JP5019771B2 - 蛍光蛋白質を用いた蛋白質の相互作用の分析方法 - Google Patents

蛍光蛋白質を用いた蛋白質の相互作用の分析方法 Download PDF

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Description

本発明は、蛍光蛋白質を用いた蛋白質の相互作用の分析方法、及び上記分析方法を行うためのキットに関する。
クラゲのエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的(semi-rational)突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
一方、蛋白質のコンプリメンテーションは古くからある手法であり、ある蛋白質を分割して、また元に戻すという方法である。オワンクラゲ由来のＧＦＰにおいても行なわれており、ＧＦＰを二つに分割して発現させ、結合させて蛍光を測定する。この系で問題となるのは、（１）時間情報が得られないために、いつ相互作用（結合）したのかわからないこと、並びに（２）前述に関連して、結合によって移動するような分子の場合、結合後の履歴が残らないために移動を追跡できないことなどが挙げられる。
Hu CD, Kerppola TK. Nat Biotechnol. 2003 May; 21(5):539-45 Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK. Mol Cell. 2002 Apr; (9):789-98
本発明は、蛋白質の相互作用を分析する方法であって、時間情報が得られ、かつ蛋白質の移動を追跡できるような方法を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質を用いて、これをＮ末端側断片とＣ末端側断片の二つに分割して発現させ、次いで互いに結合させて蛍光を測定することによって、２種類の被験蛋白質の相互作用の時間経過を蛍光比で検出することが可能になり、また当該蛋白質の結合後の移動も追跡できることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質をＮ末端側断片とＣ末端側断片とに分割し、該Ｎ末端側断片と第一の被験蛋白質との融合蛋白質と、該Ｃ末端側断片と第二の被験蛋白質との融合蛋白質とを共存させることによって該第一の被験蛋白質と該第二の被験蛋白質とを相互作用させ、該相互作用による蛍光の変化を検出することによって、第一の被験蛋白質と第二の被験蛋白質との相互作用を分析する方法が提供される。
好ましくは、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質は、 配列番号２に記載のアミノ酸配列において７０番目のアミノ酸であるプロリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質である。
さらに好ましくは、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質は、以下の何れかの蛍光蛋白質である。
（１）配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質；又は
（２）配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、時間の経過によって緑色からオレンジ色へと蛍光特性が変化する蛍光蛋白質。
本発明の別の側面によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において７０番目のアミノ酸であるプロリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質のＮ末端側断片をコードする遺伝子と、当該蛍光蛋白質のＣ末端側断片をコードする遺伝子との組み合わせを含む、蛋白質間の相互作用を分析するためのキットが提供される。
好ましくは、上記蛍光蛋白質は以下の何れかの蛍光蛋白質である。
（１）配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質；又は
（２）配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、時間の経過によって緑色からオレンジ色へと蛍光特性が変化する蛍光蛋白質。
ＧＦＰのコンプリメンテーションの系で問題となるのは、（１）時間情報が得られないために、いつ相互作用（結合）したのかわからないこと、並びに（２）結合によって移動するような分子の場合、結合後の履歴が残らないために移動の足跡はたどれないことが挙げられるが、本発明ではこの問題を解決することができる。本発明によれば、時間経過による、例えばグリーンからオレンジへと蛍光特性の変化する変異体で、且つ、蛍光特性を維持したままコンプリメンテーションにより蛍光を発することができる変異体を用いた蛋白質間の相互作用の分析方法及び分析キットが提供される。例えば、グリーンからオレンジへと蛍光特性の変化する変異体によるのコンプリメンテーションの測定系を用いれば、時間経過をグリーンとオレンジの比で検出することが可能となる。また、例えば、細胞の形質膜で相互作用（結合）して核に移行するような現象をグリーンとオレンジの比から観察することによって、相互作用（結合）後の足跡をたどることが可能となる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明では、蛍光蛋白質単量体Kusabira-Orange（mKO）に変異を導入し、グリーンからオレンジへと蛍光特性の変化する変異体mKO-FM14を作製した。この変異体は時間経過に伴い蛍光特性をグリーンからオレンジへと変化させる。このmKO-FM14を２つに分割してそのN末端側の分子（アミノ酸配列で１番−１６８番）とC末端側分子（アミノ酸配列で１６９番−２１８番）にそれぞれ違う相互作用する蛋白質を遺伝子的につなげた蛋白質を作製した。その相互作用する蛋白質同士が結合すると、mKO-FM14のN末端側分子とC末端側分子もそれに応じて結合して分子内に発色団を形成して蛍光を発し、グリーンからオレンジへと蛍光特性を変化させた。すなわち、この手法を用いると、ターゲット蛋白質間の相互作用（結合）とその後の履歴をin vitroにおいてもin vivoにおいても測定する事ができる。実際に相互作用することが知られているロイシンジッパーを、mKO-FM14のN末端側分子とC末端側分子のC末端側に遺伝子的に融合して相互作用解析を行なった。ロイシンジッパーはロイシンジッパーアシディック（LZA）とロイシンジッパーベーシック（LZB）を使用した。LZAはネガティブチャージを、LZBはポジティブチャージを持ち、LZA同士、LZB同士では結合せず、LZAとLZBが一対一で結合する（図１）。
本発明では、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質をＮ末端側断片とＣ末端側断片とに分割して使用する。
時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質の種類は特に限定されず、例えば、ＧＦＰ又はその変異体（例えば、ＣＦＰ又はＹＦＰなど）に変異を導入することによって所望の蛋白質を取得してもよいが、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列（蛍光蛋白質単量体Kusabira-Orange（mKO）のアミノ酸配列）において７０番目のアミノ酸であるプロリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質を使用することができる。このような蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかの蛍光蛋白質を挙げることができる。
（１）配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質；又は
（２）配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、時間の経過によって緑色からオレンジ色へと蛍光特性が変化する蛍光蛋白質。
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
また、所定のアミノ酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができ、これを用いて変異を有するアミノ酸配列からなる蛋白質を取得することができる。このような公知の技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載されている。
本発明では、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質のＮ末端側断片と第一の被験蛋白質との融合蛋白質と、該蛍光蛋白質のＣ末端側断片と第二の被験蛋白質との融合蛋白質を使用する。また、用いる分割蛍光蛋白質としては、多量体形成型蛍光蛋白質より単量体形成型変異蛍光蛋白質のほうがより好ましい。多量体形成型では凝集により融合した被験蛋白の相互作用アッセイに影響がある場合がある。
本発明で用いる被験蛋白質としては、互いに相互作用する２種類の蛋白質の組み合わせを使用することができる。互いに相互作用する２種類の被験蛋白質のそれぞれを第一の被験蛋白質及び第二の被験蛋白質として使用し、各被験蛋白質を時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質のＮ末端側断片とＣ末端側断片とにそれぞれ融合させる。
本発明で用いる融合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよいが、好ましくは組み換え蛋白質である
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１〜１２に記載した塩基配列及びアミノ酸配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、これらの蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、これらの蛍光蛋白質のＮ末端側断片とＣ末端側断片をそれぞれコードするＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明では、時間経過によって異なる色の蛍光を発することができる蛍光蛋白質のＮ末端側断片と第一の被験蛋白質との融合蛋白質と、該蛍光蛋白質のＣ末端側断片と第二の被験蛋白質との融合蛋白質とを共存させることによって該第一の被験蛋白質と該第二の被験蛋白質とを相互作用させ、該相互作用による蛍光の変化を検出することによって、第一の被験蛋白質と第二の被験蛋白質との相互作用を分析する。
