CN102260336A - 毕赤酵母壁蛋白Gcw5及其表面展示系统和构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母壁蛋白及其构建的表面展示系统和构建方法。所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白的氨基酸序列为SEQNO：1；所述巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统是以所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。本发明的壁蛋白Gcw5在毕赤酵母中表达量十分高，与现已用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白Pir1蛋白和Pir2蛋白相比，分别高6倍和13倍。

Description

毕赤酵母壁蛋白Gcw5及其表面展示系统和构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5及其构建的表面展示系统和构建方法。

背景技术

微生物细胞表面展示技术是一种通过锚定蛋白将蛋白质或多肽固定在细胞表面的技术。微生物细胞表面展示系统包括宿主菌、锚定蛋白和靶蛋白，有时在锚定蛋白和靶蛋白之间也添加一段连接（linker）序列。微生物细胞表面展示在多肽分离、全细胞催化剂、全细胞吸附剂、疫苗和抗体生产、蛋白文库筛选、生物传感器、生物修复等方面都有广阔的应用前景。

目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体、细菌（如大肠杆菌Escherichia. coli、奇异变形菌Proteus mirabilis等）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。表面展示使用的锚定蛋白一般具有以下特征：（1）较牢固地锚定在细胞表面，不会轻易地从细胞表面脱落；（2）可以与靶蛋白序列有效融合而不影响靶蛋白的结构和功能；（3）对蛋白酶有一定的抗性。细菌表面展示系统的锚定蛋白主要有细菌菌毛蛋白、S层蛋白、冰核蛋白（INP）和一些外膜蛋白。酿酒酵母表面展示系统的锚定蛋白主要有凝集素系统、絮凝素系统和其它GPI锚定（glycosylphosphatidylinositol anchored）蛋白系统和一些Pir蛋白系统。巴斯德毕赤酵母具有可以实现高密度发酵（细胞密度可高达140g/L）、蛋白适度糖基化和发酵培养基组成简单等优点，在微生物细胞表面展示方面的应用具有非常广阔的前景，目前已有许多种蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克鲁维酵母黄酶、米根霉脂肪酶等已经成功地展示在巴斯德毕赤酵母表面。目前巴斯德毕赤酵母表面展示系统中使用的锚定蛋白主要来自酿酒酵母的凝集素系统、絮凝素系统和Sed1p蛋白等。但是，这些锚定蛋白不是毕赤酵母的组成成分，而是通过人为手段外源引进的。因此用外源壁蛋白作为毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白，可能会与内源壁蛋白竞争壁蛋白结合位点，导致展示效率不高。

Khasa YP (Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).)等报道了利用毕赤酵母Pir蛋白作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。但发明人发现Pir蛋白本身的表达量较低，作为毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白效果一般。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提高用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白的表达效率。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5，该蛋白的氨基酸序列为SEQ NO：1。

本发明所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白由187个氨基酸组成，大小约为19.1KDa。本发明所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白以共价键的形式结合在巴斯德毕赤酵母细胞壁上，用十二烷基硫酸钠法不能提取，可以用β-1,3-葡聚糖酶法提取。

本发明所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5可用于构建毕赤酵母细胞表面展示系统，所述的巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统是以所述壁蛋白为锚定蛋白将靶蛋白固定在毕赤酵母细胞表面构成的。

编码所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5的基因，核苷酸序列如SEQ NO：4所示。

一种巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统，是以所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。

上述巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统可通过以下步骤构建：

（1）将权利要求2所述的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白的表面展示表达载体；

（2）将靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列的上游，与所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；

（3）转化巴斯德毕赤酵母，根据所述表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。

所述靶蛋白为碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B。

所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

上述方法中，所述的表达载体是常用的带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体，如pPIC9K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC等；如果是无信号肽的表达载体，可在靶蛋白基因序列的上游添加分泌信号肽序列。

表达载体为pPIC9K时，构建表面展示表达载体后，将靶蛋白的基因序列克隆连接到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列上游的限制性内切酶酶切位点EcoR I与Mlu I之间。

本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果。

本发明所述的壁蛋白Gcw5是巴斯德毕赤酵母内源壁蛋白，且在毕赤酵母中表达量十分高，与现已用于巴斯德毕赤酵母表面展示系统的内源锚定蛋白Pir1蛋白和Pir2蛋白相比，分别高6倍和13倍。因此，本发明所述巴斯德毕赤酵母可用于构建高表达效率的巴斯德毕赤酵母表面展示系统。

