KR100456450B1

KR100456450B1 - 폐글리세롤을 １,３-프로판디올로 전환하는 신균주 및이를 이용한 １,３-프로판디올 생산방법

Info

Publication number: KR100456450B1
Application number: KR10-2002-0076539A
Authority: KR
Inventors: 김세정; 김철호; 이상기; 유성수; 곽점환; 김현수; 봉상훈; 윤두한
Original assignee: 주식회사 무궁화; 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-12-04
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2004-11-10
Also published as: KR20040048620A

Abstract

본 발명은 폐글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 신균주 및 이를 이용한 1,3-프로판디올 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤 정제과정에서 발생하는 다량의 무기물과 저급 지방산을 함유한 폐글리세롤을 부산물생성의 감소로 고효율로 1,3-프로판디올로 전환하는 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP) 및 유지산업에서 발생하는 폐글리세롤을 기질로 하여 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 접종한 다음 혐기적 조건에서 배양하여 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 추출함으로써 폐기물에 함유된 고농도 유기물 제거를 통한 폐수처리 및 유용물질을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

폐글리세롤을 １,３-프로판디올로 전환하는 신균주 및 이를 이용한 １,３-프로판디올 생산방법{A newly isolated microbial strain and method for the production of 1,3-propanediol from waste glycerol using thereof}

본 발명은 폐글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 신균주 및 이를 이용한 1,3-프로판디올 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤 정제과정에서 발생하는 다량의 무기물과 저급 지방산을 함유한 폐글리세롤을 고효율로 1,3-프로판디올로 전환하는 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP) 및 유지산업에서 발생하는 폐글리세롤을 기질로 하여 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 접종한 다음 혐기적 조건에서 배양하여 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 추출함으로써 폐기물에 함유된 고농도 유기물 제거를 통한 폐수처리 및 유용물질을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 1,3-프로판디올의 생산방법은 화학적 방법{hydration of acrolein[미국 특허 제 5,015,789호], 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide)의 hydroformylation[미국 특허 제 3,687,981호]}과 생물학적 방법[유럽 특허 0373230 A1; Homannet al.(1990) Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol byKlebsiellaandCitrobacterstrains. Applied Microbiology Biotechnology. 33, 121-126; 미국 특허 제 5,254,467호] 등이 있다.

글리세롤은 생물학적 공정으로 디하이드록시아세톤(dihydroxyacetone) [Borieset al.(1991) Kinetic study and optimization of the production of dihydroxyacetone form glycerol using Gluconobacter oxydans. Process Biochemistry. 26, 243-248], 유기산[Leaveret al.(1995) The fermentation of three carbon substrate byClostridium propionicumandpriopionibacterium. Jounal of Bacteriology. 66, 611-619], 1,3-프로판디올[Gunzel et al. (1991)Fermentative production of 1,3-propanediol from glycerol byClostridium butyricumup to a scale of 2㎥. Applied Microbiology and Biotechnology. 36, 289-294; Gottschalk and Averhoff (1990) Process for the microbiological preparation of 1,3-propanediol from glycerol. 유럽 특허 0373230 A1]과 같은 유용한 자원으로 전환될 수 있다. 1,3-프로판디올은 폴리에스터(polyester), 폴리에테르(polyether), 혹은 폴리우레탄(polyurethanes)등의 합성원료로 사용될 수 있는 물질이며, 특히 1,3-PD와 테레프탈릭산(therphtalic acid)의 중합반응에 의해 생성되는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT)는 물성이 우수하고 유점이 228 ℃로 폴리에틸렌 데레프탈레이트(PET)보다 낮아 실질적인 효용성이 많아 향후 PET를 대체할 수 있는 차세대 섬유재료로서 주목받고 있다. 1,3-프로판디올을 단량체로 하여 만든 플라스틱과 중합체는 1,2-프로판디올, 부탄디올, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)로 만든 제품보다 더 우수한 광학 안정성을 가지는 특성을 나타낸다[Elmet al., 1980; Wittet al., 1994]. 또한, 1,3-프로판디올은 폴리글리콜 형태(polyglycol-type)의 윤활제와 용매(solvent)로 사용될 수 있어 글리세롤에 비해 그 상업적 가치가 훨씬 높다. 1,3-프로판디올은 폴리머(polyester, polyurethan 등) 합성시 특성 개질제로 사용될 수 있는 잠재력이 큰 화학 원료물질 중의 하나이지만 화학합성에 의한 생산 단가가 너무 높아 최근까지 상용화되지 못하고 있었다. 국내에서는 미생물 발효에 의한 1,3-프로판디올 생산에 관한 연구가 거의 전무함으로 향후 섬유산업 분야나 생분해성 플라스틱 산업분야에서 발생되는 수요를 충족시키기 위하여 전적으로 외국기술의 도입이나 제품의 수입에 의존해야할 형편이며, 따라서 국내독자 생산을 위한 기술의 개발이 시급하다.

