CN107418903B - 一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株，是基因组中含有融合基因gox‑fopA‑C的工程菌；其中，所述工程菌株的出发菌是黑曲霉ATCC 20611，融合基因gox‑fopA‑C是葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β‑呋喃果糖苷酶FopA‑C端结构域编码基因fopA‑C融合获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其上游为构巢曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，下游为构巢曲霉色氨酸终止子TtrpC。本发明还公开了所述工程菌在制备低聚果糖中的应用，实验证实：该工程菌葡萄糖氧化酶活力达到90.0U/g，β‑呋喃果糖苷酶活力达到380U/g，菌丝体直接用于制备低聚果糖，其含量达到71.2％。本发明操作简便，可实现菌丝体一步酶法制备较高纯度的低聚果糖，具有较好的工业应用价值。

Description

一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与在制备低聚果糖中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
低聚果糖(Fructooligosaccharides，简写为FOS)又称功能性果寡糖，是蔗糖分子上以β-1，2糖苷键结合数个D-果糖所形成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)及其混合物的总称。低聚果糖具有调节肠道菌群平衡、降低血脂、促进钙镁吸收等生理功效，广泛应用于食品、饮料及医药等领域。工业上通常采用微生物酶法大量生产低聚果糖，以高浓度蔗糖为原料，利用微生物产生的具有果糖基转移活性的β-呋喃果糖苷酶(EC3.2.1.26)催化合成。黑曲霉ATCC 20611是当前最主要的低聚果糖生产菌株，其产生的β-呋喃果糖苷酶(FopA)负责低聚果糖合成，工业上将发酵的菌丝体直接转化蔗糖进行低聚果糖的制备。葡萄糖是转化反应的副产物，对FopA具有非竞争性抑制效应，限制了低聚果糖合成效率，使得产物中低聚果糖含量只能达到55％-60％。转化产物中还含有30％左右的葡萄糖和10％左右的蔗糖，从而不适用于糖尿病人和龋齿患者食用。因此，消除低聚果糖合成产物中的葡萄糖对制备高纯度低聚果糖具有重要意义。
目前高纯度低聚果糖的制备方法可分为两种：一种是两步法，即先利用β-呋喃果糖苷酶转化蔗糖合成55％左右的低聚果糖，再采用色谱法等过滤除去葡萄糖和蔗糖，得到高纯度低聚果糖产品，但这种方法具有分离装置造价高、操作控制繁琐复杂、维护成本高等弊端，使得高纯低聚果糖生产成本居高不下；另一种是混合酶方法，即在β-呋喃果糖苷酶反应合成低聚果糖的体系中同时添加葡萄糖氧化酶，将副产物葡萄糖氧化为葡萄糖酸解除抑制效应，促进低聚果糖的进一步合成，从而获得较高纯度的低聚果糖，但该方法需要体外制备葡萄糖氧化酶，不仅增加了成本，且容易造成产物污染，不适合大规模的工业化生产。
迄今为止，国内外尚无在低聚果糖合成菌株中表达葡萄糖氧化酶的报道，亦未见利用葡萄糖氧化酶与β-呋喃果糖苷酶(FopA)C端结构域进行融合表达构建工程菌并应用于低聚果糖制备的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与在制备低聚果糖中的应用。
本发明所述的表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株，其特征在于，该工程菌株是基因组中含有融合基因gox-fopA-C的工程菌；其中，所述工程菌株的出发菌是黑曲霉ATCC 20611；所述融合基因gox-fopA-C是葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β-呋喃果糖苷酶FopA-C端结构域编码基因fopA-C融合获得，该融合基因gox-fopA-C的核苷酸序列如SEQID No.1所示，其上游为构巢曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，下游为构巢曲霉色氨酸终止子TtrpC。
上述表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株中，所述的葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox来自黑曲霉ATCC 1015基因组；所述的β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域编码基因fopA-C来自黑曲霉ATCC 20611基因组，所述的启动子PgpdA和终止子TtrpC基因来源于质粒pAN7-1。
