CN104152442A - T-dna及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种T-DNA及其真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法。本发明T-DNA包括左臂、右臂DNA，以及二者之间的多克隆位点和eGFP基因，且该T-DNA具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，本发明公开了其载体及构建方法；该T-DNA的真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增的上游引物对应于eGFP基因的左端序列，下游引物对应于右臂的左端序列；该右臂侧翼基因组序列的鉴定方法包括基因组DNA提取、酶切处理、纯化处理、连接反应、巢式PCR扩增及其产物鉴定、克隆和测序等步骤。本发明引物特异性强，能够快速、准确、高效、稳定、普适性地扩增出T-DNA的右臂侧翼基因组DNA序列，大大提高鉴定效率。

Description

T-DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种T-DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法。

背景技术

T-DNA（转移DNA）也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋形成的一种特殊结构。T-DNA是农杆菌Ti质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（如双子叶植物、真菌等）时分别诱发根瘤、opine化合物的合成和抑制细胞分化。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体；而外基因就是整合到T-DNA上的。农杆菌侵染受体后，Ti 质粒中的 T-DNA 区段脱离质粒而整合到受体的染色体上。因此，如果把外源基因插入 T-DNA 中，就有可能携带进入受体并整合到染色体上。

随着现代生物技术的发展，对农杆菌介导的真菌等转基因生物研究日益增多，T-DNA插入突变等反向遗传学技术已成为研究基因功能的一种重要途径，而T-DNA插入突变需要鉴定插入位点。目前，鉴定真菌T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列常采用TAIL-PCR或Hi-TAIL-PCR扩增技术，也有采用质粒挽救、外加接头等PCR扩增的报道。但这些技术均或因模板处理或因引物不确定性问题而导致扩增效率低、重复性差，甚至呈偶然性事件而被采用；现有研究中也有个别采用巢式PCR扩增未知序列的报道，但因没有找到合适的限制性酶切位点或合适的引物对，导致其PCR扩增效率非常低，这种扩增也仅仅作为一种个例被采用。

综上可知，当前亟需一种更高效、更准确、更具有普适性的T-DNA插入位点鉴定技术，以满足研究需求。

发明内容

为解决上述问题，本发明设计了一种T-DNA，并利用T-DNA区自身含有的多克隆位点、限制性内切酶选择确定性和确定引物，再加上在多克隆位点区右边界添加的一个eGFP基因，通过巢式PCR扩增技术获得靶标基因组DNA序列，提供一种T-DNA真菌插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的鉴定方法，该方法能够快速、准确、高效、稳定、普适性地扩增出T-DNA的右臂侧翼基因组DNA序列，大大提高鉴定基因的效率。

为实现上述目的，本发明设计了一种T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，以及二者之间依次的多克隆位点MCS和eGFP基因，该T-DNA具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

本发明还设计了一种载体，含有上述的T-DNA；该载体可通过以下步骤构建：

(1) 以真菌trpC启动子的潮霉素基因DNA序列代替植物pCAMBIA1300双元转化载体中T-DNA左臂区中CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列；

(2)  在T-DNA多克隆位点右边添加一段eGFP基因。

对于上述的载体构建方法，所述步骤（1）采用如下具体方法:

①pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造，即pCAMBIA1300双元转化载体限制性内切酶HpaI酶切，去除T-DNA左臂区CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得T-DNA左臂区无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段；

②再以含有真菌潮霉素基因的pCB1004载体为模板，采用引物对HPH-F/HPH-R PCR扩增pCB1004载体的潮霉素基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HpaI酶切回收潮霉素克隆DNA片段；所述HPH-F引物序列为：HpaI 5′-ACGTTAAC GGATCCGTCG ACGTTAACGT CGAG-3′；所述HPH-R引物序列为：HpaI 5′-AGGTTAAC GGGATCCGTC GACGTTAACT G-3′；

③最后，将潮霉素克隆DNA片段与上述无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造。

对于上述的载体构建方法，所述步骤（2）采用如下具体方法：

①先将上步改造后的pCAMBIA1300双元转化载体采用限制性内切酶HindIII酶切，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得去磷酸化的具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段；②再以含有真菌eGFP基因的pHBt2载体为模板，采用引物对eGFP-F/eGFP-R PCR扩增pHBt2载体的eGFP基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HindIII酶切回收含有HindIII粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；所述eGFP-F引物序列为：HindIII 5′-GAATTGGGTA CTCAAATTGG TTC-3′；所述eGFP-R引物序列为：HindIII 5′-ATCATCATGC AACATGCATG TAC-3′；