현재와 같은 대량생산, 대량소비, 대량폐기형 경제사회가 지속되는 한 금세기 중반 이전에 주요 천연자원의 고갈과 폐기물 처리계의 수용력 결여 등으로 경제성장이 어려워질 것으로 예견되고 있다. 산업폐기물을 이용한 생물전환 기술은 폐기물의 재활용이라는 측면뿐만 아니라 폐기물의 처리의 관점에서 매우 중요한 의의가 있다고 하겠다. 즉, 폐기물의 성공적인 재이용은 폐기물 양의 감소, 폐기물 처리에 수반되는 환경오염문제를 최소화시킬 수 있기 때문에 그 중요성이 갈수록 증대되고 있다. 한편, 폐기물성 바이오매스 자원(예를 들면, 축산폐수, 음식물쓰레기, 폐유지 등)은 재활용되거나 에너지로 재순환되지 않으면 폐기물로 환경문제를 일으키게 된다. 따라서, 우리나라 실정을 고려할 때 폐기물성 바이오매스 자원을 적극적으로 활용할 필요가 있다.

현재 유지를 가수분해하여 지방산을 얻는 방법으로는 고온고압 분해법(Colgate-Emery Process), 알카리 분해법(Saponification Method), 알코리시스법(Alcoholysis Method), 효소 분해법(Enzymatic Hydrolysis Method) 등이 알려져 있다.

이들 여러 방법 가운데 지금까지 가장 일반화되어 있는 것으로는 고온고압 분해법(Colgate-Emery Process)을 들 수 있는데, 운전조건인 250 ℃, 50 atm에서 9 ∼ 130 시간 반응시 가수분해율이 약 90% 이상에 도달한다. 유지의 분해공정중 부산물로 취득하는 저농도의 글리세롤을 정제, 농축, 증류, 탈색 및 탈취공정을 거쳐 산업용, 의약용, 식품첨가물, 폭약용 등 고순도의 글리세롤을 생산하고 최종 잔류물인 고농도 폐글리세롤은 폐기물로 취급되고 있다[도 1].

폐유지의 발생량은 연간 약 100만톤으로 10% 정도만 재활용되고 있으며, 그 중 90%는 사료 또는 비누의 제조 원료로 활용되고 있다. 폐유지의 안정성 문제 때문에 사료 제조 원료로의 이용이 금지되고 있는 실정이며, 또한 비누의 제조 원료로 3만톤 정도 사용되고 대부분은 폐기물로 매립 또는 소각처리되고 있다. 최근 석유연료를 대체하고 날로 심각해지는 환경오염 문제를 해결하기 위하여 외국에서 활발히 연구되어 지고 있는 바이오디젤 생산과정 중 대략 10 kg의 연료 생산시 1 kg의 글리세롤이 발생하게 되었다. 1991년 통계에 따르면 디젤연료 사용량의 10%를 바이오디젤 연료가 대체하여 사용되었으며, 국내에서도 이미 바이오디젤 제품의 생산이 시작되었고 향후 그 생산량은 기하급수적으로 증대될 전망이며, 이와 같은 타 산업분야에서 발생되는 페글리세롤도 본 연구를 통해 개발하고자 하는 생물전환기술을 이용하여 고부가가치의 1,3-프로판디올로 전환할 수 있다면 해당산업의 발전도 촉진할 것으로 생각된다..