本发明所述表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌的构建方法，步骤是：将葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β-呋喃果糖苷酶FopA-C端结构域编码基因fopA-C融合获得融合基因gox-fopA-C，再与启动子PgpdA、终止子TtrpC连接形成融合基因gox-fopA-C表达盒；将该表达盒与pMD 19-T载体连接，得到融合基因表达载体pGOC；再将该载体转化进入黑曲霉ATCC 20611的基因组，即获得表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株。
本发明所述表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌在制备低聚果糖中的应用。
其中，所述应用的方法是：
(1)将表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌以1×105-107个/mL孢子量接种到发酵培养基中，培养温度为30±3℃，转速为180～220r/min，培养时间为36～60h，收集菌丝体；
其中上述发酵培养基的组成成分为：蔗糖30g/L，酵母膏3g/L，NaNO3 5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4 7H2O 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，CuSO4 0.01g/L；
(2)测定集菌丝体的β-呋喃果糖苷酶活力，获得每克菌丝体量与β-呋喃果糖苷酶活力单位的关系值，进行低聚果糖的制备；其中低聚果糖制备的反应体系为：蔗糖浓度为300～500g/L，CaCO3质量体积比为0.5％～1.5％，菌丝体量为3～7Uβ-呋喃果糖苷酶活力/g蔗糖，温度为40±5℃，转速为150～180r/min，反应时间为5～20h。
上述应用中：所述工程菌优选以1×106个/mL孢子量接种到发酵培养基中，培养温度为30℃，转速为200r/min，培养时间为48h。
上述应用中：所述的低聚果糖制备的反应体系优选为：蔗糖浓度为400g/L，CaCO3质量体积比为1.0％，菌丝体量为6Uβ-呋喃果糖苷酶活力/g蔗糖，温度为40℃，转速为150r/min，反应时间为20h。
本发明公开的一种低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与在制备低聚果糖中的应用，实现了低聚果糖生产菌种的遗传改良；该发明得到的表达葡萄糖氧化酶工程菌株在催化蔗糖合成低聚果糖时有效地降低了副产物葡萄糖的抑制效应，促进了低聚果糖制备的正向转化，提高了产物中低聚果糖纯度，有助于降低低聚果糖生产成本。实验证实：应用本发明方法，低聚果糖合成工程菌株的葡萄糖氧化酶活力达到90.0U/g，β-呋喃果糖苷酶活力达到380U/g，菌丝体直接用于制备低聚果糖，其含量达到71.2％。
本发明公开的低聚果糖合成工程菌株提升低聚果糖制备效率的效果显著，操作简便，可节约高纯度低聚果糖制备的成本，具有较强的应用价值；同时，本发明在酶法制备高纯度低聚果糖方面具有重要的指导意义，有助于推动低聚果糖的产业化进程。
附图说明
图1.葡萄糖氧化酶基因gox、β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域基因fopA-C及两片段融合基因gox-fopA-C的扩增电泳图。
其中：M为1kb DNA marker，葡萄糖氧化酶基因gox片段大小约为1.8kb，β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域基因fopA-C片段大小约为0.3kb。
图2.葡萄糖氧化酶表达载体pGOC图谱和工程菌株的葡萄糖氧化酶活力平板检测图。
其中：A是葡萄糖氧化酶表达载体pGOC的质粒图谱；B是工程菌葡萄糖氧化酶活力平板检测图，GOC-2、GOC-3和GOC-4是表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株，ATCC20611是出发菌株，作为阴性对照。
图3.低聚果糖合成工程菌的葡萄糖氧化酶活力测定结果。