例えば、上記のようにして取得した２種類の融合蛋白質をコードする各々のＤＮＡを、細胞内で同時に発現させることによって、２種類の融合蛋白質を互いに共存させることができる。あるいは、２種類の融合蛋白質をそれぞれ予め作製し、作製した２種類の融合蛋白質を混合することによって共存させることもできる。
２種類の融合蛋白質をコードする各々のＤＮＡを細胞内で同時に発現させることによって、２種類の融合蛋白質を細胞内で共存させる場合には、発現ベクターを用いることができる。発現ベクターにおいて融合蛋白質をコードするＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillusstearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
融合蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製し、この形質転換体における蛍光を観察することによって宿主内での蛋白質間相互作用を解析することができる。
組み換え発現ベクターを導入する宿主細胞は、２種類の融合蛋白質を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することができる。
本発明では、上記のようにして第一の被験蛋白質と該第二の被験蛋白質とを細胞内又は細胞外で相互作用させ、該相互作用による蛍光の変化を検出することによって、第一の被験蛋白質と第二の被験蛋白質との相互作用を分析することができる。細胞内で被験蛋白質同士の相互作用を分析する場合には、形質転換体における蛍光を観察することにより分析を行うことができる。
蛍光の観察は、例えば、蛍光顕微鏡や画像解析装置などを用いて行うことが可能である。顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。なお、フィルターセットは、使用する蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：点変異導入による多量体形成阻害変異体ｍＫＯの作製
KO−１のアミノ酸配列から多量体形成界面を予測し、多量体形成界面のアミノ酸を置換し、なおかつ蛍光特性を保持するようKO−１の単量体化を行った。点変異導入はKO−１を挿入した大腸菌発現ベクター（pRSET B）（国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載のKO-1をコードするDNAを有する発現ベクター）で点変異導入プライマーを用いて行った。具体的には鋳型プラスミドの片側鎖に複数の変異導入プライマーを同時にアニールさせ、ポリメラーゼで伸長させる。各プライマーにより伸長された各DNA断片を同反応液中でDNAリガーゼを用いてつなぎ、変異導入された部分以外が鋳型と相補的なものを得るという手法を行った。DNAリガーゼで各DNA断片をつなぐ際にDNAの末端にリン酸基を必要とするため、用いたプライマーは5'側のリン酸化を行った。
（１）プライマーの5'リン酸化
100μM プライマー 2μl
10× T4 polynucleotide kinase buffer 5μl
100μM ATP 0.5μl
滅菌水 41.5μl
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) 1μl
上記混合物を37℃で30分間インキュベートした。ここでプライマーとしては、以下の配列番号２９から４３に記載の塩基配列を有するプライマーを使用した。
K11R, F13Y
CCAGAGATGAAGATGAGGTACTACATGGACGGC（配列番号２９）
V25I
CATGAGTTCACAATTGAAGGTGAAGGC（配列番号３０）
K32R
GAAGGCACAGGCAGACCTTACGAGGGA（配列番号３１）
S55A
CCAATGCCTTTCGCGTTTGACTTAGTG（配列番号３２）
T62V
TTAGTGTCACACGTGTTCTGTTACGGC（配列番号３３）
Q96E
GAAAGGTCGTTGGAGTTCGAAGATGGT（配列番号３４）
F102S, A104S
GAAGATGGTGGGTCCGCTTCAGTCAGTGCG（配列番号３５）
C115T, E117Y
AGCCTTAGAGGAAACACCTTCTACCACAAATCCA（配列番号３６）
V123T
CAAATCCAAATTTACTGGGGTTAACTTTCCTG（配列番号３７）
V133I
GCCGATGGTCCTATCATGCAAAACCAAAGT（配列番号３８）
S139V
GCCGATGGTCCTATCATGCAAAACCAAAGTGTTGATTGGGAGCCA（配列番号３９）
T150A, C151S
GAGAAAATTACTGCCAGCGACGGAGTTCTGAAG（配列番号４０）
F162Y, A166E
GATGTTACGATGTACCTAAAACTTGAAGGAGGCGGCAATCAC（配列番号４１）
Q190G, F193Y, G195S
CTTAAAATGCCAGGAAGCCATTACATCAGCCATCGCCTCGTCAGG（配列番号４２）
C217S
GATGCAGTAGCTCATTCCCTCGAGCACCACCACC（配列番号４３）
（２）点変異導入PCR
5'リン酸化プライマー 4μl
template(KO−pRSET B) 100ng
10× polymerase buffer 2.5μl
10× DNA ligase buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 1μl
polymerase（pfu）2.5U/μl 1μl
Taq DNA ligase 40U/μl 0.5μl
滅菌水で計50μlとする。
プログラム：
サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
1）65℃ 5 min
2）95℃ 2 min
3）95℃ 20 sec
4）52℃ 20 sec
5）65℃ 8 min
上記の３）〜５）を25サイクル繰り返す
6）75℃ 7 min
7）4℃ hold
（３）Dpn1処理
PCR後のサンプルにDpn1を1μl加えて37℃に1時間インキュベートしてテンプレートプラスミドを切断した。
（４）大腸菌への形質転換
Dpn1処理後のサンプルを大腸菌JM109に形質転換して変異導入後のKO-1を発現させた。
（５）単量体化Kusabira-Orange（ｍKO）のアミノ酸配列
変異導入後のKO変異体の塩基配列を解析し、アミノ酸配列を決定した。その結果、11番目のリジン（K）をアルギニン（R）に、13番目のフェニルアラニン（F）をチロシン（Y）に、25番目のバリン（V）をイソロイシン（I）に、32番目のリジン（K）をアルギニン（R）に、55番目のセリン（S）をアラニン（A）に、62番目のトレオニン（T）をバリン（V）に、96番目のグルタミン（Q）をグルタミン酸（E）に、102番目のフェニルアラニン（F）をセリン（S）に、104番目のアラニン（A）をセリン（S）に、115番目のシステイン（C）をトレオニン（T）に、117番目のグルタミン酸（E）をチロシン（Y）に、123番目のバリン（V）をトレオニン（T）に、133番目のバリン（V）をイソロイシン（I）に、139番目のセリン（S）をバリン（V）に、150番目のトレオニン（T）をアラニン（A）に、151番目のシステイン（C）をセリン（S）に、162番目のフェニルアラニン（F）をチロシン（Y）に、166番目のアラニン（A）をグルタミン酸（E）に、190番目のグルタミン（Q）をグリシン（G）に、193番目のフェニルアラニン（F）をチロシン（Y）に、195番目のグリシン（G）をセリン（S）に、217番目のシステイン（C）をセリン（S）に置換されていた。さらにKozak配列付加のため2番目のセリン（S）の前にバリン（V）を導入した。この変異体をmKOとした。mKOの塩基配列を配列表の配列番号１に記載し、アミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。
大腸菌を用いてmKOにHis-Tagを付加した蛋白質を常法により発現させ、Ni-Agaroseを用いて精製した。
実施例２：蛍光特性の解析
実施例１で精製したmKO蛋白質の蛍光及び吸収スペクトルを以下の通り測定し、量子収率およびモル吸光係数を算出した。
20μM蛍光蛋白、50mM HEPES pH7.5溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。mKOでは548nmに吸収のピークが認められ、500nmにおける吸収が0.0025となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈して、500nmで励起した時の蛍光スペクトルと590nmにおける蛍光による励起スペクトルを測定した。DsRed(CLONTECH)を同様に500nmにおける吸収が0.0025となるようにして蛍光スペクトルを測定し、DsRedの量子収率を0.29としてmKOの量子収率を求めた。
結果を表１に示す。表１には、国際公開ＷＯ０３／５４１９１号公報に記載のKO蛋白質（二量体蛋白質）のデータも併記する。
実施例３：超遠心分析による分子量の測定
ｍKO蛋白質溶液を150mM KCl,50mM HEPES-KOH pH7.4とした。ｍKOの分子量決定のため超遠心分析をおこなった。超遠心機XL-1（ベックマン・コールター）を用いて25,000rpm、22時間遠心して、ｍKOの吸収極大（548nm）付近の540nmの吸収を測定した。その測定結果からｍKOの分子量は28ｋDaと計算された。これはアミノ酸配列から予測される26kDaとほぼ一致し、ｍKOが単量体として存在することが確認された。
実施例４：緑色とオレンジ色の2蛍光を発するmKOの変異体の作製（時間経過測定プローブおよび追跡プローブ）