폐글리세롤은 통상적으로 정제 글리세롤 생산시 정제 글리세롤 대비 10%가 발생하는 것으로 추정되며, 현재 난분해성, 고유기성 폐액인 폐글리세롤은 일반적인 폐수처리 방법인 물리, 화학적 방법이나 활성슬러지법으로는 처리가 어려운 상태이다. 따라서, 폐글리세롤을 처리하는 방법으로는 혐기성 처리방법과 희석 후 물리, 화학적 또는 활성슬러지법으로 처리하는 방법이 있으나 활성슬러지법으로 처리하기 위해서는 화학적 산소요구량(COD)을 1,000 ppm 이하로 희석하여야 한다.화학적 산소 요구량이 400,000 ppm 이상인 폐글리세롤을 1,000 ppm 이하로 만들기 위해서는 희석 배율이 400배 이상이 되어야한다.

지금까지 보고된 글리세롤을 발효하여 1,3-프로판디올로 전환하는 균주로는 통성 혐기성 균주인 사이트로박터(Citrobacter),크렙시엘라(Klebsiella)[Menzelet al., 1997a, b; Ahrenset al., 1998], 절대 혐기성 균주인 클로스트리디움(Clostridium)[Biebl, 1991; Abbad-Andaloussiet al., 1996, 1998; Reimannet al., 1998]과 락토바실러스(Lactobacillus)[Schutz and Radler, 1984] 종들의 박테리아 그룹이 있다.

한편, 글리세롤 정제과정에서 발생하는 폐글리세롤은 정제과정에서 투입되는 다량의 무기염과 유지의 가수분해 결과 생성되는 저급 지방산들을 함유하고 있다. 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키는 미생물들이 많이 알려져 있지만, 상기 폐글리세롤에 함유되어 있는 고농도의 무기염류는 미생물의 성장을 저해하여 1,3-프로판디올을 효율적으로 생산해내기는 매우 어려웠다. 이러한 산업폐기물을 기질로 한 1,3-프로판디올 생산은 발표되어진 바가 없다.

또한, 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 것으로 보고된 크렙시엘라 뉴모니아 균주는 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 과정에서 부산물로 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)이 다량 생성되는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 유지의 가수분해에서 생성되는 글리세롤을 정제하는 공정에서 발생하는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 분리하고, 이 균주를 이용하여 폐글리세롤을 기질로 하여 부산물이 거의 생성되지 않고 1,3-프로판디올을 고효율로 생산함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 고농도의 글리세롤을 함유하고 있는 유지산업 폐기물을 이산화탄소나 메탄가스로 하여 방출하는 단순한 폐수처리 개념이 아니라, 생물학적으로 1,3-프로판디올(1,3-propanediol)을 생산하는 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP) 및 이 균주를 이용한 2,3-부탄디올과 같은 부산물 생성이 적은 1,3-프로판디올의 생산방법을 제공함으로써 폐액 중의 글리세롤을 효율적으로 처리함과 동시에, 그 처리물로부터 유용물질을 생산하는데 그 목적이 있다.

도 1은 지방산과 글리세롤의 정제공정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)의 16S rRNA 유전자의 951개 부분 염기서열를 나타낸 도면이다.

도 3은 폐글리세롤을 단일 탄소원으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)의 배양 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 초기 글리세롤 농도가 50 g/ℓ일 때의 폐글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환 실험을 도시한 그래프이다.

도 5는 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 이용한 고농도 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생산을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 폐글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(Klebsiella pneumoniaeM41)[KCTC 10328BP]을 그 특징으로 한다.

