KR20110068886A

KR20110068886A - 글리세롤로부터 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조할 수 있는 재조합 미생물 및 이러한 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 폴리락틱산 또는 락틱산 공중합체를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20110068886A
Application number: KR1020100127101A
Authority: KR
Inventors: 김태완; 강혜옥; 양택호
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2011-06-22
Also published as: KR101260187B1

Abstract

본 발명은 글리세롤(glycerol)을 이용하여 락테이트 중합체 또는 공중합체를 생산할 수 있는 미생물 및 이러한 미생물을 이용하여 글리세롤(glycerol)을 기질 중 하나로 이용하여 락테이트 중합체 또는 공중합체 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 글리세롤을 기질로 사용할 수 있는 미생물에 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소의 유전자가 도입되어 글리세롤을 기질로 이용하여 미생물을 배양하면 락테이트 중합체 및 공중합체를 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

글리세롤로부터 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조할 수 있는 재조합 미생물 및 이러한 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 폴리락틱산 또는 락틱산 공중합체를 제조하는 방법{Recombinant microorganism able to produce polylactate or polylactate copolymer from glycerol and method for producing polylactate or polylactate copolymer from glycerol using the same}

본 발명은 글리세롤로부터 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조할 수 있는 재조합 미생물 및 이러한 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 폴리락틱산 또는 락틱산 공중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

폴리락테이트(PLA)는 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 연쇄커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 유기용제(solvent)나 연쇄커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어 있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.

화학합성을 통하여 락테이트를 이용하여 PLA를 합성할 경우 PLA 호모폴리머는 쉽게 수득할 수 있지만 다양한 모노머 조성을 지닌 PLA 공중합체의 합성은 어렵고 상업적으로 효용성이 매우 떨어지는 단점이 있다.

한편, 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoaste, PHA)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.

미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. 미생물을 이용하여 PLA 및 LA 공중합체를 합성할 때도 같은 시스템이 필요하며 원래의 PHA 합성효소의 기질인 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소 이외에 추가로 락틸-CoA(lactyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소가 필요하다.

더 나아가 생분해성 고분자의 경제적인 생산을 위해서는 저가의 기질을 사용하는 것이 매우 중요하며, 특히 저가의 기질인 글리세롤을 이용하여 락테이트 중합체 또는 락테이트 공중합체를 제조할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 글리세롤을 기질로 이용하여 락테이트 중합체 또는 공중합체를 생산할 수 있는 미생물 및 이러한 미생물을 이용한 락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소의 유전자를 포함하며, 기질로 글리세롤을 사용할 수 있는 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 락테이트 및 글리세롤; 또는 락테이트, 글리세롤 및 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경 하에서 배양 또는 재배하고;

상기 세포 또는 식물로부터 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 회수하는 것을 포함하는

글리세롤로부터 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 락틸-CoA를 제공하기 위한 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 및 이에 의해 만들어진 락틸-CoA를 기질로 이용하는 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(synthase)의 변이체를 사용하여 성공적으로 락테이트 중합체 및 공중합체를 합성할 수 있었다(대한민국 특허출원 제10-2006-0116234호).

더 나아가 본 발명자들은 생분해성 고분자의 경제적인 생산을 위해서 저가의 기질인 글리세롤을 이용하여 락테이트 중합체 및 공중합체를 제조하고자 하였고, 이에, 본 발명자들은 저가의 기질인 글리세롤을 사용하는 대장균을 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제와 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 발현하는 플라스미드로 형질전환하였으며, 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 락테이트 중합체 및 공중합체를 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 폴리락테이트(polylactate) 또는 락테이트 공중합체(하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체: poly(hydroxyalkanoate-co-lactate) 생성능을 가지는 세포 또는 식물은 (a) 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 (b) 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자 중 어느 하나 이상을 포함하지 않는 세포 또는 식물을 상기 (a) 및 (b) 중 어느 하나 이상의 유전자로 형질전환하여 얻어질 수 있다. 즉, (a) 및 (b) 유전자를 가지지 않는 세포 또는 식물을 (a) 및 (b) 유전자로 형질전환하여 수득되거나, (a) 유전자를 가지지 않으면서 (b) 유전자를 가지고 있는 세포 또는 식물을 (a) 유전자로 형질전환하여 수득할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 예를 들어, 상기 (a) 및 (b) 유전자 중 어느 하나를 가지고 있는 세포에서 그 유전자를 증폭시킴과 아울러 다른 한 개의 유전자로 형질전환시킨 것도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 중의 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acid), 2-하이드록시프로피온산(2-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hexenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헵탄산(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methyl ester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propyl ester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzil ester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3, 12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시노난산(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-heptenoic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 하이드록시알카노에이트일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트렌스퍼라아제(propionyl-CoA transferase) 유전자(pct)가 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로 이러한 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 Clostridium propionicum 유래 프로피오닐-CoA 트렌스퍼라아제 유전자일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 서열번호 1의 염기 서열(CpPCT); 서열번호 1의 염기 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기 서열(CpPCT522); 서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이된 염기 서열(CpPCT512); 서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Gly335Asp가 변이된 염기 서열(CpPCT531); 서열번호 1의 염기 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이된 염기 서열(CpPCT533); 서열번호 1의 염기 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이된 염기 서열(CpPCT535); 서열번호 1의 염기 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이된 염기 서열(CpPCT537); 서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 2의 염기 서열에서 Ala243Thr이 변이된 염기 서열(CpPCT532); 서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 2의 염기 서열에서 Asp257Asn이 변이된 염기 서열(CpPCT534); 서열번호 1의 염기 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기 서열(CpPCT540)을 갖는 유전자일 수 있다.

