CN103224950A - 一种黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法 - Google Patents
一种黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明构建了一种适合于黄曲霉菌遗传转化的表达载体，它包括以下两个步骤：一）含筛选标记基因和红色荧光报告基因的融合基因表达盒的供体质粒的构建：1）选择合适的供体骨架载体，2）设计引物，3）基因融合，4）构建含融合基因表达盒的供体载体；二）将融合基因表达盒克隆到双元表达载体上：1）双元表达载体的改造，2）将融合基因表达盒插入改造后的双元表达载体。本发明的载体转化黄曲霉菌后，可同时进行抗性和红色荧光筛选重组菌，提高筛选效率；还可利用红色荧光监测黄曲霉菌对农作物、食品的侵染，为这一危害人类健康的产毒真菌的防治提供依据。亦可用于其它丝状真菌的转基因研究，在转基因真菌研究中具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法。
背景技术
本发明构建的表达载体适用于黄曲霉菌遗传转化研究，特别适用于黄曲霉菌相关功能基因的研究，以及监测黄曲霉菌对农作物和食品的侵染过程。也可用于其它真菌的遗传转化研究。
背景技术
黄曲霉常侵染玉米、花生、大米、棉籽等粮油作物及其制品，其分泌的两种毒素AFB1、AFB2对家畜、动物和人类健康构成极大的潜在危害。该菌的基因组已测序，对它的研究进入了功能基因组时代。目前黄曲霉的转基因研究主要采用PEG法，此方法有以下不足：一、需要制备原生质体。除了制备原生质体过程复杂，重复性差外，此方法最大的问题在于转化子不稳定，转化效率低。二、这种方法转化的多是黄曲霉营养缺陷型菌株，即突变后的菌株，而非野生菌株。在目标突变产生的同时，一些潜在的不易检测到的突变可能会影响后期对功能基因的研究。
在众多以获得真菌突变体为目的的技术中，农杆菌介导的遗传转化具有效率高，成本低，操作方便和重复性好等特点，为真菌的功能基因组研究提供了有力的工具，到目前为止已在30多种真菌上取得成功。但至今尚无农杆菌介导转化黄曲霉菌的报道，是因为真菌遗传转化广泛使用的是植物双元表达载体，大多采用潮霉素抗性标记，而黄曲霉菌对潮霉素敏感性较差，在筛选阶段需加入大量的潮霉素，成本较高，费时费力；且多数黄曲霉菌株抗潮霉素，无法进行筛选。
荧光报告蛋白，尤其是绿色荧光蛋白GFP，已被广泛用于转基因后代的筛选，能有效提高筛选效率。但对一些绿色荧光本底较高的宿主，则给转化子鉴定及监测真菌和宿主的相互作用带来困难。此外，将筛选标记基因与荧光报告基因构建于同一个载体，同时转化真菌已有应用，但多为潮霉素抗性标记和绿色荧光GFP基因，分属于2个表达盒，致使最后的表达载体T-DNA插入区较大，影响转化效率，目前在黄曲霉菌中尚无有关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法，包括步骤：
（1）以pAF2载体为模板，以引物①：TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG和引物②：acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC对上述pAF2载体模板进行PCR扩增获得ble基因片段；
（2）以含玉米upmt基因的质粒pUC-upmt载体为模板，以引物③：ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG和引物④：GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG对上述pUC-upmt载体模板进行PCR扩增获得upmt基因片段；
（3）将上述ble基因片段、upmt基因片段等量混合作为模板，以引物①④扩增获得融合基因ble-upmt；
（4）将上述融合基因ble-upmt使用BamHI和PstI双酶切，插入经相同酶切的pUC18载体，构建成pUC-ble-upmt载体；
（5）以pAN7-1载体为模板，以引物⑤：ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥：CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG，PCR扩增trpc终止子片段，经PstI和HindIII双酶切后，插入上述pUC-ble-upmt载体，构建成pUC-ble-upmt-trpc载体；
（6）以pAN7-1载体为模板，以引物⑦： GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG和引物⑧CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG，PCR扩增gpdA启动子，经EcoRI和KpnI双酶切后，插入上述pUC-ble-upmt-trpc载体，构建成pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体；
（7）将上述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体转入Ecoli. DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子；
