WO2004018671A1

WO2004018671A1 - 色素蛋白質及び蛍光蛋白質

Info

Publication number: WO2004018671A1
Application number: PCT/JP2003/010628
Authority: WO
Inventors: Atsushi Miyawaki; Ryoko Ando; Satoshi Karasawa; Hideaki Mizuno
Original assignee: Riken; Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2004-03-04
Also published as: EP2314683A1; EP1548107A1; EP1548107B1; US7981637B2; JP5117465B2; US20110104740A1; US20060160990A1; US20100304497A1; JP5117464B2; EP2314684A1; JPWO2004018671A1; US7892791B2; CA2499755A1; JP4452619B2; JP2010035559A; AU2003262274B2; DE60335726D1; ATE495247T1; EP2314683B1; US7345157B2

Abstract

　本発明の目的は、新規な色素蛋白質並びに蛍光蛋白質を提供することである。本発明によれば、ベリルイソギンチャク（Anthopleura　inornata）由来の所定の特性を有する色素蛋白質、並びにヒユサンゴ（Trachyphyllia　geoffroyi）及びアザミハナガタサンゴ（Scolymia　Vitiensis）由来の所定の蛍光特性を有する蛍光蛋白質が提供される。

Description

明細書

色素蛋白質及び蛍光蛋白質技術分野

本発明は、新規な色素蛋白質、より詳細にはべリルイソギンチヤク（Anthopleura inornate) 由来の新規な色素蛋白質及ぴその利用に関する。本発明はさらに、新規な蛍光蛋白質、より詳細には、ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi) 及ぴァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) 由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。背景技術

クラゲのェクオレア .ビクトリア（Aequorea victoria) に由来する緑色蛍光蛋白質（GFP) は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法およぴ半合理的（semi- rational)突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいは pH感受性を改変したといった様々な GF P変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質を GFP等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。

最もよく使用される GFP変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（YFP) が挙げられる。 YFPは、クラゲ（Aequorea) G F P変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分の YFPの εおよび Φは、それぞれ 60, 000〜100, 000Μ- lcm- 1および 0.6〜0.8であり（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev. Biochem. 67, 509 - 544)、これらの値は、一般的な蛍光団（フルォレセインおょぴローダミンなど）の値に匹敵する。従って YFPの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。

また、 GF P変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質（CFP) があり、 E C F P (enhanced cyan fluorescent protein)力 S知らてレヽる。また、イソギンチヤク（Discomasp.)からは赤色蛍光蛋白質（R F P) も単離されており、 DasRed が知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の 4種が次々と開発されスぺクトルの範囲は大幅に広がっている。

従来の蛍光蛋白質の量子収率を 0に近づけたものが色素蛋白質である。色素蛋白質は、光エネルギーを他のエネルギーに変換する分子を細胞内に導入することができる点で様々な応用が可能である。しかしながら、色素蛋白質の吸収波長特性について報告されている例は少ない。

発明の開示

本発明は、ベリノレイソギンチヤク（Anthopleura inornata) に由来する、ある特定の波長の光を吸収する新規な色素蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、刺胞動物、特にはイシサンゴの一種であるヒュサンゴ

(Trachyphyllia geoffroyi) 及ぴァザミハナガタサンゴ (Scolymia Vitiensis) に由来する新規な一次構造を有する蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。

上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づいて好適なプライマーを設計し、緑色を呈するベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) の c D NAライブラリーから上記プライマ一を用いて新規な色素蛋白質をコードする遺伝子を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の色素蛋白質の光吸収特性及び p H感受性を解析した。

さらに、本発明者らは、ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi) 及ぴァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) 由来の c D N Aライブラリーを用いてから発現クローニングを行った結果、新規な蛍光蛋白質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られた蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、当該蛍光蛋白質が独特の蛍光特性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明によれば、ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。

( 1 ) 吸収極大波長が 6 0 5 n mである；

( 2 ) 6 0 5 n mにおけるモル吸光係数が 4 7 5 5 0である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

本発明の別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質が提供される。

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するァミノ酸配列を有し、吸光特性を有するァミノ酸配列：

本発明の別の側面によれば、ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の下記の特性を有する色素蛋白質が提供される。

( 1 ) 吸収極大波長が 5 5 3 n mである；

( 2 ) 5 5 3 n mにおけるモル吸光係数が 2 5 3 0 0である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するァミノ酸配列を有し、吸光特性を有するァミノ酸配列：

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛋白質をコードする D N Aが提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの D NAが提供される。 ( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

( b ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする D NA：

本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの D N Aが提供される。

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列をコ一ドする D N A；又は、

( b ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するァミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする D NA：

本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有する D N Aが提供される。

( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；又は、

( b ) 配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ

Z又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

( a ) 配列番号 4に記載の塩基配列；又は、

( b ) 配列番号 4に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ

Z又は付カ卩を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の D NAを有する組み換えベクターが提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の D NA又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質をァクセプター蛋白質として用いて FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の色素蛋白質、 DNA、組み換えべクタ一、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、吸光試薬キットが提供される。さらに、本発明によれば、ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。

(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及ぴ 572 nm (赤）であり、蛍光極大波長が 5 18 nm (緑）及び 581 nm

(赤) である；

(2) 508 nmにおけるモル吸光係数（緑）が 98800 M— 1 c m— 1であり、 572 nmにおけるモル吸光係数（赤）が 60400M— 1 c m— 1である；

(3) 量子収率が 0. 80 (緑）及ぴ 0. 33 (赤）である；及ぴ

(4) 緑色及ぴ赤色の pH感受性についての pK aは共に 5. 7である：本発明の別の態様によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。

( a ) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の別の態様によれば、配列番号 7に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、ァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。

(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及び 578 nm (赤）であり、蛍光極大波長が 5 18 nm (緑）及ぴ 588 nm

(赤）である；

(2) 508 nm おけるモル吸光係数（緑）が 102250 M— 1 c m— 1であり、 578 nmにおけるモル吸光係数（赤）カ 76950M— 1 cm_lである；

(3) 量子収率（蛍光）が 0. 43 (緑）及び 0. 5 1 (赤）である；及び

(4)緑色（508 nm) の p H感受性について p K aが 5 · 8であり、赤色（5 78 nm) の p H感受性について p K aが 6. 5である。

本発明の別の態様によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。

( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の別の態様によれば、配列番号 1 1、 13、 15又は 1 7の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかの DNAが提供される。

(a) 配列番号 5に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b) 配列番号 5に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

(c) 配列番号 6に記載の塩基配列を有する DN A；又は、

(d) 配列番号 6に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び Z又は付カ卩を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかの DN Aが提供される。 ( a ) 配列番号 7に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 8に記載の塩基配列を有する DNA。

本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかの DN Aが提供される。 ( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

( b ) 配列番号 9に記载のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

(c) 配列番号 10に記載の塩基配列を有する DNA；又は、

( d ) 配列番号 10に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかの DN Aが提供される。

(a) 配列番号 1 1、 13、 1 5又は 1 7に記載のアミノ酸配列をコードする D NA；又は、

(b) 配列番号 12、 14、 16又は 18に記載の塩基配列を有する DNA。本発明のさらに別の態様によれば、本発明の DNAを有する組み換えベクターが提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の DNA又は組み換えベクター'を有する形質転換体が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質は、細胞内に局在する蛋白質である。さらに、好ましくは、他の蛋白質は、細胞内小器官に特異的な蛋白質である。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の蛍光蛋白質、 DNA、組み換えべクタ一、形質転換体、又は融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のベリノレイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の色素蛋白質（B e—G) の吸収スペクトルを測定した結果を示す。横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 2は、本発明のベリノレイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の色素蛋白質（B e— G) の吸光スペクトルの pH感受性を示す。横軸は pH値を示し、縦軸は吸光度を示す。 605 nmは本発明のベリルイソギンチヤク由来の色素蛋白質（B e—G) 特有の吸光度を示し、 277 nmは一般的に蛋白質定量として使われる吸光度（芳香族アミノ酸の吸光）を示す。つまり、 277 nmの値で蛋白質量が一定である事を示し、 605 nmの値で本発明のベリルイソギンチヤク由来の色素蛋白質（B e— G) 特有の吸光度が ρΗ5〜ρΗ10においてほとんど変化しないことを示す。

図 3は、本発明のベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の色素蛋白質（B e—R) の吸収スペクトルを測定した結果を示す。横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 4は、本発明のベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の色素蛋白質（B e—R) の吸光スペクトルの pH感受性を示す。横軸は pH値を示し、縦軸は吸光度を示す。 553 nmは本発明のベリルイソギンチヤク由来の色素蛋白質（B e—R) 特有の吸光度を示し、 277 nmは一般的に蛋白質定量として使われる吸光度（芳香族アミノ酸の吸光）を示す。つまり、 277 nmの値で蛋白質量が一定である事を示し、 553 nmの値で本発明のベリルイソギンチヤク由来の色素蛋白質（B e—R) 特有の吸光度が ρΗ5〜ρΗ10においてほとんど変化しないことを示す。