또한, 글리세롤 정제과정에서 발생하는 다량의 무기물과 저급 지방산이 함유된 폐글리세롤을 희석하고, 이 희석액을 기질로 하여 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 접종한 다음, 혐기적인 조건하에서 상기 균주를 배양하고, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 방법을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

일반적으로 정제 글리세롤 또는 공업용 글리세롤로부터 1,3-프로판디올로 전환하는 미생물들은 알려진 바 있으며, 이러한 미생물을 이용하여 1,3-프로판디올을 생산하는 방법이 보고되어져 왔다. 그러나, 본 발명에서 사용하는 유지산업에서 발생하는 폐글리세롤에는 고농도의 무기물과 저급 지방산을 함유하고 있어 기존의 보고된 미생물들 및 방법으로는 폐글리세롤을 이용하여 1,3-프로판디올을 생성하는데는 많은 문제점이 있었다. 그 문제점으로는 폐글리세롤에 함유된 고농도의 무기염류는 미생물의 성장을 저해하여 기존의 균주 및 배양조건으로는 1,3-프로판디올을 효율적으로 생산해내기는 매우 어렵다는 점, 또한 기존에 보고된 크렙시엘라속에 속하는 균주들은 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 과정에서 부산물로써 2,3-부탄디올이 생성한다는 점이다. 2,3-부탄디올은 1,3-프로판디올과 비점이 비슷하여 일반적인 분리 정제방법인 분별증류법에 의한 1,3-프로판디올의 정제에 어려움이 있기 때문이었다.

따라서, 본 발명은 유지의 가수분해에서 생성되는 글리세롤을 정제하는 공정에서 발생하는 폐글리세롤을 이용하여 1,3-프로판디올을 생산하는 신규 미생물을 분리하고, 이 균주를 이용하여 폐글리세롤을 기질로 하여 1,3-프로판디올을 생산하는 공정을 제공한다. 산업폐기물을 이용한 생물전환 기술은 폐기물의 재활용이라는 측면뿐만 아니라 폐기물의 처리의 관점에서 매우 중요한 의의가 있다고 하겠다. 즉, 폐기물의 성공적인 재이용은 폐기물 양의 감소, 폐기물 처리에 수반되는 환경오염문제를 최소화시킬 수 있기 때문에 그 중요성이 갈수록 증대되고 있다. 본 발명을 통하여 산업폐기물로부터 다양한 고분자물질 합성의 원료가 되는유용물질을 생산함과 동시에 처리가 곤란한 산업폐기물에 함유된 유기물을 1,3-프로판디올로 전환후 회수함으로써 산업폐기물 자원화를 통한 환경문제의 해결 및 폐기물처리비의 절감 효과 등을 기대할 수 있다.

본 발명자들은 고농도 글리세롤을 함유하는 폐기물을 1,3-프로판디올로 생물전환함에 있어 탁월하고 유용한 성질을 나타내는 신규 미생물을 발견하였다. 폐글리세롤을 이용하여 1,3-프로판디올을 생산하는 균주를 분리하기 위하여, 폐글리세롤의 성분과 유사한 성분에 순응된 미생물이 존재할 것으로 예상되는 국내 유지 공장내 글리세롤 증류 장치 부근에서 채취한 시료로부터 분리하였다. 채취한 시료로부터 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 능력을 보이는 균주들을 집적배양하고 선별하는 과정을 거쳐 미생물을 분리하였다. 집적배양은 폐액을 희석하여 만든 액체배지 300 ㎖에 상기 시료를 접종하고 37 ℃, 혐기적 조건에서 진탕배양하였고, 배양이 끝난 배양액을 새 배양배지에 5%(v/v)가 되게 재접종하여 배양하였다. 1,3-프로판디올 생산 균주의 집적배양에 사용한 폐액배지는 글리세롤 농도로 250 ∼ 500 g/ℓ의 폐글리세롤을 글리세롤의 최종 농도가 20 g/ℓ가 되도록 희석하고, 여기에 질소원으로 1%(w/v) 콘스팁 분말(corn steep powder)을 첨가하여 사용하였다.

