CN114107242B

CN114107242B - 一种提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

Info

Publication number: CN114107242B
Application number: CN202111338954.XA
Authority: CN
Inventors: 李才明; 周媛媛; 李兆丰; 陈双娣; 顾正彪; 程力; 洪雁; 班宵逢
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2041-11-12
Also published as: CN114107242A

Abstract

本发明公开了一种提高β‑环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。为了提高β‑环糊精葡萄糖基转移酶的产量，本发明提出了通过改变发酵培养基的溶氧水平以及添加金属离子提高外源蛋白在重组大肠杆菌中的可溶性表达的策略，本发明为高效表达β‑环糊精葡萄糖基转移酶提供了一个有效的策略，操作工艺简单、成本低且效果显著，为β‑环糊精葡萄糖基转移酶的工业化生产奠定了一定的基础，具有潜在的工业应用价值。

Description

一种提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称CGT酶，EC2.4.1.19)能够通过环化反应利用淀粉、麦芽寡聚糖等葡萄糖聚合物生成环糊精，在食品、医药、化工、农业及化妆品等领域有着广泛的应用，最常用的环糊精主要有三种，为α-环糊精、β-环糊精以及γ-环糊精。工业上大多采用酶法生产环糊精，根据催化反应初始阶段所产生主要环糊精的种类，也可将CGT酶分为α-CGT酶、β-CGT酶和γ-CGT酶，其中，β-CGT酶在工业中的应用最为广泛。

β-环糊精葡萄糖基转移酶大部分来源于芽孢杆菌属，由于天然菌株发酵产酶的水平较低，不足以满足工业生产的需求，因此通过异源表达来提高酶的表达量成为一种有效的途径。大肠杆菌(Escherichia coli)的遗传背景清晰、基因工程技术操作成熟，是工业上应用最广泛的宿主。

β-环糊精葡萄糖基转移酶发酵过程中，经常会遇到外源蛋白在细胞中无法正确折叠形成不溶性包涵体存在于细胞中，以及外源蛋白可溶性表达量低、难以提高等的问题，限制了β-环糊精葡萄糖基转移酶的大规模生产以及在工业中的应用，因此，有必要大幅提高β-CGT酶的产量。

发明内容

本发明提出了通过改变发酵培养基的溶氧水平以及添加金属离子提高外源蛋白在重组大肠杆菌中的可溶性表达的策略。由于适当的溶氧水平能够使重组大肠杆菌的生长速度处于适宜表达外源蛋白的水平，同时，金属离子对于细胞有保护作用以及可以增大细胞膜通透性，因此提高了外源蛋白的可溶性表达量。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种发酵培养基，所述发酵培养基包括：玉米浆膏12～24g/L，大豆蛋白胨6～18g/L，葡萄糖2～20g/L，麦芽糖2～20g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL，金属离子Ca²⁺5～40mM。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL，金属离子Ca²⁺25～40mM。

在本发明的一种实施方式中，所述金属离子Ca²⁺的浓度为25mM。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL，金属离子Ca²⁺25mM。

本发明提供了一种提高重组大肠杆菌外源蛋白表达量的方法，在发酵体系中添加金属离子以及改变发酵体系的溶氧水平。

本发明提供了一种提高重组大肠杆菌外源蛋白表达量的方法，所述方法为：将含有重组大肠杆菌的种子液添加至上述发酵培养基中进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括，将反应过程中的溶氧量控制在30％～60％。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL；金属离子Ca²⁺的添加量为：25mM，设置反应过程中的溶氧量为：50％。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以Escherichia coli BL 21(DE3)为表达宿主，以pET-20b(+)为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述外源蛋白为：β-环糊精葡萄糖基转移酶。

在本发明的一种实施方式中，所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种备β-环糊精葡萄糖基转移酶的方法，所述方法为，将表达β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组大肠杆菌添加至上述培养基中进行发酵培养，制备得到β-环糊精葡萄糖基转移酶，同时，将反应过程中的溶氧量控制在30％～60％。

在本发明的一种实施方式中，β-环糊精葡萄糖基转移酶，来源于Bacillusxiaoxiensis STB08。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为：以pET-20b(+)为表达载体，以Escherichia coli BL 21(DE3)为表达宿主。

