减弱有关的氨基酸突变的试验。

(质粒DNA的制备)

pp62(PB1)-p53_W23L如下制备：在实施例12所记载的pp62(PB1)-p53中使用包含序列号：159所记载的碱基序列(5‘-ACATTTTCAGACCTATTGAAACTACTTCCTGAAAACAACGT-3’)的引物，通过与实施例17所记载的方法同样的方法导入突变。

此外，已知p53的23位的氨基酸位于p53与MDM2的相互作用的界面部位，进而，p53中的“W23L”突变是使该相互作用减弱的突变(参照文献Zondlo SC、Biochemistry.、2006年10月3日、45卷、39号、11945～11957页)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

通过实施例1所记载的方法同样的方法，以下述质粒DNA的组合进行等量混合，将所得的物质导入细胞，观察该细胞。所得的结果示于图31。

pp62(PB1)-p53与phAG-MDM2的组合。

pp62(PB1)-p53_W23L与phAG-MDM2的组合。

如由图31所示的结果而明确的那样，在共表达p62(PB1)-p53与AG-MDM2的细胞中，显著地观察到荧光亮点(装配体的形成)(图中，左面板)。另一方面，在共表达p62(PB1)-p53_W23L与AG-MDM2的细胞中，观察不到装配体(图中，右面板)。

因此，如实施例17和18所示，还明确了在本发明的蛋白质间相互作用的检测方法中，可以以本发明的荧光亮点的荧光强度作为指标，鉴定对相互作用重要的氨基酸。特别是通过本发明的方法，在蛋白质间相互作用的界面引入突变，然后检测该相互作用的有无，从而可以非常简便地特定参与该相互作用的氨基酸。即，通过将丙氨酸扫描等蛋白质突变导入法与本发明的方法组合，可以非常简便地探索对蛋白质相互作用重要的部位(热点区)。

(实施例19)

＜蛋白质间相互作用的检测15＞

如前所述显示，在本发明的蛋白质间相互作用的检测方法中，可以定量地实时测定蛋白质间相互作用的发生和消失。因此，试验了能否使用本发明的方法，对于细胞内的内源性的信号传递经时变化的情形，通过对该信号进行应答而发生的蛋白质间相互作用来检测。

即，在本试验中作为检测对象的蛋白质间相互作用，是钙调蛋白(Calmodulin)与肌球蛋白轻链激酶2(myosin light chain kinase 2)的部分序列(M13肽、M13peptide)的相互作用，明确了该相互作用对在G蛋白偶联受体(GPCR)接受配基时发生的细胞内钙离子浓度的瞬间上升(第二信使)进行应答而发生(参照Miyawaki A等、Nature、1997年8月28日、388卷、6645号、882～887页)。因此，对于能否通过所述相互作用来检测细胞内钙离子浓度的经时变化，通过以下所示的方法进行试验。所得的结果示于图32。

(质粒DNA的制备)

在pCalmodulin-hAG的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码Calmodulin(包含序列号：38所记载的氨基酸序列的蛋白质)的DNA(包含序列号：37所记载的碱基序列的DNA)。

Calmodulin正向引物：

5’-TTGGATCCGCCACCATGGACCAACTGACAGAAGAGCAGATTGC-3’(序列号：107)

Calmodulin反向引物：

5’-AAGAATTCCCCTTTGCTGTCATCATTTGTACAAACTCTTC-3’(序列号：108)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和EcoRI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MNLinker中，从而制作pCalmodulin-hAG。此外，pCalmodulin-hAG编码Calmodulin蛋白质与AG蛋白质的融合蛋白质(也称为“Calmodulin-AG”)。

另外，在pM13peptide-p62(PB1)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码myosin light chainkinase2的一部分(包含myosin light chain kinase2蛋白质的566～591氨基酸的区域、包含序列号：40所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：39所记载的碱基序列的DNA)。

M13肽正向引物：

5’-TTGGATCCGCCACCATGAAGAGGCGCTGGAAGAAAAACTTCATTGC-3’(序列号：109)

M13肽反向引物：

5’-CCGAATTCCCCAGTGCCCCGGAGCTGGAGATCTTCTTG-3’(序列号：110)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和EcoRI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的pp62(PB1)-MNLinker中，从而制作pM13peptide-p62(PB1)。此外，pM13peptide-p62(PB1)编码M13肽与p62(PB1)的融合蛋白质(也称为“M13peptide-p62(PB1)”)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

将pCalmodulin-hAG与pM13peptide-p62(PB1)等量混合，通过实施例1所记载的方法同样的方法导入HeLaS3细胞。然后，添加200μM组胺(Histamine、和光纯药工业社制)，经时地拍摄荧光图像。此外，明确了Histamine作为在HeLaS3细胞中也表达的GPCR的1种H1受体的配基发挥功能。

如由图32所示的结果而明确的那样，配基(Histamine)添加前，Calmodulin-AG在细胞内扩散而存在，但在添加配基后90秒后，检测到荧光亮点的产生，确认了与M13peptide-p62(PB1)的装配体的形成。但是，随着细胞质钙离子浓度的降低，490秒后荧光亮点(装配体)消失。

因此，明确了通过利用本发明的蛋白质间相互作用的检测方法，可以实时测定由于来自H1受体的信号传递而瞬时上升的钙离子浓度。

另外，由该实施例19的结果还显示，本发明也可以检测瞬间蛋白质间相互作用，进而也适用于使蛋白质间相互作用发生的第二信使等内源性因子、由该第二信使等贡献的信号传递、和引发该信号传递的细胞外配基等来自外部的刺激的检测以及筛选。

(实施例20)

＜蛋白质间相互作用的检测16＞

在以国际公开第2000/017221号、国际公开第2006/099486号为代表的现有的蛋白质间相互作用的检测方法中，将构成由蛋白质间相互作用而产生的复合体的一方的蛋白质强制地(人工地)约束于细胞内的特定区域，因而不能在该相互作用所固有的细胞内环境下进行检测。但是，本发明的蛋白质间相互作用的检测方法只要在相互作用的情况下就自发地形成荧光亮点(装配体)，因而预测可以解决现有方法所具有的所述问题。因此，对于能否通过本发明而在细胞内的任意区域检测相互作用，通过以下所示的方法进行试验。

(质粒DNA的制备)

在pmTOR(FRB domain)-AGNLS的制作中，首先从pNP-AG(Amalgaam有限会社制)，使用下述引物组，通过PCR扩增AGNLS基因。

AGNLS正向引物：

5’-AAACCGGTATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAG-3’(序列号：111)

AGNLS反向引物：

5’-AATCTAGATTATTTATCCTTTTCCTTTTTACTCTTCTTCTTAGCTACTTC-3’(序列号：112)