其中A是低聚果糖合成工程菌GOC-2、GOC-3和GOC-4分别发酵培养24h、48h和72h时菌丝体的葡萄糖氧化酶活力测定结果，B是工程菌GOC-4发酵培养48h的菌丝体分别在30℃、35℃、40℃、45℃和50℃条件下测定的葡萄糖氧化酶活力结果。
图4.低聚果糖合成工程菌的β-呋喃果糖苷酶活力测定结果。
其中A是3，5-二硝基水杨酸法(DNS)法测定β-呋喃果糖苷酶活力的葡萄糖标准曲线，B是低聚果糖合成工程菌GOC-4发酵培养48h，菌丝体的β-呋喃果糖苷酶活力结果，ATCC20611是出发菌株。
图5.表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌制备低聚果糖产物中糖含量测定。
其中：A是工程菌GOC-4和出发菌株反应5h、10h和20h时制备产物中的葡萄糖含量测定结果，B是工程菌GOC-4和出发菌株反应20h时制备产物中的低聚果糖含量测定结果。
具体实施方式
下面对本发明进行清楚、完整的描述，其目的是更好的理解本发明的内容，但不是以本实施例对发明保护范围造成限制。
下面实施例中所用的菌株和质粒来源是：黑曲霉ATCC 20611和黑曲霉ATCC1015购自美国菌种保藏中心，载体pMD 19-T购自Takara。
实施例1.葡萄糖氧化酶基因gox与β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域基因fopA-C的融合获得融合基因gox-fopA-C
首先以黑曲霉ATCC1015染色体DNA为模板，gox-1F/gox-1815R为引物扩增带有fopA-C接头的不含终止密码子的1.8kb的gox基因片段，以黑曲霉ATCC 20611染色体DNA为模板，fopA-438F/fopA-965R为引物扩增0.3kb的fopA-C基因片段，然后利用Double jointPCR技术将gox和fopA-C两基因融合得到大小为2.1kb的gox-fopA-C融合基因(图1)。
上述引物对具体如下：
gox-1F：ATGCAGACTCTCCTTGTGAG
gox-1815R：CTGAACTGGTAGTAGATGGCCTGCATGGAAGCATAATC
fopA-438F：GCCATCTACTACCAGTTC
fopA-965R：TCACCACGATCTCGCCCAGGT
实施例2.葡萄糖氧化酶GOX融合FopA C-端结构域表达载体pGOC的构建
表达载体pGOC是以pMD 19-T载体为骨架构建的，包含启动子PgpdA、葡萄糖氧化酶和FopA的C端结构域融合基因gox-fopA-C和终止子TtrpC(图2A)；首先以质粒pAN7-1(Puntet al.,Gene.1987,56,117-24.)为模板，分别用引物对PgpdA-1192UF/PgpdA-7UR和TtrpC-1044DF/TtrpC-1805DR扩增带有gox接头的1.2kb的PgpdA和0.7kb的带有fopA-C接头的TtrpC，然后融合基因gox-fopA-C与启动子PgpdA、终止子TtrpC连接形成融合基因gox-fopA-C表达盒；最后将该表达盒融合片段克隆至pMD 19-T载体中，挑取单克隆子进行验证，将验证正确的质粒命名为pGOC，质粒图谱见图2A所示。
上述引物对具体如下：
PgpdA-1192UF：AGACCTAATACAGCCCCTAC
PgpdA-7UR：CTCACAAGGAGAGTCTGCATTGTCTGCTCAAGCGGGGTAG
TtrpC-1044DF：GGGCGAGATCGTGGTGAACTTAACGTTACTGAAATCATC
TtrpC-1805DR：GAGTGGAGATGTGGAGTGGG
实施例3.利用表达载体pGOC转化黑曲霉ATCC 20611构建表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌
黑曲霉ATCC 20611的遗传转化是利用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法，吡啶硫胺素抗性基因ptrA为筛选标记。将纯化的质粒pGOC和含有ptrA表达盒的质粒pME2892(Krappmann et al.,Eukaryotic Cell.2005,4,1298–1307.)各10μg混合后共转化黑曲霉ATCC 20611。
上述PEG/CaCl2介导的原生质体转化的具体方法如下：
(1)黑曲霉ATCC 20611原生质体的制备：
黑曲霉ATCC 20611孢子接种至50ml MM液体培养基中(孢子终浓度为1×106个/ml)，30℃，200rpm培养30h；离心收集菌体并用无菌水冲洗，取1g(湿重)菌丝体至20ml含有1％溶菌酶(w/v)的磷酸缓冲液(pH5.6)中，轻轻摇晃使菌体均匀分散，30℃，200rpm酶解2h，离心(2500rpm/min)收集原生质体。