本发明还提供了上述发酵培养基，或上述提高重组大肠杆菌外源蛋白表达量的方法，或上述制备β-环糊精葡萄糖基转移酶的方法，在提高重组大肠杆菌外源蛋白可溶性表达中的应用，或在提高重组大肠杆菌胞外酶的产量中的应用，或在制备β-环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。

有益效果

本发明提高了β-环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达量，本发明方法操作简单、成本低且效果好具有较大的工业应用价值，通过在减少了重组大肠杆菌的发酵液体积即增大了发酵液的溶氧以及发酵培养基中添加5～40mM Ca²⁺后，使得重组大肠杆菌的菌体浓度增大，同时将β-环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达量提高了约198.48％。本发明解决了β-环糊精葡萄糖基转移酶菌体浓度低且表达量低的问题，为该酶的工业化生产提供了新的思路及方法。

附图说明

图1：本发明实施例中添加5～40mM Ca²⁺对β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的影响。

图2：本发明实施例中在250mL三角瓶中加入30mL发酵液以及添加5～40mM Ca²⁺对β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的影响。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的Ca²⁺的添加，是采用CaCl₂、CaBr₂、CaI₂中的任意一种能提供Ca²⁺来源的盐，本发明中采用的是：CaCl₂。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定：

取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用pH 6.5、10mM磷酸缓冲液(PBS)配制的1％麦芽糊精(DE＝4)的离心管中，预热5min后在50℃下反应10min，加入3.5mL 30mMNaOH溶液终止反应，随后加入0.5mL由5mM Na₂CO₃溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液(PP)，室温下显色20min，于波长550nm下测定吸光值。以失活酶液作为空白。

酶活单位定义：每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加1.5g/L的琼脂。

发酵培养基：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL。

实施例1：含有表达本发明β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的基因工程菌的构建

具体步骤如下：

含有β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的工程菌的构建按照以下方法进行：

(1)通过PCR获得目的基因(β-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，PCR反应体系为：TaKaRa Ex Taq(5U/μL)0.25μL，10×Ex Taq Buffer(mg2+plus)20mM 5μL，Dntp Mixture(各2.5mM)4μL，Template 1μL，引物1(1μM)1μL，引物2(1μM)1μL，无菌水37μL。反应步骤：98℃10s，55℃30s，72℃3min 30s，并进行30个循环。

(2)将PCR产物以及提取后的质粒pET-20b(+)进行双酶切，双酶切体系分别为：2×10×Buffer Y 20μL，Nco I/Nde I 0.5μL，Bam HI 0.5μL，质粒DNA75μL。加入后使用移液枪充分吹吸混合体系，在37℃水浴锅中过夜。将通过T4体系连接好的pET-20b(+)/cgt基因按照E.coli JM109感受态转化方法转入到E.coli JM109中，并将受体菌涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素LB固体培养基上。

(3)将涂布后的LB固体培养基倒置于37℃恒温培养箱中培养12h；挑取阳性单克隆接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基并于37℃下培养10～12h,将收集到的菌体提取质粒并进行测序鉴定。

(4)将从JM109中提取的质粒转化至感受态大肠杆菌BL21中，转化步骤为：从超低温冰箱中取出感受态BL21，用10μL的移液枪将质粒加入到感受态BL21中并轻柔混匀，置于冰中1h。之后从冰中取出感受态置于42℃水浴中热激90s，迅速取出置于冰中3min。吸取500μL LB液体培养基于转化的菌中混合，置于37℃摇床培养箱中复苏1h。取出复苏后的菌液离心富集菌体，移去多余培养基后将剩余50μL LB液体培养基将富集菌体重悬浮，并涂于含浓度为100μg/mL的氨苄抗性的LB固体培养基中，于37℃培养10～12h。挑取阳性单克隆接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基并于37℃下培养10～12h，加甘油，保藏菌株至-80℃条件下，得到重组菌株E.coli BL 21(DE3)/pET-20b(+)-cgt。