附图说明

图1.：用SDS法和β-1,3-葡聚糖酶法提取巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5的Western blot结果。a. SDS法提取壁蛋白Gcw5；b. β-1,3-葡聚糖酶法提取壁蛋白Gcw5。

图2：重组菌GS115/GCW5和对照菌GS115的流式细胞仪检测结果。虚线：对照菌GS115；实线：重组菌GS115/GCW5。

图3：三丁酸甘油酯乳化平板水解圈法检测GS115/GCW5-CALB阳性转化子。a.对照菌GS115；b.阳性转化子GS115/GCW5-CALB。 

图4：荧光显微镜验证融合蛋白GCW5-CALB在毕赤酵母细胞壁表面展示结果。a. GS115/GCW5-CALB的普通光学显微图；

b. GS115/GCW5-CALB的荧光显微图；

c. 对照菌GS115的普通光学显微图；

d. 对照菌GS115的荧光显微图。

图5：菌体酶活曲线图。其中，                                                

表示重组菌GS115/GCW5-CALB的菌体酶活曲线；表示对照菌GS115的菌体酶活曲线。

图6：采用Gcw5、Pir1和Pir2作为锚定蛋白展示CALB的酶活比较。

术语解释

MD平板：13.4g/L酵母氮源，4×10^-4 g/L生物素，20g/L葡萄糖和20g/L琼脂

BMGY培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，13.4g/L酵母氮源，4×10^-4 g/L生物素，10g/L甘油。

BMMY培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，13.4g/L酵母氮源，4×10^-4 g/L生物素，5g/L甲醇。

三丁酸甘油酯乳化平板：：13.4g/L 酵母氮源，10g/L 三丁酸甘油酯，5g/L 聚乙烯醇，20g/L 琼脂，100mM 磷酸盐缓冲液(pH6.0)。

具体实施方式

实施例1：巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因的克隆、表达和鉴定

（1）    巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因的克隆

根据巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5的基因序列SEQ NO.4以及巴斯德毕赤酵母质粒pPIC9K上的多克隆位点特征，设计合成引物：

其中引物P1方框部分为EcoR I酶切位点，下划线部分为Mlu I酶切位点，斜体部分为FLAG标签序列；引物P2下划线部分为Not I酶切位点。以巴斯德毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，通过PCR方法扩增出壁蛋白GCW5基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。

（2）    载体p9KGCW5-FLAG的构建

将壁蛋白GCW5基因的PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，酶切的产物与巴斯德毕赤酵母表达质粒pPIC9K的EcoR I和Not I双酶切产物连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒p9KGCW5。将得到的p9KGCW5质粒转化大肠杆菌宿主Top10F。用含50mg/L氨苄青霉素的LB平板筛选转化子，挑取氨苄青霉素抗性阳性的转化子，提取质粒，通过EcoR I和Not I双酶切鉴定并测序，结果表明壁蛋白GCW5基因序列正确插入，且FLAG标签在所述壁蛋白GCW5基因的上游。   

（3）    巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5的表达和鉴定

采用限制性内切酶SacI对p9KGCW5质粒进行线性化后，用LiCl法转化巴斯德毕赤酵母GS115，在MD平板上挑取His⁺转化子，提取基因组DNA作为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，结果证明巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5的基因序列整合到了GS115的基因组中，得到的重组菌命名为GS115/ GCW5。将GS115/ GCW5接种于50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm振荡培养16-20h至OD₆₀₀到2-6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD₆₀₀为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇进行诱导表达。发酵96h后，10000 rpm离心收集菌体，采用β-1,3-葡聚糖酶法提取细胞壁蛋白，进行SDS-PAGE电泳，并用anti-FLAG抗体进行Western blot验证（图1），结果表明巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5成功地在巴斯德毕赤酵母细胞表面得到表达。用anti-FLAG抗体进行免疫反应后，采用流式细胞仪对重组菌GS115/ GCW5和GS115进行分析比较（图2），结果显示与GS115相比，重组菌GS115/ GCW5的荧光发生较大偏移，表明在重组菌GS115/ GCW5的细胞表面成功地表达了巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5-FLAG的融合蛋白。