mKOのアミノ酸を置換し、mKOとは異なった蛍光特性を持つ蛍光蛋白質の作製を行った。mKOは翻訳されてからすぐは緑の蛍光を放ち、その後オレンジ色の蛍光を放つようになる。しかし、緑色蛍光からオレンジ色蛍光への移行はすばやく完了するために、通常はほとんど見られない。そこで、いろいろな時間経過に伴って緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比の異なる蛍光蛋白質を作製した。この変異体を使用することによって蛋白質発現からの時間を緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比で測定することができる。また、この変異体は緑色蛍光とオレンジ色蛍光が独立しているために、オレンジ色蛍光のみを消光させることができた。つまり、オレンジ色蛍光のみを消光させて、オレンジ色蛍光の増加を測定すれば、時間経過測定のリセットも可能となる。さらに、同じくオレンジ色のみ任意の部分を消光して、緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比で測定すれば消光した部分のラベルした分子や細胞などの挙動を測定することもできる。結果としてわかったことは70番目のプロリン（P）をアミノ酸置換することにより、多様な、時間経過に伴って緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比の異なる蛍光蛋白質を作製できることであった。
（１）変異導入
mKOのアミノ酸を置換し、mKOとは異なった蛍光特性を持つ蛍光蛋白質の作製を行った。点変異導入はmKOを挿入した大腸菌発現ベクター（pRSETB）に点変異導入プライマーをもちいてPCRをかけることにより行った。PCRに用いたプライマーは5'側のリン酸化を行った。
(a）プライマーの5'リン酸化
100μM primer 2μl
10× T4 polynucleotide kinase buffer 5μl
100μM ATP 0.5μl
滅菌水 41.5μl
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) 1μl
37℃で30分間インキュベートした。
(b）点変異導入PCR
5'リン酸化プライマー 4μl
template(mKO−pRSET B) 100ng
10× polymerase buffer 2.5μl
10× DNA ligase buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 1μl
polymerase（pfu）2.5U/μl 1μl
Taq DNA ligase 40U/μl 0.5μl
滅菌水で計50μlとする。
プログラム
サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
1）65℃ 5 min
2）95℃ 2 min
3）95℃ 20 sec
4）52℃ 20 sec
5）65℃ 8 min
6）75℃ 7 min
7）4℃ hold
３）〜５）を25サイクル
(c）Dpn1処理
PCR後のサンプルにDpn1を1μl加えて37℃に1時間インキュベートしてテンプレートプラスミドを切断した。
(d）大腸菌への形質転換
Dpn1処理後のサンプルを大腸菌JM109(DE3)に形質転換して変異導入後のmKOを発現させ解析を行なった。
（２）mKO時間経過変異体の解析
作製されたmKOの変異体は塩基配列の解析により、49番目のリジン（K）をグルタミン酸（E）に、70番目のプロリン（P）をグリシン（G）に、185番目のリジン（K）をグルタミン酸（E）に、188番目のリジン（K）をグルタミン酸（E）に、192番目のセリン（S）をアスパラギン酸（D）に、196番目のセリン（S）をグリシン（G）にアミノ酸置換されていた。このmKOの変異体は時間経過に伴って緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比の異なる蛍光蛋白質であった。このmKOの変異体の70番目のプロリン（P）をいろいろなアミノ酸に置換することにより、時間経過に伴う緑色蛍光とオレンジ色蛍光の比が変化する速度が変わった。
バリン（V）に置換された変異体をmKO-FM14とした（アミノ酸配列を配列番号４に示し、塩基配列を配列番号３に示す）。
アラニン（A）に置換された変異体をmKO-FM5とした（アミノ酸配列を配列番号６に示し、塩基配列を配列番号５に示す）。
セリン（S）に置換された変異体をmKO-FM3とした（アミノ酸配列を配列番号８に示し、塩基配列を配列番号７に示す）。
システイン（C）に置換された変異体をmKO-FM20とした（アミノ酸配列を配列番号１０に示し、塩基配列を配列番号９に示す）。
トレオニン（T）に置換された変異体をmKO-FM24とした（アミノ酸配列を配列番号１２に示し、塩基配列を配列番号１１に示す）。
それぞれのmKO時間経過変異体の測定は大腸菌JM109(DE3)で発現させたリコンビナント蛍光蛋白質でおこなうか、in vitroトランスレーションシステムPURE SYSTEM CLASSIC MINI（ポストゲノム研究所）を使用した。大腸菌での測定は各変異体を発現させた培養プレートを37℃に保温し、時間を追ってサンプリングして580nmの励起スペクトルを測定した。その結果、緑蛍光の励起ピークである約500nmのピークにくらべ、オレンジ蛍光の励起ピークである548nmのピークが時間により増加し、各変異体によってその増加率は違った。緑蛍光のピークは509nm、オレンジ蛍光のピークは560nmであった。蛍光測定には蛍光分光光度計F-2500（HITACHI）を使用した。大腸菌内では新たな蛋白質が断続的に生産されるために、緑からオレンジへの推移に必要とされる時間が見かけ上長くなってしまう。そこで、in vitroトランスレーションシステムを使用することによって蛋白質の生産時間を限定し、より正確な時間に伴う緑からオレンジへの推移を測定した。蛋白質合成時間は1時間とした。その直後にATPなどのタンパク質合成に必要なエネルギー源をゲルろ過で除き、37℃に保温して合成後25時間まで580nmの励起スペクトルを測定した。
実施例５：コンストラクション
mKO-FM14をテンプレートに、mKO-FM14のアミノ酸配列のN末端側１番−１６８番（mKO-FM14-N）とC末端側１６９番−２１８番（mKO-FM14-C）を別々にPCRで増幅した。C末端側１６９番グリシン（G）の前に翻訳開始のメチオニン（M）を付加するようにプライマーを設計した。
mKO-FM14 N末端側(１番−１６８番)増幅用プライマー
AAAAAGCTTACCATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAGATG (primer1)（配列番号４４）
TGCAGAATTCCCTCCTTCAAGTTTTAGGTACATCGT (primer2)（配列番号４５）
mKO-FM14 C末端側(１６９番−２１８番)増幅用プライマー
AAAAAGCTTACCATGGGCGGCAATCACAAATGCCAATTC (primer3)（配列番号４６）
TGCAGAATTCCCGGAATGAGCTACTGCATCTTC (primer4)（配列番号４７）
PCR反応液組成
テンプレート（ｍKO-FM14） 1 μl
X10 pfu バッファー 5 μl
2.5 mM dNTPs 4 μl
20μM primer1 or 3 1 μl
20μM primer2 or 4 1 μl
ミリQ 37 μl
DMSO 5 μl
pfu DNApolymerase(5 U/μl) 1 μl
PCR反応条件
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒 (変性)
52℃ 30秒 (鋳型へのプライマーのアニーリング)
72℃ 1分 (プライマー伸長)
72℃ 7分(最後の伸長)
4℃ 保持
増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、切り出して精製した。制限酵素HindIII-EcoRIで切断し精製してコンストラクションに使用した。
LZA（アミノ酸配列はRAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQK）（配列番号４８）およびLZB（アミノ酸配列はRAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQK）（配列番号４９）はDNA合成により作製した。mKO-FM14-NとLZA（mKO-FM14-N-LZA）、mKO-FM14-CとLZB（mKO-FM14-C-LZB）を遺伝子的に融合した。融合部分にはリンカーとしてGNSADGGGGSGGGGSGGGGSIHHTGG（配列番号５０）の26アミノ酸を挿入した。mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBはそれぞれ発現ベクターpCDNA3(Invitrogen)のHindIII-XhoIサイトにサブクローニングして以下の実験に使用した（mKO-FM14-N-LZA-pCDNA3、mKO-FM14-C-LZB-pCDNA3）。
実施例６：インビトロトランスレーションでの蛋白質合成
mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBの相互作用を解析するためにインビトロトランスレーションで蛋白質合成を行なった。インビトロトランスレーションでの蛋白質合成にはPureSystem(ポストゲノム研究所)を用いた。キットの説明書に従い、PCRで2回増幅しインビトロトランスレーションでの蛋白質合成用テンプレートとした。
1回目PCR用のmKO-FM14-N-LZAの増幅用プライマー
AAGGAGATATACCAATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAG (primer5)（配列番号５１）
TATTCATTACTTCTGGGCCAG (primer6)（配列番号５２）
1回目PCR用のmKO-FM14-C-LZBの増幅用プライマー
AAGGAGATATACCAATGGGCAATCACAAATGCCAATTC (primer7)（配列番号５３）
TATTCATTACTTCTGGGCCAG (primer6)（配列番号５２）
1回目PCR反応液組成
テンプレート（mKO-FM14-N-LZA-pCDNA3 or mKO-FM14-C-LZB-pCDNA3）1 ul
X10 pfu バッファー 5 μl
2.5 mM dNTPs 4 μl
2μM primer5 or 7 1 μl
2μM primer6 1 μl
ミリQ 32 μl
DMSO 5 μl
pfu DNApolymerase(5 U/μl) 1 μl
PCR反応条件