其中MM培养基组成为：葡萄糖20g/l，(NH4)2SO4 5g/l，KH2PO4 15g/l，MgSO4·7H2O0.6g/l，无水CaCl2 0.6g/l，蛋白胨2g/l，微量元素为FeSO4·7H2O 0.005g/l，MnSO4·H2O0.0016g/l，ZnSO4·7H2O 0.0014g/l，CoCl2 0.002g/l，115℃灭菌30min。
(2)葡萄糖氧化酶载体pGOC转化黑曲霉ATCC 20611原生质体：
将pGOC与含有筛选标记基因ptrA表达盒的质粒pME2892各10μg与100μl的黑曲霉ATCC 20611原生质体混合，加入50μl聚乙二醇6000溶液(25％)，冰浴20min，后加2ml聚乙二醇6000溶液(25％)，室温放置5min，最后加4ml含有1M山梨醇的磷酸缓冲液(pH 6.5)，轻轻混匀；然后，将上述溶液加入到含有2μg/ml吡啶硫胺素氢溴酸盐(购自Sigma公司)的10ml转化上层培养基中，混匀后倒入预先凝固的转化下层培养基平板，冷却凝固后30℃培养3天，挑选生长良好的转化株，接种至PDA培养基生孢备用。
其中上述转化上层培养基为：葡萄糖10g/L，MgSO4·7H2O 1g/l，KH2PO4 10g/l，(NH4)2SO4 6g/l，C6H5Na3O7 3g/l，微量元素(同上述MM培养基)，山梨醇182.18g/l，琼脂糖6g/l；转化下层培养基为：葡萄糖10g/L，MgSO4·7H2O 1g/l，KH2PO4 10g/l，(NH4)2SO4 6g/l，C6H5Na3O7 3g/l，微量元素(同上述MM培养基)，琼脂粉20g/l；以上培养基均经115℃灭菌30min后使用。
其中上述PDA培养基：去皮土豆200g，切碎后，加水煮沸30min，8层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容至1L，自然pH，2％琼脂粉，115℃灭菌30min。
(3)表达葡萄糖氧化酶的工程菌株筛选：
利用葡萄糖氧化酶活力平板检测方法对转化株进行筛选，具体方法是：取转化株孢子接种至察氏固体培养基平板上，30℃培养24h；配制反应混合液：10mg/ml葡萄糖，0.6U/ml过氧化物酶，0.08mg/ml邻联二茴香胺，10mg/ml琼脂粉；将上述配制好的反应混合液倒入长有菌丝体的平板，并使其全部覆整个平板，30℃培养4h；菌落周围产生明显棕色晕圈的菌株表示葡萄糖氧化酶的成功表达。如图2B所示，转化株GOC-2、GOC-3和GOC-4菌落周围产生明显的棕色晕圈，说明gox-fopA-C表达盒成功转化至其基因组中且葡萄糖氧化酶获得表达，因此，转化株GOC-2、GOC-3和GOC-4可作为表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株用于后继分析应用。
其中上述察氏培养基成分为：NaNO3 3g/l，K2HPO4 1g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，KCl0.5g/l，FeSO4 0.01g/l，蔗糖30g/l，固体需加2％的琼脂粉，115℃灭菌30min。
实施例4.低聚果糖合成工程菌的葡萄糖氧化酶活力测定
将实施例3获得的工程菌株GOC-2、GOC-3和GOC-4与出发菌株黑曲霉ATCC 20611的新鲜孢子(1×106个/ml)分别接种至100ml发酵培养基(蔗糖30g/L，酵母膏3g/L，NaNO3 5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 7H2O 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，CuSO4 0.01g/L，115℃灭菌30min)中，30℃，200rpm，进行摇瓶培养，每隔24h取样，抽滤收集菌丝体用于测定葡萄糖氧化酶活力。
葡萄糖氧化酶活力测定方法：2.6ml含有0.1mg/ml邻联二茴香胺的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，0.3ml 180mg/ml的葡萄糖溶液，0.1ml的0.5mg/ml辣根过氧化物酶溶液，混合均匀后加入0.02g菌丝体，于30℃反应30s在460nm波长下测定吸光值记为A0，反应1.5min时读取吸光值记为A1，得出ΔA460＝A1-A0，酶活力(X，U/g)计算方法为：X＝ΔA460×f×B/(11.3×A×t)，其中f为酶液稀释倍数、B为反应总体积(3ml)、11.3为消光系数、A为加样质量(g)、t为反应时间(min)。