实施例2：巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5表面展示载体p9KGCW5的构建

（1）    巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因的克隆

根据巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因序列以及巴斯德毕赤酵母质粒pPIC9K上的多克隆位点特征，设计合成引物：

    引物P2下划线部分为Not I酶切位点；引物P3方框部分为EcoR I酶切位点，下划线部分为Mlu I酶切位点。以巴斯德毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，以P2和P3为引物，通过PCR方法扩增出壁蛋白GCW5基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。得到巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因片段。

（2）    表面展示表达载体p9KGCW5的构建

将壁蛋白GCW5基因的PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，酶切的产物与巴斯德毕赤酵母表达质粒pPIC9K的EcoR I和Not I双酶切产物连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒p9KGCW5。将得到的p9KGCW5质粒转化大肠杆菌宿主Top10F。用50mg/L氨苄青霉素的LB平板筛选转化子，挑取氨苄青霉素抗性阳性的转化子，提取质粒，通过EcoR I和Not I双酶切鉴定并测序，结果表明壁蛋白GCW5基因序列正确插入。

实施例3：巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5表面展示载体pZαAGCW5的构建

（1）    巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因的克隆

根据巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因序列以及巴斯德毕赤酵母质粒pPIC9K上的多克隆位点特征，设计合成引物：

P2：5’- TATTATGCGGCCGC TTACAAGACCAAAGCAG -3’ (SEQ NO：3)

P4：5’ –ATATCTCGAGAACGCTGCTGTTTACAAC -3’ (SEQ NO：6)

引物P2下划线部分为Not I酶切位点；引物P4下划线部分为Xho I酶切位点。以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，以P2和P4为引物，通过PCR方法扩增出壁蛋白GCW5基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。得到巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因片段。

（2）    表面展示表达载体pZαAGCW5的构建 

将壁蛋白GCW5基因的PCR产物用Xho I和Not I双酶切，酶切的产物与巴斯德毕赤酵母表达质粒pPICZαA的Xho I和Not I双酶切产物连接，得到重组毕赤酵母表面展示表达质粒pZαAGCW5。将得到的pZαAGCW5质粒转化大肠杆菌宿主Top10F。用含100mg/L Zeocin的LB平板筛选转化子，挑取Zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒，通过Xho I和Not I双酶切鉴定并测序，结果表明壁蛋白GCW5基因序列正确插入。

实施例4：巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5表面展示载体pGαAGCW5的构建

（1）    巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因的克隆

根据巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因序列以及毕赤酵母质粒pPIC9K上的多克隆位点特征，设计合成引物：

P2：5’- TATTATGCGGCCGC TTACAAGACCAAAGCAG -3’ (SEQ NO：3)

P4：5’ –ATATCTCGAGAACGCTGCTGTTTACAAC -3’ (SEQ NO：6)

引物P2下划线部分为Not I酶切位点；引物P4下划线部分为Xho I酶切位点。以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，以P2和P4为引物，通过PCR方法扩增出壁蛋白GCW5基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。得到巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5基因片段。

（2）    表面展示表达载体pGαAGCW5的构建

将壁蛋白GCW5基因的PCR产物用Xho I和Not I双酶切，酶切的产物与巴斯德毕赤酵母表达质粒pGAPZαA的Xho I和Not I双酶切产物连接，得到重组毕赤酵母表面展示表达质粒pGαAGCW5。将得到的pGαAGCW5质粒转化大肠杆菌宿主Top10F。用含100mg/L Zeocin的LB平板筛选转化子，挑取Zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒，通过Xho I和Not I双酶切鉴定并测序，结果表明壁蛋白GCW5基因序列正确插入。

实施例5： 利用p9KGCW5表面展示系统展示南极假丝酵母脂肪酶B

（1）    南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆

根据含有南极假丝酵母脂肪酶B（CALB，基因序列如SEQ NO：7所示）基因序列的质粒pKNS-CALB的限制性内切酶识别序列的特征，采用EcoR I和Mlu I进行双酶切，得到FLAG-CALB融合蛋白的DNA序列。

（2）    利用p9KGCW5表面展示表达载体在巴斯德毕赤酵母细胞表面展示南极假丝酵母脂肪酶B

将FLAG-CALB融合蛋白的DNA序列的EcoR I和Mlu I双酶切产物与p9KGCW5载体的EcoR I和Mlu I双酶切产物连接，得到重组质粒p9KGCW5-CALB，转化大肠杆菌宿主Top10F。挑取阳性转化子提取质粒，通过EcoR I和Mlu I双酶切鉴定并测序，测序结果表明壁蛋白CALB基因序列正确插入。