이러한 과정을 반복하여 얻은 순치 배양액을 1.5%의 한천이 함유된 종배양용 배지[glycerol 20.0, K₂HPO₄3.4, KH₂PO₄1.3, (NH₄)₂SO₄2.0, MgSO₄·7H₂O 0.2, CaCl₂·2H₂O 0.02, FeSO₄·7H₂O 0.005, Yeast extract 1.0 (g/ℓ)과 trace elementsolution 2.0 (㎖/ℓ)]에 도포하여 37 ℃에서 배양한 후, 한천배지 위에 형성되는 단일 콜로니를 백금이로 취하여 새 배지에 접종함으로써 순수 분리하였다. 이렇게 순수 분리한 균주는 다시 종배양용 액체배지에 접종하여, 글리세롤 분해와 1,3-프로판디올의 생산을 확인하였다. 상기 방법으로 얻어진 수종의 균주들 중, 균주들의 생장과 글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환능, 글리세롤 및 1,3-프로판디올에 대한 내성평가를 통하여 가장 우수한 내성을 나타내는 하나의 균주를 분리하였다.

상기 방법으로 분리한 균주에 대하여 일반적인 실험방법에 의거하여 그람염색, 산화효소, 유기물의 이용, 최적 pH 등 생화학적 특성을 조사하였다[표 1]. 이상의 세균학적 성상을 버지스 매뉴얼(Bergys Manual)의 계통 세균학(Systematic Bacteriology)를 참고로 검토한 결과, 분리균주는 크렙시엘라 뉴모니아에 속하는 것으로 판단되었다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이 16S rRNA 유전자의 951개 부분 염기서열을 조사한 결과 크렙시엘라 뉴모니아와 99%의 상동성을 나타내었다. 이러한 동정결과를 토대로 분리한 균주는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에 속하는 신균주로 동정하고, 이를 크렙시엘라 뉴모니아 M41로 명명하였다. 상기 신균주를 한국생명공학연구원내의 유전자은행에 2002년 8월 26일자로 기탁하였으며 수탁번호 KCTC 10328BP를 부여받았다.

분리균주의 생화학적 특성

형태	간균
그람염색	-
운동성	-
산소요구성	통성혐기성
옥시다제	-
β-갈락토시다제	+
아르기닌 다이하이드롤라제	-
리신 디카르복실라제	+
오르니틴 디 카르복실라제	-
트립토판 디아미나제	-
우레아제(urease)	+
인돌(indole) 생성	-
겔라틴 가수분해	-
아세토인(acetoin) 생성	+
소디움 티오설페이트	-
소디움 시트레이트	+
글리세롤	+
글루코스	+
만니톨	+
이노시톨	+
소르비톨	+
람노스	-
수크로스	+
멜리비오스(melibiose)	+
아미그달린(amygdalin)	+
아라비노스	+
OF-F 시험	+
OF-O 시험	+
맥콘키(MacConkey) 배지	+
NO₂생성	+
질산염 환원	-
최적 pH	7.0
+: 양성, -: 음성

본 배양에 앞서 본 발명에 따라 분리된 균주를 먼저 전배양 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 적당한 전배양 배지는 글리세롤을 탄소원으로 하며 질소원과 영양염류들을 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 접종 균주의 전배양용 배지의 조성은 배지 1ℓ당 글리세롤 20.0 g, K₂HPO₄3.4 g, KH₂PO₄1.3 g, (NH₄)₂SO₄2.0 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g, CaCl₂·2H₂O 0.02 g, FeSO₄·7H₂O 0.005 g, 효모 추출물 1.0 g과 미량원소 2.0 ㎖을 포함한다. 이러한 전배양은 발효조에서 미생물이 충분히 성장할 때까지 배양하는 것이 바람직하다. 접종량은 총 배지량에 대해5% 정도가 바람직하다.