然后，将所得的扩增产物用AgeI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了hAG区域的pmTOR(FRB domain)-hAG中，从而制作pmTOR(FRB domain)-AGNLS。此外，pmTOR(FRB domain)-AGNLS编码包含mTOR(FRB domain)、AG蛋白质和核定位信号(NLS)的融合蛋白质(也称为“mTOR(FRB domain)-AGNLS”)。另外，mTOR(FRBdomain)-AGNLS因为在mTOR(FRB domain)-AG的C末端融合了核定位信号，所以定位于细胞的核内。

另外，在pp62(PB1)-HRas的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，通过使用下述引物组的PCR来扩增编码HRas蛋白质的DNA，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断。

HRas正向引物：

5’-AAGAATTCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGGCAAGAGTGC-3’(序列号：113)

HRas反向引物：

5’-TTCTCGAGACCTCCGGAGACGTTCAGCTTCCGCAGCTTGTGCTGCCGGATCTCACGCACCAAC-3’(序列号：114)。

进而，通过使用下述引物组的PCR扩增来源于KRas蛋白质的异戊烯化序列，将所得的扩增产物用XhoI和NotI切断。

KRas正向引物：

5’-AACTCGAGAAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTG-3’(序列号：115)

KRas反向引物：

5’-TTGCGGCCGCTTACATAATTACACACTTTGTCTTTGACTTCTTTTTCTTCTTTTTACCAT-3’(序列号：116)。

然后，将这样制备的所述2种DNA片段插入用EcoRI和NotI处理后的pp62(PB1)-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-HRas(WT)。

进而，编码恒常活性型突变体HRas与p62(PB1)的融合蛋白质的pp62(PB1)-HRas的制作，以pp62(PB1)-HRas(WT)作为模板，使用AMAP多定点突变导入试剂盒(AMAP(TM)Multi Site-directed Mutagenesis Kit、Amalgaam有限会社制)，按照附带的使用说明书，通过下述引物来导入突变。

HRas突变引物：

5’-GCTGGTGGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGGCAAGAGTGCGC-3’(序列号：117)。

此外，pp62(PB1)-HRas编码p62(PB1)与编码在C末添加了来源于KRas蛋白质的异戊烯化序列的HRas(包含序列号：42所记载的氨基酸序列的蛋白质)的DNA(包含序列号：41所记载的碱基序列的DNA)融合而成的蛋白质。另外，该融合蛋白质通过具有异戊烯化序列，而在细胞内受到翻译后脂质修饰，定位于细胞膜。

在phAG-cRaf的制作中，首先。以HeLaS3细胞的cDNA文库作为模板，使用下述引物组，通过PCR扩增编码cRaf的一部分(包含cRaf蛋白质的51-131氨基酸的区域、包含序列号：44所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：43所记载的碱基序列的DNA)。

cRaf正向引物：

5’-AAGGTACCCCTTCTAAGACAAGCAACACTATCCGTGTTTTCTTGCCGAACAAGCAAAGAA-3’(序列号：118)

cRaf反向引物71：

5’-TTAAGCTTTTACAGGAAATCTACTTGAAGTTCTTCTCCAATCAAAGACGCAG-3’(序列号：119)

然后，将所得的扩增产物用KpnI和HindIII切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MCLinker中，从而制作phAG-cRaf。此外，phAG-cRaf是AG蛋白质与cRaf蛋白质的一部的融合蛋白质(也称为“AG-cRaf”)。另外，该cRaf蛋白质的一部分与HRas蛋白质相互作用(参照Mochizuki N等、Nature、2001年6月28日、411卷、6841号、1065～1068页)。

进而，在pSmac-p62(PB1)的制作中，首先从pp62(PB1)-MNL，使用下述引物组，通过PCR扩增编码Smac的一部分(包含Smac蛋白质的1～10氨基酸的区域、包含序列号：46所记载的氨基酸序列的区域)与p62(PB1)的融合蛋白质的DNA。

Smac正向引物：

5’-AGGATCCGCCACCATGGCCGTGCCCATCGCCCAGAAATCAGAGAATTCGG-3’(序列号：120)

p62(PB1)反向引物2：

5’-ACCTCTAGATTATTTCTCTTTAATGTAGATTCGGAAGATG-3’(序列号：64)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和XbaI切断，插入到用相同的限制性酶处理而切出了连接物和p62(PB1)的pp62(PB1)-MNL中，从而制作pSmac-p62(PB1)。此外，pSmac-p62(PB1)编码Smac的一部分与p62(PB1)的融合蛋白质(也称为“Smac-p62(PB1)”)。

另外，在pXIAP-hAG的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码XIAP的一部分(包含XIAP蛋白质的243～356氨基酸的区域、包含序列号：48所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：47所记载的碱基序列的DNA)。

XIAP正向引物：

5’-TTGGATCCGCCACCATGGCTGTGAGTTCTGATAGGAATTTCCCAAATTC-3’(序列号：121)

XIAP反向引物：

5’-TTGAATTCTCAGTAGTTCTTACCAGACACTCCTCAAGTGAATGAG-3’(序列号：122)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和EcoRI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MNLinker中，从而制作pXIAP-hAG。此外，pXIAP-hAG编码XIAP的一部分与AG蛋白质的融合蛋白质(也称为“XIAP-AG”)。另外，已知所述Smac的一部分与所述XIAP的一部分在细胞质内相互作用(参照Liu Z等、Nature、2000年12月21-28日、408卷、6815号、1004～1008页)。

进而，在pp62(PB1)-BclX(L)的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库中，使用下述引物组，通过PCR扩增编码BclX(L)的一部分(包含BclX(L)蛋白质的1～209氨基酸的区域、包含序列号：50所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：49所记载的碱基序列的DNA)。

BclX(L)正向引物：

5’-TTCTCGAGGATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTTGAC-3’(序列号：123)

BclX(L)反向引物：

5’-CTAAGCGGCCGCTTAGCGTTCCTGGCCCTTTCGGCTCTCGGCTG-3’(序列号：124)

然后，将所得的扩增产物用XhoI和NotI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的pp62(PB1)-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-BclX(L)。此外，pp62(PB1)-BclX(L)编码p62(PB1)与BclX(L)的一部分的融合蛋白质(也称为“p62(PB1)-BclX(L)”)。

另外，在phAG-BAD的制作中，首先使用下述引物组，通过PCR扩增编码BAD的一部分(包含BAD蛋白质的103～127氨基酸的区域、包含序列号：52所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：51所记载的碱基序列的DNA)。

BAD正向引物1：

5’-GCAGCACAGCGCTATGGCCGCGAGCTCCGGAGGATGAGTGACGAGTTTGT-3’(序列号：125)