将重组质粒p9KGCW5-CALB转化毕赤酵母GS115，通过MD平板筛选转化子。转化子在MD平板上生长48h后，随机挑取His⁺转化子转接至三丁酸甘油酯乳化平板进行鉴定。阳性转化子GS115/GCW5-CALB菌落在平板上形成明显的水解圈（图3），表明CALB在巴斯德毕赤酵母中表达，并且表现出脂肪酶水解活性。

将阳性转化子GS115/GCW5-CALB接种于50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm振荡培养16-20h至OD₆₀₀到2-6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD₆₀₀为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇进行诱导表达。发酵96h后，10000rpm离心收集菌体，采用β-1,3-葡聚糖酶法方法提取细胞壁蛋白，进行SDS电泳，并用anti-FLAG抗体进行Western blot验证，结果表明CALB成功地在巴斯德毕赤酵母细胞表面得到展示。用anti-FLAG抗体进行免疫反应后，采用荧光显微镜对GS115/GCW5-CALB和对照菌株GS115进行分析比较（图4），结果显示，GS115/GCW5-CALB的细胞表面可发出明显的荧光，而对照菌GS115的细胞表面则几乎没有荧光。表明在GS115/GCW5-CALB的细胞表面成功地展示了FLAG-CALB的融合蛋白。

（3）    阳性转化子GS115/GCW5-CALB的发酵与脂肪酶活性的测定

将阳性转化子GS115/GCW5-CALB接种于50mL BMGY培养基中，30℃，200rpm振荡培养16-20h至OD₆₀₀到2-6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD₆₀₀为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1%的甲醇进行诱导表达。每24h取样，利用分光光度法测定脂肪酶的酶活力：在1mL 50mM Tris-HCl（pH 8.0）、1.25mM pNPB的反应体系中加入10μL菌体悬液，45℃反应5min，测定OD₄₀₅值。1个酶活力单位定义为每分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

脂肪酶活性测定的结果（图5）显示，GS115/GCW5-CALB的菌体酶活随着发酵时间的增加逐渐升高，到96h可达1231U/g，而对照菌GS115的菌体则几乎没有酶活。表明CALB被以活性形式成功地展示在巴斯德毕赤酵母细胞表面。

实施例6：利用p9KGCW5表面展示表达载体展示米黑根毛霉脂肪酶

（1）    根据含有米黑根毛霉脂肪酶（RML）基因序列的质粒pKFS-RML的序列特征，设计并合成引物：

P5：GCGGGAATTCGATTACAAGGATGATGACGATAAGGTTCCAATTAAGAGAC

AATCTAACT (SEQ NO：8)

P6：GCGCACGCGTAGTACACAAACCAGTGTTAATACCA  (SEQ NO：9)

其中P5下划线部分为EcoR I识别位点，斜体部分为FLAG标签序列；P6中下划线部分为Mlu I位点。通过PCR方法扩增出RML基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行30个以下循环：94℃变性30秒、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟45秒；最后72℃延伸10分钟。得到FLAG-RML基因片段。测序结构显示RML基因(SEQ NO：10)被正确扩增：

（2）    利用p9KGCW5表面展示表达载体在巴斯德毕赤酵母细胞表面展示RML

将FLAG-RML融合蛋白的DNA序列的EcoR I和Mlu I双酶切产物与p9KGCW5载体的EcoR I和Mlu I双酶切产物连接，得到重组质粒p9KGCW5-RML，转化大肠杆菌宿主Top10F。挑取阳性转化子提取质粒，通过EcoR I和Mlu I双酶切鉴定。将重组质粒p9KGCW5-RML转化毕赤酵母GS115，通过MD平板筛选转化子。转化子在MD平板上生长48h后，随机挑取部分转化子转接至三丁酸甘油酯乳化平板进行鉴定。在三丁酸甘油酯乳化平板上形成明显水解圈的转化子为阳性转化子GS115/GCW5-RML。

实施例7：利用p9KGCW5表面展示表达载体展示碱性木聚糖酶

（1）    根据含有碱性木聚糖酶基因（XYN）序列的质粒pPIC9K-XYN的序列特征，设计并合成引物：

P7：CGTGAATTCATGATTACTTTGTTTAAGAAGCC  (SEQ NO：11)