図 5は、本発明の蛍光蛋白質（Kaede) の吸収スペクトルを示す。

図 6は、本発明の蛍光蛋白質（Kaede) の蛍光スペクトルを示す。

図 7は、本発明の蛍光蛋白質（Kaede) の遺伝子を導入した HeLa細胞を 470nm で励起して、 510nmの蛍光で測定した結果を示す。

図 8は、 Kaedeおよび Kaede2の 12. 5 %アタリルァミドでの電気泳動パターンを示す。 Kaedeに比べ低い分子量として Kaede2のバンドが現れる。

図 9は、 HeLa細胞の形質膜に Kaede (上図）及び Kaede2 (下図）をターグティングされた時の発現パターンを示す。 ' 図 10は、紫（外）光照射依存的 Kaedeタンパク質の切断を示す実験結果である。上段の図は、紫（外）光照射依存的ペプチド鎖切断の推移を、 1².5%アタリルアミドゲルによる電気泳動像で示す。 Kaede蛋白溶液に 365 nm光照射を行い、 20分ごとにサンプリングして SDS/PAGEを行った。中段の図は、 365 nm光照射前 (0分）の吸収スぺクトルを示す。下段の図は、 365 nm光照射 140分後の吸収スぺクトルを示す。

図 1 1は、本発明の蛍光蛋白質 (Momiji)の励起スぺクトル及ぴ蛍光スぺクトルを示す。

図 1 2は、本発明の蛍光蛋白質 (Momiji)の p H感受性を示す。

図 1 3は、本発明の蛍光蛋白質 (Momiji)に UV 3 6 5 nmを照射した場合の蛍光スぺクトルの変化を示す。

図 1 4は、本発明の蛍光蛋白質 (Momiji)に UV 3 6 5 nmを照射した場合の吸収スぺクトルの変化を示す。

図 1 5は、 UV照射前後の吸収スぺクトルの変化（Momiji2) を示す。

図 1 6は、 UV照射前後の吸収スペクトルの変化（Momiji4) を示す。

図 1 7は、 UV照射前後の吸収スぺクトルピークの pHによる変化 (Momiji)を示す。照射前（508 nm) 照射後（578 nm)

図 1 8は、 UV照射前後の吸収スぺクトルピークの pHによる変化（Momiji2)を示す。照射前（508 nm) 照射後（576 nm)

図 1 9は、 UV照射前後の吸収スぺクトルピークの pHによる変ィ匕（Momiji4)を示す。照射前（508 nm) 照射後（583 nm)

図 2 0は、 365 nm光照射時間による蛍光特性変化の推移 (Momiji)を示す。ら μ g/mlの蛋白溶液で測定した。変異体との差を明確にするために非常に弱い 365 nm の光で光変換を行い 470 nmから 650 nmまでの蛍光スぺクトルを測定した。

図 2 1は、 365 nm光照射時間による蛍光特性変化の推移 (Momiji2)を示す。 6μ g/mlの蛋白溶液で測定した。変異体との差を明確にするために非常に弱い 365 nm の光で光変換を行い 470 nmから 650 nmまでの蛍光スぺクトルを測定した。

図 2 2は、 365 nm光照射時間による蛍光特性変化の推移 (Momiji4)を示す。 6μ g/mlの蛋白溶液で測定した。変異体との差を明確にするために非常に弱い 365 nm の光で光変換を行い 470 から 650 nmまでの蛍光スぺクトルを測定した。

図 2 3は、 HeLa細胞内での蛍光特性の推移を示す。

exposure time 410 nm 100ms

Green 400ms , Red 50ms

DM 420DCLP

Green Ex 475AF20, Em 530DF35

Red Ex 550DF35, Em 575ALP

Object lens X40 Uapo/340

410 nm照射、緑蛍光測定、赤蛍光測定を 3秒間隔で行った。

上記条件で測定を行い赤/緑の蛍光値をグラフ化した。

図 2 4は、 12. 5°/。アクリルアミドゲル（Pseudo -native SDS/PAGE) での泳動パターンを青色光で励起してデジタル力メラで撮影した結果を示す。

WT (Momiji) ：四量体

dl6：二量体

ml6：単量体

図 2 5は、 365 nm光照射前後の蛍光スぺクトル（dl6)を示す。

緑蛍光ピーク（518 nm)

赤蛍光ピーク（591 nm)

図 2 6は、 365 nm光照射前後の蛍光スぺクトル (ml6)を示す。

緑蛍光ピーク（518 nm)

赤蛍光ピーク（587 nm) 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

( 1 ) 本発明の色素蛋白質

本発明の第一の色素蛋白質は、ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

( 1 ) 吸収極大波長が 6 0 5 n mである；

( 2 ) 6 0 5 n mにおけるモル吸光係数が 4 7 5 5 0である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

本発明の第二の色素蛋白質は、ベリルイソギンチヤク (Anthopleura inornate) 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

( 1 ) 吸収極大波長が 5 5 3 n mである；

( 2 ) 5 5 3 n mにおけるモル吸光係数が 2 5 3 0 0である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

ベリノレイソギンチヤク (Arrthopleura inornata) は、 9 6本の触手を有し、規則正しく配列している。また、口盤は触手と同色で口のまわりが赤茶色に彩色されるのが本種の特徴である。体壁には 9 8列の吸着イボが並び、体壁の下端付近まで分布する。体壁の色には大きな変異があり、褐色系、ブルー系、ピンク系が知られている。ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) は、北海道南部から九州に分布し、潮間帯付近に多産する。

なお、本書中以下の実施例では、ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) を出発材料として上記特性を有する色素蛋白質を単離したが、ベリルイソギンチャク（Anthopleura inornata) 以外のイソギンチヤクから本発明の色素蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような色素蛋白質も本発明の範囲内である。

本発明の第一の色素蛋白質（B e—G) は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が 6 0 5 n mであり、また、 6 0 5 n mにおけるモル吸光係数は 4 7 5 5 0である。

本発明の第二の色素蛋白質（B e— R) は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が 5 5 3 n mであり、また、 5 5 3 n mにおけるモル吸光係数は 2 5 3 0 0である。

モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表す。量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。本発明の色素蛋白質の量子収率は極めて低いため、蛍光は殆ど発しない。この性質から、本発明の色素蛋白質は、（1 ) F R E Tのァクセプター分子（エネルギー受容体）として用いたり、（2 )照射した光のエネルギーを光以外のエネルギーに変換させるシステムの開発に利用したり、あるいは（3 ) 蛋白質のアミノ酸配列に変異を導入して蛍光を発するように改変することなどに用いることができる。また、本発明の色素蛋白質は、光吸収特性の; p H感受性が p H 5〜 1 0で安定であることを特徴とする。即ち、本発明の色素蛋白質では、 p H 5〜1 0の範囲において吸収スぺクトルのピーク値の変動が少ない。従って、本努明の色素蛋白質は、広範囲の p H環境において同様の条件で使用することができ、生体内での使用に際しての制約は少ない。

本発明の色素蛋白質の具体例としては、以下の何れかのァミノ酸配列を有する色素蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 1又は 3に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 1又は 3に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：

本明細書で言う「 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列」における「1から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、

1から 2 0個、好ましくは 1から 1 0個、より好ましくは 1から 7個、さらに好ましくは 1から 5個、特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。

本明細書で言う「吸光特性」とは、ある波長の光を吸収できる特性を意味し、例えば、本明細書に示した色素蛋白質と同様に吸収極大波長が 6 0 5 n m又は 5

5 3 n mであってもよいし、あるいは吸収極大波長の値がシフトしたものであつてもよい。なお、光吸収特性の p H感受性は、 p H 5〜l 0で安定であることが好ましい。

上記した通り、本発明の配列表の配列番号 1又は 3に記載したァミノ酸配列を有する色素蛋白質は蛍光をほとんど発しないものである。本発明においては、配列番号 1又は 3に記載したアミノ酸配列に対して 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を導入することにより、より強い蛍光を発する蛋白質を作製してもよく、このような蛋白質も本発明の範囲内に含まれる。

本発明の色素蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。

組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする DNAを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号 1又は 3に記載したアミノ酸配列並びに配列番号 2又は 4に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて、ベリルイソギンチヤク (Anthopleura inornate) 由来の c D N Aライブラリーを铸型にして P C Rを行うことにより、本発明の色素蛋白質をコードする DNAを取得することができる。この DNAを適当な発現系に導入することにより、本発明の色素蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。

(2) 本発明の蛍光蛋白質 - 本発明の第一の蛍光蛋白質は、ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi) 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

( 1 )紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及び 572 nm (赤）であり、蛍光極大波長が 518 nm (緑）及ぴ 581 nm