③最后，将eGFP基因克隆DNA片段与上述具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现T-DNA多克隆位点右臂区一段eGFP基因添加，即完成T-DNA区改造。

本发明还设计了一种上述T-DNA真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增引物，其上游引物对应于上述eGFP基因的左端序列，其下游引物对应于上述右臂DNA的左端序列，具体引物序列如下：

第一次扩增中引物对的核苷酸序列为：FxRB1：5′-GGCACTGGCC GTCGTTTTAC A-3′，FxLB1：5′-GAAATTGGGG GTTTCGGAAT GT-3′；

第二次扩增中引物对的核苷酸序列为：FxRB2：5′-ACGTCGTGAC TGGGAAAACC C-3′，FxLB2：5′-GGGAACCAAT TTGAGTACCC AA-3′。

本发明还设计了一种利用上述扩增引物对上述T-DNA的真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的鉴定方法，包括如下步骤：

（1）基因组DNA提取：取含有上述特异T-DNA插入的真菌体，采用CTAB法提取基因组DNA；

（2）酶切处理：选择9种与T-DNA多克隆位点相对应的限制性内切酶EcoRI、SacI、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、SphI、SalI和PstI，任选一种单酶切基因组DNA，然后，再在75℃条件下水浴20min，使限制性内切酶完全失去活性后备用；

（3）纯化处理：将所得酶切产物进行纯化；

（4）连接反应：将所得纯化产物进行连接反应，连接反应结束后，加入体积百分比为75%的乙醇200μL，混匀5min，再以相对离心力12000×g离心10 min后，去除上清液，去盐纯化DNA，干燥后加入20 μL去离子水溶解DNA备用；

（5）巢式PCR扩增及其产物鉴定：

①第一次PCR扩增：将上步所得连接产物作为模板DNA，进行第一次扩增反应，采用25μL反应体系：5μL的5×PCR buffer，1μL的1U/μL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75μL的10mmol/L dNTP，1μL的10μmol/L FxLB1，1μL的10μmol/L FxRB1，50～200ng的模板 DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s， 94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第一次PCR扩增完成后，产物4-10℃下保存；

 ② 第二次PCR扩增：将第一次所得扩增产物稀释2000倍后，作为模板DNA进行第二次扩增反应，采用25μL反应体系：5μL的5×PCR buffer，1μL的1U/μL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75μL的10mmol/L dNTP，1μL的10μmol/L FxLB2，1μL 的10μmol/L FxRB2，50～200ng的模板 DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s， 94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第二次PCR扩增完成后，产物4-10℃下保存;  

③PCR扩增产物鉴定：采用1×TAE电泳缓冲液、1wt%琼脂糖水平电泳鉴定第一、二次PCR反应产物；

（6）巢式PCR产物的克隆及其T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列分析：将所得第二次PCR扩增产物经电泳后切胶回收，克隆到pMD19-T 载体上并测序，所测得DNA序列经去除载体序列、T-DNA右边界序列后，即为T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列。

 对于上述鉴定方法，步骤（1）中所述CTAB法提取基因组DNA包括以下步骤：

①称取菌体0.5g，加液氮研磨成粉后，转移至盛放有700μL CTAB的2ml离心管中，65°C 保温1h，再加入700μL氯仿、异戊醇混合溶液，然后，先以300rpm振荡20min，再以10000rpm离心10min；所述氯仿、异戊醇混合溶液中氯仿与异戊醇体积比为24:1；

②离心后吸取上清液，再加入与其等体积的上述氯仿、异戊醇混合溶液，然后，先以300rpm震荡20min，再以12000rpm离心10min；

③离心后吸取上步所得上清液，再加入与其等体积异丙醇混合均匀，然后，先冰浴沉淀20min，再以12000rpm离心10min；

④离心后去除上清液，加入1000μL体积百分比为70%的乙醇水溶液，洗涤沉淀，再以12000rpm离心10min后，去除上清液，干燥沉淀，即得基因组DNA，加入80μL ddH₂O溶解备用。      

对于上述的鉴定方法，步骤（2）所述酶切采用50μL酶切反应体系：1U/μL restriction enzyme 1μL，10×buffer 5μL，基因组DNA 1-20μg，加去离子水补充至50μL；反应程序为：基因组DNA在37℃酶切4h。   

对于上述鉴定方法，步骤（3）中的纯化可采用Axyprep DNA清洁试剂盒纯化，包括以下步骤：

①在酶切反应液中，加入其3倍体积的Buffer PCR-A，混匀后转移到制备管中，再将制备管置于2ml离心管中，以相对离心力12000×g离心1min后，弃滤液；