实施例2：β-环糊精葡萄糖基转移酶的表达

具体步骤如下：

(1)配置发酵培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O16.43g/L，甘油5g/L。

(2)宿主菌活化培养：

将实施例1构建得到的E.coli BL 21(DE3)/pET-20b(+)-cgt重组菌株在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养12h；制备得到种子液。

(3)发酵培养：

将步骤(1)制备得到的种子液按4％(v/v)的接种量，接种于发酵培养基中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在30℃下诱导96h。

各培养基在使用前添加终浓度为100g/mL的氨苄青霉素。

将发酵结束后的发酵液于4℃，10000r/min离心20min，收集上清液。经过分离纯化后进行SDS-PAGE电泳验证，结果如图1所示。即为β-环糊精葡萄糖基转移纯酶液，在50℃下按照β-环糊精葡萄糖基转移酶活力测定方法检测酶活，结果为：14.63U/mL。

实施例3：发酵培养基的优化

具体步骤如下：

具体如下：

(1)氮源的选择

具体实施方式同实施例2，区别在于将发酵培养基中氮源(酵母粉、胰蛋白胨)分别更换为：玉米浆膏、酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨，浓度为：36g/L，发酵结束后，分别检测酶活，结果如表1所示：

表1不同氮源条件下的酶活

氮源种类	玉米浆膏	酵母粉	胰蛋白胨	大豆蛋白胨	鱼粉蛋白胨
						酶活(U/mL)	15.95	4.48	4.48	11.79	4.96

结果显示：以玉米浆膏、大豆蛋白胨作为氮源时，有利于提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的提高。

(2)复合氮源的选择

具体实施方式同实施例2，区别在于将发酵培养基中氮源(酵母粉、胰蛋白胨)分别更换为：玉米浆膏24g/L+大豆蛋白胨6g/L，玉米浆膏24g/L+大豆蛋白胨12g/L，玉米浆膏24g/L+鱼粉蛋白胨6g/L，玉米浆膏24g/L+鱼粉蛋白胨12g/L，发酵结束后，分别检测酶活，结果如表2所示：

表2不同复合氮源条件下的酶活

结果显示：以玉米浆膏24g/L+大豆蛋白胨6g/L作为复合氮源时，有利于提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的提高。

(3)碳源的选择

具体实施方式同实施例2，区别在于将发酵培养基中的碳源(甘油)分别更换为：木薯淀粉、玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，浓度为：5g/L，将发酵培养基中氮源(酵母粉、胰蛋白胨)分别更换为：玉米浆膏24g/L+大豆蛋白胨6g/L，发酵结束后，分别检测酶活，结果如表3所示：

表3不同碳源条件下的酶活

碳源种类	木薯淀粉	玉米淀粉	葡萄糖	蔗糖	麦芽糖
						酶活(U/mL)	5.39	6.59	21.98	9.81	22.69

结果显示：以葡萄糖、麦芽糖作为碳源时，有利于提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的提高。

(4)复合碳源的选择

具体实施方式同实施例2，区别在于将发酵培养基中的碳源(甘油)分别更换为：葡萄糖2g/L+麦芽糖2g/L，葡萄糖2g/L+麦芽糖4g/L，葡萄糖2g/L+麦芽糖8g/L，将发酵培养基中氮源(酵母粉、胰蛋白胨)分别更换为：玉米浆膏24g/L+大豆蛋白胨6g/L，发酵结束后，分别检测酶活，结果如表4所示：

表4不同复合碳源条件下的酶活

复合碳源	葡萄糖2g/L+麦芽糖2g/L	葡萄糖2g/L+麦芽糖4g/L	葡萄糖2g/L+麦芽糖8g/L
				酶活(U/mL)	20.27	33.54	18.87

结果显示：以葡萄糖2g/L+麦芽糖4g/L作为复合碳源时，有利于提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的提高。

最终得到效果最好的培养基为：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL。在此培养基下发酵结束后，检测酶活，结果为34.66U/mL。

实施例4：添加金属离子对重组大肠杆菌BL21/pET-20b(+)/cgt摇瓶发酵产酶量的影响

具体步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取出实施例1制备得到的含有表达载体质粒pET-20b(+)-cgt的E.coli BL21(DE 3)的菌株E.coli BL 21(DE3)/pET-20b(+)-cgt，在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养12h；制备得到种子液；