P8：GATACGCGTTTAATCAATAATTCTCCAG  (SEQ NO：12)

其中P7下划线部分为EcoR I识别位点；P8中下划线部分为MluI位点。通过PCR方法扩增出XYN基因序列，扩增条件为：预变性94℃5分钟；再进行35个以下循环：94℃变性30秒、55℃退火1分钟、72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。得到XYN基因片段。测序结构显示XYN基因(SEQ NO：13)被正确扩增： 

（2）    利用p9KGCW5表面展示表达载体在巴斯德毕赤酵母细胞表面展示XYN

将XYN序列的EcoR I和MluI双酶切产物与p9KGCW5载体的EcoR I和MluI双酶切产物连接，得到重组质粒p9KGCW5-XYN，转化大肠杆菌宿主Top10F。挑取阳性转化子提取质粒，通过EcoR I和MluI双酶切鉴定。将重组质粒p9KGCW5-XYN转化毕赤酵母GS115，通过MD平板筛选转化子。转化子在MD平板上生长48h后，随机挑取部分转化子进行菌落PCR和测序鉴定p9KGCW5-XYN阳性转化子。

实施例8：

本发明所述壁蛋白所构建的巴斯德毕赤酵母表面展示系统与用Pir蛋白所构建的巴斯德毕赤酵母表面展示系统的效果比较。

1、实验材料

（1）本发明所述壁蛋白所构建的巴斯德毕赤酵母表面展示系统：

GS115/GCW5-CALB，制备方法参见实施例5。

（2）用Pir蛋白所构建的巴斯德毕赤酵母表面展示系统：

GS115/GCW5-CALB中的锚定蛋白用Pir1或Pir2替换，得到GS115/ Pir1-CALB和GS115/ Pir2-CALB，方法如下：

pZαA/Pir1和pZαA/Pir2表达载体的构建：详见Khasa YP的报道(Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).

pZαA/Pir1-CALB和pZαA/Pir2-CALB的构建：将CALB基因（SEQ NO：7）分别插入到pZαA/Pir1和pZαA/Pir2中（sfu 1和Not 1双酶切）。

GS115/ Pir1-CALB和GS115/ Pir2-CALB：将pZαA/Pir1-CALB和pZαA/Pir2-CALB分别转化毕赤酵母GS115，用含100mg/L Zeocin的YPD平板筛选阳性转化子。

2、实验方法

GS115/GCW5-CALB 、GS115/ Pir1-CALB和GS115/ Pir2-CALB在分别BMMY培养基中诱导表达后，测定菌体的CALB酶活，方法参见实施例5。

3、实验结果

结果如图6所示，GS115/ Pir1-CALB和GS115/ Pir2-CALB的菌体酶活仅为GS115/GCW5-CALB的17.06%和7.72%。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南理工大学

 

<120>  毕赤酵母壁蛋白Gcw5及其表面展示系统和构建方法

 

<130> 

 

<160>  13   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  187

<212>  PRT

<213>  巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）

 

<400>  1

 

Asn Ala Ala Val Tyr Asn Thr Thr Val Thr Asp Val Val Ser Glu Leu

1             5               10               15     

 

 

Glu Thr Thr Val Leu Thr Ile Thr Ser Cys Ala Glu Asp Lys Cys Ile

          20              25                30         

 

 

Thr Ser Lys Ser Thr Gly Leu Ile Thr Thr Ser Thr Leu Thr Lys His

        35              40              45             

 

 

Gly Val Val Thr Val Val Thr Thr Val Cys Asp Leu Pro Ser Thr Thr

    50              55               60                 

 

 

Lys Ser Tyr Val Pro Pro Ala Lys Thr Thr Thr Ile Pro Pro Pro Glu

65              70               75              80 

 

 

Lys Thr Thr Thr Thr Val Pro Pro Pro Ala Lys Thr Thr Thr Thr Val

              85              90               95     

 

 

Pro Pro Pro Ala Lys Thr Thr Ser Thr Val Pro Pro Pro Ala Lys Thr

         100              105              110        

 

 

Ser Ser His His Glu Ser Thr Ile Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

      115              120            125            

 

 