(赤）である；

(2) 508 nmにおけるモル吸光係数（緑）が 98800 M— 1 c m— 1であり、 572 nmにおけるモル吸光係数（赤）が 60400M— 1 c m_ 1である；

(3) 量子収率が 0. 80 (緑）及ぴ 0. 33 (赤）である；及び

(4) 緑色及ぴ赤色の pH感受性についての pK aは共に 5. 7である：ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi)は、刺胞動物ィソギンチヤクの 1種で、非常にカラフルな蛍光を示すことを特徴とする。主として、本州中部以南に分布し、内湾の泥底などに生息し、夜間触手を伸ばしてプランクトンなどを捕獲する。色のバリエーションとしては、緑色、褐色又は赤色のものが存在する。

本発明の第一の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及ぴ 572 nm (赤）であり、蛍光極大波長は 5 18 nm (緑）及ぴ 581 nm (赤）である。また、 508 nmにおけるモル吸光係数（緑）は 98800 M_ 1 c m_ 1であり、 5 72 nmにおけるモル吸光係数（赤）は 60400M— 1 c m_ 1である。

本発明の第一の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が変わることを特徴とし、光によって特定の細胞や器官のマーキング（optical marking) が可能である。本発明の第一の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 5に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の第一の蛍光蛋白質の別の具体例としては、配列番号 7に記載のァミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

本発明の第二の蛍光蛋白質は、ァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及ぴ 578 nm (赤）であり、蛍光極大波長が 518 nm (緑）及び 588 nm

(赤) である；

(2) 508 nmにおけるモル吸光係数 (緑) が 102250 M— 1 c m— 1であり、 578 nmにおけるモル吸光係数（赤）が 76950M— 1 cm- 1である；

(3) 量子収率（蛍光）が 0. 43 (緑）及び 0. 5 1 (赤）である；及び ( 4 )緑色（5 0 8 n m) の p H感受性について p K aが 5 . 8であり、赤色（5 7 8 n m) の p H感受性について p K aが 6 . 5である。

ァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) は固着性の単体サンゴで、小型の個体は鉢型で円形であるが、大きくなると楕円形になる。サンゴ個体の中心には大きなスポンジ状の軸柱があり、莢壁から長い障壁がほぼ一定の傾斜で中心に伸びる。隔壁には大きな鋸歯があり、外からもその様子がうかがえる。昼間はポリプを開かない。色彩は普通暗緑色であるが赤色なども稀に見られる。ァザミハナガタサンゴ属は約 4種が知られているが、日本周辺海域には 1種が分布している。

本発明の第二の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 5 0 8 n m (緑）及ぴ 5 7 8 n m (赤）であり、蛍光極大波長は 5 1 8 n m (緑）及び 5 8 8 n m (赤）である。また、 5 0 8 n mにおけるモル吸光係数（緑）は 1 0 2 2 5 0 M— 1 c m— 1であり、 5 7 8 n mにおけるモル吸光係数（赤）は 7 6 9 5 0 M— 1 c m _ 1である。本発明の第二の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が変わることを特徴とし、光によって特定の細胞、器官又は蛋白質のマーキング（optical marking) が可能でめる。

本発明の第二の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列；又は、

本発明の蛍光蛋白質の別の具体例としては、配列番号 1 1、 1 3、 1 5又は 1 7の何れかに記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

本明細書で言う「1から数個のアミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するアミノ酸配列」における「1から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、 1から 20個、好ましくは 1から 10個、より好ましくは 1から 7個、さらに好ましくは 1から 5個、特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。

本明細書で言う「蛍光を有する」とは、蛍光を発することができる全ての場合を包含し、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、 pH感受性などの諸特性は、配列番号 5に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と比較して、変動していてもよいし、同様のままでもよい。

本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。

組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする DNAを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号 5、 7、 9、 1 1、 13、 1 5又は 1 7に記載したァミノ酸配列並びに配列番号 6、 8、 10、 1 2、 14、 16又は 18に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質の c DNAクローンを铸型にして PCRを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードする DNAを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードする DNAの一部の断片を上記した PCRにより得た場合には、作製した DN A断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードする DN Aを得ることができる。この DNAを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。

(3) 本発明の DNA

本発明によれば、本発明の色素蛋白質及ぴ蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。

本発明の第一の色素蛋白質をコードする DNAの具体例としては、以下の何れかの DNAが挙げられる。 ( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする DNA：

本発明の第一の色素蛋白質をコードする DNAの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有する D N Aが挙げられる。

( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ /又は付カ卩を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

本発明の第二の色素蛋白質をコードする DNAの具体例としては、以下の何れかの DN Aが挙げられる。

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 3に記载のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする DNA：

本発明の第二の色素蛋白質をコードする DN Aの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有する D N Aが挙げられる。

(a) 配列番号 4に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 4に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び /又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

本発明の第一の蛍光蛋白質をコードする DN Aの具体例としては、以下の何れかの DN Aが挙げられる。

( a ) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列をコ一ドする D N A；又は、

(b) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

(c) 配列番号 6に記載の塩基配列を有する DNA；又は、

(d) 配列番号 6に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び /又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：本発明の第一の蛍光タンパク質をコードする DN Aの更なる具体例としては、以下の何れかの DN Aが挙げられる。

(a) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

( b ) 配列番号 8に記載の塩基配列を有する D NA。

本発明の第二の蛍光蛋白質をコードする DN Aの具体例としては、以下の何 3τ かの DNAが挙げられる。

(a) 配列番号 9に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b) 配列番号 9に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するァミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

. (c) 配列番号 10に記載の塩基配列を有する DNA；又は、

(d) 配列番号 10に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：本発明の第二の蛍光蛋白質をコードする DNAの更なる具体例としては、以下の何れかの DN Aが挙げられる。

( a ) 配列番号 1 1、 13、 1 5又は 17に記載のァミノ酸配列をコードする D

NA；又は、

(b) 配列番号 12、 14、 16又は 18に記載の塩基配列を有する DNA。本発明の DNAは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR) によって製造することもできる。本発明の DNAの作製方法については、本明細書中上述した通りである。

また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いる P C R、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有する D N Aを構築することができる。このような公知の技術は、例は、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989、並ぴに Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, John Wiley & Sons (1987 - 1997)に記載されている。

( 4 ) 本発明の組み換；

本発明の D N Aは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター

(例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってあよい。

好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の D N Aは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示す D N A配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。

細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス ·ステア口テルモフィルス · マノレトジエニック · アミラーセ遺伝子 (Bac i 1 lus s t earothermophi lus maltogenic amylase gene)、ノチノレス · リケエホノレミス a ァミラ一" IT遺伝子 (Bacillus licheniformis alpha— amylase gene) ^ /ヽチノレス · ,ミロリケファテェンス · BA アミラーセ遺伝子 (Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス ·サブチリス ·アルカリプロテアゼ遺伝子（Bacillus S ubtilis alkaline protease gene)もしくはバチノレス ·プミ/レス ·キシロシダーゼ遺伝子 (Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ ' ラムダの P R若しくは PLプロモータ、大腸菌の lac、 trp若しくは tacプロモータなどが挙げられる。

哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、 SV40プロモータ、 M T一 1 (メタ口チォネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス 2主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリへドリンプロモータ、 p 10プロモータ、ォートグラファ 'カリホル二力 'ポリへドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキユウロウィルス即時型初期遺伝子 1プ口モータ、またはパキユウロウィルス 39 K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、ァノレコーノレデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、 TP I 1プロモータ、 ADH2-4cプロモータなどが挙げられる。

糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、 ADH 3プロモータまたは t p i Aプロモータなどがある。

また、本発明の DNAは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主については TP I 1ターミネータ若しくは ADH 3ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えべクタ一は更に、ポリアデニレーションシグナル（例えば SV 40またはアデノウイルス 5E 1 b領域由来のもの）、転写ェンハンサ配列（例えば SV 40ェンハンサ）および翻訳ェンハンサ配列（例えばアデノウイルス VA RNA をコードするもの）のような要素を有していてもよい。

本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にする DNA配列を具備してもよく、その一例としては SV 40複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。

本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR) またはシゾサッカロマイセス ·ボンべ TP I遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフエ二コール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。

本発明の D NA、プロモータ、および所望によりターミネータおよび Zまたは分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。

( 5 ) 本発明の形質転換体

本発明の D N A又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。

本発明の D N Aまたは組み換えべクタ一を導入される宿主細胞は、本発明の D NA構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。

細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンビテント細胞を用いることにより行なえばよレ、。

哺乳類細胞の例としては、 H E K 2 9 3細胞、 H e L a細胞、 C O S細胞、 B H K細胞、 C H L細胞または C H O細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された D NA配列を発現させる方法も公知であり、例えば、ェレクト口ポーレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等を用いることができる。

酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス ' セレビシェ（Saccharomyces cerevislae)また ίまサッカロマセス · クノレイべリ ( S accharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、ェレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばァスペルギルス、ニューロスポラ、フザリゥム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、 D N A構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。 D N A構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよぴバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイ/レスを得- た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる (例ば、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual；及ぴ力レント 'プロトコールズ'イン'モレキュラー ·バイオ口ジー、 Bio/Technology， 6, 47 (1988)等に記載）。

バキュロウィルスとしては、例えば、ョトウガ科昆虫に感染するウィルスであるアウトグラファ ·カリフォルニ力 ·ヌクレア一 ·ポリへドロシス · ウィルス (Autographa caliiornica nuclear polynedrosis virus)等を用レヽること力できる。昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperda の卵巣細胞である S f 9、 S f 2 1 〔バキュロウィルス 'エクスプレッション ·ベクターズ、ァ -ラボラトリー · マニュアル、ダブリュー'エイチ.フリ一マン ·アンド ·力ンパニー (W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク（New York)、（1992)〕、 Trichoplusia niの卵巣細胞である H i F i v e (インビトロジェン社製）等を用いることができる。 ' 組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入べクタ一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフエクシヨン法等を挙げることができる。

上記の形質転換体は、導入された D N A構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。

例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破碎機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル (DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一法、 S- Sepharose FF (フアルマシァ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換ク口マトグラフィ一法、ブチルセファロース、フエ二ルセファロース等のレジンを用いた疎水†生クロマトグラフィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法、クロマトフオーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

( 6 ) 本発明の色素蛋白質及びそれを含む融合蛋白質の利用

本発明の色素蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質を構築することができる。本発明の色素蛋白質に融合させる他の蛋白質の種類は特に限定されなレ、が、他の分子と相互作用する蛋白質であることが好ましく、例えば、受容体蛋白質又はそのリガンド、あるいは抗原又は抗体などが挙げられる。本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質であよい。

組み換え融合蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする D NA を入手することが必要である。本発明の色素蛋白質をコードする D NAおよぴそれに融合すべき他の蛋白質をコードする D NAは、本明細書中上記した方法またはそれに準じてそれぞれ入手することができる。次いで、これらの D NA断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛋白質をコードする D NAを得ることができる。この D N Aを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を産生することができる。

分子間の相互作用を分析する手法の一つとして、 F R E T (蛍光共鳴エネルギ一転移）が知られている。 F R E Tでは、例えば、第一の蛍光蛋白質としてのシアン蛍光蛋白質（C F P ) で標識した第一の分子と、第二の蛍光蛋白質としての黄色蛍光蛋白質（YFP) で標識した第二の分子とを共存させることにより、黄色蛍光蛋白質（YFP) をァクセプター分子として作用させ、シアン蛍光蛋白質

(CFP) をドナー分子として作用させ、両者の間で FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）を生じさせることにより、第一の分子と第二の分子との間の相互作用を可視化することができる。即ち、 FRETでは 2種類の分子にそれぞれ異なる色素を導入し、エネルギーレベルの高い方の色素（ドナー分子）を選択的に励起し、その色素の蛍光を測定し、もう一方の色素（ァクセプター分子）からの長波長蛍光も測定して、それらの蛍光変化量によって分子間の相互作用を可視化する。両方の色素が、 2種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少とァクセプター分子の蛍光の増加が 1波長励起 2波長測光法により観測される。しかし、ァクセプター分子に色素蛋白質を用いた場合は、両方の色素が、 2種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少を生じ 1波長励起 1波長測光法により観測することができる。即ち、測定機器の簡易化が可能となる。

本発明の色素蛋白質は、特に、 FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）におけるァクセプター分子としての利用価値が高い。即ち、本発明の色素蛋白質と被験物質との融合体（第一の融合体）を作製する。次いで、該被験物質と相互作用する別の被験物質と別の蛍光蛋白質との融合体（第 2の融合体）を作製する。そして、第一の融合体と第 2の融合体とを相互作用させ、発する蛍光を分析することにより、上記 2種類の被験物質間の相互作用を分析することができる。なお、本発明の色素蛋白質を用いた FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）は、試験管内で行つてもよいし、細胞内で行ってもよい。

(7) 本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用

本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。

本突明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。

組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする D NAを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5又は 1 7に記載したアミノ酸配列及ぴ配列番号 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6又は 1 8に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含む D NA断片を鎳型にして P C Rを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードする D N Aを構築するのに必要な D NA断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードする D N A断片も入手する。

次いで、これらの D NA断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードする D N Aを得ることができる。この D NAを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。

本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検ァミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。

本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアブレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードする D N Aが発現可能に挿入されたべクタ一が宿主細胞に導入される。

また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードする D NAが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。

上記被検ァミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「pNE0」（P. Southern, and P. Berg (1982) J. M01. Appl. Genet. 1： 327)、 r_pCAGGSJ (H. Niwa, K. Yamamura, and J. Miyazaki. Gene 108, 193—200 (1991) )、

「pRc/CMVj (インビトロゲン社製）、「pCDM8」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「pRS303」 , r_pRS304J , 「pRS305j , 「pRS306」，「pRS313」 , r_PRS314j ，「pRS315」 , [pRS316] (R. S. Sikorski and P. Meter (1989) Genetics 122 : 19-27)、「pRS423」，「pRS424」，「pRS425」 , 「pRS426」（T. W. Christianson, R. S. Sikorski, M. Dante, J. H. Shero, and P. Meter (1992) Gene 110： 119—122) などが好適に用いられる。

また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、 L 細胞、 BalbC- 3T3細胞、 NIH3T3細胞、 CHO (Chinese hamster ovary)細胞、 HeLa細月包、 NRK (normal rat kidney)糸田月包、「Saccharomyces cerevisiaej などの酵母細月包や大腸菌（E. coli) 細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。

上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質 Xとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質 Xの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードする D N Aで形質転換またはトランスフエタトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質 Xの局在や動態を可視化して分析することができる。例えば、蛋白質 Xとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルォキソームなどの分布や動きを観察できる。

また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。

本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社アキシォフォトフィルターセット 09) や画像解析装置（ATT0デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。

顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとして,は、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーシヨンを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。

フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の第一の蛍光蛋白質の場合、励起極大波長が 5 0 8 n m、蛍光極大波長が 5 1 8である緑色を検出する場合は、励起光 4 9 0〜 5 1 0 n m、蛍光 5 1 0 〜5 3 0 n m程度のフィルターを使用することが好ましい。また、励起極大波長が 5 7 2 n mであり、蛍光極大波長が 5 8 1 n mである赤色を検出する場合は、励起光 5 6 0〜5 7 5 n m、蛍光 5 7 5〜5 9 0 n m程度のフィルターを使用することが好ましい。

本発明の第二の蛍光蛋白質の場合、励起極大波長が 5 0 8 n m、蛍光極大波長が 5 1 8である緑色を検出する場合は、励起光 4 9 0〜5 1 0 n m、蛍光 5 1 0 〜5 3 0 n m程度のフィルターを使用することが好ましい。また、励起極大波長が 5 7 8 n mであり、蛍光極大波長が 5 8 8 n mである赤色を検出する場合は、励起光 5 7 0〜5 8 0 n m、蛍光 5 8 0〜5 9 5 n m程度のフィルターを使用することが好ましい。

また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却 C C Dカメラを使用する。冷却 C C Dカメラは、 C C Dを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。

( 8 ) 本発明のキット

本発明によれば、本明細書に記載した色素蛋白質、融合蛋白質、 D NA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも 1種以上を含むことを特徴とする、吸光試薬キットが提供される。さらに本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、 D NA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも 1種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び/又は生理活性物質の分析のためのキットが提供きれる。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。色素蛋白質、蛍光蛋白質又は D NAなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例

実施例 A— 1 ：イソギンチヤクからの新規色素蛋白遺伝子の単離

( 1 ) total 腿の抽出

イソギンチヤクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には緑色を呈する 1 個体のベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) を用いた。凍結したベリルイソギンチヤクを乳鉢で砕き、湿重量 1グラムに" TRIzol" (GIBCO BRL) を⁷. 5 m 1加えてホモジナイズし、 1500xgで 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 1. 5 m 1を加え、 15秒間攪抨した後、 3分間静置した。 7500xgで 15分間遠心した。上清にィソプロパノール 3. 75m 1を加え、 15秒間攪拌した後、 10分間静置した。 17000xgで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノールを 6ml加えて 17000xg で 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D, 260と 0. D. 280の値を測定して R A濃度を測った。 2. 2mgの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 4 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット "Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA (33 μ 1)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA (33 μ 1)のうち 3 1を铸型として PCRを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5， - GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY -3， (primerl) (配列番号 1 9 )

5， - ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT - 3，（primer2) (配列番号 2 0 )

Iはィノシン、 Rは A又は G、 Yは C又は T、 Vは A, C 又は G、 Dは A, G又は T、 S は C又は G、 Hは A, T又は C を示す。