94℃ 1 分(PAD)
94℃ 30 秒 (変性)
42℃ 30 秒 (鋳型へのプライマーのアニーリング)
72℃ 1 分 (プライマー伸長)
72℃ 7 分 (最後の伸長)
4℃ 保持
各増幅産物を50倍希釈してテンプレートとして2回目のPCRを行なった。
2回目PCR用のmKO-FM14-N-LZAの増幅用プライマー
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (primer8：キットに付属)（配列番号５４）
TATTCATTACTTCTGGGCCAG (primer6)（配列番号５２）
2回目PCR用のmKO-FM14-C-LZBの増幅用プライマー
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (primer8：キットに付属)（配列番号５４）
TATTCATTACTTCTGGGCCAG (primer6)（配列番号５２）
２回目PCR反応液組成
テンプレート（1回目PCR増幅産物をそれぞれ50倍希釈） 1 μl
X10 taq バッファー 5 μl
2.5 mM dNTPs 4 μl
2μM primer8 1 μl
2μM primer6 1 μl
ミリQ 37 μl
taq DNApolymerase(5 U/μl) 1 μl
PCR反応条件
94℃ 1 分(PAD)
94℃ 30 秒 (変性)
42℃ 30 秒 (鋳型へのプライマーのアニーリング)
72℃ 1 分 (プライマー伸長)
72℃ 7 分 (最後の伸長)
4℃ 保持
2回目のPCR増幅産物5μlを一回のインビトロトランスレーションに使用した。インビトロトランスレーションはキットの方法に準じた。タンパク質合成は37℃で1時間行い、測定に使用した。
同じく、ネガティブコントロールとしてロイシンジッパー含まないmKO-FM14-NとmKO-FM14-Cのインビトロトランスレーション用テンプレートも同様に作製した。PCRのテンプレートはmKO-FM14-N-LZA-pCDNA3とmKO-FM14-C-LZB-pCDNA3を用いた。それぞれリンカーとロイシンジッパーが翻訳されないようにリンカーの前にストップコドンがはいるリバースプライマーを設計して前述と同様に2回PCRを行なった。結果としてロイシンジッパー含まないmKO-FM14-NとmKO-FM14-CのPCR増幅産物を得た。このPCR増幅産物5ulを一回のインビトロトランスレーションに使用した。
1回目PCR用のmKO-FM14-Nの増幅用プライマー
AAGGAGATATACCAATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAG (primer5)（配列番号５１）
TATTCATTATCCTTCAAGTTTTAGGTACAT (primer9)（配列番号５５）
1回目PCR用のmKO-FM14-Cの増幅用プライマー
AAGGAGATATACCAATGGGCAATCACAAATGCCAATTC (primer7)（配列番号５３）
TATTCATTAGGAATGAGCTACTGCATCTTCTACCA (primer10)（配列番号５６）
2回目PCR用のmKO-FM14-Nの増幅用プライマー
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (primer8：キットに付属)（配列番号５４）
TATTCATTATCCTTCAAGTTTTAGGTACAT (primer9)（配列番号５５）
2回目PCR用のmKO-FM14-Cの増幅用プライマー
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (primer8：キットに付属)（配列番号５４）
AAGGAGATATACCAATGGGCAATCACAAATGCCAATTC (primer7)（配列番号５３）
TATTCATTAGGAATGAGCTACTGCATCTTCTACCA (primer10)（配列番号５６）
実施例７：mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBの相互作用解析
インビトロトランスレーションで合成したmKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBのそれぞれ20ulをPBS 1000ulに加え、トータル1040ulとした。その混合液を37℃に静置して、2時間おき（混合してから3時間、5時間、7時間）に蛍光測定を行なった。蛍光測定はF-2500（HITACHI）で行なった。測定方法は二波長励起一波長測光（580nmでの励起スペクトル、グリーン成分は500nm、オレンジ成分は548nmに設定）、または二波長励起二波長測光（470nmで励起したときのグリーン蛍光509nmと520nmで励起したときのオレンジ蛍光560nmを取得）で行なった（図２）。また、ネガティブコントロールとして、相互作用をする分子をつないでいない、インビトロトランスレーションで合成したmKO-FM14-NとmKO-FM14-Cのそれぞれ20ulをPBS 1000ulに加え、トータル1040ulとした。その混合液を37℃に静置して、2時間おき（混合してから3時間、5時間、7時間）に蛍光測定を行なった。蛍光測定はF-2500（HITACHI）で行なった。結果としてmKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合して静置したもの時間に伴う蛍光の増加とオレンジ/グリーン比の増加が見られた。また、mKO-FM14-NとmKO-FM14-Cにおいては蛍光の増加は見られず（図３、４）、LZAとLZBの結合（相互作用）依存的に蛍光蛋白質mKO-FM14のグリーンからオレンジへの成熟過程が観測された。
実施例８：成熟時間の違うmKO 変異体によるLZAとLZBの相互作用解析
mKOの70番目のプロリン（P）をいろいろなアミノ酸に置換することにより、時間経過に伴うグリーン色蛍光とオレンジ色蛍光の比が変化する変異体が得られている。70番目のプロリン（P）をアラニン（A）に置換された変異体はmKO-FM5、セリン（S）に置換された変異体はmKO-FM3、システイン（C）に置換された変異体はmKO-FM20、トレオニン（T）に置換された変異体はmKO-FM24、バリン（V）に置換された変異体はmKO-FM14である。それぞれの変異体を同様に2つの分子に分けて、同様にLZAとLZBをつなげたものでも解析を行なった。変異部分は70番目のアミノ酸であるため、各変異体のN末端側（１番から１６８番）にLZAを遺伝子的に融合したもののみ作製して、変異体の性質に影響を与えないC末端側（１６９番から２１８番）は同じくmKO-FM14-C-LZBを使用し測定を行なった。方法は前述に準じた。蛍光測定は混合後1時間から12時間まで行なった。その結果、各変異体においてもLZAとLZBの結合（相互作用）依存的に蛍光蛋白質のグリーンからオレンジへの成熟過程が観測された。また、変異体により蛍光強度や成熟具合（時間）にバリエーションが見られ、用途に応じて使い分けられると考えられた（図５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６）。
なお、上記の実施例で用いた構築物の塩基配列とアミノ酸配列は、下記の通り配列表に示す。
mKO-FM14-N-LZAの塩基配列（配列番号１３）
mKO-FM14-N-LZAのアミノ酸配列（配列番号１４）
mKO-FM14-C-LZBの塩基配列（配列番号１５）
mKO-FM14-C-LZBのアミノ酸配列（配列番号１６）
mKO-FM14-Nの塩基配列（配列番号１７）
mKO-FM14-Nのアミノ酸配列（配列番号１８）
mKO-FM14-Cの塩基配列（配列番号１９）
mKO-FM14-Cのアミノ酸配列（配列番号２０）
mKO-FM20-N-LZAの塩基配列（配列番号２１）
mKO-FM20-N-LZAのアミノ酸配列（配列番号２２）
mKO-FM3-N-LZAの塩基配列（配列番号２３）
mKO-FM3-N-LZAのアミノ酸配列（配列番号２４）
mKO-FM5-N-LZAの塩基配列（配列番号２５）
mKO-FM5-N-LZAのアミノ酸配列（配列番号２６）
mKO-FM24-N-LZAの塩基配列（配列番号２７）
mKO-FM24-N-LZAのアミノ酸配列（配列番号２８）
実施例９：mKO-FM14-N-p21とmKO-FM14-C-PCNAの細胞内相互作用解析
mKO-FM14-NのC末端側とmKO-FM14-CのC末端側に相互作用することがわかっている蛋白質をそれぞれ融合してHeLa細胞で発現させ、細胞内での相互作用後の経緯を測定した。
mKO-FM14-NのC末端側にはp21を、mKO-FM14-CのC末端側にはPCNAを遺伝子的に繋いだモチーフを作製した。p21は別名をWAF1、Sdi1またはCip1といい、全長164アミノ酸からなる蛋白質である。p21はp53によって発現誘導されることが知られており、老化の進んだ細胞に特異的に高発現している遺伝子として単離された。PCNA（proliferating cell nuclear antigen）は261アミノ酸からなり、ホモ3量体を形成するDNA複製・修復関連因子として知られる核で機能する蛋白質である。p21はPCNAと結合してDNA複製に作用すると考えられている。p21はPCNAや細胞周期調節因子と結合する事により、細胞増殖を停止する方向に働く。
mKO-FM14-N-LZA-pCDNA3をNotI、XhoIで切断してLZA部分 を抜き出し、NotI、XhoI 認識配列をPCRで付加したp21を挿入してmKO-FM14-N-p21-pCDNA3を構築した。同じくmKO-FM14-C-LZB-pCDNA3をNotI、XhoIで切断してLZB部分 を抜き出し、NotI、XhoI 認識配列をPCRで付加したPCNAを挿入してmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3を構築した。
p21増幅用プライマー
ACTGGCGGCCGCATGTCAGAACCGGCTGGGGATGT (primer11)（配列番号６３）
GGGCTCGAGTTAGGGCTTCCTCTTGGAGAAGAT (primer12) （配列番号６４）
PCNA増幅用プライマー
ACTGGCGGCCGCATGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCA (primer13) （配列番号６５）
GGGCTCGAGTTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATCTT (primer14) （配列番号６６）
PCR反応液組成
テンプレート（HeLa-cDNAライブラリー） 1μl
X10 pfu バッファー 5μl
2.5 mM dNTPs 4μl
20 μM primer11又は13 1μl
20 μM primer12又は14 1μl
ミリQ 37μl
DMSO 5μl
pfu DNApolymerase(5 U/μl) 1μl
PCR反応条件
94℃ 1分(PAD)
94℃ 30秒 (変性)
52℃ 30秒 (鋳型へのプライマーのアニーリング)
72℃ 1 分 (プライマー伸長)
72℃ 7 分 (最後の伸長)
4℃ 保持
増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、切り出して精製した。その後、制限酵素NotIとXhoIで切断し精製してコンストラクションに使用した。作製したmKO-FM14-N-p21-pCDNA3とmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3をHeLa細胞に導入してp21とPCNAの結合の履歴データを得た。3.5ｃｍディッシュにHeLa細胞を30％コンフルエントとなるように継代し、16時間後に遺伝子導入試薬polyfect(QIAGEN)を用いてmKO-FM14-N-p21-pCDNA3とmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3のプラスミドを各500ngずつ導入し、mKO-FM14-N-p21とmKO-FM14-C-PCNAを共発現させた。遺伝子導入についてはpolyfectのプロトコールに準じた。
遺伝子導入8時間後と22時間後にOrangeとGreenの蛍光画像を取得した。ただし、遺伝子導入後8時間後および22時間後とは、細胞が発現プラスミドを取り込んでから8時間後、22時間後を表す物ではなく、遺伝子導入試薬と発現プラスミドの複合体を添加してから8時間後、22時間後であることを表す。Orange蛍光画像は、励起フィルター 25BP520-540HQ、蛍光フィルター 25BA555-600HQ、ダイクロイックミラーDM545HQを、Green蛍光画像は励起フィルター BP460-480、蛍光フィルター BA495-540、ダイクロイックミラー DM485を使用し、画像取得した。励起光は９７％をカット（3％透過）してそれぞれ1秒間露光した。顕微鏡は倒立型顕微鏡IX-71（オリンパス）を、レンズは40倍Uapo/340 N.A.1.35（オリンパス）を使用した。画像取得及び画像解析にはMetaMolph（日本ローパー）を使用して、ビニング２で画像取得を行なった。冷却CCDカメラORCA-ER（浜松ホトニクス）を用いて蛍光像を取得した。
8時間後、細胞質と核の輝度には差があり、細胞１の平均輝度値は、Orange、Greenともに細胞質＞核となっており、細胞２では細胞質＜核となっていた。Orange/Greenの比（Ratio）を測定すると、どちらの細胞のRatio値も細胞質よりも核の方が高い値を示した。このことより、p21とPCNAが細胞質で結合した後、核へと移動していることが示された（図１７）。p21とPCNAが核でDNA複製に作用すると考えるとリーズナブルな結果と考えられた。
22時間後、細胞３、細胞４、ともに、核内にp21とPCNAの複合体がクラスター（核内輝点）を作っている様子が観察された。核内のクラスターはDNA修復もしくはDNA複製の場と考えられた。また、細胞質、核、核内輝点の順にRatio値が高くなっていた。この結果から、p21とPCNAの複合体は細胞質から核へ、核から核内輝点へと移動することが、Ratio画像から判断できた（図１８）。
比較例１：
mKO-FM14の65番目のシステイン（C）をアラニン（A）に置換することにより、GreenからOrangeへのタイマー機能を持たないGreenの蛍光蛋白質(mKG)が得られた。65番目のアミノ酸はmKO-FM14-N 側に含まれるため、mKO-FM14-N-p21-pCDNA3の65番目のシステイン（C）をアラニン（A）に置換し、mKG-N-p21-pCDNA3を作製した。mKG-N-p21-pCDNA3とmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3をHeLa細胞に導入してp21とPCNAの結合を測定した。3.5ｃｍディッシュにHeLa細胞を30％コンフルエントとなるように継代し、16時間後に遺伝子導入試薬polyfect(QIAGEN)を用いてmKG -N-p21-pCDNA3とmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3のプラスミドを各500ngずつ導入し、mKG-N-p21とmKO-FM14-C-PCNAを共発現させた。遺伝子導入についてはpolyfectのプロトコールに準じた。遺伝子導入24時間後にGreenの蛍光画像を取得した。蛍光画像は励起フィルター BP460-480、蛍光フィルター BA495-540、ダイクロイックミラー DM485を使用し、画像取得した。励起光は９０％をカット（１０％透過）して1秒間露光した。顕微鏡は倒立型顕微鏡IX-71（オリンパス）を、レンズは40倍Uapo/340 N.A.1.35（オリンパス）を使用した。画像取得及び画像解析にはMetaMolph（日本ローパー）を使用して、ビニング２で画像取得を行なった。冷却CCDカメラORCA-ER（浜松ホトニクス）を用いて蛍光像を取得した。mKO-FM14-N-p21-pCDNA3とmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3の共発現の時と同様の細胞質、核、核内輝点の発現画像が得られたが、時間情報は含まれないために、画像からは、p21とPCNAの複合体、時間、位置の関係は判断できない（図１９）。
通常の蛍光イメージングでは、蛍光ラベルした物質の移動履歴が残らないために、時間経過を追って画像を連続取得する必要がある。しかしながら、本発明では、画像を連続取得する必要もなく、Ratio画像で、蛋白質複合体形成からの移動までの経歴を取得することができる。
なお、上記の実施例９及び比較例１で用いた構築物の塩基配列とアミノ酸配列は、下記の通り配列表に示す。
mKO-FM14-N-p21の塩基配列（配列番号５７）
mKO-FM14-N-p21のアミノ酸配列（配列番号５８）
mKO-FM14-C-PCNAの塩基配列（配列番号５９）
mKO-FM14-C-PCNAのアミノ酸配列（配列番号６０）
mKG-N-p21の塩基配列（配列番号６１）
mKG-N-p21のアミノ酸配列（配列番号６２）
図１は、本発明による蛋白質の相互作用の分析方法の概要を示す。 図２は、mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBの相互作用のデータ取得法を示す。 図３は、二波長励起二波長測光による測定の結果を示す。実線（mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合）、点線（mKO-FM14-NとmKO-FM14-Cを混合） 図４は、二波長励起一波長測光による測定の結果を示す。実線（mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合）、点線（mKO-FM14-NとmKO-FM14-Cを混合） 図５は、二波長励起二波長測光による相互作用測定の結果を示す。mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図６は、二波長励起二波長測光による相互作用測定の結果を示す。mKO-FM5-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図７は、二波長励起二波長測光による相互作用測定の結果を示す。mKO-FM3-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図８は、二波長励起二波長測光による相互作用測定の結果を示す。mKO-FM20-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図９は、二波長励起二波長測光による相互作用測定の結果を示す。mKO-FM24-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図１０は、二波長励起二波長測光による相互作用測定の結果を示す。各変異体の時間に伴うRatio（560nm/509nm）の変化を示す。 図１１は、二波長励起一波長測光による測定の結果を示す。mKO-FM14-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図１２は、二波長励起一波長測光による測定の結果を示す。mKO-FM5-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図１３は、二波長励起一波長測光による測定の結果を示す。mKO-FM3-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図１４は、二波長励起一波長測光による測定の結果を示す。mKO-FM20-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図１５は、二波長励起一波長測光による測定の結果を示す。mKO-FM24-N-LZAとmKO-FM14-C-LZBを混合した。 図１６は、二波長励起一波長測光による相互作用測定の結果を示す。各変異体の時間に伴うRatio（548nm/500nm）の変化を示す。 mKO-FM14-N-p21とmKO-FM14-C-PCNAの遺伝子導入から8時間後における細胞のOrangeとGreenの蛍光画像を示す。 mKO-FM14-N-p21とmKO-FM14-C-PCNAの遺伝子導入から22時間後における細胞のOrangeとGreenの蛍光画像を示す。 図１９は、mKG-N-p21-pCDNA3とmKO-FM14-C-PCNA-pCDNA3の遺伝子導入から24時間後における細胞のGreenの蛍光画像を示す。
SEQUENCE LISTING
<110> Riken
<120> A method of analyzing interaction of proteins using a fluorescent protein