②将制备管置回2ml离心管，加入700μL Buffer W2，再以相对离心力12000×g离心1 min后，弃滤液；

③再次将制备管置回2 ml离心管，加入400μL Buffer W2，再以相对离心力12000×g离心1 min；

④将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中，在制备管膜中央加入25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1 min后，再以相对离心力12000×g离心1 min洗脱DNA。   

对于上述的鉴定方法，步骤（4）所述连接反应采用30μL反应体系：纯化DNA 20μL，10×T4 Buffer 3μL，T4 ligase 1μL，ddH₂O 6μL；反应程序为：16℃条件下连接4h。    

对于上述的鉴定方法，步骤（5）所述的扩增反应中，反应前先混匀反应液，快速离心收集反应液至离心管底部，反应时采用热盖或者样品顶部添加石蜡油防止挥发。        

对于上述的鉴定方法，步骤（6）所述切胶回收采用Axyprep DNA凝胶回收试剂盒回收扩增产物，具体包括以下步骤：

①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎凝胶；称重凝胶，以1mg=1μL计，以所称重量数作为1个凝胶体积；

②在凝胶中加入3倍凝胶体积的buffer DE-A , 混合均匀后于75℃加热，每2-3min间断混合，直至凝胶块完全融化；

③再加入0.5倍buffer DE-A体积的buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，需要再加入1个凝胶体积的异丙醇；

④吸取上步所得混合液，转移到DNA制备管中，置于试剂盒内提供的2ml离心管中，以相对离心力12000×g离心1 min，弃滤液；

⑤将制备管回置2ml离心管，加入500μL buffer W1，以相对离心力12000×g离心30s，弃滤液；

⑥将制备管回置2ml离心管，加700μL buffer W2，以相对离心力12000×g离心30s，弃滤液；再重复本步骤一次；

⑦将制备管回置2ml离心管，以相对离心力12000×g离心1min；

⑧将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中，在制备管膜中央加25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1 min后，以相对离心力12000×g离心1 min，洗脱DNA。

对于上述的鉴定方法，步骤（6）所述克隆、测序包括以下步骤：

①在200μL离心管中配制5μL DNA溶液，其中pMD19-T载体1μL，PCR回收产物0.1～0.3 pmol，补充去离子水至5μL；

②加入5μL的solution I，16℃条件下反应4h；

③将所得连接反应液加入100μL JM109感受态细胞中，在冰中放置30min；然后，在42℃加热45s后，再在冰中放置1 min；

④加入890μL SOC培养基，37℃条件下振荡培养60min后，再在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB平板上培养，直至形成单菌落，计数白色和蓝色菌落；

⑤挑选白色菌落，采用M13 primers引物对，PCR扩增插入DNA片段，确认载体中插入片段的长度大小；

⑥PCR产物克隆鉴定正确后，进行测序；

⑦从测得DNA序列中去除pMD19-T载体序列和T-DNA右边界序列（CGTTACCCAA CTTAATCGCC TTGCAGCACA TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGGGCGAAT GCTAGAGCAG CTTGAGCTTG GATCAGATTG TCGTTTCCCG CCTTCAGTTT AAACTATCAG TGTTTGA）后，所得到的序列即为T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列。

本发明的积极有益效果：

1. 本发明设计了能特异性鉴定真菌T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的引物，得以建立本发明的巢式PCR分子检测技术；两对引物FxRB1/FxLB1和FxRB2/FxLB2具有嵌套性，FxRB1/FxLB1这对引物扩增产物大于FxRB2/FxLB2扩增产物，即FxRB1/FxLB1引物对居于外侧，FxRB2/FxLB2引物对居于内侧；因而，以FxRB1/FxLB1为引物的PCR产物可以作为FxRB2/FxLB2引物对的模板。

2. 现有传统的T-DNA中不含eGFP，因而其多克隆位点与T-DNA右臂区仅仅300bp，所设计的对扩增引物仅位于右臂区，引物过于集中，长期以来本领域研究者进行过无数次扩增实验均没有获得目的扩增产物，而本发明在T-DNA右臂区加入eGFP基因后，多克隆位点与T-DNA右臂区已经达2000bp，所设计的上游引物位于多克隆位点附近的eGFP区，下游引物位于T-DNA右臂区，大大提高了PCR扩增效率，即添加完成后形成一个有利于右臂基因组DNA序列获得的T-DNA。