특히, CpPct540 유전자가 글리세롤을 이용하여 락테이트 중합체 또는 공중합체를 생산하는데 있어 더욱 바람직한 Clostridium propionicum 유래 propionyl-CoA transferase 변이체의 유전자이다.

본 발명에 따른 세포 또는 식물은 또한 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소(Polyhydroxyalkanoate synthase)의 유전자를 포함한다. 이러한 PHA 합성효소 유전자로는 슈도모나스(Pseudomonas) 속 6-19 유래 PHA 합성효소인 서열번호 4의 아미노산 서열; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 갖는 유전자 등이 이용될 수 있다.

특히 상기 phaC1_Ps6 _-19337 유전자가 글리세롤을 이용하여 락테이트 중합체 또는 공중합체를 생산하는데 있어 더욱 바람직한 Pseudomonas 속 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체의 유전자이다.

또한 본 발명에 따른 세포 또는 식물은 글리세롤로부터 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 생성하는 효소의 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 글리세롤로부터 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 생성하는 효소의 유전자를 추가로 포함하는 재조합 세포 또는 식물은 하이드록시아실-CoA를 자체적으로 생산할 수 있으므로, 하이드록시알카노에이트를 배지에 포함시키지 않더라도 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 높은 수율로 생산할 수 있게 한다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 글리세롤로부터 하이드록시아실-CoA를 생성하는 효소는 케토티올라제 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케토티올라제 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 Ralstonia eutropha에서 유래한 것이 바람직하다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 세포는 박테리아, 특히, 대장균일 수 있다.

본 발명은 또한 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸l-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소의 유전자를 포함하는 락테이트 중합체 또는 공중합체 제조용 재조합 벡터로 형질전환된 글리세롤을 기질로 사용할 수 있는 세포 또는 식물을 제공한다. 상기 세포 또는 식물은 글리세롤로부터 3-하이드록시부틸-CoA를 생성하는 효소의 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에서, 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 바람직한 숙주세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵세포는 전술한 세 가지 유전자들 중 어느 하나의 유전자를 가지는 미생물뿐만 아니라, 대장균과 같이 상기 유전자 모두를 가지지 않는 미생물 또한 사용 가능하다. 바람직한 대장균은 E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL1-Blue(Stratagene), E. coli B 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)도 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli 및 PHA 합성효소의 유전자를 가지는 미생물에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 등이 숙주세포로서 이용될 수 있다. 효모와 곰팡이 같은 주지의 진핵숙주세포, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포, CHO 및 생쥐 세포와 같은 동물세포, 조직배양된 인간세포 및 식물세포도 사용될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.　진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다.　플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다.　예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다.　그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 전술한 바와 같이 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명에 적합한 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.

또한, 원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.　선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.

한편, 식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환 식물을 수득할 수 있다. 예를 들면, 형질전환된 식물을 이용하여 PHA를 제조하는 것에 관한 선행특허(WO 94/11519; US 6,103,956)와 동일 내지 유사한 방법으로 본 발명에 적합한 형질전환 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 이용가능한 형질전환 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명은 저가의 기질인 글리세롤로부터 락테이트 중합체 또는 공중합체를 효율적으로 제조할 수 있는 세포 또는 식물을 제공하며, 이러한 세포 또는 식물을 재배 또는 배양하는 것을 특징으로 하는 락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법을 제공한다.