BAD正向引物2：

5’-TTGGATCCAACCTCTGGGCAGCACAGCGCTATGGCCGCGAGCTCCGGAGG-3’(序列号：126)

BAD反向引物：

5’-TTGAATTCTTACTTCTTAAAGGAGTCCACAAACTCGTCACTCATCCTCCG-3’(序列号：127)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和EcoRI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MCLinker中，从而制作phAG-BAD。此外，编码AG蛋白质与BAD的一部分的融合蛋白质(也称为“AG-BAD”)。另外，已知所述BclX(L)的一部分与所述BAD的一部分在细胞质内相互作用(参照Sattler M等、Science、1997年2月14日、275卷、5302号、983～986页)。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

pFKBP12-p62(PB1)与pmTOR(FRB domain)-AGNLS的组合

pp62(PB1)-HRas与phAG-cRaf的组合

pSmac-p62(PB1)与pXIAP-hAG的组合

pp62(PB1)-BclX(L)与phAG-BAD的组合。

另外，基因导入细胞的观察也通过与实施例1所记载的方法同样的方法来进行。但是，对于导入了pFKBP12-p62(PB1)与pmTOR(FRBdomain)-AGNLS的细胞，在添加100nM雷帕霉素后300秒后拍摄荧光图像和位相差图像。所得的结果示于图33～36。

如由图33所示的结果而明确的那样，使mTOR(FRB domain)-AGNLS与FKBP12-p62(PB1)在细胞内表达时，mTOR(FRB domain)-AGNLS通过在其C末端具有核定位信号序列，而以扩散的状态定位于细胞的核内(参照图33左侧的面板)。并且，通过添加雷帕霉素，FKBP12-p62(PB1)与mTOR(FRB domain)-AGNLS装配而产生的荧光亮点仅在核内被检测到(参照图33右侧的2个面板)。

另外，如由图34所示的结果而明确的那样，使C末端具有异戊烯化序列的p62(PB1)-HRas、与AG-cRaf在细胞内表达时，通过异戊烯化序列，p62(PB1)-HRas与AG-cRaf装配而产生的荧光亮点在细胞膜被检测到。

进而，如由图35所示的结果而明确的那样，使Smac-p62(PB1)与XIAP-AG在细胞内表达时，反映已知在细胞质内发生的Smac蛋白质与XIAP蛋白质的相互作用的、Smac-p62(PB1)与XIAP-AG装配而产生的荧光亮点也在细胞质内被检测到。

另外，如由图36所示的结果而明确的那样，使p62(PB1)-BclX(L)与AG-BAD在细胞内表达时，反映已知在细胞质内产生的BclX(L)蛋白质与BAD蛋白质的相互作用的、p62(PB1)-BclX(L)与AG-BAD装配而产生的荧光亮点也在细胞质内被检测到。

(实施例21)

＜蛋白质间相互作用的检测17＞

与实施例20同样地，对于使用本发明的方法，能否在作为对象的蛋白质所固有的细胞内环境下检测蛋白质间相互作用，通过以下所示的方法进行试验。

此外，在本实施例21中，以Rac1蛋白质与PBD(p21结合结构域)的蛋白质间相互作用作为检测的对象。低分子量G蛋白质的Rac1蛋白质通过Tiam1、Trio、VAV1等鸟苷酸转换因子(GEF)，从惰性型的GDP结合型转换为活性型的GTP结合型。然后，已知活性型的Rac1蛋白质、与Cdc42/Rac效应蛋白(p21活化激酶1：PAK1)PBD相互作用。另外，GEF的定位根据其种类不同而不同，位于核内、细胞的边缘(细胞膜近傍)等。因此，虽然Rac1蛋白质在细胞内全体中存在，但Rac1蛋白质的活化、以及活性型的Rac1蛋白质与PBD的相互作用在与根据种类不同而不同的GEF的定位相应的的细胞内的区域发生(参照Benard V等、J Biol Chem.、1999年5月7日、274卷、19号、13198～13204页)。

(质粒DNA的制备)

在phAG-Rac1的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库，使用下述引物组，通过PCR扩增编码Rac1蛋白质(包含序列号：54所记载的氨基酸序列的蛋白质)的DNA(包含序列号：53所记载的碱基序列的DNA)。

Rac1正向引物：

5’-GAGAATTCGATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTGG-3’(序列号：128)

Rac1反向引物：

5’-GGCTCGAGTTACAACAGCAGGCATTTTCTCTTCC-3’(序列号：129)

然后，将所得的扩增产物用EcoRI和XhoI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的phAG-MNLinker中，从而制作phAG-Rac1。

另外，在pp62(PB1)-PBD的制作中，首先从HeLaS3细胞的cDNA文库，使用下述引物组，通过PCR扩增编码PBD(包含PAK1蛋白质的67～150氨基酸的区域、包含序列号：56所记载的氨基酸序列的区域)的DNA(包含序列号：55所记载的碱基序列的DNA)。

PBD正向引物：

5’-TTGGATCCAAGAAAGAGAAAGAGCGGCCAGAGATTTCTCTCCC-3’(序列号：130)

PBD反向引物：

5’-CCGAATTCTTACGCTGACTTATCTGTAAAGCTCATGTATTTCTGGC-3’(序列号：131)

然后，将所得的扩增产物用BamHI和EcoRI切断，插入到用相同的限制性酶处理后的pp62(PB1)-MCLinker中，从而制作pp62(PB1)-PBD。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

以下述质粒DNA的组合进行等量混合，将所得的物质通过与实施例1所记载的方法同样的方法分别导入U2OS细胞。

phAG-Rac1与pp62(PB1)-PBD的组合

phAG-Rac1与pp62(PB1)-MNLinker的组合

所得的结果示于图37～39。

如由图37和38所示的结果而明确的那样，使AG-Rac1与p62(PB1)-PBD在细胞内表达时，在核内(图37)和细胞的边缘(图38)检测到由AG-Rac1与p62(PB1)-PBD的装配而产生的荧光亮点。

另一方面，如由图39所示的结果而明确的那样，使AG-Rac1与未融合PBD的p62(PB1)在细胞内表达时，检测不到荧光亮点。

由以上的结果显示，可以在细胞内的多种区域检测相同的蛋白质间相互作用。因此明确了，本发明不需要将构成由蛋白质间相互作用而生成的复合体的蛋白质强制(人工)地约束于细胞内的特定区域，可以在与该蛋白质的定位相应的固有的细胞内环境下检测该蛋白质间相互作用。