3. 本发明方法克服了常规TALI-PCR方法以一边是特异性引物、一边是随机引物所引起的克隆产物的不确定性、反应程序复杂，重复性低，同时假阳性出现频率高的缺点；又克服了外加接头所导致的过高的经济花费，及其假阳性PCR产物的存在；还克服了选择酶切位点在T-DNA区外，相同的酶切位点在基因组中不确定性和分散性，相同的酶切位点间距离很远，超出PCR所用TaqE扩增DNA片段的能力，导致PCR的失败；

4. 本发明巢式PCR方法利用所具有的多克隆位点及其T-DNA右臂区域的DNA序列设计出的两对嵌套式特异性引物，能够快速、准确、高效、稳定、普适性地扩增出T-DNA右臂侧翼基因组DNA序列，大大提高了T-DNA标记基因鉴定的效率。

附图说明

图1 为本发明鉴定方法的操作流程图。

图2为T-DNA区多克隆位点、引物、左臂、右臂位置示意图，其中，LB为T-DNA左臂，MCS为多克隆位点区，eGFP为外源导入的eGFP基因；RB为T-DNA右臂，箭头1、2、3、4分别为引物FxLB2、FxLB1、FxRB1和FxRB2。

图3、４为本发明所设计的两对特异性引物在T-DNA区的位置图及其多克隆位点至右边界DNA序列，图４为图３的续图。其中，左侧空白区域为多克隆位点区（MCS）DNA; 中间浅色阴影区为eGFP基因DNA；右侧空白区域为T-DNA右臂DNA；深色阴影区（从前至后）依次对应引物FxLB2、FxLB1、FxRB1和FxRB2。

图５为本发明方法中Axyprep DNA清洁试剂盒及凝胶回收试剂盒操作流程图。

图６稻瘟病菌T-DNA插入突变体T-DNA右侧翼基因组DNA序列扩增产物电泳图：左为A46B1菌株采用EcoRI酶切处理后PCR产物电泳结果；右为A15A6菌株采用PstI酶切处理后PCR产物电泳结果（Marker、一轮PCR产物、二轮PCR产物）。

图７西瓜尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体T-DNA右侧翼基因组DNA序列扩增产物电泳图：左为T46B1菌株采用BamHI酶切处理后PCR产物电泳结果，右为 M15A6菌株采用KpnI酶切处理后PCR产物电泳结果（Marker、一轮PCR产物、二轮PCR产物）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本实施例设计一种T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，以及二者之间依次的多克隆位点MCS和eGFP基因，该T-DNA具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

实施例2

设计一种含实施例1所述T-DNA的载体,其构建方法包括以下步骤：

(1) 以真菌trpC启动子的潮霉素基因DNA序列代替植物pCAMBIA1300双元转化载体中T-DNA左臂区中CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列，具体为：首先，pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造，即pCAMBIA1300双元转化载体限制性内切酶HpaI酶切，去除T-DNA左臂区CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得T-DNA左臂区无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段；随之，以含有真菌潮霉素基因的pCB1004载体为模板，采用引物对HPH-F/HPH-R PCR扩增pCB1004载体的潮霉素基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HpaI酶切回收潮霉素克隆DNA片段；最后，将潮霉素克隆DNA片段与上述无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造；真菌启动子的潮霉素基因序列如SEQ ID NO.10所示，其中序列1~385为TrpC启动子，序列386~1408为潮霉素编码区序列，序列1409~1474为终止子区。

(2)  在T-DNA多克隆位点右边添加一段eGFP基因（如SEQ ID NO.11所示），具体为：首先，将上步改造后的pCAMBIA1300双元转化载体采用限制性内切酶HindIII酶切，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得去磷酸化的具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段； 随之，以含有真菌eGFP基因的pHBt2载体为模板，采用引物对eGFP-F/eGFP-R PCR扩增pHBt2载体的eGFP基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HindIII酶切回收含有HindIII粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；最后，将eGFP基因克隆DNA片段与上述具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现T-DNA多克隆位点右臂区一段eGFP基因添加，即完成T-DNA区改造。

实施例3

本实施例设计一种实施例1所述T-DNA真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增引物，其上游引物对应于所述eGFP基因的左端序列，其下游引物对应于所述右臂DNA的左端序列，具体引物序列如下：

第一次扩增中引物对的核苷酸序列为：FxRB1：5′-GGCACTGGCC GTCGTTTTAC A-3′，FxLB1：5′-GAAATTGGGG GTTTCGGAAT GT-3′；

第二次扩增中引物对的核苷酸序列为：FxRB2：5′-ACGTCGTGAC TGGGAAAACC C-3′，FxLB2：5′-GGGAACCAAT TTGAGTACCC AA-3′。