葡萄糖氧化酶活力测定结果如图3A所示，工程菌GOC-2、GOC-3和GOC-4在培养48h时葡萄糖氧化酶的活力最高，其中GOC-4的葡萄糖氧化酶活力达到46.3U/g；而出发菌株ATCC 20611没有检测到葡萄糖氧化酶活力，说明工程菌葡萄糖氧化酶活力来自gox-fopA-C融合基因的成功表达。因为GOC-4的葡萄糖氧化酶活力最高，所以选择GOC-4作为后继应用的工程菌株。
进一步测定GOC-4工程菌在30℃、35℃、40℃、45℃和50℃条件下的葡萄糖氧化酶活力，结果如图3B所示，40℃时GOC-4的葡萄糖氧化酶活力最高，达到90.0U/g，表明该酶的最适催化温度为40℃。
实施例5.低聚果糖合成工程菌GOC-4在制备低聚果糖中的应用
将工程菌GOC-4和出发菌株ATCC 20611的新鲜孢子以1×106个/mL接种到发酵培养基中，30℃，200r/min培养48h，收集菌丝体；测定菌丝体的β-呋喃果糖苷酶活力，测定方法为：称取0.02克菌丝体与2ml 25％(W/V)蔗糖溶液(用0.1mol/L pH 5.0的柠檬酸磷酸缓冲溶液配制)和2ml pH 5.0的磷酸缓冲液混合，50℃反应2h，沸水浴5min终止反应，将反应上清液适当稀释后，取1ml加入酶标管中，再加入2ml的10mg/ml 3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，煮沸2min，冷水冷却，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测OD值。空白对照是直接取1ml蒸馏水与2ml DNS混匀进行同样实验条件操作。
酶活定义是催化底物蔗糖每分钟反应产生1μmol的还原糖所需的酶量定为一个单位。葡萄糖标准曲线的制备采用相同的还原糖测定体系，标准曲线葡萄糖浓度在1g/L-10g/L之间，葡萄糖标准曲线如图4A。
β-呋喃果糖苷酶活力测定结果如图4B所示，工程菌GOC-4酶活力达到380U/g，与出发菌株相比没有显著差异。
菌丝体直接用于制备低聚果糖的条件：底物蔗糖浓度为400g/L，加入培养48h的工程菌GOC-4菌体，菌体量为6Uβ-呋喃果糖苷酶活力/g蔗糖(根据工程菌GOC-4酶活力达到380U/g换算获得)，温度为40℃，转速为150r/min，CaCO3加入量为1.0％(质量体积比)，反应时间为5h、10h和20h。
反应产物利用HPLC进行分析，条件为：液相仪是LC-6A(Shimadzu，Japan)，色谱柱是安捷伦Agilent Zorbax NH2column(5μm，4.6mm×250 208mm)，示差检测器(2414，Waters，USA)，70％的乙腈为流动相，进样量10μl，以1.0ml/min的流速进行流加，最后根据保留时间和峰面积确定产物中各糖组分的含量。
低聚果糖制备产物中糖含量分析结果如图5所示，工程菌GOC-4反应产物中葡萄糖含量在20h为128.4mg/ml，比出发菌株ATCC 20611(199.5mg/ml)相比减少36％(图5A)，合成的低聚果糖含量可达71.2％(图5B)，比出发菌株(59.6％)提高了19.5％。
实施例6.低聚果糖合成工程菌GOC-4在制备低聚果糖中的应用
将工程菌GOC-4和出发菌株ATCC 20611的新鲜孢子以1×105个/mL接种到发酵培养基中，30℃，180r/min培养36h，收集菌丝体；测定菌丝体的β-呋喃果糖苷酶活力方法与葡萄糖标准曲线的制备与实施例5的描述相同。此条件下工程菌GOC-4的β-呋喃果糖苷酶活力达到320U/g。
菌丝体直接用于制备低聚果糖的条件：底物蔗糖浓度为300g/L，加入培养48h的工程菌GOC-4菌体，菌体量为3Uβ-呋喃果糖苷酶活力/g蔗糖(根据工程菌GOC-4酶活力达到320U/g换算获得)，温度为35℃，转速为150r/min，CaCO3加入量为0.5％(质量体积比)，反应时间为20h。反应产物利用HPLC进行分析，条件与实施例5的描述相同。此条件下，工程菌GOC-4反应产物中葡萄糖含量在20h为173.8mg/ml，合成的低聚果糖含量为63.2％。
实施例7.低聚果糖合成工程菌GOC-4在制备低聚果糖中的应用
将工程菌GOC-4和出发菌株ATCC 20611的新鲜孢子以1×107个/mL接种到发酵培养基中，30℃，220r/min培养60h，收集菌丝体；测定菌丝体的β-呋喃果糖苷酶活力方法与葡萄糖标准曲线的制备与实施例5的描述相同。此条件下工程菌GOC-4的β-呋喃果糖苷酶活力达到345U/g。
菌丝体直接用于制备低聚果糖的条件：底物蔗糖浓度为500g/L，加入培养48h的工程菌GOC-4菌体，菌体量为7Uβ-呋喃果糖苷酶活力/g蔗糖(根据工程菌GOC-4酶活力达到345U/g换算获得)，温度为45℃，转速为150r/min，CaCO3加入量为1.5％(质量体积比)，反应时间为20h。反应产物利用HPLC进行分析，条件与实施例5的描述相同。此条件下，工程菌GOC-4反应产物中葡萄糖含量在20h为182.8mg/ml，合成的低聚果糖含量为66.7％。