도 1은 pPs619C1337-CPPCT540벡터를 도시한 것이다.
도 2는 pMCS104ReAB 플라스미드를 도시한 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 재조합 대장균의 제작

pPs619C1337CPPCT540 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue 와 pPs619C1337CPPCT540 및 pMCS104ReAB 등 두 개의 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue를 각각 제작하였다. 본 연구를 위해 제작된 pPs619C1337CPPCT540 플라스미드와 pMCS104ReAB는 각각 두 종류의 주요 효소가 발현되도록 구성되어 있다. 이들 효소들은 대장균 내에서 생분해성 고분자인 폴리락테이트 및 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-락테이트)가 생합성되기 위한 필수 효소들로서, Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래의 고분자 중합효소인 phaC1_Ps6 _-19337, 아세틸-CoA로부터 CoA를 락테이트로 전달시켜 릭틸-CoA로 전환시켜주는 효소인 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트렌스퍼라아제(propionyl-CoA transferase, CPPCT), 그리고 글리세롤로부터 3-하이드록시부틸-CoA를 합성하는 효소인 Ralstonia eutropha 유래의 ketothiolase(phaA_RE) 및 acetoacetyl-CoA reductase(phaB_RE)이다. 본 pPs619C1337CPPCT540 플라스미드에는 phaC1_Ps6 _-19337, CPPCT540 유전자들을 포함하고 있고 (도 1), pMCS104ReAB 플라스미드에는 phaA_RE 및 phaB_RE 유전자들을 포함하고 있다 (도 2).

또한 phaC1_Ps6 _-19337 유전자와 CPPCT540 유전자의 경우, 서열번호 3 Pseudomonas sp. 유래의 PHA synthase인 phaC1_Ps6 _-19유전자와 서열번호 1의 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(propionyl-CoA transferase, CPPCT) 유전자로부터 각각 락테이트 중합체 및 공중합체에 유리하도록 변이된 유전자들이다. 각 플라스미드 상에서 포함된 유전자 모두는 재조합 대장균 내에서 콘스티튜티브(constitutive)하게 발현되도록 제작되었다.

< 실시예 1-1> Pseudomonas sp . 6-19 유래 PHA 합성효소의 기질 특이성 변이 체 제작

다양한 종류의 PHA 합성효소 중에서 Type II PHA 합성효소는 비교적 탄소수가 긴 기질을 중합시키는 MCL-PHA(medium-chain-length PHA) 합성효소로 알려져 있고, 이 MCL-PHA 합성효소는 락테이트 공중합체 생산에 매우 유용할 것으로 기대되고 있다. 본 발명에서 획득한 phaC1_Ps6 _-19합성효소와 매우 상동성이 높은 Pseudomonas sp. 61-3 유래 phaC1 합성효소는 Type II 합성효소이지만, 비교적 넓은 범위의 기질 특이성을 가진다고 보고되어 있고(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998), SCL-PHA(short-chain-length PHA) 생산에 적합한 돌연변이체에 관한 연구 결과가 보고되어 있다(Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004). 이를 바탕으로 본 발명인들은 SCL 활성에 영향을 미치는 아미노산을 SDM 방법을 이용하여 phaC1_Ps6 _-19합성효소 변이체들을 만든바 있다(국내특허 출원번호 10-2006-0116234).

보다 구체적으로는 다음과 같이 제조하였다. Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP) 유래 PHA 합성효소(phaC1_Ps6 _-19) 유전자를 분리하기 위해 Pseudomonas sp. 6-19의 전체 DNA를 추출하고, phaC1_Ps6 _-19 염기 서열(송애진, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)에 기반한 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하고, PCR을 수행하여 phaC1_Ps6 _-19 유전자를 수득하였다.

서열번호 5: 5'- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3'

서열번호 6: 5'- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3'

PCR 반응물을 아가로오스 젤 전기영동 한 결과, phaC1_Ps6 _-19 유전자에 해당하는 1.7kbp 크기의 유전자 절편을 확인하였다. phaC1_Ps6 _-19합성효소의 발현을 위해서 단량체(monomer) 공급 효소와 합성효소가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현 시스템을 도입하였다.

pSYL105 벡터(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다.

pReCAB 벡터는 PHA 합성효소 (phaC_RE)와 단량체 공급효소 (phaA_RE & phaB_RE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현되며, 대장균에서도 잘 작동된다고 알려져 있다(Lee et al., Biotech . Bioeng., 1994, 44:1337-1347). pReCAB 벡터를 BstBI/SbfI으로 절단하여 R. eutropha H16 PHA 합성효소 (phaC_RE)를 제거한 다음, 상기에서 수득한 phaC1_Ps6 _-19유전자를 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 제조하였다.

BstBI/SbfI 인식부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1_Ps6 _-19합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환 없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.

서열번호 7: 5'- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3'

서열번호 8: 5'- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3'

서열번호 9: 5'- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3'

서열번호 10: 5'- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3'

서열번호 11: 5'- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3'

서열번호 12: 5'- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3'

상기 제작한 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터의 phaC1_Ps6 _-19유전자의 염기 서열은 시퀀싱을 통해 확인하여, 서열번호 3로 나타내었으며, 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열번호 4에 나타내었다.

