KR20190027988A - 2,3-부탄디올 생산 미생물 고속 스크리닝 방법 - Google Patents

2,3-부탄디올 생산 미생물 고속 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2,3-부탄디올 생산 미생물 고속 스크리닝 방법에 관한 것으로 시료를 NADP+, 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제를 포함하는 완충용액에 첨가하는 단계; 및 NADPH 또는 NADH의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올 생산균주 고속 스크리닝 방법이다. 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 2,3-부탄디올 생산균주를 고속으로 높은 민감도로 분석할 수 있다.

Description

2,3-부탄디올 생산 미생물 고속 스크리닝 방법{High-Throughput screening method of microorganism producing 2,3-butanediol}
본 발명은 2,3-부탄디올 생산 미생물 고속 스크리닝 방법에 관한 것이다.
2.3-부단디올(2,3-butandiol; BDO)는 여러 종류의 플라스틱 및 살충제의 전구물질이다. 해가 지날수록 합성고무에 대한 수요가 증가하는데, 1.3-부타디엔을 합성하는데 필수적인 전구물질인 2,3-BDO의 수요는 더 증가될 것이다. 현재는 2,3-부탄디올은 석유의 정제 공정으로 얻어지는데, 환경문제를 일으킬 뿐만 아니라 화석연료의 고갈의 문제를 직면하게 된다. 이에 따라 상당한 정도의 생물학적 방법을 사용하여 생산하는 것이 수행되었다. 헤테로트로프(heterotroph)는 포도당, 녹말 및 셀룰로오스와 같은 당을 사용하는 반면에, 오토트로프(autotroph)는 CO, CO2 및 합성가스를 탄소원으로 이용한다. 전형적인 헤테로트로프 미생물로는 Klebsiella , Serratia, Bacillus, 및 Enterobacter가 있고, 몇 종류의 C . ljungdahlii , C. ragsdalei, 및 C. autoethanogenum 같은 Clostridium 이 오토트로프의 대표적인 예이다. 2,3-BDO의 빠르고 민감한 관측은 2.3-BDO를 생산하는 균주를 스크리닝 하는데 중용하다. 아세토인 릭덕타아제/2,3-부탄디올 디하이드로게나아제는 다음의 반응을 촉매한다. 2,3-BDO를 관측하기 위하여 가스 크로마토그래피(Gas chromatography; GC), HPLC가 일반적으로 사용되었다. 최근에는 박막크로마토그래피(Thin layer Chromatography, TLC)가 제안되기도 하였다. GC와 HPLC로 배양액을 분석하는 것은 정량적인 결과를 제공한다. 그러나 이들 방법은 고비용이 소모되고 많은 장치가 필요하거나 단백질 및 다른 분자를 제거하기 위하여 시료를 전처리하는 과정이 필요하다. 이에 더하여 분석은 40 내지 60분이 소요된다. 때문에 고속 스크리닝이나 시료를 동시간적으로 처리하는 것이 매우 어렵다. 때문에 GC와 HPLC는 스크리닝 목적에 적합하지 않다.
미국 특허 US 9493746 B2에서는 4-하이드록실-CoA(4-hydroxybutyryl-CoA)를 4-하이드록시부틸알데하이드(4-hydroxybutyraldehyde)로 전환시키는 재조합된 부틸아데하이드 디하드로게나아제(butylaldenyde dehydrogenase; Bld)와 4-하이드록시부틸알데하이드를 1,4-부탄디올(1,4-butanediol)을 생산하는 부탄올 디하이드로게나아제(butanol dehydrogenase; Bdh) 및 이의 탐색 방법이 개시되어져 있다. 여기에서는 최종 산물은 1.4-부탄디올을 생산하는지 여부를 확인하기 위해서 Schiff 염기를 4-하이드록시부틸알데하이드와의 결합을 이용한 간접 특정 방법을 사용하였다. 4-하이드록시부틸알데하이드 아가 배지에 첨가된 Schiff 염기와 반응하여 540nm에서의 발색을 나타낸다. 이 측정을 위해서는 3시간 동안 항온반응 시켜서 발색 여부를 확인하여야 하는 어려움이 있었다. 위와 비슷한 방법으로 유럽특허 2876155 A2에서는 Raoultella planticola의 개선된 균주를 이용한 2,3-부탄디올의 생산방법에 대해 개시하고 있는데, 여기에서도 2,3-부탄디올의 생산량을 2,3-부탄디올을 산화시켜 아세트알데하이드를 만들고 이를 페닐하이드라진 및 소디움 니트로프루시에이트(sodium nitroprussiate)와 반응시켜 분광기에서 측정하였다.