因此，利用本发明公开的低聚果糖合成工程菌GOC-4能够表达葡萄氧化酶，且在低聚果糖制备过程中发挥了去除副产物葡萄糖抑制效应的作用，有利于低聚果糖制备反应的正向进行，从而得到纯度较高的低聚果糖产品。
序列表
<110>山东大学
<120>一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与应用
<141>2017-06-22
<160> 1
<210> 1
<211>2061
<212>cDNA
<213>人工序列
<221>融合基因gox-fopA-C的核苷酸序列
<222>（1）…（2061）
<400>1
atgcagactc tccttgtgag ctcgcttgtg gtctccctcg ctgcggccct gccacactac 60
atcaggagca atggcattga agccagcctc ctgactgatc ccaaggatgt ctccggccgc 120
acggtcgact acatcatcgc tggtggaggt ctgactggac tcaccaccgc tgctcgtctg 180
acggagaacc ccaacatcag tgtgctcgtc atcgaaagtg gctcctacga gtcggacaga 240
ggtcctatca ttgaggacct gaacgcctac ggcgacatct ttggcagcag tgtagaccac 300
gcctacgaga ccgtggagct cgctaccaac aatcaaaccg cgctgatccg ctccggaaat 360
ggtctcggtg gctctactct agtgaatggt ggcacctgga ctcgccccca caaggcacag 420
gttgactctt gggagactgt ctttggaaat gagggctgga actgggacaa tgtggccgcc 480
tactccctcc aggctgagcg tgctcgcgca ccaaatgcca aacagatcgc tgctggccac 540
tacttcaacg catcctgcca tggtgttaat ggtactgtcc atgccggacc ccgcgacacc 600
ggcgatgact attctcccat cgtcaaggct ctcatgagcg ctgtcgaaga ccggggcgtt 660
cccaccaaga aagacttcgg atgcggtgac ccccatggtg tgtccatgtt ccccaacacc 720
ttgcacgaag accaagtgcg ctccgatgcc gctcgcgaat ggctacttcc caactaccaa 780
cgtcccaacc tgcaagtcct gaccggacag tatgttggta aggtgctcct tagccagaac 840
ggcaccaccc ctcgtgccgt tggcgtggaa ttcggcaccc acaagggcaa cacccacaac 900
gtttacgcta agcacgaggt cctcctggcc gcgggctccg ctgtctctcc cacaatcctc 960
gaatattccg gtatcggaat gaagtccatc ctggagcccc ttggtatcga caccgtcgtt 1020
gacctgcccg tcggcttgaa cctgcaggac cagaccaccg ctaccgtccg ctcccgcatc 1080
acctctgctg gtgcaggaca gggacaggcc gcttggttcg ccaccttcaa cgagaccttt 1140
ggtgactatt ccgaaaaggc acacgagctg ctcaacacca agctggagca gtgggccgaa 1200
gaggccgtcg cccgtggcgg attccacaac accaccgcct tgctcatcca gtacgagaac 1260
taccgcgact ggattgtcaa ccacaacgtc gcgtactcgg aactcttcct cgacactgcc 1320
ggagtagcca gcttcgatgt gtgggacctt ctgcccttca cccgaggata cgttcacatc 1380
ctcgacaagg acccctacct tcaccacttc gcctacgacc ctcagtactt cctcaacgag 1440