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tgt tac ggc cac aga act ttt act aaa tat cca gaa gag ata cca gac 240
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tat ttc aaa caa gca ttt cct gaa ggc ctg tca tgg gaa agg tcg ttg 288
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
gag ttc gaa gat ggt ggg tcc gct tca gtc agt gcg cat ata agc ctt 336
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
aga gga aac acc ttc tac cac aaa tcc aaa ttt act ggg gtt aac ttt 384
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cct gcc gat ggt cct atc atg caa aac caa agt gtt gat tgg gag cca 432
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100 105 110
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<213> Fungia sp.
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ggc tcc gtc aat ggg cat gag ttc aca att gaa ggt gaa ggc aca ggc 96
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
aga cct tac gag gga cat caa gag atg aca cta cgc gtc aca atg gcc 144
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<213> Fungia sp.
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Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
tgt tac ggc cac aga gct ttt act aaa tat cca gaa gag ata cca gac 240
Cys Tyr Gly His Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
tat ttc aaa caa gca ttt cct gaa ggc ctg tca tgg gaa agg tcg ttg 288
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
gag ttc gaa gat ggt ggg tcc gct tca gtc agt gcg cat ata agc ctt 336
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
aga gga aac acc ttc tac cac aaa tcc aaa ttt act ggg gtt aac ttt 384
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
cct gcc gat ggt cct atc atg caa aac caa agt gtt gat tgg gag cca 432
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
tca acc gag aaa att act gcc agc gac gga gtt ctg aag ggt gat gtt 480
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
acg atg tac cta aaa ctt gaa gga ggg aat tct gca gat ggt gga ggc 528
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg atc cat cac act 576
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
ggc ggc cgc gcc cag ctc gaa aag gag ctg caa gcc ctg gag aag gag 624
Gly Gly Arg Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu
195 200 205
aac gcc cag ctc gaa tgg gag ctc cag gcc ctg gag aag gag ctg gcc 672
Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala
210 215 220
cag aag 678
Gln Lys
225
<210> 26
<211> 226
<212> PRT
<213> Fungia sp.
<400> 26
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
35 40 45
Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
Cys Tyr Gly His Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
Gly Gly Arg Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu
195 200 205
Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala
210 215 220
Gln Lys
225
<210> 27
<211> 678
<212> DNA
<213> Fungia sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(678)
<400> 27
atg gtg agt gtg att aaa cca gag atg aag atg agg tac tac atg gac 48
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
ggc tcc gtc aat ggg cat gag ttc aca att gaa ggt gaa ggc aca ggc 96
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
aga cct tac gag gga cat caa gag atg aca cta cgc gtc aca atg gcc 144
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
35 40 45
gag ggc ggg cca atg cct ttc gcg ttt gac tta gtg tca cac gtg ttc 192
Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
tgt tac ggc cac aga act ttt act aaa tat cca gaa gag ata cca gac 240
Cys Tyr Gly His Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
tat ttc aaa caa gca ttt cct gaa ggc ctg tca tgg gaa agg tcg ttg 288
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
gag ttc gaa gat ggt ggg tcc gct tca gtc agt gcg cat ata agc ctt 336
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
aga gga aac acc ttc tac cac aaa tcc aaa ttt act ggg gtt aac ttt 384
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
cct gcc gat ggt cct atc atg caa aac caa agt gtt gat tgg gag cca 432
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
tca acc gag aaa att act gcc agc gac gga gtt ctg aag ggt gat gtt 480
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
acg atg tac cta aaa ctt gaa gga ggg aat tct gca gat ggt gga ggc 528
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg atc cat cac act 576
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
ggc ggc cgc gcc cag ctc gaa aag gag ctg caa gcc ctg gag aag gag 624
Gly Gly Arg Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu
195 200 205
aac gcc cag ctc gaa tgg gag ctc cag gcc ctg gag aag gag ctg gcc 672
Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala
210 215 220
cag aag 678
Gln Lys
225
<210> 28
<211> 226
<212> PRT
<213> Fungia sp.