유럽특허 EP 3135760 A1에서는 1,3-부탄디올을 생성하는 균주에 대해서 개시하고 있고, 1,3-부탄디올의 생산을 확인하기 위해서 HPLC, GCMS 및 LCMS를 사용하였다.
그러나 위와 같은 방법은 상당한 시간과 장비가 필요하다. 본 발명자는 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제를 이용하게 되면, 이 효소에 의하여 2,3-부탄디올이 산화되고, 이에 따라 발생되는 NADPH의 양을 측정하게 되면 2,3-부탄디올의 생성량을 간접적으로 측정할 수 있어서 간편하고 용이하게 2,3-부탄디올의 생산량을 측정할 수 있음을 발견하고 2,3-부탄디올 생성균주 고속 스크리닝 방법을 개발하였다.
본 발명은 2,3-BDO 생산균주의 고속 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 위하여 본 발명의 제 1 의 형태는 시료를 NADP+,2,3-부탄디올 디하이드로게나아제를 포함하는 완충용액에 첨가하는 단계; 및NADPH의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올 생산균주 고속 스크리닝 방법를 제공한다. 상기 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제는 2,3부탄디올을 아세토인을 생성하면서 NAD+ 또는 NADP+를 환원시켜 NADH 또는 NADPH를 생산하는 효소이다. 바람직하게는 Clostridium ljungdahlii DSM13528로 부터 분리된 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제이다. 상기 흡광도는 NADH 또는 NADPH의 흡광도를 이용하여 측정될 수 있다. NADH와 NADPH의 흡광도는 잘 알려져 있다(https://en.wikipedia.org/wiki/Nicotinamide_adenine_dinucleotide; 2017.08.07 최종접속). 상기 흡광도는 바람직하게는 다른 물질과의 간섭을 방지하기 위하여 340nm의 빛의 파장에서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 2,3-부탄디올 생산균주를 고속으로 높은 민감도로 분석할 수 있다.
도 1은 Clostridium ljungdahlii DSM13528로 부터 분리된 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제의 분자 크기를 보인다.
도 2는 340nm의 흡광도와 2.3-부탄디올의 농도에 따른 상관관계를 보여준다.
이하에서는 본 발명을 구체적인 예를 통하여 상세히 설명한다.
비교예 1) HPLC를 이용한 ( R,R )-2,3- 부탄디올 생산 균주의 분석
HPLC를 이용한 분석은 HPLC의 (R,R)-2,3-부탄디올에 대한 민감도와 배양액 속의 (R,R)-2,3-butanediol 분석을 통한 정량을 위하여 진행하였다. 민감도 분석을 위하여 0.01-0.05 mM과 0.1-1.0 mM 농도의 기질을 이용하였다. 배양액 속의 2,3-butanediol 농도 분석을 위하여 1 ml의 배양액을 취한 후 원심분리 하여 상등액을 0.2 ｕm 멤브레인 필터를 이용하여 여과 후 HPLC 분석에 이용하였다. 분석에는 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Hercules, USA)을 이용하였으며 이동상으로 5 mM H2SO4 을 사용했다. 조건은 50 oC , 유량 0.6 ml/min로 40분간 굴절률 검출기를 이용하여 분석하였다(RID) (Kim and Hahn, 2015; Park, Rathnasingh and Song et al., 2015).
실시예 1) 효소 방법을 통한 2,3-부탄디올 생산 균주 고속 스크리닝
균주와 배양조건
재조합 플라스미드 DNA 제작을 위하여 필요한 유전자 확보에 사용한 균주인 clostridium ljungdahlii DSM13528 는 DSMZ로부터 분양 받았다. 해당 균주를 이용하여 혐기 조건 하에 PETC 배지 (DSMZ 배지 879) 80 ml를 이용하여 37 oC 에서 180 rpm 으로 진탕 배양하였다. 이 후 배양액을 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형 DNA로 이용하여 PCR 방법으로 bdh 유전자를 증폭하였다.