ctggacctgc tcggtcaggc tgccgctact caactggccc gcaacatctc caactccggt 1500
gccatgcaga cctacttcgc tggggagact atccccggtg ataacctcgc gtatgatgcc 1560
gatttgagcg cctggactga gtacatcccg taccacttcc gtcctaacta ccatggcgtg 1620
ggtacttgct ccatgatgcc gaaggagatg ggcggtgttg ttgataatgc tgcccgtgtg 1680
tatggtgtgc agggactgcg tgtcattgat ggttctattc ctcctacgca aatgtcgtcc 1740
catgtcatga cggtgttcta tgccatggcg ctaaaaattt cggatgctat cttggaagat 1800
tatgcttcca tgcaggccat ctactaccag ttcagcaacg agtcgctggt cgtcgaccgc 1860
agccagacta gtgcggcggc gcccacgaac cccgggctgg atagctttac tgagtccggc 1920
aagttgcggt tgttcgacgt gatcgagaac ggccaggagc aggtcgagac gttggatctc 1980
actgtcgtcg tggataacgc ggttgtcgag gtgtatgcca acgggcgctt tgcgttgagc 2040
acctgggcga gatcgtggtg a 2061

Claims (1)

1.一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌发酵生产低聚果糖的方法，步骤是：
（1）构建表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌，步骤是：将葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β-呋喃果糖苷酶FopA-C端结构域编码基因fopA-C融合获得融合基因gox-fopA-C，再与启动子PgpdA、终止子TtrpC连接形成融合基因gox-fopA-C表达盒；将该表达盒与pMD19-T载体连接，得到融合基因表达载体pGOC；再将该载体转化进入黑曲霉ATCC 20611的基因组，即获得表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株；其中，所述表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株是基因组中含有融合基因gox-fopA-C的工程菌；该工程菌株的出发菌是黑曲霉ATCC 20611；所述融合基因gox-fopA-C是葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域编码基因fopA-C融合获得，该融合基因gox-fopA-C的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其上游为构巢曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，下游为构巢曲霉色氨酸终止子TtrpC，其中所述的葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox来自黑曲霉ATCC1015基因组；所述的β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域编码基因fopA-C来自黑曲霉ATCC20611基因组，所述的启动子PgpdA和终止子TtrpC基因来源于质粒pAN7-1；
（2）将表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌以1×106 个/mL孢子量接种到发酵培养基中，培养温度为30℃，转速为200 r/min，培养时间为48 h，收集菌丝体；
（3）测定菌丝体的β-呋喃果糖苷酶活力，获得每克菌丝体与β-呋喃果糖苷酶活力单位的关系值，进行低聚果糖的制备；其中低聚果糖制备的反应体系为：蔗糖浓度为400 g/L，CaCO3质量体积比为1.0%，菌丝体量为6 U β-呋喃果糖苷酶活力/g蔗糖，温度为40℃，转速为150 r/min，反应时间为20 h。
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