另外还显示，通过该蛋白质间相互作用的检测，可以在本发明中检测活性型(GTP结合型)的Rac1蛋白质。进而证实了，通过检测向该活性型的GTP结合型的转换，还可以检测作为细胞内源性的酶的GEF的定位以及活性，明确了本发明的方法通过蛋白质间相互作用还可以检测内源性因子的活性。

(实施例22)

＜蛋白质间相互作用的检测18＞

如实施例21所记载的那样，明确了活性型的Rac1蛋白质与Cdc42/Rac效应蛋白(p21活化激酶1：PAK1)的PBD相互作用。

另外，已知Rac1蛋白质通过其C末端被香叶基香叶基基修饰(异戊烯化)而其定位变化。进而，还已知Rac1蛋白质介由其香叶基香叶基基而与RhoGDI相互作用。

因此，通过以下所示的方法确认了可以通过本发明的方法来检测这些蛋白质间相互作用的定位的变化。

首先，基于编码Genbank登录号：NP_004300所特定的氨基酸序列的DNA序列，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作pRhoGDI-p62(PB1)。另外，关于phAG-Rac1和pp62(PB1)-PBD，如实施例21所记载。

然后，将以下述质粒DNA的组合进行等量混合而得的物质，通过与实施例2同样的方法导入细胞。

phAG-Rac1与pp62(PB1)-PBD的组合

phAG-Rac1与pRhoGDI-p62(PB1)的组合。

然后，在基因导入之后培养6小时，然后添加作为针对香叶基香叶基基修饰的抑制剂的美伐他汀(Mevastatin、Enzo Life Sciences社)至终浓度10μM，进一步培养15小时培养，进行观察。对于共表达AG-Rac1与p62(PB1)-PBD的细胞的结果示于图40，对于共表达AG-Rac1与RhoGDI-p62(PB1)的细胞的结果示于图41。此外，在图40和41中，将对于同一细胞，通过与实施例1所记载的方法同样的方法使用通常的落射型倒置荧光显微镜拍摄而得的照片(A)、和通过与实施例17所记载的方法同样的方法使用电弧光源全反射荧光显微镜系统拍摄而得的照片(B)一并显示。

如由图40的上部2个面板所示的结果而明确的那样，通过本发明的方法确认了，在通常的状态下，无论在核内还是核外Rac1与PBD均进行蛋白质间相互作用，即Rac1以活化状态存在。

已知如果将香叶基香叶基基修饰用美伐他汀等药剂抑制，则Rac1定位于核内。关于该见解，如由图40的下部2个面板所示的结果而明确的那样，通过本发明的方法确认了，通过美伐他汀处理，Rac1与PBD的相互作用变得仅在核内发生。进而，通过本发明的方法确认了，通过该相互作用的检测，即使在没有香叶基香叶基基修饰的状态，Rac1也以活化状态存在。

另外，关于Rac1与RhoGDI的相互作用，如由图41的上部2个面板所示的结果而明确的那样，通过本发明的方法确认了，在通常的状态下，Rac1与RhoGDI在核外进行蛋白质间相互作用。

另一方面，如由图41的下部2个面板所示的结果而明确的那样，通过本发明的方法确认了，通过美伐他汀处理，如前所述，Rac1的定位变为仅在核内，进而该Rac1由于香叶基香叶基基修饰被抑制，因而Rac1与RhoGDI的相互作用减少。

因此确认了，通过本发明，可以检测在细胞内的多种区域发生的蛋白质间相互作用通过来自外部的刺激而变化的情形。进而确认了，还可以检测影响蛋白质间相互作用的蛋白质的修饰(例如，Rac1与RhoGDI的相互作用中的Rac1的香叶基香叶基基修饰)的有无。

(实施例23)

KRas与cRaf的相互作用在细胞增殖、分化等中是重要的信号传递之一。另外明确了，该蛋白质间相互作用如下发生：通过从被表皮生长因子(EGF)活化的EGF受体介由Grb2-SOS而传递信号，其结果KRas被活化。进而还已知，通过该蛋白质间相互作用，cRaf的定位从细胞质变为细胞膜。

这样，因为KRas与cRaf的相互作用依赖于EGF，所以在EGF不存在下不发生。但是，在KRas的突变体中，也存在即使在EGF不存在下也能与cRaf相互作用的恒常活化型的突变体(例如，KRasG12D)，进而所述突变体在各种癌中被检测到。因此，在有效的癌治疗法的开发等中，检测KRas或其突变体与cRaf的装配体形成、该装配体的定位等这样的蛋白质间相互作用的位置信息和时间信息是重要的。

因此，对于通过本发明，能否检测具有疾患相关突变的蛋白质与其野生型蛋白质在蛋白质间相互作用中的差异，通过以下所示的方法进行试验。

(质粒DNA的制备)

基于编码Genbank登录号：NP_004976所特定的氨基酸序列的DNA序列，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作pp62(PB1)-KRas(WT)。

pp62(PB1)-KRas(G12D)，使用包含序列号：160所记载的DNA序列(5‘-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGACGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTG-3’)的引物，通过与实施例17所记载的方法同样的方法在pp62(PB1)-KRas(WT)中导入突变。phAG-cRaf(R59A)基于编码包含序列号：162所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列(序列号：161)，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作。此外，对于cRaf，参照Harvey CD等、Science.、2008年7月4日321卷、5885号、136-140页所记载的方法，将该蛋白质的突变体(cRaf(R59A))在本实施例中使用。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

将所述质粒DNA以下述组合等量混合，通过与实施例2所记载的方法同样的方法导入Cos-7细胞。

pp62(PB1)-KRas(WT)与phAG-cRaf(R59A)的组合

pp62(PB1)-KRas(G12D)与phAG-cRaf(R59A)的组合。

细胞的观察使用仅能激发细胞膜附近的电弧光源全反射荧光显微镜系统(オリンパス社制、IX71-ARCEVA)来进行。另外，对于pp62(PB1)-KRas(WT)和phAG-cRaf(R59A)的组合，获得不添加EGF时的图像后，以终浓度50ng/ml添加EGF(SIGMA社制)，在37℃静置30分钟静置后，再进行观察。所得的结果示于图42。

如由图42所示的结果而明确的那样，在共表达p62(PB1)-KRas(WT)与AG-cRaf(R59A)的细胞中，在没有来自外部的刺激的状态(不添加EGF)，观察不到荧光亮点(装配体的形成)。但是，随着EGF添加而确认了细胞膜中的装配体的形成。另一方面，对于pp62(PB1)-KRas(G12D)和phAG-cRaf(R59A)的组合，即使在没有来自外部的刺激的状态下，也在细胞膜确认了装配体的形成。