클로닝에 사용한 숙주 균주 E. coli DH5α는 암피실린 100 μg/ml을 함유한 LB (Luria-Bertani) 배지에서 배양하였다. 그리고 재조합 단백질을 대량으로 얻기 위하여 사용한 E. coli BL21 (DE3) 균주는 클로람페니콜 (25 μg/ml) 을 함유한 600 ml 의 LB (Luria-Bertani) 배지 조건에서 37 oC 에서 130rpm 으로 진탕 배양하였다 (Tan et al., 2015 , Raedts et al., 2014 ).
클로스트리디움 bdh 유전자의 클로닝
DSMZ 로 부터 분양 받은 C. ljungdahlii DSM13528SMS PETC 배지 조건에서 배양한 다음 이로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 그 다음, 다음의 프라이머 조합과 (CLJU23220_F 5'- AGAAGGAGATATACATATGAAAGCTGTATTGTGGTATGAT
A (서열번호 1) / CLJU23220_R 5'-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCAATAAGGATTTGTCAGGAGTT
AC (서열번호 2)) nPfu-Forte DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR 방법으로 CL-bdh 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 (NdeI/ XhoI) 처리 된 pET24a 벡터와 함께 SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning) 방법으로 클로닝 하였다. (Jeong et al., 2012). 완성된 재조합 플라스미드 pET24a_CL-bdh 는 플라스미드 DNA 증폭을 위해 E. coli DH5α에 도입하였고, 이 배양액을 innuPREP 플라스미드 미니 키트(Analytik Jena, Jena, Germany)를 이용하여 재조합 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이후 대량의 재조합 단백질을 얻기 위하여 단백질 발현용 균주인 E. coli BL21로 pET24a_CL-bdh를 도입하였다.
클로스트리디움 Bdh 단백질의 발현 및 정제
단백질 발현을 위하여 pET24a_CL-Bdh를 보유하고 있는 E. coli BL21 (DE3)를 100 ｕg/ml 의 앰피실린을 함유하고 있는 LB배지에 접종하였다. 이 후 OD600이 0.6이 되었을 때 CL-Bdh 발현을 유도하기 위하여 0.5mM IPTG 처리를 하고 16 oC 에서 15시간 동안 배양하였다. 배양 후 4 oC 에서 13,000 rpm 으로 20분간 원심분리하여 세포만 수확하였다. 분리한 세포는 인산 완충용액(300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 1 mM DTT, pH 8.0)에 현탁 하여 초음파를 이용하여 4 oC 에서 10,000 rpm 으로 1 시간 동안 세포벽 파쇄를 진행하였다. 이 후 상등액을 니켈 친화(nickel affinity) 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하고 브래드포드 분석(Bradford assay)로 농도를 확인하고 SDS-PAGE로 정제한 단백질의 크기를 확인하였다(Tan et al., 2015).
효소적 분석법
C. ljungdahlii DSM13528의 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제(butanediol dehydrogenase)는 (R,R)-2,3-부탄디올 및 메조-2,3-부탄디올에 기질 특이성을 가지며, Clostridium beijerinkii의 알코올 분해효소(Cbei_1464)와 매우 높은 시퀀스 유사도를 가지고 있다. 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제를 이용하여 2.3-부탄디올생산 균주를 스크리닝 하는 분석방법은 200 mM Tris-HCl 8.0, 5 mM NADP+, 1 mM DTT, 20 ｕg/ml 효소와 생물배양액 또는 기질을 조성으로 한 200 μl의 혼합액을 만든 다음 96 웰에 분주 후 45℃에서 20분간 반응하여 NADPH가 빛을 흡수하는 파장인 340nm에서 UV-2600 분광기(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도 측정하여 스크리닝 하였다.