발효조의 배지는 폐액을 희석하여 사용한다. 이때, 폐액으로는 바이오디젤 부산물, 폐유지와 같은 유기성 폐기물, 발효 부산물 등과 같은 생물학적 또는 공업적으로 생산된 글리세롤이 바람직하다. 발효조 배지는 전배양 배지와는 달리 배양액의 pH를 연속적으로 유지시켜주므로 별도의 완충용액을 첨가하지 않았으며, 폐글리세롤을 물로 5 ∼ 10 배 희석하여 탄소원으로 사용한다. 또한, 균주의 성장에 소량으로 필요한 무기물들이 폐글리세롤에는 과량으로 존재하여 세포의 성장을 오히려 저해하는 물질로 작용하기 때문에 별도의 무기염류의 첨가없이 균주의 성장에 요구되는 질소원만을 투입하였으며, 질소원으로는 콘스팁 분말을 첨가한다. 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 이용하여 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산하기 위한 발효공정은 폐글리세롤과 물을 혼합하여 액화한 폐기물에 상기 1,3-프로판디올 생산 균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41을 접종하고, 혐기적 조건을 유지시키기 위해 연속적으로 질소를 공급하면서 배양한다. 교반과 혐기적 조건을 유지하여 배양하는데, 배양하는 동안에 글리세롤이 소모되면서 배양액의 pH가 낮아지게 되므로 5N NaOH로 pH를 7로 유지시켜 준다. 글리세롤의 소모와 1,3-프로판디올의 생성 반응이 끝날 때까지 배양시킨다.

발효가 끝난 배양액은 원심분리 또는 여과를 통해 배양액중의 균체와 고형물을 제거시킨 후 정제 공정에 도입한다. 원심분리된 상등액은 물과 비점이 낮은 성분을 증류장치 내에서 연속적으로 또는 비연속적으로 제거한 후, 증류장치에 남아있는 비교적 비점이 높은 성분을 2차적으로 증류하여 1,3-프로판디올을 농축시킨다.

종래의 크렙시엘라 뉴모니아 균주로는 폐글리세롤를 기질로 하였을 때 초기 글리세롤 농도가 20 g/ℓ에서는 본 발명의 신균주와 유사한 전환율을 나타내었으나, 초기 글리세롤 농도가 50 g/ℓ에서는 성장이 저해를 받고 전환율이 급격히 떨어진다. 본 발명에서는 배양액중의 초기 글리세롤 농도를 65 g/ℓ까지 성장하였으며 1,3-프로판디올의 농도를 25 g/ℓ까지 배양할 수 있었다. 또한, 크렙시엘라 뉴모니아 균주는 글리세롤을 소비하여 1,3-프로판디올로 전환하는 과정에서 부산물로 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)이 생성되는 것으로 알려져 있다. 1,3-프로판디올과 2,3-부탄디올은 비점이 비슷하여 증류에 의해 분리·정제하기 힘드나, 본 발명에서 얻어진 신규 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)은 2,3-부탄디올의 생성이 거의 없었으며, 증류에 의해 폐글리세롤로부터 93%의 1,3-프로판디올을 얻을 수 있었다.

이와 같이 본 발명은 폐기물의 유기물 제거를 통한 폐수처리 및 1,3-프로판디올과 같은 유용물질이 고효율로 생산 가능하여 향후 섬유산업나 생분해성 플라스틱 산업 등의 분야에 매우 유용하다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 폐글리세롤을 단일 탄소원으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)의 증식 실험

폐액 배지에서의 증식 실험이전에, 미리 종배양용 액체배지를 이용하여 전배양한 후 본배양 배지에 접종하였다. 전배양은 500 ㎖ 마개가 있는 병(screw-capped bottle)에 배지 100 ㎖를 넣어 고압증기멸균을 하고, 미생물을 접종한 후 멸균 질소가스로 공기를 치환시켜 혐기적으로 하여 37 ℃에서 20시간동안 진탕 배양하였다.

폐글리세롤을 단일 탄소원으로 하는 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)의 증식 실험은 3 ℓ자(jar) 발효기를 사용하였다. 폐액 배지 2 ℓ를 발효조에 넣고 121 ℃, 15 psi에서 25분간 고압증기멸균기로 멸균하였다. 멸균이 끝난 발효조에 녹아 있는 산소를 제거하고 혐기적 상태로 만들기 위해 0.5 vvm의 속도로 0.22 ㎛의 에어필터를 통과시켜 멸균한 질소가스를 불어넣었다. 발효조 배양을 위하여 배지의 5%(v/v)에 해당하는 종배양액을 발효조에 설치된 접종용 포트를 통해 접종하였다. 발효가 진행되는 동안 배양액의 수소이온 농도(pH)를 조절하기 위해 5N NaOH, 0.25N HCl을 이용하였다. 발효시험 결과를 도 3에 나타내었다.