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X10 taqバッファー 5 μ 1

2. 5mM dNTPs 4 μ 1

100 μ Μ primerl 1 μ ΐ 100 μ M primer 2 ΐ μ ΐ

Q 35 i l

taq polymerase (5U/ μ 1) 1 μ ΐ

PCR反応条件

94°C 1分（PAD)

94°C 30秒（変性）

52°C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング）

72°C 1分（プライマー伸長）上記 3ステップを 30サイクル行い、ァニーリング温度を 1サイクルごとに 0· 3°C 下げた。 30サイクル時の温度は 43°C。

72°C 7分（最後の伸長）

4°Cで保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物 Ι μ ΐをテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で、 350bpを切り出し、精製した。

( 4 ) サブクローニング及ぴ塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株 (TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5，- RACE法および 3， - RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。 ( 5 ) 5，- RACE法

Degenerated PCR で得られた DNA 断片の 5'側の塩基配列を決定するために 5， - RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBCO BRL) を用いて、 5，- RACE法を行った。鎵型として（1 ) で調製した total RNAを 4 μ _§ 使用した。

dC - tailed cDNAの一回目の増幅には

5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3' (primer3) (目 c歹番"^ 2 1 ) 5， - AAGAGACTCCTTGAAGTAATCGGGA -3， (primer4) (配列番号 2 2 )

のプライマーを用いた。

Iはイノシンを示す。

二回目の増幅には

b'-ggccacgcgtcgactagtac-ύ' (primer5) (目己歹 (J番^" 2 3 )

5，- AAAATATCGTACGCAAAGGG -3， (primer6) (配列番号 2 4 )

のプライマーを用いた。 PCR反応条件等はキットのプロトコールに準じた。

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 200bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株

(TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より pl_asmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシータエンサ一により決定した。

( 6 ) 3， - RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 3，側部分は、（ 4 ) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（ 2 ) で調製した first strand cDNAを 3 μ 1使用した。

作成したプライマーは、

5， - AGGAGGTCCGCTACCCTTTG -3， (primer7) (配列番号 2 5 ) PGR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X10 taq バッファー 5 μ 1

2. 5mM dNTPs 4 μ 1

20 jU M primer 7 Ι μ ΐ

10 /z Mオリコ dTprimer Ι μ ΐ

taq polymerase (5U/ μ 1) i ,u i

PCR反応条件

94°C 1分 (PAD)

94°C 30秒（変性）

52°C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング）

72°C 1分（プライマ伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72°C 7分（最後の伸長）

4°Cで保持ァガロースゲル電気泳動で、増幅された約 lOOObpのパンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 2に示し、全長のァミノ酸配列を配列表の配列番号 1に示す。実施例 A— 2 ：大腸菌での蛋白発現

得られた全長の塩基配列より、蛋白の N末端に相当する部分でプライマーを作製し、 C末端側はオリゴ dTプライマーを使用して、実施例 A— 1の（2) で調製した First strand cDNAを鍚型として PCRを行った。

使用プライマー

5'- CCCGGATCCGACCATGGCTACCTTGGTTAAAGA -3， (primer8) (配列番号 2 6 )

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3μ 1

X10 pyrobest ハツファー 5 μ ΐ

2.5mM dNTPs 4μ 1

100 μ M primer8 Ι ΐ

ΙΟΟμΜオリゴ dTプライマー Ιμ ΐ

Sジ Q 35 μΐ

pyrobest polymerase (5U/ μ 1) Ιμΐ

PCR反応条件

94°C 1分（PAD)

94°C ³0秒（変性）

52°C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング)

72°C 1分（プライマー伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72°C 7分（最後の伸長）

4°Cで保持ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された約 llOObpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invitrogen)の BamH I、 EcoR I部位にサブクローニングして、大腸菌株（JM109 - DE3) で発現させた。発現蛋白は N末端に His - tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白は Ni - Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。この色素蛋白質を B e _Gと命名する。以下の実施例 3では、精製した蛋白の性質を解析した。実施例 A— 3 ：色素蛋白質（B e—G) の性質

(1) 光吸収特性の解析

20μΜ色素蛋白（B e—G)、 50mM HEPES ρΗ7· 9溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。緑色個体由来色素蛋白（B e— G)では 605nmに吸収のピークが認められた（表 1、図 1)。表 1

(2) pH感受性の測定

50mMの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スぺクトルを測定した（図 2)。

各 pHの緩衝液は次の通り、

pH4、 5 ：酢酸バッファー

pH6 ：リン酸バッファー

pH7、 8 ： HEPESバッファー

pH9、 10 ：グリシンバッファー

図 2の結果から分かるように、 pH5〜10でピークの値は安定していた。実施例 B— 1 ：イソギンチヤクからの新規色素蛋白遺伝子の単離

(1) total R Aの抽出

イソギンチヤクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には赤色を呈する 1 個体のベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) を用いた。凍結したベリルイソギンチヤクを乳鉢で砕き、湿重量 1グラムに" TRIzol" (GIBCO BRL) を 7· 5 m 1加えてホモジナイズし、 1500xgで 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 1. 5 m 1を加え、 15秒間攪拌した後、 3分間静置した。 7500xgで 15分間遠心した。上清にイソプロパノール 3. 75m 1を加え、 15秒間攪拌した後、 10分間静置した。 17000xgで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノールを 6ml加えて 17000xg で 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D. 260と 0. D. 280の値を測定して R A濃度を測った。 3mgの total R Aを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 4 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット" Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA (33 μ 1)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA (33 u 1)のうち 3 μ 1を铸型として PCRを行った。プライマーのデザィンは既知の蛍光蛋白のァミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5， - GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY -3， (primerl) (配列番号 1 9 )

5， - ACVGGDCCATYDGVAAGAMRTT -3' (primer 2) (配列番号 2 0 )

Iはイノシン、 Rは A又は G、 Yは C又は T、 Vは A, C又は G、 Dは A, G又は T、 S は C又は G、 Hは A, T又は Cを示す。

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 / 1

X10 taqバッファー 5 ju 1

2. 5mM dNTPs 4 1

100 M primerl 1 μ, Ι

100 / M primer2 1 β ΐ ミリ Q 35 μ ΐ

taq polymerase (5U/ 1) Ι μ ΐ

PGR反応条件

94°C 1分 (PAD)

94°C 30秒（変性）

52°C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング）

72°C 1分（プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行い、ァユーリング温度を 1サイクルごとに 0. 3°C 下げた。 30サイクル時の温度は 43°C。

72°C 7分（最後の伸長）

4°Cで保持一回目の PCR反応で得られた増幅産物 1 1をテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で、 350bpを切り出し、精製した。

( 4 ) サブク口一ニング及ぴ塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7 - blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5，-MCE法おょぴ 3，- RACE法による遺伝子全長のクローニングを行つた。

( 5 ) 5，— RACE法 Degenerated PCR で得られた DNA 断片の 5，側の塩基配列を決定するために 5'— RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBCO BRL) を用いて、 5，- RACE法を行った。铸型として（1 ) で調製した total RNAを 4 ^ g 使用した。

赤色の個体由来の DC-tailed cDNAの一回目の増幅には

5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3' (primer3) (酉己歹 U番号 2 1 ) 5'- AAGAGACTCCTTGAAGTAATCGGGA -3， (primer4) (配列番号 2 2 )

のプライマーを用いた。

Iはイノシンを示す。 - 二回目の増幅には

5'-ggccacgcgtcgactagtac-3' (primer5) (fc列吞号 2 3 )

5，- AAAATATCGTACGCAAAGGG -3， (primer6) (配列番号 2 4 )

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 200bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株 (TG1) にトランスフォーメーションしてブ/レーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

( 6 ) 3，- RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 3'側部分は、（ 4 ) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（ 2 ) で調製した first strand cDNAを 3 μ 1使用した。

作成したプライマーは

5， - AGGAGGTCCGCTACCCTTTG -3， (primer7) (配列番号 2 5 )

PCR反応液組成テンプレー卜 (first strand cDNA) 3μ1

X10 taq バッファ一 5μ1

2.5mM dNTPs 4 1

20 μ M primer 7 Ιμΐ

10 μ Mオリゴ dTprimer ΙμΙ

ミリ Q 35 μΐ

taq polymerase (5U/ μ 1) ΙμΙ

PCR反応条件

94°C 1分 (PAD)

94°C 30秒（変性）

52°C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング）

72°C 1分（プライマ伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行った。

72°C 7分（最後の伸長）

4°Cで保持ァガロースゲル電気泳動で、増幅された約 lOOObpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 4に示し、全長のァミノ酸配列を配列表の配列番号 3に示す。実施例 B_ 2 ：大腸菌での蛋白発現

得られた全長の塩基配列より、蛋白の N末端に相当する部分でプライマーを作製し、 C末端側はオリゴ dTプライマーを使用して、実施例 B— 1の（2) で調製した First strand cDNAを铸型として PCRを行った。