Ser Thr Lys Lys Ile Glu Thr Glu Ser Thr Thr Tyr His Phe Val Thr

    130            135               140                

 

 

Gln Thr Thr Thr Ala Arg Asn Ile Thr Pro Pro Ala Ile Thr Thr Gln

145             150              155             160

 

Ser His Gly Ala Ala Gly Met Asn Ala Ala Asn Phe Val Gly Leu Gly

             165              170              175    

 

 

Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Val Leu

         180              185        

 

 

<210>  2

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

atatgaattc attacaagga tgacgacgat aagacgcgta acgctgctgt ttacaac       57

 

 

<210>  3

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tattatgcgg ccgcttacaa gaccaaagca g           31

 

 

<210>  4

<211>  564

<212>  DNA

<213>  巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）

 

<400>  4

aacgctgctg tttacaacac caccgtcact gacgttgttt ccgagttgga gaccaccgtt  60

 

ctgactatca cctcttgtgc tgaggacaag tgtatcacca gtaagtccac cggattgatc   120

 

actacctcca ccctcaccaa gcacggtgtt gtcactgttg tcaccactgt ctgtgacttg   180

 

ccaagcacca ccaagagcta cgtcccacct gctaagacta ctactattcc tcctccagag  240

 

aagactacca ccactgtccc acctccagcc aagactacca ccactgtccc acctccagcc  300

 

aagactacta gtaccgtccc acctccagct aagaccagct ctcaccatga gtctaccatc   360

 

actgtgactg tcccatcctc cacttctacc aagaagattg agactgagtc taccacttac    420

 

cactttgtta cccagaccac tactgctaga aacattaccc caccagccat caccacccaa   480

 

tctcacggtg ccgctggtat gaacgccgcc aacttcgtcg gattaggtgc tgccgctgtt    540

 

gccgccgctg ctttggtctt gtaa                                   564

 

 

<210>  5

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

atatgaattc acgcgtaacg ctgctgttta caac                      34

 

 

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

atatctcgag aacgctgctg tttacaac                         28

 

 

<210>  7

<211>  972

<212>  DNA

<213>  南极假丝酵母（Candida antarctica）

 

<400>  7

gccactcctt tggtgaagcg tctgccttcc ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag       60

 

tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc    120

 

atccttctcg tccccggaac cggcaccaca ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc     180

 

cccctctctg cgcagctggg ttacacaccc tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc     240

 

aacgacaccc aggtcaacac ggagtacatg gtcaacgcca tcaccacgct ctacgctggt   300

 

tcgggcaaca acaagcttcc cgtgctcacc tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg   360

 

ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc      420

 

gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc   480

 

gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc actaccgcac tccgaaacgc aggtggtctg  540

 

acccagatcg tgcccaccac caacctctac tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag    600

 

gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag    660

 

gctgtgtgtg ggccgctgtt cgtcatcgac catgcaggct cgctcacctc gcagttctcc    720

 

tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc accacgggcc aggctcgtag tgcagactat   780

 

ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc     840

 

gcggctgcgc tcctggcgcc ggcggctgca gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc  900

 

gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc    960

 

atcgtcaccc cc                                             972

 

 

<210>  8

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

gcgggaattc gattacaagg atgatgacga taaggttcca attaagagac aatctaact     59

 

 

<210>  9

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

gcgcacgcgt agtacacaaa ccagtgttaa tacca                 35

 

 

<210>  10

<211>  1017

<212>  DNA

<213>  米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）

 

<400>  10

gttccaatta agagacaatc taactctact gttgattctt tgccaccatt gattccatct       60

 

agaacttctg ctccatcttc ttctccatct actactgatc cagaagctcc agctatgtct     120

 

agaaacggtc cattgccatc tgatgttgaa actaagtacg gtatggcttt gaacgctact     180

 

tcttacccag atactgttgt tcaagctatg tctattgatg gtggtattag agctgctact     240

 

tctcaagaaa ttaacgaatt gacttactac actactttgt ctgctaactc ttactgtaga      300

 

actgttattc caggtgctac ttggggttgt attcattgtg atgctactga agatttgaag      360

 

attattaaga cttggtctac tttgatttac gatactaacg ctatggttgc tagaggtgat    420

 

tctgaaaaga ctatttacat tgtttttaga ggttcttctt ctattagaaa ctggattgct     480

 