（8）将pCAMBIA1300载体经XhoI和BstXI双酶切，去除原载体上的CaMV35S启动子和hph基因，凝胶电泳回收大片段，加大肠杆菌DNA polymerase I于15℃反应2h补平末端，80℃保温5min灭活，用PCR产物纯化试剂盒回收片段，并于4℃连接16h，将连接产物转化Ecoli. DH5α，筛选阳性转化子；
（9））将上述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体用EcoRI和 HindIII双酶切，插入上述改造后的pCAMBIA1300的阳性转化子载体中。
进一步地，上述步骤（7）中，pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体转入Ecoli. DH5α感受态细胞是采用热击法转入。
进一步地，上述步骤（7）中，筛选阳性转化子是在含Amp抗生素的LB平板上进行筛选的。
进一步地，上述步骤（8）中，筛选阳性转化子是在含Kan抗生素的LB平板上进行筛选的。
本发明的有益效果：
1、本发明中所选的筛选标记基因ble是基于黄曲霉菌对抗生素的敏感性实验而得；荧光报告蛋白选择尿卟啉原Ⅲ甲基化酶UPMT，这是一种新型红色荧光蛋白，在长紫外光下产生强烈红色荧光，灵敏度与信噪比均优于GFP，已被用作大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞转录报告基因。
2、本发明将筛选标记基因和报告基因融合，置于Aspergillus nidulans的gpdA强启动子下，构建在一个表达盒中。与分别构建每个基因的表达盒再串联相比，本发明构建的载体T-DNA区较小，有利于黄曲霉菌的遗传转化。
3、这一构建将解决农杆菌介导黄曲霉菌的遗传转化问题，有助于转化后的筛选鉴定，减轻工作量，也为后期功能基因的研究奠定基础。
4、含红色荧光的黄曲霉菌可作为研究黄曲霉菌与宿主细胞相互作用的工程菌。红色荧光在活细胞成像具有以下优点：一是在多种颜色成像实验中需要红色探针，二是红色荧光较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。所以它能很好地追踪黄曲霉菌的侵染过程而又不伤害宿主细胞，为这一危害人类健康的产毒真菌的防治提供依据。
5、本发明构建的载体除可用于黄曲霉菌外，其它可以ble基因为筛选标记基因的真菌也可利用该载体进行遗传转化研究。
附图说明
图1为含ble-upmt融合基因表达盒的供体质粒的构建过程；
图2为p1300双元表达载体的改造过程；
图3为含ble-upmt融合基因表达盒的双元表达载体的构建过程。
具体实施方式
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施案例1：
含ble-upmt融合基因表达盒的供体质粒的构建
1）选择合适的供体骨架载体。用Primer Premier 5.0 软件分析ble 基因、upmt基因、gpdA启动子和trpC终止子序列的限制性酶切位点，确定pUC18作为骨架载体，且插入的先后顺序为：ble-upmt融合基因，trpC终止子，gpdA启动子。
2）运用Primerdesign软件设计引物。
a)依据pAF2载体上的ble 基因序列设计引物①：TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG和引物②：acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC；依据玉米upmt基因设计引物③：ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG和引物④：GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG。上述引物②和引物③中的小写字母部分为基因融合所需要的连接肽GGSGS对应的核苷酸序列。
b)依据pAN7-1载体上的trpC终止子序列设计引物⑤：ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥：CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG。
c)依据pAN7-1上的gpdA启动子序列设计引物⑦： GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG和引物⑧： CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG。
3）ble和upmt基因融合。利用2）中设计的引物①和②，以pAF2载体为模板，扩增ble 基因；利用引物③和④，以含玉米upmt基因的质粒为模板扩增upmt基因。将以上两种基因片段回收后等量混合，作为模板，以引物①④扩增获得融合基因ble-upmt。如图1（1）。
4）含融合基因表达盒的供体载体的构建，具体步骤如下：
a）将融合基因用BamHI和PstI双酶切，插入经相同酶切的pUC18载体，构建成pUC-ble-upmt载体。如图1（2）