使用プライマー

5'- CCCGGATCCGACCATGGCTACCTTGGTTAAAGA -3， (primer8) (配列番号 26 )

PCR反応液組成

テンプレー卜 (first strand cDNA) 3 μ 1

X10 pyrobest ノヽッファー 5μ1

2.5mM dNTPs 4μ1

100 M primer8 Ιμΐ

ΙΟΟμΜオリゴ dTプライマー ΙβΙ

^ y Q 35 μ 1

pyrobest polymerase (5U/ μ 1) Ιμΐ

PCR反応条件

94°C 1分（PAD)

94°C 30秒（変性）

52°C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング）

72°C 1分（プライマー伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72°C 7分（最後の伸長）

4°Cで保持ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された約 llOObpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invi rogen)の BamHI、 EcoR I部位にサブクローニングして、大腸菌株 (JM109-DE3) で発現させた。発現蛋白は N末端に His - tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白は Ni- Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。この色素蛋白質を B e— Rと命名する。以下の実施例 3では、精製した蛋白の性質を解析した ₍ 実施例 B— 3 ：色素蛋白質（B e— R) の性質

(1) 光吸収特性の解析

20 Μ色素蛋白、 50mM HEPES pH7.9溶液を用いて吸収スぺクトルを測定した。このスぺクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。赤色の個体由来色素蛋白（B e—R) では 553nmに吸収のピークが認められた（表 2、図 3)。表 2

(2) pH感受性の測定

50mMの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スぺクトルを測定した（図 4)。

各 pHの緩衝液は次の通り、

pH4、 5 酢酸バッファー

pH6 リン酸バッファー

pH7、 8 HEPESバッファー

pH9、 10 グリシンパ'ッファー

図 4の結果から分かるように、 pH5〜10でピークの値は安定していた。実施例 C一 1 ：サンゴからの新規蛍光蛋白遺伝子 (Kaede)の単離

色彩に富む蛍光を放つヒュサンゴ Trachyphylliageoffroyi から、蛍光蛋白遺伝子を以下の手順で単離した。

(1) total RNAの抽出

Acid Guanidium- Phenol - Chroloform法で total RNAを抽出した。

凍結したヒュサンゴを Multi- Beads Shocker (安井器械）を用いて変性溶液中で砕き、フエノール Zクロ口ホルムを加え、遠心して蛋白質、 DNAと R Aを分離する。 R Aを含む水層を isopropanolに加え遠心すると、沈殿として total RNAが得られる。

( 2 ) RNAの精製

Oligotex - dT30 (Roche社製）を用いて、 total RNAから mR Aを分離した。

total RNA に Oligotex- dT30<super> を加え、加熱して RNAの 2次構造を壊してから、 3 7 °Cで RNAと Oligotex - dTを結合させる。洗浄後、加熱、遠心すると、 mR Aが溶出された上清が得られる。 Oligotex- dTを取り除いた上、 ethanolと NaCl で mR A沈殿させ、 zKに溶した。

( 3 ) cDNA の作製

TimeSaver と Directional Cloning Toolbox (共【こ Amersham pharmacia社製) を用いて cDNA断片を作製した。

mRNA を加熱して 2次構造を壌した後、 First - Strand Reaction Mix に DTT と Notl-dT primerと共に加え、： first- strandを合成する。更にそれを Second- Strand Reaction Mixにカ卩え、 second-strandを合成し、付属のスパンカラムで精製する。精製した double-stranded cDNAの両端に EcoRI adaptor を付け、 0«で3，側のみカットする。もう一度スパンカラムで精製して、 cDNA断片（EcoRI- Notl) を得た。

( t Expression し loning

pRSETB (Invitrogen社製）に EcoRI、NotIサイトを設け、作製した cDNAを挿入、大腸菌の JM109 DE3株に導入して、 LAプレートで培養した。この株では蛋白が合成されるため、 UVを照射した時に蛍光を発するコロニーを単離した。

その結果、約 1 3万個から 2個の蛍光を持つコロニーを得た。塩基配列を DNA シークェンサ一により決定し、このクローンを Kaede と命名した。 Kaedeのアミノ酸配列を配列表の配列番号 5に記载し、塩基配列を配列表の配列番号 6に記載する。

(5) 蛍光特性の解析

(a) 蛋白の発現と精製

得られた全長 cDNAの N末端に BamHIサイトを、 C末端に EcoRIサイトを設け、 pRSETB (Invitrogen社製）に in frameでサブクローニングして、大腸菌の JM109 DE3 株で発現させた。発現蛋白は N末端の His - tagを利用して、 Ni-Agarosegel(QIAGEN 社製）を用いて精製した。

(b) 吸収スぺクトルとモル吸光係数、蛍光スぺクトルと量子収率

この蛍光蛋白質は、 UVを照射することで吸収及び蛍光スぺクトルが緑から赤に長波長シフトする。図 5は、精製蛋白の UV照射前後の吸収スぺクトルを示す（実線が前、点線が後）。モル吸光係数は、蛋白濃度と吸収極大での吸光度より求めた (表 3)。

蛍光スペクトルは、 UV照射前後を 480nmで励起して測定し（図 6)、量子収率を Fluorescein (Molecular Probes社製）と比較して算出した（表 3)。

Kaedeの蛍光特性を以下の表 3に示す。表 3

Kaedeの蛍光特性

(c) pH感受性の特性

緑、赤それぞれにっき pH4〜l 1のバッファ一中での吸収スぺクトルを測定した。緑、赤共に p H 9を境に吸収は徐々に落ちてくる。吸収極大の変化から算出した _PKaを上記の表 3中に示した。実施例 C一 2 ：哺乳類細胞への新規蛍光蛋白の遺伝子導入

HeLa細胞に LIPOFECTIN Reagent (Gibco社）を用いて Kaedeの遺伝子を導入した。図 7は、 470nmで励起して 510nmの蛍光で測定したもので、導入後 9時間前後で蛍光が確認できる。哺乳類細胞中でも、 UVを照射すると蛍光が長波長にシフトする。実施例 C一 3 ： Kaedeの二量体化

Kaede は四量体を形成するため、他の蛋白質を融合させた際に発現パターンに異常が見られる場合がある。そこで、 Kaedeの 158番目のトレオニン（T) をアルギニン（R) に、 160番目のァラニン（A) をグルタミン酸（E) に置換し、二量体変異体を作製した。この変異体を Kaede 2とした。 Kaede 2のアミノ酸配列及ぴ塩基配列を配列表の配列番号 7及ぴ 8にそれぞれ示す。 12. 5%ァクリルァミドゲルのサンプルを煮沸しない電気泳動（Pseudonative SDS/PAGE) において、 Kaede2 は Kaedeよりも低分子としてバンドが検出された（図 8 )。また、 HeLa細胞の細胞形質膜に Kaede、 Kaede2を発現させたとき、 Kaedeは明らかに正常でない発現パターンを示した。し力、し、 Kaede2に於いては正常に細胞形質膜にターグティングされた発現パターンを示した（図 9 )。実施例 C一 4 ：紫（外）光照射依存的 Kaedeタンパク質の切断

紫（外）光照射による Kaedeの緑から赤への蛍光特性変換はタンパク質の切断を伴う。 12. 5%アクリルアミドゲルの電気泳動の結果は、 365 nm光照射により 27kDaの Kaede分子が 17kDaと lOkDaのペプチド鎖に切断される事を示し（図 1 0 上段）、且つ、 365 nm光照射により 508 nmの吸収値が減少し、 572 nmの吸収値が増加するという緑から赤への蛍光特性変換と一致することを示した（図 1 0中段、下段)。この性質はタンパク質の切断を光によりコントロールする技術となる。タンパク質を光によって切断する技術はこれまでに報告されていなレ、。またこの切断はタンパク質内での /3脱離反応であるが、タンパク質内の ]3脱離反応、あるいはアミド基が脱離基となる脱離反応はこれまでに報告されていない。実施例 D— 1 ：珊瑚からの新規蛍光蛋白遺伝子 (Momiji)の単離

(1) total RNAの抽出

蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) を用いた。ァザミハナガタサンゴをハンマーで砕き、砕いたサンゴ 10グラムに" TRIzol" (GIBC0 BRL) を 15 m l加えて攪拌し、 1500 xgで 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 3 m lを加え、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500xgで 15分間遠心した。上清にイソプロパノール 7.5 m 1を加え、 15秒間攪拌した後 10分間静置した。 17000 x gで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノールを 6 ml加えて、 17000 x gで 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ ΐで溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100 倍に希釈して O.D. 260と O.D. 280の値を測定して RNA濃度を測った。 230 jug の total RNAを得た。

(2) First strand cDNAの合成

total RNA 3 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット" Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA(33 μ ΐ)を合成した。

(3) Degenerated PGR

合成した First strand cDNA (33 μ 1)のうち 3 μΐを铸型として PCRを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー 5， - ATCAAGNTNWRYATGGAAGG -3， (primerl) (配列番号 2 7 )