(2)将步骤(1)制备得到的种子液以4％(v/v)的接种量将上述菌液转移至实施例2最终得到的最优发酵培养基中：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL。

现将发酵培养基设置为对照组和实验组，其中，对照组为不添加金属离子的发酵培养基；实验组为添加不同金属离子的发酵培养基，具体添加方式如下：

实验组：在发酵培养基中分别添加终浓度为5mM Ca²⁺、5mM Ba²⁺、5mM Fe³⁺、5mM Mg² ⁺、5mM K⁺、5mM Cu²⁺；分别制备得到发酵培养基1～6；

分别将上述实验组和对照组的发酵培养基同时在温度30℃、转速200rpm的条件下，培养96h后结束发酵，发酵液于4℃，10000r/min离心20min，收集上清液。即为β-环糊精葡萄糖基转移酶液，在50℃下按照β-环糊精葡萄糖基转移酶活力测定方法检测对照组与实验组的酶活，结果如表5和图2所示：

表5：添加不同金属离子对β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活的影响

培养基	1(Ca<sup>2+</sup>)	2(Ba<sup>2+</sup>)	3(Fe<sup>3+</sup>)	4(Mg<sup>2+</sup>)	5(K<sup>+</sup>)	6(Cu<sup>2+</sup>)	对照组
								酶活(U/mL)	45.39	24.85	30.87	40.85	22.02	22.40	33.52

由表5可知，添加不同的金属离子对β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活的影响是不同的，添加Ca²⁺后，β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活最高。

(3)将步骤(1)制备得到的种子液以4％(v/v)的接种量将上述菌液转移至实施例2最终得到的最优发酵培养基中：玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL。

现将发酵培养基设置为对照组和实验组，其中，对照组为不添加金属离子的发酵培养基；实验组为：在发酵培养基中添加终浓度分别为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM的Ca²⁺，分别制备得到含有不同终浓度的金属离子Ca²⁺的培养基

分别将上述实验组和对照组的发酵培养基同时在温度30℃、转速200rpm的条件下，培养96h后结束发酵，发酵液于4℃，10000r/min离心20min，收集上清液。即为β-环糊精葡萄糖基转移酶液，在50℃下按照β-环糊精葡萄糖基转移酶活力测定方法检测对照组与实验组的酶活，结果如表6和图2所示。

表6重组大肠杆菌在添加Ca²⁺的发酵液培养基中的酶活

Ca<sup>2+</sup>浓度	5mM	10mM	15mM	20mM	25mM	30mM	对照组
								酶活(U/mL)	45.39	50.31	72.14	77.87	83.15	79.60	34.66

结果显示：对照组酶活为34.66U/mL，而添加了不同的金属离子即Ca²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、K⁺、Cu²⁺后发现添加Ca²⁺最有利于提高β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活，而添加了不同浓度Ca²⁺的实验组酶活均高于对照组，添加终浓度为25mM的实验组酶活为83.15U/mL，相比于对照组提高了139.9％，据此，说明添加Ca²⁺能够提高β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活。

实施例5：改变发酵过程中的溶氧量及添加Ca²⁺对重组大肠杆菌摇瓶发酵产酶量的影响具体步骤如下：

(2)将步骤(1)制备得到的种子液以4％(v/v)的接种量接种至下述发酵培养基中：

玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖2g/L，麦芽糖4g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL；

(3)控制溶氧发酵：由于是在摇瓶阶段，因此，本实施例采用的是通过控制发酵培养基的体积来达到控制溶氧的目的。

对照组：

将50mL不添加金属离子的发酵培养基设置为对照组1；

将30mL不添加金属离子的发酵培养基设置为对照组2；

实验组：

在30mL发酵培养基中添加终浓度为25mM的Ca²⁺；

分别将上述实验组和对照组同时在温度30℃、转速200rpm的条件下，培养96h后结束发酵，发酵液于4℃，10000r/min离心20min，收集上清液。即为β-环糊精葡萄糖基转移酶液，在50℃下按照β-环糊精葡萄糖基转移酶活力测定方法检测对照组与实验组的酶活，同时检测反应结束后的生物量，结果如表7所示。