因此，因为通过本发明，可以明确地掌握由与疾患相关的突变产生的蛋白质间相互作用的差异(外部刺激依存性等)，所以在与疾患相关的蛋白质等的细胞内动态、功能的分析中，本发明的方法是有效的。

(实施例24)

＜蛋白质间相互作用的检测20＞

如实施例19中也显示的那样，通过以下所示的方法确认了，可以通过本发明来检测蛋白质间相互作用的经时变化。

此外，在实施例24中，作为对象的蛋白质间相互作用，是BclX(L)与Bak的相互作用、BclX(L)与Bax的相互作用。明确了Bak和Bax都介由BH3结构域而与BclX(L)相互作用，但明确了BclX(L)与Bak BH3结构域的解离常数为340nM，BclX(L)与Bax BH3结构域的解离常数为13μM(参照Sattler M等、Science.、1997年2月14日、275卷5302号、983～986页)。另外，还已知这些蛋白质间相互作用被ABT-737(BH3模仿药)而竞争性抑制。

(质粒DNA的制备)

pBak-hAG使用编码包含序列号：164所记载的氨基酸序列的区域的DNA(序列号：163)，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作。phAG-Bax使用编码包含序列号：166所记载的氨基酸序列的区域的DNA(包含序列号：165)，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作。另外，关于pp62(PB1)-BclX(L)，如实施例20所记载。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

将以下述组合将质粒DNA等量混合而得的物质，通过与实施例2所记载的方法同样的方法向293细胞进行基因导入。

pp62(PB1)-BclX(L)与pBak-hAG的组合

pp62(PB1)-BclX(L)与phAG-Bax的组合。

然后，对导入了这些质粒DNA的293细胞添加ABT-737(santa cruzbiotechnology社制)至终浓度15μM，通过与实施例2所记载的方法同样的方法，对于共表达p62(PB1)-BclX(L)和Bak-AG的细胞每隔30分钟获得图像，对于共表达p62(PB1)-BclX(L)和AG-Bax的细胞每隔5分钟获得图像图像。基于所得的图像，通过与实施例11所记载的方法同样的方法进行分析，将荧光亮点(装配体)的总荧光强度相对于时间作图。此外，图的x轴表示以药剂添加时为0的时间(分钟)，y轴表示荧光亮点(装配体)的总荧光强度。对于共表达p62(PB1)-BclX(L)和Bak-AG的细胞的结果示于图43，对于共表达p62(PB1)-BclX(L)和AG-Bax的细胞的结果示于图44。

如由图43和44所示的结果而明确的那样，BclX(L)与Bak的相互作用、BclX(L)与Bax的相互作用、以及依赖于这些蛋白质间相互作用而形成的装配体的总荧光亮度，通过ABT-737的添加而经时地减少。因此证实了，通过本发明，可以通过检测荧光亮点而检测至蛋白质间相互作用的消失所需的时间。

另外，总荧光亮度显示半值的时间，对于BclX(L)与Bak约为80分钟，对于BclX(L)与Bax约为35分钟。这样，解离常数小的BclX(L)与Bak(解离常数：340nM)，与BclX(L)与Bax(解离常数：13μM)相比，装配体的减少慢，因而确认了，如前所述，可以通过本发明来评价蛋白质间相互作用的强弱。

(实施例25)

＜蛋白质间相互作用的检测21＞

如实施例24中也显示的那样，通过以下所示的方法确认了，可以通过本发明来检测蛋白质间相互作用的发生的经时变化。

首先，将实施例13所记载的、稳定地表达p62(PB1)-p53和AG-MDM2的CHO-K1细胞接种于35mm玻璃基盘(旭硝子社制)。然后，第二天，添加Nutlin-3(CALBIOCHEM社制)至终浓度10μM，通过与实施例1所记载的方法同样的方法进行观察，从该添加之前2分钟开始，每隔15秒获得图像。对于获得的图像，使用与实施例11所记载的方法同样的方法分析装配体的总荧光亮度，相对于时间作图。所得的结果示于图45。

如由图45所示的结果而明确的那样，随着Nutlin-3(CALBIOCHEM社制)的添加而装配体的总荧光亮度迅速减少，显示其半值的时间为约3分钟。因此确认了，通过本发明，可以通过检测荧光亮点来检测至蛋白质间相互作用的消失所需的时间及其过程。

(实施例26)

＜蛋白质间相互作用的检测22＞

与上述同样地，通过以下所示的方法确认了，可以通过本发明来检测蛋白质间相互作用的发生的经时变化。

首先，对实施例11所记载的、稳定地表达mTOR(FRB domain)-AG和p62(PB1)-FKBP12的HeLaS3细胞添加雷帕霉素至终浓度20nM，通过与实施例11所记载的方法同样的方法进行分析。所得的结果示于图46。

如由图46所示的结果而明确的那样，雷帕霉素添加后，随着经过时间而装配体的形成被诱导，显示其半值的时间为约3分钟。因此确认了，通过本发明，可以通过检测荧光亮点来检测蛋白质间相互作用发生所需的时间、及其过程。

(实施例27)

＜蛋白质间相互作用的检测23＞

明确了如果通过EGF刺激而细胞内的ERK被活化，则ERK底物(ERK_substrate)被磷酸化，其结果ERK_substrate与Pin1蛋白质的ww结构域(Pin1(ww))相互作用。进而还已知，如果添加作为MEK抑制剂的U0126，则ERK的活性降低，结果ERK底物受到去磷酸化，ERK底物与Pin1(ww)的相互作用被解除。

在本实施例中，通过以下所示的方法确认了，可以通过本发明来检测介由ERK的活化被EGF间接诱导的ERK底物与Pin1(ww)的相互作用，另外，可以通过本发明来检测介由ERK的钝化而被U0126间接抑制的ERK底物与Pin1(ww)的相互作用，进而，可以通过本发明来经时地检测依赖于EGF刺激的信号传递。

(质粒DNA的制备)

在本实施例中，为了检测依赖于EGF刺激的ERK底物与Pin1(ww)的相互作用，以利用FRET来检测该相互作用的系统(参照ChristopherD.Harvey等、Proc Natl Acad Sci U S A.、2008年12月9日、105卷、49号、19264～19269页)作为参考，使用编码包含序列号：168所记载的氨基酸序列的区域的、化学合成的DNA(包含序列号：167)，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作pp62(PB1)-ERK_substrate-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES。

此外，在序列号：168所记载的氨基酸序列中，1～102位的氨基酸序列表示p62(PB1)的氨基酸序列。103～128位的氨基酸序列表示连接物序列。129～138位的氨基酸序列表示作为ERK底物的人Cdc25C的43～52位的氨基酸序列，139～142位的氨基酸序列表示ERK停泊位点的氨基酸序列。146～164位的氨基酸序列表示P2A肽的氨基酸序列。165～390位的氨基酸序列表示AG的氨基酸序列。391～416位的氨基酸序列表示连接物序列。417～470位的氨基酸序列表示Pin1(ww)的氨基酸序列。471～482位的氨基酸序列表示MEK的核转出信号(NES)的氨基酸序列。