5， - acVggDccatYDgVaagaaaRtt-3' (primer2) (配列番号 2 8 )

Rは A又は Gを示し、 Yは C又は Tを示し、 Vは A，C又は Gを示し、 Dは A，G又は

Tを示す。

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ ΐ

X 10 taqバッファ— 5 μ 1

2. 5m M dNTPs 4 μ 1

100 μ M primerl 1 μ ΐ

100 μ M primer2 1 1

^ U Q 35 μ 1

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 1

PCR反応条件

94 °C 1分 (PAD)

94 °C 30秒（変性）

52 °C 30秒 (プライマーの铸型へのァニーリング）

72 °C 1 分（プライマー伸長）

上記 3 ステップを 30 サイクル行い、アニーリング温度を 1 サイクルごとに 0. 3 。C下げた。 30サイクル時の温度は 43 °C。

72 °C 7 分（最後の伸長）

4 °Cで保持一回目の PCR反応で得られた増幅産物 1 μ 1をテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で予想された大きさの 350 bp のバンドを切り出し、精製した。 ( 4 ) サブクローユング及び塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションして X- gal存在下でブルーホワイトセレクシヨンを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DMを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5，- RACE法およぴ 3，- RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。

( 5 ) 5， - RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 5，側の塩基配列を決定するために 5'- RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBCO BRL)を用いて、 5，- RACE法を行つた。铸型として 1 )で調整した total醒を 3 μ g使用した。 DC-tailed cDNAの一回目の増幅には

5'-ggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig-3' ^primer 3) (酉己歹 U番^ " 2 9 ) 5，- AGTTCACACCATGATATTCAATATCATA -3， (primer4) (配列番号 3 0 )

のプライマーを用いた。二回目の増幅には

5， - ggccacgcgtcgactagtac - 3， (primerりノ (目 ϋ列番 3 1 )

5，- TCTTCGTMGTCATGCTTCGTTC- 3， (primer6) (配列番号 3 2 )

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 400 bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションして X- gal存在下でブルーホワイトセレクシヨンを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid蘭 Aを精製して、挿入された DNA断片の塩 ¾配列を DNAシークェンサ一により決定した。 ( 6 ) 3，- RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 3'側部分は、（ 4 ) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（ 2 ) で調整した first strand cDNAを 3 μ 1使用した。

作成したプライマーは 5，- GGTATTCGCCAAATACCCAAA -3， (primer7) (配列番号 3 3 )

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ ΐ

X 10 taq バッファ一 5 μ 1

2. 5 mM dNTPs 4 μ 1

20 μ M primer3 1 μ ΐ

10 μ M oligo dT primer 1 μ ϊ

^ U Q 35 μ \

taq polymerase (5 H/ μ 1) 1 μ ΐ

PCR反応条件

94 °C 1分 (PAD)

94 °C 30秒 (変性）

52 。C 30秒（プライマーの铸型へのァニーリング）

72 °C 1分（プライマー伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72 °C 7分（最後の伸長） ·

4 °Cで保持ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 500 bpのバンドを切り出し、精製した精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株 (TG1) にトランスフォーメーションして X- gal存在下でブルーホワイトセレクシヨンを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

( 7 ) 全長 cDNAの取得

得られた全長の塩基配列より蛍光蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを決定した。 N末端、 C末端に相当する部分でプライマーを作製し、（2 ) で調製した First strand cDNAを铸型として PCRを行つて全長の cDNAを得た。このクローンを Momi j i と命名した。 Momijiのアミノ酸配列を配列表の配列番号 9 に記載し、塩基配列を配列表の配列番号 1 0に記載する。

使用プライマー

5'- CCCGGATCCGACCATGGTGAGTGTGATTAAGGACGAAATG - 3，（primer8) (配列番号 3 4 ) 5， - CCGCTCGAGTTGTTGTTGTTTCTCTTTGTCCTG -3， (primer9) (配列番号 3 5 )

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X 10 pyrobest ノッファー 5 μ ΐ

2. 5 mM dNTPs 4 μ ΐ

20 μ M primer4 1 μ 1

20 μ Μ primer 5 1 μ 1

リ Q 35 μ 1

pyrobest polymerase (5 U/ μ 1) 1 ΐ

PCR反応条件

94 °C 1分 (FAD)

94 °C 30秒（変性） 52 °C 30秒（プライマーの铸型へのアニーリング）

72 °C 1 分（プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行った。

72 °C 7分 (最後の伸長）

4 °Cで保持実施例 D— 2 ：大腸菌での蛋白発現

実施例 D— 1 ( 7 ) で増幅された 700 bpのバンドをァガロースゲルの電気泳動で、切り出し、精製して pET28 vector (Novagen)の Nco I、 Xho I部位に挿入して、大腸菌株（JM109-DE3) で発現させた。 C末端に His- tagが付くようにコンストラタトし、産生させた蛋白は Ni - Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。以下、実施例 D— 3で、精製した蛋白（Momi ji) の性質を解析した。実施例 D— 3 ：蛍光蛋白の解析

( 1 ) 蛍光特性の解析

蛍光蛋白（Momij i) 20 μ Μ 50 mM HEPES pH 7. 4、 150 mM KC1溶液を用いて、吸収スぺクトルを測定した。さらに上記の緩衝液で 20倍希釈し、蛍光スぺクトル及ぴ励起スぺタトルを測定した。別に Bradford法で求めた蛋白質濃度と吸収スぺクトルのピークの値より、 508 nmと 578 nmにおけるモル吸光係数を計算した。 4δ0 nraの吸収が 0. 002となるように蛍光蛋白を同緩衝液で希釈し、 450 で励起した時の蛍光スぺクトルを測定した。 EGFP (CLONTECH)を同様に 450 nmの吸収が 0. 002 となるようにして蛍光スぺクトルを測定し、両スぺクトルの面積比から今回クロ一ユングされた蛍光蛋白の蛍光の量子収率を求めた。 EGFP の蛍光の量子収率を 0. 6とした。測定結果等は表 4及び図 1 1に示す。表 4

( 2 ) UVによるスぺクトル変化の測定

本発明の蛍光蛋白（Momiji) は UV (365 nm付近）の照射により、蛍光、及び、吸収スぺクトルが変化するため、その変化を測定した。蛍光蛋白を 50 mM HEPES pH 7. 4、 150 mM KC1溶液で希釈して、 365 nmの光を照射し、 365 nmで励起した時の蛍光スぺクトルを測定した。また蛍光蛋白 20 μ Μ、 50 mM HEPES pH 7. 4、 150 mM KC1溶液を用いて、 365 nmの光を照射した後の吸収スぺクトルを測定した。測定結果等は図 1 3及ぴ図 1 4に示す。なお、蛍光スぺクトルと吸収スぺクトルの測定を行ったときの 365 nmの光量が違うため、蛍光スぺクトルと吸収スぺクトルの変化と時間は一致しない。

( 3 ) pH感受性の測定

pH 4力、ら 1 1の緩衝液で吸収スぺクトルをとり p H感受性（pKa) を測定した _t 各 pHの緩衝液は次の通り、

pH 4、 5 ：酢酸ノ

pH 6、 11 ：リン酸ノ

pH 7、 8 ： HEPESバッファー

pH 9、 10 ：グリシンバッファー

測定結果等は表 4及び図 1 2に示す。実施例 D— 4 ： Momij iの蛍光特性の改良 Momijiの 86番目のグルタミン酸（E) をリジン（K) に 111番目のァスパラギン酸（D) をグルタミン酸（E) に、 142番目のグルタミン（Q) をプロリン（P) に、 203番目のアルギニン（R) をヒスチジン（H) にアミノ酸置換する事によりモル吸光係数の値が 102250 (508nm)から 127200 (505nm)に上昇し、緑から赤への紫

(外）光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持したまま、緑の蛍光が明るくなった（表 5、図 1 5及び 2 1 )。また、紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わつた赤い蛍光を放つ分子は、野生型 (Momiji) のそれにくらベて低い p H に抵抗性をもった（図 1 7及び 1 8 )。この変異体を Momiji2 とした。 Momiji2のァミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号 1 1及び 1 2にそれぞれ示す。表 5 ：蛍光特性変異体

実施例 D— 5 ： Momijiの光照射依存的な蛍光特性の改良

Momijiの 197番目のイソロイシン（I)をメチォニン（M)にアミノ酸置換した。この変異体を Momiji 4とした。 Momiji4のァミノ酸配列及ぴ塩基配列を配列表の配列番号 1 3及び 1 4にそれぞれ示す。紫（外）光照射依存的な緑から赤への蛍光変化が 365 nm光照射後 1分から Momiji4では観測されたが、野生型（Momiji) に於いては 365 nra光照射後 1 0分力 S Momiji の 1分間照射に相当し、明らかに Momiji 4が野生型（Momiji) より光照射依存的蛍光特性変換効率が高いことを示した（図 1 6、 2 0及び 2 2 )。 HeLa細胞に Momiji、 Momiji4を発現させて、細胞内での 410 nm光照射による緑から赤への蛍光特性の変化（Red/Green) を測定した結果も、光照射依存的蛍光特性変換効率が Momiji 4のほうが良いことを示した。紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わった赤い蛍光を放つ分子は、野生型