상기 phaC1_Ps6 _-19합성효소의 PHB 합성 여부를 확인하기 위해 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 E. coli XL-1Blue(Stratagene)에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육 시킨 결과 PHB 생성이 관찰되지 않았다.

SCL(short chain length) 활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳을 아미노산 서열 배열 분석을 통해 찾았고, 서열번호 13 내지 18의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 다음 표 1과 같은 phaC1_Ps6 _-19합성효소 변이체들을 만들었다.

재조합 벡터	핵산 치환	아미노산 치환	프라이머
pPs619C1200-ReAB	AGC →ACC	S325T	서열번호 13/14
pPs619C1200-ReAB	CAG →ATG	Q481M	서열번호 15/16
pPs619C1300-ReAB	GAA →GAT	E130D	서열번호 17/18
	AGC →ACC	S325T	서열번호 13/14
	CAG →ATG	Q481M	서열번호 15/16

S325T

서열번호 13: 5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC-3'

서열번호 14: 5'-GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG-3'

Q481M

서열번호 15: 5'-CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC-3'

서열번호 16: 5'-GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG-3'

E130D

서열번호 17: 5'-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc-3'

서열번호 18: 5'-ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat-3'

이들 재조합 벡터를 E. coli XL1-Blue에 형질전환시키고, 이를 PHB 검출배지 (LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육시킨 결과, pPs619C1200-ReAB로 형질전환된 E. coli XL1-Blue와 pPs619C1300-ReAB로 형질전환된 E. coli XL1-Blue에서 모두 PHB 생성을 확인할 수 있었다. 즉, 단량체 공급효소인 phaA_RE와 phaB_RE 에 의해 글루코스로부터 3HB-CoA가 생성되고, 이를 기질로 하여 phaC1_Ps6 _-19합성효소 SCL 변이체들(phaC1_Ps6 _-19200 & phaC1_Ps6 _-19300)이 PHB를 합성한 것이다.

여기에 PLA 및 PLA 공중합체 합성 시 필요한 단량체인 락틸-CoA를 제공하기 위한 CP-PCT가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 구축하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(CP-PCT)를 사용하였다. cp - pct는 Clostridium propionicum의 염색체 DNA를 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR하여 얻어진 단편을 사용하였으며, 이 때, 원래 야생형 CP-PCT에 존재하는 NdeI site를 cloning의 용이성을 위해 SDM방법을 이용하여 제거하였다.

서열번호 19: 5'-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3'

서열번호 20: 5'-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg-3'

또한, SbfI/NdeI 인식부위를 첨가하기 위해 서열번호 21과 22의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다.

서열번호 21: 5'-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg-3'

서열번호 22: 5'-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c-3'

phaC1_Ps6 _-19합성효소 SCL 변이체인 phaC1_Ps6 _-19300를 함유한 pPs619C1300-ReAB 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 Ralstonia eutrophus H16 유래의 단량체 공급효소 (phaA_RE & phaB_RE)를 제거한 다음, 상기 PCR 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제조하였다.

위와 유사한 방법으로 하기 프라이머들을 이용하여 다양한 PHA 합성효소 변이체들을 제작하였다. 제작된 변이체들을 하기 표 2 내지 5에 종합하여 나타내었다.

E130D

서열번호 17: 5'-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc-3'

서열번호 18: 5'-ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat-3'

S325T

서열번호 13: 5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC-3'

서열번호 14: 5'-GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG-3'

S477R

서열번호 23: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc-3'

서열번호 24: 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc-3'

S477H

서열번호 25: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cat ggg cat atc-3'

서열번호 26: 5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc-3'

S477F

서열번호 27: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ttt ggg cat atc- 3'

서열번호 28: 5'-gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3'

S477Y

서열번호 29: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc tat ggg cat atc-3'

서열번호 30: 5'-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc-3'

S477G

서열번호 31: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc-3'

서열번호 32: 5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc-3'

Q481K

서열번호 33: 5'-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c-3'

서열번호 34: 5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c-3'

Q481M

서열번호 35: 5'-ggg cat atc atg agc atc ctg aac ccg c-3'

서열번호 36: 5'-gcg ggt tca gga tgc tca tga tat gcc c-3'

Q481R

서열번호 37: 5'-ggg cat atc cgc agc atc ctg aac ccg c-3'

서열번호 38: 5'-gcg ggt tca gga tgc tgc gga tat gcc c-3'

재조합 합성효소	핵산 치환	아미노산 치환	프라이머
pPs619C1200	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
pPs619C1200	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1202	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
pPs619C1202	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1203	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
pPs619C1203	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1204	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
pPs619C1204	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1205	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
pPs619C1205	CAG → CGC	Q481R	서열번호 37, 38