实施例4

利用实施例2所述引物对实施例1所述T-DNA的稻瘟病菌插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的进行鉴定，包括如下步骤：

（1）基因组DNA提取：取含有特异T-DNA插入的稻瘟病菌A46B1菌株，采用CTAB法提取基因组DNA；

①称取稻瘟病菌菌体0.5g，加液氮研磨成粉后，转移至盛放有700μL CTAB的2ml离心管中，65°C 保温1h，再加入700μL氯仿、异戊醇混合溶液，然后，先以300rpm振荡20min，再以10000rpm离心10min；所述氯仿、异戊醇混合溶液中氯仿与异戊醇体积比为24:1；

②离心后吸取上清液，再加入与其等体积的上述氯仿、异戊醇混合溶液，然后，先以300rpm震荡20min，再以12000rpm离心10min；

③离心后吸取上步所得上清液，再加入与其等体积异丙醇混合均匀，然后，先冰浴沉淀20min，再以12000rpm离心10min；

④离心后去除上清液，加入1000μL体积百分比为70%的乙醇水溶液，洗涤沉淀，再以12000rpm离心10min后，去除上清液，干燥沉淀，即得基因组DNA，加入80μL ddH₂O溶解备用。      

（2）酶切处理：选择与T-DNA多克隆位点相对应的限制性内切酶EcoRI单酶切基因组DNA，然后，再在75℃条件下水浴20min，使限制性内切酶完全失去活性后备用；所述酶切采用50μL酶切反应体系：1U/μL restriction enzyme 1μL，10×buffer 5μL，基因组DNA 1-20μg，加去离子水补充至50μL；反应程序为：基因组DNA在37℃酶切4h。   

（3）纯化处理：将所得酶切产物进行纯化，采用Axyprep DNA清洁试剂盒纯化，包括以下步骤：

①在酶切反应液中，加入其3倍体积的Buffer PCR-A，混匀后转移到制备管中，再将制备管置于2ml离心管中，以相对离心力12000×g离心1min后，弃滤液；

②将制备管置回2ml离心管，加入700μL Buffer W2，再以相对离心力12000×g离心1 min后，弃滤液；

③再次将制备管置回2 ml离心管，加入400μL Buffer W2，再以相对离心力12000×g离心1 min；

④将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中，在制备管膜中央加入25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1 min后，再以相对离心力12000×g离心1 min洗脱DNA。   

（4）连接反应：将所得纯化产物进行连接反应，连接反应结束后，加入体积百分比为75%的乙醇200μL，混匀5min，再以相对离心力12000×g离心10 min后，去除上清液，去盐纯化DNA，干燥后加入20 μL去离子水溶解DNA备用；所述连接反应采用30μL反应体系：纯化DNA 20μL，10×T4 Buffer 3μL，T4 ligase 1μL，ddH₂O 6μL；反应程序为：16℃条件下连接4h。    

（5）巢式PCR扩增及其产物鉴定：        

①第一次PCR扩增：将上步所得连接产物作为模板DNA，进行第一次扩增反应，引物对核苷酸序列为：FxRB1：5′-GGCACTGGCCGTCGTTTTACA-3′，FxLB1：5′-GAAATTGGGGGTTTCGGAATGT-3′，采用25μL反应体系：5μL的5×PCR buffer，1μL的1U/μL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75μL的10mmol/L dNTP，1μL的10μmol/L FxLB1，1μL的10μmol/L FxRB1，50～200ng的模板 DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s， 94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第一次PCR扩增完成后，产物4-10℃下保存；

 ② 第二次PCR扩增：将第一次所得扩增产物稀释2000倍后，作为模板DNA进行第二次扩增反应，引物对核苷酸序列为：FxRB2：5′-ACGTCGTGACTGGGAAAACCC-3′，FxLB2：5′-GGGAACCAATTTGAGTA -CCCAA-3′，采用25μL反应体系：5μL的5×PCR buffer，1μL的1U/μL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75μL的10mmol/L dNTP，1μL的10μmol/L FxLB2，1μL 的10μmol/L FxRB2，50～200ng的模板 DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s， 94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第二次PCR扩增完成后，产物4-10℃下保存;  

扩增反应前先混匀反应液，快速离心收集反应液至离心管底部，反应时可采用热盖或者样品顶部添加石蜡油防止挥发；

③PCR扩增产物鉴定：采用1×TAE电泳缓冲液、1wt%琼脂糖水平电泳鉴定第一、二次PCR反应产物，电泳结果见图６；

（6）巢式PCR产物的克隆及其T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列分析：将所得第二次PCR扩增产物经电泳后切胶回收，克隆到pMD19-T 载体上并测序，所测得DNA序列经去除载体序列、T-DNA右边界序列后，即为T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列。