b）利用引物⑤和⑥，以pAN7-1为模板，扩增trpc终止子片段，经PstI和HindIII双酶切后，插入pUC-ble-upmt载体，构建成pUC-ble-upmt-trpc载体。如图1（3）。
c) 利用引物⑦和⑧，以pAN7-1为模板，扩增gpdA启动子，经EcoRI和KpnI双酶切后，插入pUC-ble-upmt-trpc载体，构建成pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体。如图1（4）。
以上所构建的载体均通过热击法转入Ecoli. DH5α感受态细胞，在含Amp抗生素的LB平板上筛选阳性转化子。双酶切验证质粒，采用插入时所用的两种限制性内切酶。
Ecoli.DH5a可从宝生物、全式金、上海生工等生物公司购买。
实施案例2：
将ble-upmt融合基因表达盒克隆到双元表达载体上。
1）双元表达载体的改造。将pCAMBIA1300载体经XhoI和BstXI双酶切，去除原载体上的CaMV35S启动子和hph基因，凝胶电泳回收大片段。加大肠杆菌DNA polymerase I于15℃反应2h补平末端，80℃保温5min灭活。用PCR产物纯化试剂盒回收片段，并于4℃连接16h。将连接产物转化Ecoli. DH5α，于含Kan抗生素的LB平板上筛选阳性转化子，用XhoI和BstXI双酶切验证。改造过程如图2。
2）将载体pUC-gpdA-ble-upmt-trpc用EcoRI和 HindIII双酶切，插入上述改造后的p1300载体中。构建成pFL-gpdA-ble-upmt-trpc载体，简称pFL-ble-upmt。构建过程如图3。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：
（1）以pAF2载体为模板，以引物①：TAGGATCCATGGCCAAGTTGACCAGTG和引物②：acttccgctaccaccGTCCTGCTCCTCGGCCAC对所述pAF2载体模板进行PCR扩增获得ble基因片段；
（2）以含玉米upmt基因的质粒pUC-upmt载体为模板，以引物③：ggtggtagcggaagtCAGCTGCCGGAACTGCGG和引物④：GCTCTGCAGCTATGACTCAACCCAGAAG对所述pAF2载体模板进行PCR扩增获得upmt基因片段；
（3）将所述ble基因片段、upmt基因片段等量混合作为模板，以引物①④扩增获得融合基因ble-upmt；
（4）将所述融合基因ble-upmt使用BamHI和PstI双酶切，插入经相同酶切的pUC18载体，构建成pUC-ble-upmt载体；
（5）以pAN7-1载体为模板，以引物⑤：ATACTGCAGCCGCGGGATCCACTTAACG和引物⑥：CGCAAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAG，PCR扩增trpc终止子片段，经PstI和HindIII双酶切后，插入所述pUC-ble-upmt载体，构建成pUC-ble-upmt-trpc载体；
（6）以pAN7-1载体为模板，以引物⑦： GCGAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG和引物⑧CTAGGTACCGTTCTTGGATGGGAAGATG，PCR扩增gpdA启动子，经EcoRI和KpnI双酶切后，插入所述pUC-ble-upmt-trpc载体，构建成pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体；
（7）将所述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体转入Ecoli. DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子；
（8）将pCAMBIA1300载体经XhoI和BstXI双酶切，去除原载体上的CaMV35S启动子和hph基因，凝胶电泳回收大片段，加大肠杆菌DNA polymerase I于15℃反应2h补平末端，80℃保温5min灭活，用PCR产物纯化试剂盒回收片段，并于4℃连接16h，将连接产物转化Ecoli. DH5α，筛选阳性转化子；
（9））将所述pUC-gpdA-ble-upmt-trpc的用EcoRI和 HindIII双酶切，插入所述改造后的pCAMBIA1300的阳性转化子载体中。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中，pUC-gpdA-ble-upmt-trpc载体转入Ecoli.DH5α感受态细胞是采用热击法转入。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤（7）中，筛选阳性转化子是在含Amp抗生素的LB平板上进行筛选的。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉菌遗传转化表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤（8）中，筛选阳性转化子是在含Kan抗生素的LB平板上进行筛选的。
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