재조합 합성효소	핵산 치환	아미노산 치환	프라이머
pPs619C1300	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1301	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1304	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → CGC	S477R	서열번호 23, 24
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1305	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → CGC	S477R	서열번호 23, 24
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1306	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → CGC	S477R	서열번호 23, 24
	CAG → CGC	Q481R	서열번호 37, 38
pPs619C1307	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → CAT	S477H	서열번호 25, 26
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1308	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → CAT	S477H	서열번호 25, 26
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1309	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → CAT	S477H	서열번호 25, 26
	CAG → CGC	Q481R	서열번호 37, 38
pPs619C1310	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → TTT	S477F	서열번호 27, 28
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34

재조합 합성효소	핵산 치환	아미노산 치환	프라이머
pPs619C1311	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → TTT	S477F	서열번호 27, 28
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1312	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → TTT	S477F	서열번호 27, 28
	CAG → CGC	Q481R	서열번호 37, 38
pPs619C1313	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → TAT	S477Y	서열번호 29, 30
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1314	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → TAT	S477Y	서열번호 29, 30
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1315	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → TAT	S477Y	서열번호 29, 30
	CAG → CGC	Q481R	서열번호 37, 38

재조합 합성효소	핵산 치환	아미노산 치환	프라이머
pPs619C1400	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	AGC → CGC	S477R	서열번호 23, 24
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1401	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	AGC → CGC	S477R	서열번호 23, 24
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1334	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	AGC → TTT	S477F	서열번호 27, 28
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1336	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	AGC → GGC	S477G	서열번호 31, 32
	CAG → ATG	Q481M	서열번호 35, 36
pPs619C1337	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	AGC → GGC	S477G	서열번호 31, 32
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34
pPs619C1339	GAA → GAT	E130D	서열번호 17, 18
	AGC → ACC	S325T	서열번호 13, 14
	AGC → TTT	S477F	서열번호 27, 28
	CAG → AAA	Q481K	서열번호 33, 34

< 실시예 1-2> Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐 - CoA 트랜스퍼라아제 돌연변이체 라이브러리 제작 및 스크리닝

CP-PCT의 경우 대장균에서 고발현될 경우 심각한 대사 장애를 일으켜 독성을 나타낸다고 알려져 있는데, 일반적으로 재조합 단백질 발현에 널리 사용되는 tac 프로모터나 T7 프로모터를 사용한 IPTG에 의한 발현유도 시스템에서는 유도제 첨가와 동시에 재조합 대장균이 모두 사멸하였다. 이 때문에 약하게 발현되지만 미생물 성장에 따라 지속적으로 발현되는 항시적 발현 시스템을 사용하여 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체 합성에 성공하였다. cp - pct에 무작위적 돌연변이를 도입하기 위해 pPs619C1300-CPPCT(대한민국 특허출원 제10-2006-0116234호)를 주형으로 하고, 서열번호 39 및 40의 프라이머를 이용하여 Mn² ⁺이 첨가되고 dNTPs의 농도 차이가 존재하는 조건에서 Error-prone PCR을 실시하였다.

서열번호 39: 5'- cgc cgg cag gcc tgc agg - 3'

서열번호 40: 5'- ggc agg tca gcc cat atg tc - 3'

그 후, 무작위적 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 서열번호 39 및 40의 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. phaC1_Ps6 _-19합성효소 SCL 변이체인 phaC1_Ps6 _-19300를 함유한 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 야생형 cp - pct를 제거한 후, 상기 증폭된 돌연변이 PCR 단편을 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 E. coli JM109에 도입하여 ~10^{^5} 정도 규모의 CP-PCT 라이브러리를 제작하였다. 상기 제작된 CP-PCT 라이브러리는 고분자 검출 배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일간 생육 시킨 후 고분자 생성 여부를 확인하는 스크리닝 작업을 수행하여 ~80여 개체의 후보를 1차 선정하였다. 이들 후보를 고분자가 생성되는 조건에서 4일간 액체 배양(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 1g/L, ampicillin 100mg/L, 37℃)하였고, FACS(Florescence Activated Cell Sorting) 분석하여 최종 2개체를 선정하였다. 상기 제작된 CP-PCT 변이체의 돌연변이 위치를 찾기 위해 유전자 염기 서열을 분석하였고 그 결과는 다음 표 6과 같다.

재조합벡터	핵산 치환
CP-PCT Variant 512	A1200G
CP-PCT Variant 522	T78C, T669C, A1125G, T1158C

상기 최종 선별된 돌연변이체들(512, 522)을 기본으로 다시 상기 Error-prone PCR의 방법으로 random mutagenesis를 수행하였고 아래와 같은 PCT 변이체 531-540을 얻었다.