表7重组大肠杆菌在添加Ca²⁺的30mL发酵液培养基中的酶活

	酶活(U/mL)	OD<sub>600</sub>
			对照组(50mL)	35.41	4.81
对照组(30mL)	19.04	6.38
			实验组	105.69	8.47

结果显示：发酵结束后，对照组的生物量为4.81，为实验组的生物量为8.47，相比于对照组提高了76.09％；对照组(30mL)酶活为19.04U/mL，而实验组酶活为105.69U/mL，相比于对照组提高了198.48％，对照组(50mL)酶活为35.41U/mL；据此，说明改变发酵液体积及添加Ca²⁺能够提高发酵液中的生物量以及β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活。

(4)溶氧值的优化

具体实施方式同步骤(1)～(3)，区别在于，调整步骤(3)的实验组为：分别在30mL，50mL，70mL，100mL，120mL，150mL发酵培养基中添加终浓度为25mM的Ca²⁺；结果如表8所示：

表8不同培养基体积对β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活的影响

发酵液体积	30mL	50mL	70mL	100mL	120mL	150mL
							酶活(U/mL)	105.69	37.30	67.02	58.43	49.21	40.77

结果显示：在不同体积的发酵液中添加终浓度为25mM的Ca²⁺后，发酵液体积为30mL时，β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活最高，说明改变发酵液体积为30mL以及添加Ca²⁺能够提高发酵液中的生物量以及β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活。

实施例6：重组大肠杆菌发酵罐发酵产酶量

具体步骤如下：

(1)配置发酵培养基：

玉米浆膏24g/L，大豆蛋白胨6g/L，葡萄糖6g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O16.43g/L，氨苄青霉素100μg/mL。

(2)宿主菌活化培养：

将实施例1构建得到的E.coli BL 21(DE3)/pET-20b(+)-cgt重组菌株在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养12h；制备得到种子液；

(3)发酵培养：

将步骤(1)制备得到的种子液按4％(v/v)的接种量，接种于发酵培养基中，同时添加终浓度为25mM的Ca²⁺，并置于5L发酵罐中进行培养，设置DO值分别为30％、40％、50％，DO与转速关联(转速为200～800rpm)，在30℃下培养96h得到发酵液。

将发酵结束后的发酵液于4℃，10000r/min离心20min，收集上清液。即为β-环糊精葡萄糖基转移酶液，在50℃下按照β-环糊精葡萄糖基转移酶活力测定方法检测酶活，结果如表9所示。

表9不同DO对β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活的影响

发酵罐DO	30％	40％	50％
				酶活(U/mL)	53.08	60.40	80.24

结果显示：提高发酵液的溶氧即DO，有利于β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的提高，且当DO为50％时，β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活最高，结果为80.24U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高β-环糊精葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法

<130> BAA211299A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2025

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctagtgtca caaacaaagt caattattca aaagatgtca tttatcaaat tgtgaccgac 60