另外，已知插入在p62(PB1)-ERK_substrate与AG-Pin1(ww)-NES之间的P2A肽是来源于猪捷申病毒(porcine teschovirus)的CHYSEL(顺式作用性水解酶酶因子：cis-acting hydrolase element)序列，在蛋白质翻译时发生核糖体跳跃，该氨基酸序列(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)中的最后的脯氨酸之前发生分裂(Donnelly ML等、J Gen Virol.、2001年5月82卷5号1013～1025页)。因此，在细胞中导入了pp62(PB1)-ERK_substrate-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES的情况下，结果在该细胞内分裂成在p62(PB1)-ERK_substrate的C末端融合了P2A肽的一部分的蛋白质、与在AG-Pin1(ww)-NES的N末端融合了P2A肽的一部分的蛋白质而表达。

(向培养细胞的基因导入、以及基因导入细胞的观察)

将pp62(PB1)-ERK_substrate-P2A-hAG-Pin1(ww)-NES，通过与实施例1所记载的方法同样的方法转染293细胞。第二天，在细胞中添加EGF(SIGMA社制)至终浓度50ng/ml，进一步在其14分钟后，在细胞中添加U0126至终浓度10μM。另外，细胞的观察从添加EGF添加前2分钟开始，每隔15秒获得观察图像。对于获得的图像，通过与实施例11所记载的方法同样的方法分析荧光亮点(装配体)的总荧光亮度，相对于时间作图。所得的结果示于图47。

如由图47所示的结果而明确的那样，在添加EGF后，在表达p62(PB1)-ERK_substrate与AG-Pin1(ww)-NES的细胞中，随着时间显著地观察到荧光亮点(装配体)。但是，在添加U0126之后，反映出相应于该添加所造成的内源性ERK的钝化而产生的ERK底物的去磷酸化的促进，荧光亮点缓缓减少。

显示ERK底物与Pin1(ww)的相互作用的荧光亮点(装配体)的总荧光亮度的经时变化，与Christopher D.Harvey等、Proc Natl Acad Sci U S A.、2008年12月9日、105卷、49号、19264～19269页所记载的使用FRET测定ERK底物与Pin1(ww)的相互作用所得的结果为相同程度。

这样，通过本发明，可以通过检测荧光亮点来检测被特定刺激间接诱导或抑制的蛋白质间相互作用。另外，通过本发明，还可以经时地检测信号传递。

(实施例28)

＜蛋白质间相互作用的检测24＞

与上述同样地，通过实施例20所记载的HRas与cRaf的相互作用而确认了，可以通过本发明来检测蛋白质间相互作用的发生的经时变化。

即，将实施例20所记载的pp62(PB1)-HRas(WT)、与实施例23所记载的phAG-cRaf(R59A)通过与实施例23所记载的方法同样的方法导入细胞，添加EGF(SIGMA社制)至终浓度50ng/ml，使用仅能检测细胞膜附近的荧光信号的测定装置进行观察。此外，观察从添加EGF添加之前5分钟开始，到添加后30分钟，每隔5分钟进行，进一步在30分钟后进行，基于所得的图像数据，通过与实施例11所记载的方法同样的方法进行分析，将荧光亮点(装配体)的总荧光强度相对于时间作图。此外，图的x轴表示以EGF添加时为0的时间(分钟)，y轴表示荧光亮点(装配体)的总荧光强度。所得的结果示于图48。

如由图48所示的结果而明确的那样，可以经时地检测由EGF添加而产生的HRas与cRaf的相互作用。

另外，如前所述，已知在细胞中添加EGF的情况下，从该细胞的EGF受体，介由Grb2-SOS复合体而信号传递，其结果HRas被活化，与cRaf相互作用。因此，由图48所示的结果可以确认，通过本发明，可以经时地追踪针对影响细胞的来自外部的刺激(EGF等)的细胞内信号传递途径(介由Grb2-SOS复合体的信号传递途径等)活化的过程。

(实施例29)

＜蛋白质间相互作用的检测25＞

如前所述，明确了雷帕霉素与FKBP12蛋白质结合，进而该复合体与mTOR蛋白质的FRB结构域(mTOR(FRB))结合。mTOR蛋白质是具有活化参与蛋白质合成、细胞增殖的信号传递的功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，但通过所述FKBP12蛋白质与雷帕霉素的复合体形成，其功能被抑制。

进而，对于FKBP12蛋白质，已知介由包含催化亚基A(钙调神经磷酸酶A)和调节亚基B(钙调神经磷酸酶B)的蛋白磷酸酶(钙调神经磷酸酶)和FK506相互作用。还明确了，钙调神经磷酸酶是在T细胞等的信号传递中承担非常重要的功能的酶，但通过所述FKBP12蛋白质与FK506的复合体形成，其功能被抑制。

因此，在本实施例中，对于能否使FKBP12、mTOR(FRB)与钙调神经磷酸酶A和钙调神经磷酸酶B在同一细胞内共表达，通过本发明来检测、判别该细胞内的依赖于雷帕霉素而形成的FKBP12与mTOR(FRB)的复合体、以及依赖于FK506而形成的FKBP12与钙调神经磷酸酶A和钙调神经磷酸酶B的复合体、以及这些复合体所参与的信号传递的抑制，通过以下所示的方法进行试验。

此外，作为在细胞中表达的“钙调神经磷酸酶A和钙调神经磷酸酶B”，使用钙调神经磷酸酶A的一部分与钙调神经磷酸酶B的一部分融合而成的mCAB蛋白质(参照Clemons PA等、Chem Biol.、2002年1月、9卷、1号、49～61页)。

首先，将phAG-mCAB、pp62(PB1)-FKBP12和pmTOR(FRB)-hKO1导入HeLaS3细胞。phAG-mCAB编码包含序列号：170所记载的氨基酸序列的区域，使用人工合成的DNA(序列号：169)，通过与实施例2所记载的方法同样的方法制作。关于pp62(PB1)-FKBP12，如实施例2所记载。关于pmTOR(FRB)-hKO1(pmTOR(FRB domain)-hKO1)，如实施例6所记载。

另外，HeLaS3细胞通过与实施例1所记载的方法同样的方法进行培养。进而，在基因导入中，在8孔室(nunc社制)的2孔中接种HeLaS3细胞，第二天，通过与实施例1所记载的方法同样的方法，将所述质粒DNA各130ng使用转染试剂1μl导入HeLaS3细胞。