	변이(Mutations)	침묵 돌연변이(Silent Mutations)
CpPct512		A1200G
CpPct522		T78C, T669C, A1125G, T1158C
CpPct531	Gly335Asp	A1200G
CpPct532	Ala243Thr	A1200G
CpPct533	Asp65Gly	T669C, A1125G, T1158C
CpPct534	Asp257Asn	A1200G
CpPct535	Asp65Asn	T669C, A1125G, T1158C
CpPct537	Thr199Ile	T669C, A1125G, T1158C
CpPct540	Val193Ala	T78C, T669C, A1125G, T1158C

그 후, CpPct540 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 서열번호 39 및 40의 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. 상기 pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 CPPCT 부분을 제거한 후, 상기 증폭된 CpPct540 PCR 단편을 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 pPs619C1300-CPPCT540 벡터를 제조하였다.

< 실시예 1-3> pPs619C1337 - CPPCT540 벡터의 제작

표 5에 정리하였듯이 상기 phaC1_Ps6 _-19합성효소 변이체(phaC1_Ps6-19300)를 이용하여 E130D, S325T, S477G 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열을 가진 Pseudomonas 속 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1_Ps6-19337)을 서열번호 31 및 32, 그리고 서열번호 33 및 34의 프라이머를 사용한 SDM 방법을 이용하여 제작하였고 그 유전자를 이용하여 pPs619C1337-CPPCT540벡터를 제작하였다 (도 1).

서열번호 31: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc- 3'

서열번호 32: 5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3'

서열번호 33: 5'-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c- 3'

서열번호 34: 5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c- 3'

이로부터 얻은 재조합 벡터(pPs619C1337-CPPCT540)를 E. coli JM109에 형질전환 시키고, 이를 3HB가 포함된 중합체 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, 3HB 2g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 생육 시킨 결과, 중합체 생성을 확인할 수 있었다.

< 실시예 1-4> pMCS104ReAB 의 제작

R. eutropha 유래의 β-케토티올레이즈(PhaA), 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈(acetoacetyl-CoA reductase: PhaB)를 제공하는 플라스미드 pMCS104ReAB를 제작하였다(박시재, PhD thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2003). pSYL105(Lee et al. Biotechnol . Bioeng . 44: 1337, 1994) 를 PstI 으로 절단해 수득한 phaAB 유전자를 PstI으로 절단한 p10499A (Park et al., FEMS Microbiol . Lett., 214:217, 2002)에 삽입하여, p10499PhaAB를 제작하였다. 상기 p10499PhaAB 플라스미드를 SspI으로 절단해 104 프로모터와 phaAB 유전자를 함유한 유전자 조각을 수득한 다음 EcoRV로 절단한 pBBR1MCS 플라스미드에 삽입해 pMCS104ReAB 플라스미드를 제작하였다 (도 2).

< 실시예 2> 탄소원으로 글리세롤을 이용한 재조합 대장균으로부터의 폴리락테이트( PLA ) 제조

항생제로서 100 mg/L의 앰피실린이 함유된 LB 아가 플레이트 상의 <실시예 1-3>과 같이 pPs619C1337-CPPCT540 벡터로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue 콜로니 1개를 100 mg/L의 앰피실린을 함유하는 3 mL의 LB 배지에 접종한 후 이를 30℃에서 200 rpm의 속도로 교반해 주면서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL을 100 mg/L의 앰피실린과 20 g/L 또는 50 g/L의 글리세롤이 함유된 100 mL의 MR 배지에 접종하였고, 이를 30℃에서 200 rpm의 교반 속도로 배양해 주면서 본 배양을 시작하였다. 배양은 4일간 진행 되었다. MR 배지의 경우 10 N NaOH를 이용하여 초기 pH를 7로 조절해 주었다. 본 배양에 사용된 배지는 하기 표 8에 도시하였다.

배양 종료 후, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 증류수로 3번 세척한 후 100℃의 건조기에서 24시간 건조하였고, 건조된 균체 중 일부를 채취하여 가스크로마토그래피(GC)분석을 수행함으로써 세포 내 합성된 P(3HB-co-LA) 함량을 측정하였다. 분석에 사용된 표준물질은 P(3HB-co-3HV) 공중합체(이중 3HV의 함량은 무게비로 약 12%) 및 폴리락테이트 호모폴리머이었다. GC 분석결과는 하기 표 9에 나타내었다. 분석 결과, 글리세롤로부터 PLA 호모폴리머를 생합성할 수 있음을 확인할 수 있었는 바, 본 발명에 따른 재조합 대장균을 통하여 글리세롤로부터 PLA 호모폴리머를 제조할 수 있었다.