cggttctcag acggaaatcc agcgaacaac ccatctgggg ctattttcag tcaaaattgt 120

agtgatcttc ataagtattg tggtggtgac tggcaaggaa ttataaacaa gatgaacgac 180

ggttatttaa ccgatttagg aattacggca ctttggattt ctcagccggt cgaaaatgtt 240

tatgcgctgc acccgagcgg atacacctca tatcacggat attgggcaag agattacaaa 300

aaaacaaacc cttacttcgg gaatttctct gattttgacc gattggttag taccgcccat 360

aataaaggca ttaagattat tatggacttt acaccaaatc attcatcacc tgcgctcgaa 420

acgaatccta actatgtaga aaatggagcg ctctacaata atggcgcact gttaggcaat 480

tattcgaatg atcgtaacaa actctttcac cataatgggg gaacagactt ttcttcgtat 540

gaagacagca tttaccgaaa cttatacgat ttagccgact atgatttgaa taacaaggtc 600

gttgaccagt atttaaagga gtcgattaag ctttggttag ataaaggaat tgatggcatt 660

cgagtcgatg cggttaaaca tatgtctgag ggttggcaaa cctctttaat gagcgacatc 720

tatacttata aacctgtttt taccttcggt gagtggtttt taggaacagg agaagtcgat 780

ccacaaaatc atcacttcgc caatgaaagt ggtatgagtt tattagattt ccagtttggc 840

caaacgattc gaagtgtcct aaaggaccgc acgagcaact ggtatgattt taatgaaatg 900

attaagagca ccgagaagga ttatgacgag gtcattgatc aagtaacctt tattgacaac 960

catgacatga gccgtttttc aatgggttcg tcttcaaatc gtcagacaga tatagcgtta 1020

gccgttttgc ttacttctcg aggcgtacca acaatttact acgggacaga gcaatattta 1080

acaggcggta atgatcctga caatcggaag ccgatgaaaa cgtttgatcg ttctacaaat 1140

tcttataaaa ttactagcaa attggcttct ttaagacagc gcaattcagc cctaggctat 1200

ggcaacacaa ctgaacgttg gattaactca gatgtctata tttacgaaag aaaatttggc 1260

aacagcattg tactaaccgc tgtaaacagt agcaatcgaa atcaaacaat ctctaattta 1320

aacacttcat tacctcaagg aaactataca gatgaactac agcaactttt agacgggaac 1380

accattactg ttaacgccaa tggttcagcg aattcttttc aattgcaggc aaacagtgta 1440

gcggtttggc aagtgaccaa agagtccaca tctcctttaa tcggccatgt cggtccgatg 1500

atgggcaaaa ctggaaatac agttacggta agcggtgaag gctttggtga caaaaaaggt 1560

agcgttctct ttggctcaac gtccgctgaa attgtttctt ggtcgaatac agaaatacag 1620

gttaaggttc caaatgtgac agccggtcac tataatcttt ccgttgtaaa tgcgacgaac 1680

acaaaaagtc ccgcgtatga gaagtttgaa gtgttatcag gcaatcaagt cagtgttcgc 1740

tttgcagtta acaacgctac gactaactca ggaacaaatg tttatattgt tggtaatgtg 1800

agtgaacttg gtaattggga ccctaacaaa gcgattgggc cgatgtttaa tcaagtgatg 1860

tataaatacc ctacttggta ctatgacatc agcgttcctg ctggtaagaa tttggaatac 1920

aagtatatta aaaaggatca gaacggtaac gtcacttggc aaagtgggaa caatcgaacg 1980

tatacgtctc ctgctactgg aaccgatacg gtcatatcaa attgg 2025

<210> 2

<211> 675

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala Ser Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Ser Lys Asp Val Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Ile Val Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn Asn Pro Ser

20 25 30

Gly Ala Ile Phe Ser Gln Asn Cys Ser Asp Leu His Lys Tyr Cys Gly

35 40 45

Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Met Asn Asp Gly Tyr Leu Thr

50 55 60

Asp Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val

65 70 75 80

Tyr Ala Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala

85 90 95

Arg Asp Tyr Lys Lys Thr Asn Pro Tyr Phe Gly Asn Phe Ser Asp Phe

100 105 110

Asp Arg Leu Val Ser Thr Ala His Asn Lys Gly Ile Lys Ile Ile Met

115 120 125

Asp Phe Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu Thr Asn Pro Asn

130 135 140

Tyr Val Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Ala Leu Leu Gly Asn

145 150 155 160

Tyr Ser Asn Asp Arg Asn Lys Leu Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp

165 170 175

Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala

180 185 190

Asp Tyr Asp Leu Asn Asn Lys Val Val Asp Gln Tyr Leu Lys Glu Ser

195 200 205

Ile Lys Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala

210 215 220

Val Lys His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu Met Ser Asp Ile

225 230 235 240

Tyr Thr Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Thr

245 250 255

Gly Glu Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met

260 265 270

Ser Leu Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg Ser Val Leu Lys

275 280 285

Asp Arg Thr Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met Ile Lys Ser Thr