所述切胶回收采用Axyprep DNA凝胶回收试剂盒回收扩增产物，具体包括以下步骤：

①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎凝胶；称重凝胶，以1mg=1μL计，以所称重量数作为1个凝胶体积；

②在凝胶中加入3倍凝胶体积的buffer DE-A , 混合均匀后于75℃加热，每2-3min间断混合，直至凝胶块完全融化；

③再加入0.5倍buffer DE-A体积的buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，需要再加入1个凝胶体积的异丙醇；

④吸取上步所得混合液，转移到DNA制备管中，置于试剂盒内提供的2ml离心管中，以相对离心力12000×g离心1 min，弃滤液；

⑤将制备管回置2ml离心管，加入500μL buffer W1，以相对离心力12000×g离心30s，弃滤液；

⑥将制备管回置2ml离心管，加700μL buffer W2，以相对离心力12000×g离心30s，弃滤液；再重复本步骤一次；

⑦将制备管回置2ml离心管，以相对离心力12000×g离心1min；

⑧将制备管置于洁净的1.5 ml离心管中，在制备管膜中央加25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1 min后，以相对离心力12000×g离心1 min，洗脱DNA。

所述克隆、测序包括以下步骤：

（1）在200μL离心管中配制5μL DNA溶液，其中pMD19-T载体1μL，PCR回收产物0.1～0.3 pmol，补充去离子水至5μL；

（2）加入5μL的solution I，16℃条件下反应4h；

（3）将所得连接反应液加入100μL JM109感受态细胞中，在冰中放置30min；然后，在42℃加热45s后，再在冰中放置1 min；

（4）加入890μL SOC培养基，37℃条件下振荡培养60min后，再在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB平板上培养，直至形成单菌落，计数白色和蓝色菌落；

（5）挑选白色菌落，采用M13 primers引物对，PCR扩增插入DNA片段，确认载体中插入片段的长度大小；

（6）PCR产物克隆鉴定正确后，进行测序；

（7）从测得DNA序列中去除pMD19-T载体序列和T-DNA右边界序列（CGTTACCCAA CTTAATCGCC TTGCAGCACA TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGGGCGAAT GCTAGAGCAG CTTGAGCTTG GATCAGATTG TCGTTTCCCG CCTTCAGTTT AAACTATCAG TGTTTGA）后，所得到的序列即为T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列。

实施例5

利用实施例3所述引物对实施例1所述T-DNA的稻瘟病菌插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的进行鉴定：提取含有特异T-DNA插入的稻瘟病菌A15A6菌株，并采用限制性内切酶PstI单酶切处理，其它步骤与实施例4相同。

实施例6

利用实施例3所述引物对实施例1所述T-DNA的西瓜尖孢镰刀菌插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的进行鉴定：提取含有特异T-DNA插入的西瓜尖孢镰刀菌T46B1菌株，并采用限制性内切酶BamHI单酶切处理，其它步骤与实施例4相同。

实施例7

利用实施例3所述引物对实施例1所述T-DNA的西瓜尖孢镰刀菌插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的进行鉴定：提取含有特异T-DNA插入的西瓜尖孢镰刀菌M15A6菌株，并采用限制性内切酶KpnI单酶切处理，其它步骤与实施例4相同。

本发明并不局限于上述具体实施方式，本领域技术人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或者类似的变化都应涵盖在本发明权利要求的范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 河南省农业科学院园艺研究所

<120>  T-DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法

<130>  /

<160>  11   

<170>  PatentIn version 3.2

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  1

ggatccgtcgacgttaacgt cgag                                            24

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  2

gggatccgtcgacgttaact g                                              21

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  3

gaattgggtactcaaattgg ttc                                             23

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  4

atcatcatgcaacatgcatg tac                                             23

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  5

ggcactggccgtcgttttac a                                               21

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  6

gaaattgggggtttcggaat gt                                              22

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  7

acgtcgtgactgggaaaacc c                                              21

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  8

gggaaccaatttgagtaccc aa                                             22

 