성분	MR 배지 (/L)
KH₂PO₄	6.67 g
(NH₄)₂HPO₄	4 g
Citrate	0.8 g
MgSO₄ _·H₂O	0.8 g
Sodium lactate	0 g 또는 2 g
Thiamine	10 mg
글리세롤	20 g 또는 50 g
Tracer^*	5 mL

^*Tracer (/L): FeSO₄ _·H₂O, 10 g ; ZnSO₄ _·H₂O, 2.25 g ; CuSO₄ _·H₂O, 1 g ; MnSO₄ _·H₂O, 0.5 g ; CaCl₂ _·H₂O, 2 g ; Na₂B₄O₇ _·H₂O, 0.23 g ; (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 0.1 g ; 35 % HCl, 10 mL.

배지	초기 기질	생합성된 고분자 유형	고분자 함량 (무게비)	고분자 중 LA 함량 (몰비)
MR	G2^*	PLA	6.48	100
MR	G2, NaL⁺	PLA	10.00	100
MR	G5^**	PLA	1.85	100
MR	G5, NaL	PLA	5.75	100

* G2: 글리세롤 20 g/L

** G5: 글리세롤 50 g/L

+ NaL: Sodium lactate (pH 7.0) 2 g/L

< 실시예 3> 탄소원으로 글리세롤을 이용한 재조합 대장균으로부터의 폴리(3- 하이드록시부티레이트 - co - 락테이트 )(P(3 HB - co - LA )) 제조

항생제로서 100 mg/L의 앰피실린 및 34 mg/L의 클로람페니콜이 함유된 LB 아가 플레이트 상의 <실시예 1-3> 및 <실시예 1-4> 에서 기술된 pPs619C1337-CPPCT540 벡터 및 pMCS104ReAB 벡터로 동시에 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue 콜로니 1개를 100 mg/L의 앰피실린 및 34 mg/L의 클로람페니콜 등의 항생제를 함유하는 3 mL의 LB 배지에 접종한 후 이를 30℃에서 200 rpm의 속도로 교반해 주면서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL을 100 mg/L의 앰피실린 및 34 mg/L의 클로람페니콜, 그리고 20 g/L 또는 50 g/L의 글리세롤이 함유된 100 mL의 MR 배지에 접종하였고, 이를 30℃에서 200 rpm의 교반 속도로 배양해 주면서 본 배양을 시작하였다. 배양은 4일간 진행 되었다. MR 배지의 경우 10 N NaOH를 이용하여 초기 pH를 7로 조절해 주었다. 본 배양에 사용된 배지는 하기 표 10에 도시하였다.

배양 종료 후, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 증류수로 3번 세척한 후 100℃의 건조기에서 24시간 건조하였고, 건조된 균체 중 일부를 채취하여 가스크로마토그래피(GC)분석을 수행함으로써 세포 내 합성된 P(3HB-co-LA) 함량을 측정하였다. 분석에 사용된 표준물질은 P(3HB-co-3HV) 공중합체(이중 3HV의 함량은 무게비로 약 12%) 및 폴리락테이트 호모폴리머이었다. GC 분석결과는 하기 표 11에 나타내었다. 분석 결과, 글리세롤로부터 P(3HB-co-LA) 공중합체를 생합성할 수 있음을 확인할 수 있었는 바, 본 발명에 따른 재조합 대장균을 통하여 글리세롤로부터 P(3HB-co-LA) 공중합체를 제조할 수 있었다.

배지	초기 기질	생합성된 고분자 유형	고분자 함량 (무게비)	고분자 중 LA 함량 (몰비)
MR	G2^*	P(3HB-LA)	53.08	64.75
MR	G2, NaL⁺	P(3HB-LA)	51.38	69.92
MR	G5^**	P(3HB-LA)	40.11	53.13
MR	G5, NaL	P(3HB-LA)	53.37	51.94