종배양용 배지

글리세롤	20.0 g/ℓ
K₂HPO₄	3.4 g/ℓ
KH₂PO₄	1.3 g/ℓ
(NH₄)₂SO₄	2.0 g/ℓ
MgSO₄·7H₂O	0.2 g/ℓ
CaCl₂·2H₂O	0.02 g/ℓ
FeSO₄·7H₂O	0.005 g/ℓ
효모 추출물	1.0 g/ℓ
미량 원소 용액	2.0 ㎖/ℓ
pH	7.0

발효조용 폐액 배지

글리세롤 폐액	100 ㎖/ℓ
콘스팁 분말	10 g/ℓ
pH	7.0

실시예 2: 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)에 의한 폐글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 발효용 배지의 폐글리세롤 농도를 50 g/ℓ로하여 발효를 수행하고, 이때의 1,3-프로판디올로의 전환율을 계산하였다. 발효 결과를 도 4와 다음 표 4에 나타내었다. 글리세롤 농도가 50 g/ℓ되도록 폐액을 희석한 배지에 있어서, 첨가한 글리세롤의 전부가 소비되어졌으며, 최고 1,3-프로판디올의 농도는 27.7 g/ℓ가 달성되었고 60%(g/g)의 1,3-프로판디올 전환율을 보였다.

폐글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환(글리세롤 농도 50 g/ℓ)

소모된 글리세롤	생성된 1,3-프로판디올	생성된 2,3-부탄디올	생성된 에탄올	발효 시간	전환율	생산성(g/ℓ/시간)
49.5 g/ℓ	27.7 g/ℓ	0.3 g/ℓ	0	27 시간	60.0%	1.03

실시예 3: 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 이용한 고농도 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생산

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 글리세롤의 초기농도를 65 g/ℓ로 높여 발효를 수행하였다. 65 g/ℓ의 글리세롤은 배양 종료 후 5 g/ℓ가 남아 약 92%의 소비율을 나타내었다. 배양액중의 1,3-프로판디올의 농도는 25 g/ℓ로 나타났다. 발효시험 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 4: 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)로부터 1,3-프로판디올 정제

상기 실시예 2와 동일한 조건에서 얻어진 배양액을 이용하여 1,3-프로판디올의 분별증류시험을 한 결과를 다음 표 5에 나타내었다. 배양액중의 1,3-프로판디올의 농도는 27 g/ℓ이었으며 분별 증류 결과 순도 93%의 1,3-프로판디올이 얻어졌다.

배양액으로부터 1,3-프로판디올의 분별 증류

여액 정제	침전물 및 cell의 제거원심분리 3,000 rpm, 10분
여액 농축	반응기 온도 : 80 ℃진공효율 94% (710 mmHg)1차 냉각 응축기(cooling condenser) 온도 : 40 ℃2차 냉각 응축기 온도 : 30 ℃3차 냉각 응축기 온도 : 15 ℃4차 냉각 응축기 온도 : 10 ℃저온 트랩(cold trap) : -40 ℃물 증발량 : 250 g/h
1,3-프로판디올증 류	반응기 온도 : 180 ℃진공효율 94% (710 mmHg)1차 냉각 응축기 온도 : 60 ℃2차 냉각 응축기 온도 : 40 ℃3차 냉각 응축기 온도 : 5 ℃4차 냉각 응축기 온도 : 5 ℃저온 트랩 : -40 ℃
증류산물	1,3-프로판디올 93%2,3-부탄디올 2.6%글리세롤 및 기타 4.4%

실시예 5 : 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 15380 균주와 M41(KCTC 10328BP)에 의한 폐글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환율 비교