<210>  9

<211>  1694

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  9

gaattcgagctcggtacccg gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttgaa     60

ttgggtactcaaattggttc ccgcttgacg acattccgaa acccccaatt tcgcggcttc    120

gaatcgtggctacccttggc cgaggttgcg atttctctgc cgtatctgac aatgatccaa    180

ccggccggatgtgtgggagg acgcaaaggg tgtaattggg tctaggcgtg agctgcatgt    240

ccgatggcagaaaaagaact actaaaactc tgtgacgtcc tcagggctgg tagctattta    300

gcttgcccctccctcacccc acctagctca aacccaacaa aacacagcac cgaccacaaa    360

aatctgcctcttaccacctg ctcatcacct tttctcacat ataaagcagt gagctcagcc    420

cgatttccattcctcaattc aagtctatta actctctcaa agaggaaccc aatcttcaaa    480

atggtgagcaagggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac    540

ggcgacgtaaacggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    600

ggcaagctgaccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    660

ctcgtgaccaccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    720

cagcacgacttcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    780

ttcaaggacgacggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    840

gtgaaccgcatcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    900

aagctggagtacaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    960

ggcatcaaggtgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc   1020

gaccactaccagcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac   1080

tacctgagcacccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc   1140

ctgctggagttcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa   1200

atcattccactcaacattca ggctcctctg cgcacgtaaa gtgccaaagg caataccctg   1260

ctcggtggaatgccgccggg cttgtcgatt ttacgcacat atgcgcattc ttgacttgaa   1320

gcggaggagttcttcgttgc gggttacagt gttttaataa aagaatggtc aaatcaaact   1380

gctagatatacctgtcagac actctagttg ttgaccccta tactcttaat acatcagaca   1440

gtacatgcatgttgcatgat gataagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac   1500

tgggaaaaccctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc   1560

tggcgtaatagcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat   1620

ggcgaatgctagagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa   1680

ctatcagtgtttga                                               1694

 

<210>  10

<211>  1474

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  10

ggatccgtcgacgttaacgt cgagagaaga tgatattgaa ggagcatttt tgggcttggc     60

tggagctagtggaggtcaac acatcaatgc tattttggtt tagtcgtcca ggcggatcac    120

aaaatttgtgtcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc agcccacttg    180

taagcagtagcggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt    240

attatcatctgctgcttggt gcacgataac ttgtgcgttt gtcaagcaag gtaagtgaac    300

gacccggtcataccttctta agttcgccct tcctcccttt atttcagatt caatctgact    360

tacctattctacccaagcct cgatcatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga    420

gaagtttctgatcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga    480

agaatctcgtgctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag    540

ctgcgccgatggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct    600

cccgattccggaagtgcttg acattgggga gttcacggag agcctgacct attgcatctc    660

ccgccgtgcacagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct    720

ggagccggtcgcggaggcca tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg    780

gttcggcccattcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg    840

cgcgattgctgatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc    900

gtccgtcgcgcaggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtcca    960

cctcgtgcacgcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc gcataacagc   1020

ggtcattgactggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt   1080

cttctggaggccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca   1140

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actctatcagagcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg   1260

cgacgcaatcgtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag   1320

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cagcactcgtccgagggcaa aggaatagag tagatgccga ccgaacaaga gctgatttcg   1440

agaacgcctcagccagttaa cgtcgacgga tccc                             1474

 

<210>  11

<211>  1406

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  11

gaattgggtactcaaattgg ttcccgcttg acgacattcc gaaaccccca atttcgcggc     60

ttcgaatcgtggctaccctt ggccgaggtt gcgatttctc tgccgtatct gacaatgatc    120

caaccggccggatgtgtggg aggacgcaaa gggtgtaatt gggtctaggc gtgagctgca    180

tgtccgatggcagaaaaaga actactaaaa ctctgtgacg tcctcagggc tggtagctat    240

ttagcttgcccctccctcac cccacctagc tcaaacccaa caaaacacag caccgaccac    300

aaaaatctgcctcttaccac ctgctcatca ccttttctca catataaagc agtgagctca    360

gcccgatttccattcctcaa ttcaagtcta ttaactctct caaagaggaa cccaatcttc    420

aaaatggtgagcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg    480

gacggcgacgtaaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc    540

tacggcaagctgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc    600

accctcgtgaccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg    660

aagcagcacgacttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc    720

ttcttcaaggacgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc    780

ctggtgaaccgcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg    840

cacaagctggagtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag    900

aacggcatcaaggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc    960

gccgaccactaccagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac   1020

cactacctgagcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg   1080

gtcctgctggagttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag   1140

taaatcattccactcaacat tcaggctcct ctgcgcacgt aaagtgccaa aggcaatacc   1200

ctgctcggtggaatgccgcc gggcttgtcg attttacgca catatgcgca ttcttgactt   1260

gaagcggaggagttcttcgt tgcgggttac agtgttttaa taaaagaatg gtcaaatcaa   1320

actgctagatatacctgtca gacactctag ttgttgaccc ctatactctt aatacatcag   1380

acagtacatgcatgttgcat gatgat                                  1406

 