CL - Bdh의 클로닝 , 발현, 정제
C. ljungdahlii의 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제(CL-Bdh)는 Zn2 + 의존 알코올 분해효소로 환원 반응 시에는 보조인자로서 NADPH만을 이용하며 (R,R)-2,3-부탄디올과 메조-2,3-부탄디올에 기질 특이성을 가진 C. beijerinkii NCIMB 8052 (Cbei_1464)와 BLAST상에서 78%의 유사도를 가지고 있다(Tan et al., 2015; Raedts et al., 2014). 재조합 단백질을 확보하기 위해서 먼저 재조합 플라스미드 DNA 제작을 위한 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제 유전자(CL- bdh )를 얻고자 C. ljungdahlii를 PETC 배지에서 배양 후 게노믹 DNA를 추출하여 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다. 증폭한 유전자는 pET-24a(+)와 함께 라이게이션 디펜던트(ligation dependent) 방법을 이용하여 클로닝 한 후 단백질 발현을 위하여 E. coli BL21 (DE3)에 도입하였다. 발현된 단백질은 니켈 친화성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고 SDS-PAGE를 통해 크기가 40 kDa 으로 확인하였다.
효소적 분석방법을 이용한 2,3- 부탄디올 탐색
정제한 재조합 효소가 기질 (R,R)-2,3-butanediol에 반응하는지 효소적 분석방법으로 확인 하였다. 분석 방법은 45 oC 에서 20분간 반응 후에 NADPH가 빛을 흡수하는 파장인 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 기재한 비교예 1과 같이 민감도 비교를 위하여 2,3-butanediol 분석 시 보편적으로 많이 사용하는 HPLC로 농도 별로 희석한 (R,R)-2,3-butanediol 을 분석 해 보았다. HPLC를 이용한 분석법은 최소 (R,R)-2,3-butanediol 0.2Mm까지 분석 할 수 있는 것으로 확인되었다. 반면에, 본 연구에서 사용한 효소적 분석방법은 0.01Mm 에서 1.0Mm 농도의 (R,R)-2,3-butanediol을 분석 할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서 효소적 분석법을 이용한 2,3-butaneidol 탐색은 HPLC보다 약 20배정도 높은 민감도를 가지고 있는 것을 알 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 효소적 분석방법은 매우 빠르고 민감도가 높았다.
효소적 분석방법을 이용한 2,3- 부탄디올 생산 균주 탐색
본 발명에 따른 효소적 분석방법이 2,3-부탄디올을 생산하는 균주 탐색에 적합한지 알아보기 위하여 균주 배양액을 기질로 실험을 진행 해 보았다. 그리고 효소적 분석방법이 정확한지 확인 하기 위하여 상기 비교예1에서 같이 HPLC와 함께 동일한 샘플을 이용하여 실험을 진행하여 비교하였고 하기 표1에 그 결과를 나타내었다. 실험 결과 샘플을 효소적 분석방법을 이용 하였을 때에 23개의 샘플 중 13개에서 2,3-부탄디올을 확인 할 수 있었다. 반면 HPLC를 이용한 분석법으로는 8개에서 2,3-부탄디올을 확인 할 수 있었다. 이는 민감도 비교분석 결과와 마찬가지로 민감도가 더 높은 효소적 분석방법이 배양액 속의 낮은 2,3-부탄디올 농도까지도 분석하였기 때문인 것을 알 수 있다. 그리고 비교예 1에 따른 HPLC 분석법에서 2,3-부탄디올이 확인된 샘플은 모두 효소적 분석법을 이용하였을 때도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 효소적 분석방법은 분석시간이 20분으로 빠르고 96 웰 플레이트를 사용하기 때문에 쉽게 대량의 2,3-부탄디올 샘플을 스크리닝 할 수 있는 방법이다.
Figure pat00001
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Claims (3)

  1. 시료를 NADP+, 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제를 포함하는 완충용액에 첨가하는 단계; 및
    NADPH 또는 NADH의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올 생산균주 고속 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 2,3-부탄디올 디하이드로게나아제는 Clostridium ljungdahlii DSM13528로 부터 분리된 것으로 특징으로 하는 2,3-부탄디올 생산균주 고속 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡광도는 340nm의 빛의 파장에서 측정되는 것을 특징으로 하는 는 2,3-부탄디올 생산균주 고속 스크리닝 방법.
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JP2015530116A (ja) * 2012-09-28 2015-10-15 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 光合成微生物を使用してアセトインおよび２，３−ブタンジオールを生産する方法
KR20150121789A (ko) * 2014-04-21 2015-10-30 지에스칼텍스 주식회사 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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