* G2: 글리세롤 20 g/L

** G5: 글리세롤 50 g/L

+ NaL: Sodium lactate (pH 7.0) 2 g/L

<110> LG CHEM, LTD. <120> Recombinant microorganism able to produce polylactate or polylactate copolymer from sucrose and method for producing polylactate or polylactate copolymer from sucrose using the same <130> 2009-0492 <150> KR10-2009-0124171 <151> 2009-12-14 <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Clostridium propionicum propionyl-CoA transferase <400> 1 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta 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130 135 140 Asn Asp Ile Thr Lys Glu Asp Ile Val Glu Leu Val Glu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Gln Glu Tyr Leu Phe Tyr Pro Ala Phe Pro Ile His Val Ala Leu Ile 165 170 175 Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Phe Glu Lys Glu 180 185 190 Val Ala Pro Leu Glu Gly Thr Ser Val Cys Gln Ala Val Lys Asn Ser 195 200 205 Gly Gly Ile Val Val Val Gln Val Glu Arg Val Val Lys Ala Gly Thr 210 215 220 Leu Asp Pro Arg His Val Lys Val Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val 225 230 235 240 Val Val Ala Asp Pro Glu Asp His Gln Gln Ser Leu Asp Cys Glu Tyr 245 250 255 Asp Pro Ala Leu Ser Gly Glu His Arg Arg Pro Glu Val Val Gly Glu 260 265 270 Pro Leu Pro Leu Ser Ala Lys Lys Val Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Glu Lys Asp Val Ala Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro Glu 290 295 300 Tyr Val Ala Ser Val Ala Asp Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Arg Phe Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Asp Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr 340 345 350 Gln Phe Asp Tyr Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Cys Tyr Leu Gly 355 360 365 Leu Ala Glu Cys Asp Glu Lys Gly Asn Ile Asn Val Ser Arg Phe Gly 370 375 380 Pro Arg Ile Ala Gly Cys Gly Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr 385 390 395 400 Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val 405 410 415 Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys 420 425 430 Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu Gln Ile Thr Phe Asn Gly Asp Val Ala 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Gln Gln Val Thr Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val Phe 450 455 460 Leu Leu Lys Glu Asp Gly Leu His Leu Ser Glu Ile Ala Pro Gly Ile 465 470 475 480 Asp Leu Gln Thr Gln Ile Leu Asp Val Met Asp Phe Ala Pro Ile Ile 485 490 495 Asp Arg Asp Ala Asn Gly Gln Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe 500 505 510 Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu Lys Glu Met Lys Ser 515 520 <210> 3 <211> 1677 <212> DNA <213> PHA synthase <400> 3 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat 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aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 4 <211> 559 <212> PRT <213> PHA synthase <400> 4 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 aacgggaggg aacctgcagg 20 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg 36 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg 32 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c 31 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gaattcgtgc tgtcgagcca tgggcatatc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gatatgccca tggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gaattcgtgc tgtcgagctt tgggcatatc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gatatgccca aagctcgaca gcacgaattc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gaattcgtgc tgtcgagcta tgggcatatc 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gatatgccca tagctcgaca gcacgaattc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gaattcgtgc tgtcgagcgg cgggcatatc 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gatatgcccg ccgctcgaca gcacgaattc 30 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gggcatatca aaagcatcct gaacccgc 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcgggttcag gatgcttttg atatgccc 28 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gggcatatca tgagcatcct gaacccgc 28 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gcgggttcag gatgctcatg atatgccc 28 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gggcatatcc gcagcatcct gaacccgc 28 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gcgggttcag gatgctgcgg atatgccc 28 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cgccggcagg cctgcagg 18 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ggcaggtcag cccatatgtc 20 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ttcgtgctgt cgagcagagg gcatatc 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gatatgccct ctgctcgaca gcacgaa 27 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 agacatatgc aagtaccttg ccgacatcta tg 32 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatgacaacg tcagtcatga tttgattgtc tctctg 36 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cagagagaca atcaaatcat gactgacgtt gtcatc 36 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gcaggtcagc ccatatgcag 20 <210> 47 <211> 1677 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPs619C1-335-540 (1537bp - 3213bp, direct) <400> 47 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgat gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgaccgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacatgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcgg cgggcatatc 1440 atgagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677

Claims

락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소의 유전자를 포함하며, 기질로 글리세롤을 사용할 수 있는 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 세포 또는 식물을 락테이트 및 글리세롤; 또는 락테이트, 글리세롤 및 하이드록시알카노에이트를 함유하는 환경 하에서 배양 또는 재배하고;
상기 세포 또는 식물로부터 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 회수하는 것을 포함하는
글리세롤로부터 락테이트 중합체 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 또는 식물은 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자 중 어느 하나 이상을 포함하지 않으며 기질로 글리세롤을 사용할 수 있는 세포 또는 식물을, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자로 형질전환하여 얻어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 중의 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acid), 2-하이드록시프로피온산(2-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hexenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헵탄산(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methyl ester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propyl ester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzil ester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3, 12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시노난산(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-heptenoic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트렌스퍼라아제 (propionyl-CoA transferase) 유전자(pct)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 pct 유전자인 방법.
제1항에 있어서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는
서열번호 1의 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Gly335Asp가 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이된 염기 서열;
서열번호 1의 염기 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이된 염기 서열; 및
서열번호 1의 염기 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 서열번호 1의 염기 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 염기 서열을 가지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 슈도모나스 속 6-19(pseudomonas sp . 6-19)의 PHA 합성효소 유전자인 방법.
제1항에 있어서, 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는
서열번호 4의 아미노산 서열; 또는
서열번호 4의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 식물이 글리세롤(glycerol)으로부터 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 생성하는 효소의 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 글리세롤로부터 하이드록시아실-CoA를 생성하는 효소는 케토티올라제 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제인 방법.
제12항에 있어서, 상기 케토티올라제 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 Ralstonia eutropha에서 유래한 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 박테리아인 방법.
제14항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 방법.