然后，在其24小时后，将基因导入的细胞通过与与实施例1所记载的方法同样的方法进行观察，在其中添加雷帕霉素或FK506至终浓度500nM，进一步在15分钟后进行观察。所得的结果示于图49。

如由图49所示的结果而明确的那样，通过对表达AG-mCAB、p62(PB1)-FKBP12和mTOR(FRB)-KO1的细胞添加雷帕霉素，而mTOR(FRB)与FKBP12的相互作用作为发出来源于KO1的荧光信号的荧光亮点被观察到。另一方面，通过添加FK506，mCAB与FKBP12的相互作用作为发出来源于AG的荧光信号的荧光亮点被观察到。

因此确认了，通过本发明，可以检测同一细胞中多种蛋白质间相互作用、特别是同一细胞中依赖于不同的刺激的多种蛋白质间相互作用。

另外，本发明可以提供通过这样检测同一细胞中参与信号传递的多种蛋白质间相互作用来检测、判别同一细胞中多种信号传递的方法。

进而，如在本实施例中也显示的那样，与在活细胞内进行蛋白质间相互作用的检测的其他方法FRET不同，不需要选择适合接纳体和供体的条件的荧光蛋白质，也不需要考虑激发接纳体荧光蛋白质的供体荧光蛋白质的荧光泄漏到和供体荧光蛋白质的荧光泄漏到检测接纳体荧光蛋白质的荧光的滤光器(吸收滤光器)组中的渗透(bleed through)。因此，在本发明中，可以容易地选择波长特性不同的多种荧光蛋白质，组合利用。

(实施例30)

＜蛋白质间相互作用的检测26＞

通过实施例2所述的方法，对于能否通过作为装配诱导蛋白质使用p62(PB1)、作为有多聚化能力的荧光蛋白质使用AG蛋白质的本发明的方法来检测表3所记载的公知的蛋白质间相互作用，进行试验。

表3

其结果虽未图示，但证实了对于任一组合均可以作为荧光亮点检测蛋白质间相互作用，显示本发明是通用的蛋白质间相互作用的检测方法。

产业可利用性

如以上说明的那样，通过本发明，可以将蛋白质间相互作用在其固有的细胞内环境下进行检测，另外可以检测蛋白质间相互作用的位置信息和时间信息。另外，在本发明中，因为蛋白质间相互作用的强弱与荧光亮点的荧光强度相关，所以在以所述荧光强度作为指标的参与蛋白质间相互作用的氨基酸残基的鉴定、调节蛋白质间相互作用的物质的筛选中，也可以利用方法。

因此，本发明的蛋白质间相互作用的检测方法等、以及用于这些方法的试剂盒，在通过生体内各种信号传递、各种生物体反应的控制等的阐明、以及疾病机理的阐明而进行的医药品等的开发中是有用的。

序列表自由文本

序列号1和2

＜223＞密码子人源化后的Azami Green(AG)

序列号3和4

＜223＞p62的PB1结构域

序列号5和6

＜223＞MEK5的PB1结构域

序列号7和8

＜223＞Nbr1的PB1结构域

序列号9和10

＜223＞PKCiota的PB1结构域

序列号11和12

＜223＞TFG的PB1结构域

序列号13和14

＜223＞TEL的SAM结构域

序列号15和16

＜223＞EphB2的SAM结构域

序列号17和18

＜223＞DGKdelta的SAM结构域

序列号19和20

＜223＞端锚聚合酶-1的SAM结构域

序列号21和22

＜223＞mTOR的FRB结构域

序列号23和24

＜223＞FKBP12

序列号25和26

＜223＞p53

序列号27和28

＜223＞MDM2

序列号29和30

＜223＞Sec5

序列号31和32

＜223＞RalB

序列号33和34

＜223＞RalB蛋白质Q72L突变体

序列号35和36

＜223＞RalB蛋白质S28N突变体

序列号37和38

＜223＞钙调蛋白

序列号39和40

＜223＞M13肽

序列号41和42

＜223＞HRas

序列号43和44

＜223＞cRaf

序列号45和46

＜223＞Smac

序列号47和48

＜223＞XIAP

序列号49和50

＜223＞BclX(L)