gatttgactt ttgttccagt ttcttaccca ccagtttctg gtactaaggt tcataagggt     540

 

tttttggatt cttacggtga agttcaaaac gaattggttg ctactgtttt ggatcaattt      600

 

aagcaatacc catcttacaa ggttgctgtt actggtcatt ctttgggtgg tgctactgct    660

 

ttgttgtgtg ctttggattt gtaccaaaga gaagaaggtt tgtcttcttc taacttgttt      720

 

ttgtacactc aaggtcaacc aagagttggt gatccagctt ttgctaacta cgttgtttct     780

 

actggtattc catacagaag aactgttaac gaaagagata ttgttccaca tttgccacca    840

 

gctgcttttg gttttttgca tgctggtgaa gaatactgga ttactgataa ctctccagaa     900

 

actgttcaag tttgtacttc tgatttggaa acttctgatt gttctaactc tattgttcca      960

 

tttacttctg ttttggatca tttgtcttac tttggtatta acactggttt gtgtact   1017

 

 

<210>  11

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

cgtgaattca tgattacttt gtttaagaag cc    32

 

 

<210>  12

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

gatacgcgtt taatcaataa ttctccag   28

 

 

<210>  13

<211>  1188

<212>  DNA

<213>  枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

 

<400>  13

atgattactt tgtttaagaa gccatttgtt gctggtttgg ctatttcttt gttggttggt   60

 

ggtggtttgg gtaacgttgc tgctgctcaa ggtggtccac caaagtctgg tgtttttggt   120

 

gaaaaccaaa agagaaacga tcaaccattt gcttggcaag ttgcttcttt gtctgaaaga  180

 

taccaagaac aatttgatat tggtgctgct gttgaaccat accaattgga aggtagacaa   240

 

gctcaaattt tgaagcatca ttacaactct ttggttgctg aaaacgctat gaagccagtt   300

 

tctttgcaac caagagaagg tgaatggaac tgggaaggtg ctgataagat tgttgaattt 360

 

gctagaaagc ataacatgga attgagattt catactttgg tttggcattc tcaagttcca  420

 

gaatggtttt ttattgatga aaacggtaac agaatggttg atgaaactga tccagaaaag  480

 

agaaaggcta acaagcaatt gttgttggaa agaatggaaa accatattaa gactgttgtt  540

 

gaaagataca aggatgatgt tacttcttgg gatgttgtta acgaagttat tgatgatggt   600

 

ggtggtttga gagaatctga atggtaccaa attactggta ctgattacat taaggttgct  660

 

tttgaaactg ctagaaagta cggtggtgaa gaagctaagt tgtacattaa cgattacaac 720

 

actgaagttc catctaagag agatgatttg tacaacttgg ttaaggattt gttggaacaa 780

 

ggtgttccaa ttgatggtgt tggtcatcaa tctcatattc aaattggttg gccatctatt   840

 

gaagatacta gagcttcttt tgaaaagttt acttctttgg gtttggataa ccaagttact  900

 

gaattggata tgtctttgta cggttggcca ccaactggtg cttacacttc ttacgatgat  960

 

attccagaag aattgtttca agctcaagct gatagatacg atcaattgtt tgaattgtac  1020

 

gaagaattgt ctgctactat ttcttctgtt actttttggg gtattgctga taaccatact    1080

 

tggttggatg atagagctag agaatacaac aacggtgttg gtgttgatgc tccatttgtt  140

 

tttgatcata actacagagt taagccagct tactggagaa ttattgat            1188

 

Claims (8)

1.一种巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

2.编码权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白GCW5的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ NO：4所示。

3.一种巴斯德毕赤酵母细胞表面展示系统，其特征在于，是以权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw5为锚定蛋白，将靶蛋白固定在巴斯德毕赤酵母细胞表面构成的。

4.权利要求3所述的巴斯德毕赤酵母表面展示系统的构建方法，该方法由以下步骤组成：

（1）将权利要求2所述的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以权利要求1所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白的表面展示表达载体；

（2）将靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表达载体的巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因序列的上游，与所述巴斯德毕赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；

（3）转化巴斯德毕赤酵母，根据所述表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体包括带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pPIC9K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB或pGAPZαC。

7.根据权利要求4～6之一所述的构建方法，其特征在于，所述靶蛋白为碱性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶B。

8.根据权利要求4～6之一所述的构建方法，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。

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