<400> 28
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
35 40 45
Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
Cys Tyr Gly His Arg Thr Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
Gly Gly Arg Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu
195 200 205
Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala
210 215 220
Gln Lys
225
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 29
ccagagatga agatgaggta ctacatggac ggc 33
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 30
catgagttca caattgaagg tgaaggc 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 31
gaaggcacag gcagacctta cgaggga 27
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 32
ccaatgcctt tcgcgtttga cttagtg 27
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 33
ttagtgtcac acgtgttctg ttacggc 27
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 34
gaaaggtcgt tggagttcga agatggt 27
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 35
gaagatggtg ggtccgcttc agtcagtgcg 30
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 36
agccttagag gaaacacctt ctaccacaaa tcca 34
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 37
caaatccaaa tttactgggg ttaactttcc tg 32
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 38
gccgatggtc ctatcatgca aaaccaaagt 30
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 39
gccgatggtc ctatcatgca aaaccaaagt gttgattggg agcca 45
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 40
gagaaaatta ctgccagcga cggagttctg aag 33
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 41
gatgttacga tgtacctaaa acttgaagga ggcggcaatc ac 42
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 42
cttaaaatgc caggaagcca ttacatcagc catcgcctcg tcagg 45
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 43
gatgcagtag ctcattccct cgagcaccac cacc 34
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 44
aaaaagctta ccatggtgag tgtgattaaa ccagagatg 39
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 45
tgcagaattc cctccttcaa gttttaggta catcgt 36
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 46
aaaaagctta ccatgggcgg caatcacaaa tgccaattc 39
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 47
tgcagaattc ccggaatgag ctactgcatc ttc 33
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: LZA sequence
<400> 48
Arg Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala
1 5 10 15
Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: LZB sequence
<400> 49
Arg Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala
1 5 10 15
Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln Lys
20 25 30
<210> 50
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: linker sequence
<400> 50
Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr Gly Gly
20 25
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 51
aaggagatat accaatggtg agtgtgatta aaccagag 38
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 52
tattcattac ttctgggcca g 21
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 53
aaggagatat accaatgggc aatcacaaat gccaattc 38
<210> 54
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 54
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60
ttaactttaa gaaggagata tacca 85
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 55
tattcattat ccttcaagtt ttaggtacat 30
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 56
tattcattag gaatgagcta ctgcatcttc tacca 35
<210> 57
<211> 1080
<212> DNA
<213> Fungia sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1080)
<223>
<400> 57
atg gtg agt gtg att aaa cca gag atg aag atg agg tac tac atg gac 48
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
ggc tcc gtc aat ggg cat gag ttc aca att gaa ggt gaa ggc aca ggc 96
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
aga cct tac gag gga cat caa gag atg aca cta cgc gtc aca atg gcc 144
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
35 40 45
gag ggc ggg cca atg cct ttc gcg ttt gac tta gtg tca cac gtg ttc 192
Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
tgt tac ggc cac aga gta ttt act aaa tat cca gaa gag ata cca gac 240
Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
tat ttc aaa caa gca ttt cct gaa ggc ctg tca tgg gaa agg tcg ttg 288
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
gag ttc gaa gat ggt ggg tcc gct tca gtc agt gcg cat ata agc ctt 336
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
aga gga aac acc ttc tac cac aaa tcc aaa ttt act ggg gtt aac ttt 384
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
cct gcc gat ggt cct atc atg caa aac caa agt gtt gat tgg gag cca 432
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
tca acc gag aaa att act gcc agc gac gga gtt ctg aag ggt gat gtt 480
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
acg atg tac cta aaa ctt gaa gga ggg aat tct gca gat ggt gga ggc 528
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg atc cat cac act 576
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
ggc ggc cgc atg tca gaa ccg gct ggg gat gtc cgt cag aac cca tgc 624
Gly Gly Arg Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys
195 200 205
ggc agc aag gcc tgc cgc cgc ctc ttc ggc cca gtg gac agc gag cag 672
Gly Ser Lys Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln
210 215 220
ctg agc cgc gac tgt gat gcg cta atg gcg ggc tgc atc cag gag gcc 720
Leu Ser Arg Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala
225 230 235 240
cgt gag cga tgg aac ttc gac ttt gtc acc gag aca cca ctg gag ggt 768
Arg Glu Arg Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly
245 250 255
gac ttc gcc tgg gag cgt gtg cgg ggc ctt ggc ctg ccc aag ctc tac 816
Asp Phe Ala Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr
260 265 270
ctt ccc acg ggg ccc cgg cga ggc cgg gat gag ttg gga gga ggc agg 864
Leu Pro Thr Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg
275 280 285
cgg cct ggc acc tca cct gct ctg ctg cag ggg aca gca gag gaa gac 912
Arg Pro Gly Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp
290 295 300
cat gtg gac ctg tca ctg tct tgt acc ctt gtg cct cgc tca ggg gag 960
His Val Asp Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu
305 310 315 320
cag gct gaa ggg tcc cca ggt gga cct gga gac tct cag ggt cga aaa 1008
Gln Ala Glu Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys
325 330 335
cgg cgg cag acc agc atg aca gat ttc tac cac tcc aaa cgc cgg ctg 1056
Arg Arg Gln Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu
340 345 350
atc ttc tcc aag agg aag ccc taa 1080
Ile Phe Ser Lys Arg Lys Pro
355
<210> 58
<211> 359
<212> PRT
<213> Fungia sp.