(Momiji) のそれにくらべて低い p H に抵抗性を持ち、特性変換光照射前の緑の蛍光を放つ分子は低い p Hに感受性となった（図 1 7及ぴ 1 9 )。実施例 D— 6 ： Momijiの二量体の作製

12. 5 %アクリルアミドゲルを用いて Momiji を煮沸せずに電気泳動

(Pseudonative SDS/PAGE) を行うと Momijiは四量体を形成していることを示した。 Momijiの 11番目のァスパラギン（N) をアルギニン（R) に、 29番目のロイシン（L) をトレオニン（T) に、 122 番目のチロシン（Y) をグルタミン酸（E) に、 136番目のリジン（K) をァスパラギン（N) に、 1³8番目のグルタミン（Q) をロイシン（L) に、 142番目のグルタミン（Q) をプロリン（P) に、 159番目のァスパラギン（N) をァスパラギン酸（D) に、 161番目のァラニン（A) をセリン

(S) に、 190番目のチロシン（Y) をトレオニン（T) に、 192番目のフエ-ルァラニン（F) をチロシン（Y) に、 196番目のシスティン（C) をセリン（S) にァミノ酸置換し、 224番目から 229番目までの 6アミノ酸を削除する事により二量体となった（図 2 4 )。 Momijiと同様に緑から赤への紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持していた（図 2 5 )。この変異体を dl6 とした。 dl6のァミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号 1 5及び 1 6にそれぞれ示す。実施例 D— 7 ： Momijiの単量体の作製

Momijiの 11番目のァスパラギン（N) をアルギニン（R) に、 29番目の口イシン（L) をトレオニン (T) に、 95番目のイソロイシン (I) をトレオニン (T) に、 101番目のイソロイシン（I) をパリン（V) に、 103番目のイソロイシン（I) をトレオニン（T) に、 122番目のチロシン（Y) をグルタミン酸（E) に、 124番目のバリン（V) をトレオニン（T) に、 138番目のグルタミン（Q) をロイシン（L) に、 142番目のグルタミン（Q) をプロリン（P) に、 159番目のァスパラギン（N) をァスパラギン酸（D) に、 161番目のァラニン（A) をセリン（S) に、 174番目のフエ二ルァラニン (F) をメチォニン（M) に、 190番目のチロシン (Y) をトレォニン（T) に、 192番目のフエ二ルァラニン（F) をチロシン（Y) に、 196番目 8 のシスティン (C) をセリン (S) に、 212番目のフエ二ルァラニン (F) をチロシン（Y) にアミノ酸置換し、 224番目から 229番目までの 6アミノ酸を削除する事により単量体となった（図 2 4 )。 Momijiと同様に緑から赤への紫（外）光照射依存的に蛍光特性が変わる性質を保持していた（図 2 6 )。この変異体を ml6とした。 ml6 のァミノ酸配列及ぴ塩基配列を配列表の配列番号 1 7及ぴ 1 8にそれぞれ示す産業上の利用の可能性

本発明により、ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornate) 由来の新規な色素蛋白質が提供されることになつた。本発明の色素蛋白質は所定の吸光特性を有し、また p H感受性が低いことから、分子生物学的分析において有用である。また、本発明の色素蛋白質の吸収度 (モル吸光係数) は著しく大きいため、光ェネルギ一の高効率な変換が可能である。また、遺伝子改変技術によって本発明の色素蛋白質の量子収率を 1に近づけることも可能であり、その場合、新規な蛍光蛋白質を作製することができる。

また本発明により、ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi) に由来する新規な一次構造を有する蛍光蛋白質を提供される。本発明の蛍光蛋白質は、紫外光によつて色が緑色から赤色に変わることを特徴とし、光によって特定の細胞や器官をマーキング（optical marking) することが可能である。さらに本発明により、ァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) に由来する新規な一次構造を有する蛍光蛋白質を提供される。本発明の蛍光蛋白質は、紫外光によって色が緑色から赤色に変わることを特徴とし、光によって、特定の細胞、器官又は蛋白質をマーキング（optical marking) することが可能である。また、本発明の蛍光蛋白質によれば、紫外光によつて非常に簡単に効率よく特異的に緑色から赤色への色変換が可能であり、色変換の前後の緑色及び赤色の両状態が非常に安定で明るいため実用的である。

Claims

請求の範囲

1 . ベリルイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の下記の特' 14を有する色素蛋白質。

( 1 ) 吸収極大波長が 6 0 5 n mである；

( 2 ) 6 0 5 n mにおけるモル吸光係数が 4 7 5 5 0である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

2 . 以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、.吸光特性を有するアミノ酸配列：

3 . ベリノレイソギンチヤク（Anthopleura inornata) 由来の下記の特'性を有する色素蛋白質。

( 1 ) 吸収極大波長が 5 5 3 n mである；

( 2 ) 5 5 3 n mにおけるモル吸光係数が 2 5 3 0 0である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

4 . 以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び Z又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：

5 . 請求項 1から 4の何れかに記載の蛋白質をコードする D NA。

6 . 以下の何れかの D NA。 '

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

( b ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする DNA：

7. 以下の何れかの DNA。

(b) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする DNA：

8. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び

9. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

(a) 配列番号 4に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 4に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び

10. 請求項 6から 9の何れかに記載の DN Aを有する組み換えベクター。

1 1. 請求項 6から 10の何れかに記載の D N A又は請求項 10に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。

1 2. 請求項 1から 4の何れかに記載の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質。

13. 請求項 1から 4の何れかに記載の色素蛋白質をァクセプター蛋白質として用いて FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。

14. 請求項 1から 4の何れかに記載の色素蛋白質、請求項 5から 9の何れかに記載の DNA、請求項 10に記載の組み換えベクター、請求項 1 1に記載の形質転換体、又は請求項 1 2に記載の融合蛋白質を含む、吸光試薬キット。

1 5. ヒュサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及ぴ 572 nm (赤）であり、蛍光極大波長が 51 8 nm (緑）及ぴ 581 nm

(赤）である；

(3) 量子収率が 0. 80 (緑）及ぴ 0. 33 (赤）である；及ぴ

(4) 緑色及ぴ赤色の pH感受性についての: K aは共に 5. 7である：

16. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するァミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するァミノ酸配列：

1 7. 配列番号 7に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

18. ァザミハナガタサンゴ（Scolymia Vitiensis) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1)紫外線の照射により緑色から赤色に変化し、励起極大波長が 508 nm (緑）及び 578 nm (赤）であり、蛍光極大波長が 518 nm (緑）及ぴ 588 nm

(赤）である；

(2) 508 nmにおけるモル吸光係数（緑）が 102250M— 1 c m— 1であり、 578 nmにおけるモル吸光係数（赤）が 76950 M— 1 c m— 1である；

(3) 量子収率（蛍光）が 0. 43 (緑）及び 0. 51 (赤）である；及び

(4)緑色（508 nm) の； H感受性について p K aが 5. 8であり、赤色（5 78 nm) の p H感受性について p K aが 6. 5である。

1 9. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。 ( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 9に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

20. 配列番号 11、 13、 1 5又は 1 7の何れかに記載のァミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

21. 以下の何れかの DNA。

( a ) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 5に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

( c ) 配列番号 6に記載の塩基配列を有する DN A；又は、

(d) 配列番号 6に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付カ卩を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

22. 以下の何れかの DNA。

( a ) 配列番号 7に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 8に記載の塩基配列を有する DNA。

23. 以下の何れかの DNA。

( b ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

( c ) 配列番号 10に記載の塩基配列を有する D N A；又は、

( d ) 配列番号 10に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA： 24. 以下の何れかの DNA。

( a ) 配列番号 1 1、 13、 15又は 1 7に記載のァミノ酸配列をコードする D

NA；又は、

(b) 配列番号 12、 14、 16又は 18に記載の塩基配列を有する DNA。

25. 請求項 21から 24の何れかに記載の DN Aを有する組み換えべクタ

26. 請求項 21から 24の何れかに記載の DN A又は請求項 25に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。

27. 請求項 15から 20の何れかに記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。

28. 他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項 27に記載の融合蛍光蛋白質。

29. 他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項 27又は 28に記載の融合蛍光蛋白質。

30. 請求項 27カゝら 29の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。

31. 請求項 15から 20の何れかに記載の蛍光蛋白質、請求項 21から 2 4の何れかに記載の DNA、請求項 25に記載の組み換えベクター、請求項 26 に記載の形質転換体、又は請求項 27から 29の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キット。