序列号51和52

＜223＞BAD

序列号53和54

＜223＞Rac1

序列号55和56

＜223＞PBD

序列号57

＜223＞人工合成的hAG正向引物1的序列

序列号58

＜223＞人工合成的hAG反向引物1的序列

序列号59

＜223＞人工合成的p62(PB1)正向引物1的序列

序列号60

＜223＞人工合成的p62(PB1)反向引物1的序列

序列号61

＜223＞人工合成的hAG正向引物2的序列

序列号62

＜223＞人工合成的hAG反向引物2的序列

序列号63

＜223＞人工合成的p62(PB1)正向引物2的序列

序列号64

＜223＞人工合成的p62(PB1)反向引物2的序列

序列号65

＜223＞人工合成的p62(PB1)正向引物3的序列

序列号66

＜223＞人工合成的p62(PB1)反向引物3的序列

序列号67

＜223＞人工合成的mTOR(FRB)正向引物的序列

序列号68

＜223＞人工合成的mTOR(FRB)反向引物的序列

序列号69

＜223＞人工合成的FKBP12正向引物的序列

序列号70

＜223＞人工合成的FKBP12反向引物的序列

序列号71

＜223＞人工合成的MEK(PB1)正向引物的序列

序列号72

＜223＞人工合成的MEK(PB1)反向引物的序列

序列号73

＜223＞人工合成的Nbr1(PB1)正向引物的序列

序列号74

＜223＞人工合成的Nbr1(PB1)反向引物的序列

序列号75

＜223＞人工合成的PKCiota(PB1)正向引物的序列

序列号76

＜223＞人工合成的PKCiota(PB1)反向引物的序列

序列号77

＜223＞人工合成的TFG(PB1)正向引物的序列

序列号78

＜223＞人工合成的TFG(PB1)反向引物的序列

序列号79

＜223＞人工合成的TEL(SAM)正向引物的序列

序列号80

＜223＞人工合成的TEL(SAM)反向引物的序列

序列号81

＜223＞人工合成的EphB2(SAM)正向引物的序列

序列号82

＜223＞人工合成的EphB2(SAM)反向引物的序列

序列号83

＜223＞人工合成的DGKdelta(SAM)正向引物的序列

序列号84

＜223＞人工合成的DGKdelta(SAM)反向引物的序列

序列号85

＜223＞人工合成的Tankyrase(SAM)正向引物的序列

序列号86

＜223＞人工合成的Tankyrase(SAM)反向引物的序列

序列号87

＜223＞人工合成的TFG(PB1)正向引物2的序列

序列号88

＜223＞人工合成的TFG(PB1)反向引物2的序列

序列号89

＜223＞人工合成的TEL(SAM)正向引物2的序列

序列号90

＜223＞人工合成的TEL(SAM)反向引物2的序列

序列号91

＜223＞人工合成的DGKdelta(SAM)正向引物2的序列

序列号92

＜223＞人工合成的DGKdelta(SAM)反向引物2的序列

序列号93

＜223＞人工合成的Tankyrase(SAM)正向引物2的序列

序列号94

＜223＞人工合成的Tankyrase(SAM)反向引物2的序列

序列号95

＜223＞人工合成的hKO1正向引物的序列

序列号96

＜223＞人工合成的hKO1反向引物的序列

序列号97

＜223＞人工合成的p53正向引物的序列

序列号98

＜223＞人工合成的p53反向引物的序列

序列号99

＜223＞人工合成的MDM2正向引物的序列

序列号100

＜223＞人工合成的MDM2反向引物的序列

序列号101

＜223＞人工合成的Sec5正向引物的序列

序列号102

＜223＞人工合成的Sec5反向引物的序列

序列号103

＜223＞人工合成的RalB正向引物的序列

序列号104

＜223＞人工合成的RalB反向引物的序列

序列号105

＜223＞人工合成的RalB(Q72L)突变引物的序列

序列号106

＜223＞人工合成的RalB(S28N)突变引物的序列

序列号107

＜223＞人工合成的钙调蛋白正向引物的序列

序列号108

＜223＞人工合成的钙调蛋白反向引物的序列

序列号109

＜223＞人工合成的M13肽正向引物的序列

序列号110

＜223＞人工合成的M13肽反向引物的序列

序列号111

＜223＞人工合成的AGNLS正向引物的序列

序列号112

＜223＞人工合成的AGNLS反向引物的序列

序列号113

＜223＞人工合成的HRas正向引物的序列

序列号114

＜223＞人工合成的HRas反向引物的序列

序列号115

＜223＞人工合成的KRas正向引物的序列

序列号116

＜223＞人工合成的KRas反向引物的序列

序列号117

＜223＞人工合成的HRas突变引物的序列

序列号118

＜223＞人工合成的cRaf正向引物的序列

序列号119

＜223＞人工合成的cRaf反向引物的序列

序列号120

＜223＞人工合成的Smac正向引物的序列

序列号121

＜223＞人工合成的XIAP正向引物的序列

序列号122

＜223＞人工合成的XIAP反向引物的序列

序列号123

＜223＞人工合成的BclX(L)正向引物的序列

序列号124

＜223＞人工合成的BclX(L)反向引物的序列

序列号125

＜223＞人工合成的BAD正向引物1的序列

序列号126

＜223＞人工合成的BAD正向引物2的序列

序列号127

＜223＞人工合成的BAD反向引物的序列

序列号128

＜223＞人工合成的Rac1正向引物的序列

序列号129

＜223＞人工合成的Rac1反向引物的序列

序列号130

＜223＞人工合成的PBD正向引物的序列

序列号131

＜223＞人工合成的PBD反向引物的序列

序列号132

＜223＞KO(Kusabira-Orange)单体型的碱基序列

序列号133

＜223＞KO(Kusabira-Orange)单体型的氨基酸序列

序列号134和135

＜223＞密码子人源化后的mAG1

序列号136和137

＜223＞mMiCy1

序列号138和139

＜223＞mKikGR1

序列号140和141

＜223＞KCy1

序列号142和143

＜223＞dAG(AB)

序列号144和145

＜223＞dAG(AC)

序列号146和147

＜223＞TGuv

序列号148和149

＜223＞Momiji

序列号150和151

＜223＞COR3.01

序列号152和153

＜223＞DsRed2

序列号154、159和160

＜223＞人工合成的引物的序列

序列号155、157、161、163、165、167和169

＜223＞人工合成的多核苷酸的序列

序列号156、158、162、164、166、168和170

＜223＞人工合成的多肽的序列

序列号171和172

＜223＞COR5

Claims

1.用于检测第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，为了检测所述相互作用的发生或消失、至该相互作用的发生或消失所需的时间、或该相互作用的持续时间，而检测所述荧光亮点。

3.根据权利要求1所述的方法，为了检测对特定刺激进行应答的所述相互作用的发生或消失、至该相互作用的发生或消失所需的时间、或该相互作用的持续时间，而检测所述荧光亮点。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，是用于筛选与特定蛋白质相互作用的蛋白质的方法，第1蛋白质和第2蛋白质的任一方是该特定蛋白质，另一方是被检蛋白质，通过所述荧光亮点的检测来选择与该特定蛋白质相互作用的蛋白质。

5.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，是用于鉴定参与所述相互作用的第1蛋白质中的氨基酸残基或第2蛋白质中的氨基酸残基的方法，使用在该第1蛋白质和该第2蛋白质的任一方中导入了突变的蛋白质，在所述荧光亮点的强度与使用未导入突变的蛋白质时相比减弱的情况下，判定为导入了该突变的氨基酸残基参与所述相互作用。

6.用于筛选调节第1蛋白质与第2蛋白质的相互作用的物质的方法，包括：

7.根据权利要求1～6的任一项所述的方法，所述装配诱导蛋白质是选自p62的PB1结构域、TFG的PB1结构域、PKCiota的PB1结构域、TEL的SAM结构域、DGKdelta的SAM结构域和端锚聚合酶-1的SAM结构域中的至少一种蛋白质。

8.用于筛选装配诱导蛋白质的方法，包括：

9.根据权利要求1～8的任一项所述的方法，所述有多聚化能力的荧光蛋白质是选自单体Kusabira-Orange2、Azami-Green、Kusabira-Orange1、二聚体Keima-Red、Kikume Green-Red、单体Keima-Red、单体Midoriishi-Cyan1、单体Kusabira-Orange1、单体Kikume Green-Red1、Midoriishi-Cyan1、Kusabira-Cyan1、二聚体Azami-Green(AB)、二聚体Azami-Green(AC)、TGuv、Momiji、COR3.01、COR5和DsRed2中的至少一种荧光蛋白质。

10.用于权利要求1～9的任一项所述的方法的试剂盒，包含选自下述(a)～(j)中的至少一种物质和使用说明书，

(d)编码第1融合蛋白质的载体；

(e)编码第2融合蛋白质的载体；

(g)包含(b)所记载的载体和(c)所记载的载体的载体组；

(h)保持编码第1融合蛋白质的载体的转化细胞；

(i)保持编码第2融合蛋白质的载体的转化细胞；