1,3-프로판디올 생산 균주로 보고된 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 15380 균주를 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 발효용 배지의 폐글리세롤 농도를 50 g/ℓ로 하여 발효를 수행하고, 이때의 1,3-프로판디올로의 전환율을 계산하였다. 발효 결과를 다음 표 6에 나타내었다. 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 15380의 경우, 글리세롤 농도가 50 g/ℓ되도록 폐액을 희석한 배지에 있어서, 첨가한 글리세롤중 30.4 g/ℓ만이 소모되었으며, 1,3-프로판디올의 최고 농도는 12.1 g/ℓ로 39.8% (g/g)의 1,3-프로판디올 전환율을 보였다. 또한, 이때 배양액중의 2,3-부탄디올의 농도는 2.7 g/ℓ에 달하였으며, 1,3-프로판디올 대 2,3-부탄디올의 비는 82 : 18이었다. 반면, 본 발명에서 분리한 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)는 최고 1,3-프로판디올의 농도는 27.7 g/ℓ가 달성되었고 60%(g/g)의 1,3-프로판디올 전환율을 보였다. 이때의 배양액중의 2,3-부탄디올의 농도는 0.3 g/ℓ이며, 1,3-프로판디올 대 2,3-부탄디올의 비로는 99 : 1로 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)에 의한 1,3-프로판디올 생산에서는 2,3-부탄디올이 거의 생성되지 않음을 확인하였다.

폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올로의 전환 (글리세롤 농도 50 g/ℓ)

균주	소모된 글리세롤	생성된 1,3-프로판디올	생성된 2,3-부탄디올	생성된 에탄올	전환율
M41	49.5 g/ℓ	27.7 g/ℓ	0.3 g/ℓ	0	60.0%
ATCC15380	30.4 g/ℓ	12.1 g/ℓ	2.7 g/ℓ	1.41 g/ℓ	39.8%

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)은 종래 균주에 비해 부산물(2,3-부탄디올)이 거의 없으며, 글리세롤 정제과정에서 발생하는 다량의 무기물과 저급 지방산이 함유되어 있는 폐글리세롤에서 1,3-프로판디올을 효율적으로 생산하는데 매우 유용하다. 따라서, 신균주를 이용한 1,3-프로판디올 생산방법은 폐기물의 유기물 제거를 통한 폐수처리 및 1,3-프로판디올과 같은 유용물질이 고효율로 생산 가능하여 향후 섬유산업나 생분해성 플라스틱 산업 등의 분야에 매우 유용하다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY MUKUNGHWA CO., LTD <120> A newly isolated microbial strain and method for the production of 1,3-propanediol from waste glycerol using thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 951 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae M41 <400> 1 ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tgtgaagaag gccttcgggt 60 tgtaaagcac tttcagcggg gaggaaggcg gtgaggttaa tacctcatcg attacgttac 120 ccgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag 180 cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg tctgtcaagt cggatgtgaa 240 atccccgggc tcaacctggg aactgcattc gaaactggca ggctagagtc ttgtagaggg 300 gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga 360 aggcggcccc ctggacaaag actgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 420 tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggc 480 gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg agtacggccg caagggccag 540 cggttaggcc gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga 600 cgtcaagtca tcatggccct tacgaccagg gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa 660 agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga 720 gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg 780 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg accgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa 840 gaagtaggta gcttaacctt tgggagggcg cttaccactt tgtgattcat gactggggtg 900 aagtcgtaac aaggtaaccg tatcgggaac ctgcggttgg atcacctcct t 951

Claims

폐글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 2,3-부탄디올과 같은 부산물 생성이 적은 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 M41(Klebsiella pneumoniaeM41)[KCTC 10328BP].
글리세롤 정제과정에서 발생하는 폐글리세롤을 희석하고, 이 희석액을 기질로 하여 크렙시엘라 뉴모니아 M41(KCTC 10328BP)을 접종한 다음, 혐기적인 조건하에서 상기 균주를 배양하고, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 추출하는 것을 특징으로 하는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올의 생산방법.