<400> 58
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
35 40 45
Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
Gly Gly Arg Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys
195 200 205
Gly Ser Lys Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln
210 215 220
Leu Ser Arg Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala
225 230 235 240
Arg Glu Arg Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly
245 250 255
Asp Phe Ala Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr
260 265 270
Leu Pro Thr Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg
275 280 285
Arg Pro Gly Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp
290 295 300
His Val Asp Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu
305 310 315 320
Gln Ala Glu Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys
325 330 335
Arg Arg Gln Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu
340 345 350
Ile Phe Ser Lys Arg Lys Pro
355
<210> 59
<211> 1020
<212> DNA
<213> Fungia sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1020)
<223>
<400> 59
atg ggc ggc aat cac aaa tgc caa ttc aag act act tac aag gcg gca 48
Met Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Ala
1 5 10 15
aaa gag att ctt gaa atg cca gga gac cat tac atc ggc cat cgc ctc 96
Lys Glu Ile Leu Glu Met Pro Gly Asp His Tyr Ile Gly His Arg Leu
20 25 30
gtc agg aaa acc gaa ggc aac att act gag ctg gta gaa gat gca gta 144
Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr Glu Leu Val Glu Asp Ala Val
35 40 45
gct cat tcc ggg aat tct gca gat ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt 192
Ala His Ser Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
ggc tct ggc ggt ggc gga tcg atc cat cac act ggc ggc cgc atg ttc 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr Gly Gly Arg Met Phe
65 70 75 80
gag gcg cgc ctg gtc cag ggc tcc atc ctc aag aag gtg ttg gag gca 288
Glu Ala Arg Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu Glu Ala
85 90 95
ctc aag gac ctc atc aac gag gcc tgc tgg gat att agc tcc agc ggt 336
Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser Ser Gly
100 105 110
gta aac ctg cag agc atg gac tcg tcc cac gtc tct ttg gtg cag ctc 384
Val Asn Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val Gln Leu
115 120 125
acc ctg cgg tct gag ggc ttc gac acc tac cgc tgc gac cgc aac ctg 432
Thr Leu Arg Ser Glu Gly Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg Asn Leu
130 135 140
gcc atg ggc gtg aac ctc acc agt atg tcc aaa ata cta aaa tgc gcc 480
Ala Met Gly Val Asn Leu Thr Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys Cys Ala
145 150 155 160
ggc aat gaa gat atc att aca cta agg gcc gaa gat aac gcg gat acc 528
Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr
165 170 175
ttg gcg cta gta ttt gaa gca cca aac cag gag aaa gtt tca gac tat 576
Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser Asp Tyr
180 185 190
gaa atg aag ttg atg gat tta gat gtt gaa caa ctt gga att cca gaa 624
Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu
195 200 205
cag gag tac agc tgt gta gta aag atg cct tct ggt gaa ttt gca cgt 672
Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe Ala Arg
210 215 220
ata tgc cga gat ctc agc cat att gga gat gct gtt gta att tcc tgt 720
Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile Ser Cys
225 230 235 240
gca aaa gac gga gtg aaa ttt tct gca agt gga gaa ctt gga aat gga 768
Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly Asn Gly
245 250 255
aac att aaa ttg tca cag aca agt aat gtc gat aaa gag gag gaa gct 816
Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu Glu Ala
260 265 270
gtt acc ata gag atg aat gaa cca gtt caa cta act ttt gca ctg agg 864
Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala Leu Arg
275 280 285
tac ctg aac ttc ttt aca aaa gcc act cca ctc tct tca acg gtg aca 912
Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr Val Thr
290 295 300
ctc agt atg tct gca gat gta ccc ctt gtt gta gag tat aaa att gcg 960
Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys Ile Ala
305 310 315 320
gat atg gga cac tta aaa tac tac ttg gct ccc aag atc gag gat gaa 1008
Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asp Glu
325 330 335
gaa gga tct taa 1020
Glu Gly Ser

<210> 60
<211> 339
<212> PRT
<213> Fungia sp.
<400> 60
Met Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Ala
1 5 10 15
Lys Glu Ile Leu Glu Met Pro Gly Asp His Tyr Ile Gly His Arg Leu
20 25 30
Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr Glu Leu Val Glu Asp Ala Val
35 40 45
Ala His Ser Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr Gly Gly Arg Met Phe
65 70 75 80
Glu Ala Arg Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu Glu Ala
85 90 95
Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser Ser Gly
100 105 110
Val Asn Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val Gln Leu
115 120 125
Thr Leu Arg Ser Glu Gly Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg Asn Leu
130 135 140
Ala Met Gly Val Asn Leu Thr Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys Cys Ala
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Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala Asp Thr
165 170 175
Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser Asp Tyr
180 185 190
Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu
195 200 205
Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe Ala Arg
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Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile Ser Cys
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Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly Asn Gly
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Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu Glu Ala
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Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala Leu Arg
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Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr Val Thr
290 295 300
Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys Ile Ala
305 310 315 320
Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asp Glu
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Glu Gly Ser

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<211> 1080
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1080)
<223>
<400> 61
atg gtg agt gtg att aaa cca gag atg aag atg agg tac tac atg gac 48
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
ggc tcc gtc aat ggg cat gag ttc aca att gaa ggt gaa ggc aca ggc 96
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
aga cct tac gag gga cat caa gag atg aca cta cgc gtc aca atg gcc 144
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
35 40 45
gag ggc ggg cca atg cct ttc gcg ttt gac tta gtg tca cac gtg ttc 192
Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
gct tac ggc cac aga gta ttt act aaa tat cca gaa gag ata cca gac 240
Ala Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
tat ttc aaa caa gca ttt cct gaa ggc ctg tca tgg gaa agg tcg ttg 288
Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu
85 90 95
gag ttc gaa gat ggt ggg tcc gct tca gtc agt gcg cat ata agc ctt 336
Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu
100 105 110
aga gga aac acc ttc tac cac aaa tcc aaa ttt act ggg gtt aac ttt 384
Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe
115 120 125
cct gcc gat ggt cct atc atg caa aac caa agt gtt gat tgg gag cca 432
Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro
130 135 140
tca acc gag aaa att act gcc agc gac gga gtt ctg aag ggt gat gtt 480
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
145 150 155 160
acg atg tac cta aaa ctt gaa gga ggg aat tct gca gat ggt gga ggc 528
Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg atc cat cac act 576
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
ggc ggc cgc atg tca gaa ccg gct ggg gat gtc cgt cag aac cca tgc 624
Gly Gly Arg Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys
195 200 205
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Gly Ser Lys Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln
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ctg agc cgc gac tgt gat gcg cta atg gcg ggc tgc atc cag gag gcc 720
Leu Ser Arg Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala
225 230 235 240
cgt gag cga tgg aac ttc gac ttt gtc acc gag aca cca ctg gag ggt 768
Arg Glu Arg Trp Asn Phe Asp Phe Val Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly
245 250 255
gac ttc gcc tgg gag cgt gtg cgg ggc ctt ggc ctg ccc aag ctc tac 816
Asp Phe Ala Trp Glu Arg Val Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr
260 265 270
ctt ccc acg ggg ccc cgg cga ggc cgg gat gag ttg gga gga ggc agg 864
Leu Pro Thr Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg
275 280 285
cgg cct ggc acc tca cct gct ctg ctg cag ggg aca gca gag gaa gac 912
Arg Pro Gly Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln Gly Thr Ala Glu Glu Asp
290 295 300
cat gtg gac ctg tca ctg tct tgt acc ctt gtg cct cgc tca ggg gag 960
His Val Asp Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Val Pro Arg Ser Gly Glu
305 310 315 320
cag gct gaa ggg tcc cca ggt gga cct gga gac tct cag ggt cga aaa 1008
Gln Ala Glu Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gln Gly Arg Lys
325 330 335
cgg cgg cag acc agc atg aca gat ttc tac cac tcc aaa cgc cgg ctg 1056
Arg Arg Gln Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu
340 345 350
atc ttc tcc aag agg aag ccc taa 1080
Ile Phe Ser Lys Arg Lys Pro
355
<210> 62
<211> 359
<212> PRT
<213> Fungia sp.
<400> 62
Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly
20 25 30
Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala
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Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe
50 55 60
Ala Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val
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Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile His His Thr
180 185 190
Gly Gly Arg Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Val Arg Gln Asn Pro Cys
195 200 205
Gly Ser Lys Ala Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Val Asp Ser Glu Gln
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Leu Ser Arg Asp Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gln Glu Ala
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Ile Phe Ser Lys Arg Lys Pro
355
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 63
actggcggcc gcatgtcaga accggctggg gatgt 35
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 64
gggctcgagt tagggcttcc tcttggagaa gat 33
<210> 65
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 65
actggcggcc gcatgttcga ggcgcgcctg gtcca 34
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 66
gggctcgagt taagatcctt cttcatcctc gatctt 36

Claims (2)

  1. 配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ 酸配列からなる蛍光蛋白質をＮ末端側断片とＣ末端側断片とに分割し、該Ｎ末端側断片と第一の被験蛋白質との融合蛋白質と、該Ｃ末端側断片と第二の被験蛋白質との融合蛋白質とを共存させることによって該第一の被験蛋白質と該第二の被験蛋白質とを相互作用させ、該相互作用による蛍光の変化を検出することによって、第一の被験蛋白質と第二の被験蛋白質との相互作用を分析する方法。
  2. 配列番号４、６、８、１０、又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列からなる蛍光蛋白質のＮ末端側断片をコードする遺伝子と、当該蛍光蛋白質のＣ末端側断片をコードする遺伝子との組み合わせを含む、蛋白質間の相互作用を分析するためのキット。
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