290 295 300

Glu Lys Asp Tyr Asp Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn

305 310 315 320

His Asp Met Ser Arg Phe Ser Met Gly Ser Ser Ser Asn Arg Gln Thr

325 330 335

Asp Ile Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Thr Ile

340 345 350

Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Gly Asn Asp Pro Asp Asn

355 360 365

Arg Lys Pro Met Lys Thr Phe Asp Arg Ser Thr Asn Ser Tyr Lys Ile

370 375 380

Thr Ser Lys Leu Ala Ser Leu Arg Gln Arg Asn Ser Ala Leu Gly Tyr

385 390 395 400

Gly Asn Thr Thr Glu Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val Tyr Ile Tyr Glu

405 410 415

Arg Lys Phe Gly Asn Ser Ile Val Leu Thr Ala Val Asn Ser Ser Asn

420 425 430

Arg Asn Gln Thr Ile Ser Asn Leu Asn Thr Ser Leu Pro Gln Gly Asn

435 440 445

Tyr Thr Asp Glu Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gly Asn Thr Ile Thr Val

450 455 460

Asn Ala Asn Gly Ser Ala Asn Ser Phe Gln Leu Gln Ala Asn Ser Val

465 470 475 480

Ala Val Trp Gln Val Thr Lys Glu Ser Thr Ser Pro Leu Ile Gly His

485 490 495

Val Gly Pro Met Met Gly Lys Thr Gly Asn Thr Val Thr Val Ser Gly

500 505 510

Glu Gly Phe Gly Asp Lys Lys Gly Ser Val Leu Phe Gly Ser Thr Ser

515 520 525

Ala Glu Ile Val Ser Trp Ser Asn Thr Glu Ile Gln Val Lys Val Pro

530 535 540

Asn Val Thr Ala Gly His Tyr Asn Leu Ser Val Val Asn Ala Thr Asn

545 550 555 560

Thr Lys Ser Pro Ala Tyr Glu Lys Phe Glu Val Leu Ser Gly Asn Gln

565 570 575

Val Ser Val Arg Phe Ala Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Ser Gly Thr

580 585 590

Asn Val Tyr Ile Val Gly Asn Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro

595 600 605

Asn Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Met Tyr Lys Tyr Pro

610 615 620

Thr Trp Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Gly Lys Asn Leu Glu Tyr

625 630 635 640

Lys Tyr Ile Lys Lys Asp Gln Asn Gly Asn Val Thr Trp Gln Ser Gly

645 650 655

Asn Asn Arg Thr Tyr Thr Ser Pro Ala Thr Gly Thr Asp Thr Val Ile

660 665 670

Ser Asn Trp

675

Claims

1.一种提高重组大肠杆菌外源蛋白表达量的方法，其特征在于，所述方法为：将含有重组大肠杆菌的种子液添加至发酵培养基中进行发酵培养；

所述发酵培养基为：玉米浆膏24 g/L，大豆蛋白胨6 g/L，葡萄糖2 g/L，麦芽糖2~8 g/L，KH₂PO₄ 2.32 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43 g/L，氨苄青霉素100 μg/mL，金属离子Ca²⁺ 5~40mM；

所述外源蛋白为：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-环糊精葡萄糖基转移酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：玉米浆膏24 g/L，大豆蛋白胨6 g/L，葡萄糖2 g/L，麦芽糖4 g/L，KH₂PO₄ 2.32 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43 g/L，氨苄青霉素100 μg/mL，金属离子Ca²⁺ 25 mM。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，将反应过程中的溶氧量控制在30%~60%。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以Escherichia coliBL 21(DE3)为表达宿主，以pET-20b(+)为表达载体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，编码所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种制备β-环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，所述方法为，将表达β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组大肠杆菌添加至发酵培养基中进行发酵培养，制备得到β-环糊精葡萄糖基转移酶，同时，将反应过程中的溶氧量控制在30%~60%；

所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种发酵培养基在制备β-环糊精葡萄糖基转移酶中的应用，其特征在于，所述发酵培养基为：玉米浆膏24 g/L，大豆蛋白胨6 g/L，葡萄糖2 g/L，麦芽糖2~8 g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43 g/L，氨苄青霉素100 μg/mL，金属离子Ca²⁺ 5~40 mM，所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。