Claims (10)

1.一种T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，其特征在于：在左、右臂DNA之间还依次包括多克隆位点MCS和eGFP基因，该T-DNA具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

2.一种载体，含有权利要求1所述的T-DNA。

3.一种权利要求2所述载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 以真菌trpC启动子的潮霉素基因DNA序列代替植物pCAMBIA1300双元转化载体中T-DNA左臂区中CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列；

(2)  在T-DNA多克隆位点右边添加一段eGFP基因。

4.根据权利要求3所述的载体构建方法，其特征在于：所述步骤（1）采用如下具体方法：

①pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造，即pCAMBIA1300双元转化载体限制性内切酶HpaI酶切，去除T-DNA左臂区CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得T-DNA左臂区无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段；

②再以含有真菌潮霉素基因的pCB1004载体为模板，采用引物对HPH-F/HPH-R PCR扩增pCB1004载体的潮霉素基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HpaI酶切回收潮霉素克隆DNA片段；所述HPH-F引物序列为：HpaI 5′-GGATCCGTCG ACGTTAACGT CGAG-3′；所述HPH-R引物序列为：HpaI 5′-GGGATCCGTC GACGTTAACT G-3′；

③最后，将潮霉素克隆DNA片段与上述无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造。

5.根据权利要求3所述的载体构建方法，其特征在于：所述步骤（2）采用如下具体方法：

①先将上步改造后的pCAMBIA1300双元转化载体采用限制性内切酶HindIII酶切，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得去磷酸化的具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段； 

②再以含有真菌eGFP基因的pHBt2载体为模板，采用引物对eGFP-F/eGFP-R PCR扩增pHBt2载体的eGFP基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HindIII酶切回收含有HindIII粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；所述eGFP-F引物序列为：5′-ACAAGCTT GAATTGGGTA CTCAAATTGG TTC-3′；所述eGFP-R引物序列为：5′-ACAAGCTT ATCATCATGC AACATGCATG TAC-3′；

③最后，将eGFP基因克隆DNA片段与上述具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现T-DNA多克隆位点右臂区一段eGFP基因添加，即完成T-DNA区改造。

6.一种权利要求1所述T-DNA的真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增引物，其特征在于：所述巢式PCR的上游引物对应于权利要求1所述eGFP基因的左端序列，所述巢式PCR的下游引物对应于权利要求1所述右臂DNA的左端序列，具体引物序列如下：

第一次扩增引物对的核苷酸序列为：FxRB1：5′-GGCACTGGCC GTCGTTTTAC A-3′，FxLB1：5′-GAAATTGGGG GTTTCGGAAT GT-3′；

第二次扩增引物对的核苷酸序列为：FxRB2：5′-ACGTCGTGAC TGGGAAAACC C-3′，FxLB2：5′-GGGAACCAAT TTGAGTACCC AA-3′。

7.一种利用权利要求6所述扩增引物对权利要求1所述T-DNA真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）基因组DNA提取：取含有权利要求1所述特异T-DNA插入的真菌体，采用CTAB法提取基因组DNA；

（2）酶切处理：选择9种与T-DNA多克隆位点相对应的限制性内切酶EcoRI、SacI、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、SphI、SalI和PstI，任选一种单酶切基因组DNA，然后，再在75℃条件下水浴20min，使限制性内切酶完全失去活性后备用；

（3）纯化处理：将所得酶切产物进行纯化处理；

（4）连接反应：将所得纯化产物进行连接反应，连接反应结束后，加入体积百分比为75%的乙醇200μL，混匀5min，再以相对离心力12000×g离心10 min后，去除上清液，去盐纯化DNA，干燥后加入20 μL去离子水溶解DNA备用；

（5）巢式PCR扩增及其产物鉴定：

①第一次PCR扩增：将上步所得连接产物作为模板DNA，进行第一次扩增反应，采用25μL反应体系：5μL的5×PCR buffer，1μL的1U/μL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75μL的10mmol/L dNTP，1μL的10μmol/L FxLB1，1μL的10μmol/L FxRB1，50～200ng的模板 DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s， 94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第一次PCR扩增完成后，产物4-10℃下保存；

 ② 第二次PCR扩增：将第一次所得扩增产物稀释2000倍后，作为模板DNA进行第二次扩增反应，采用25μL反应体系：5μL的5×PCR buffer，1μL的1U/μL LongAmp Taq DNA聚合酶，0.75μL的10mmol/L dNTP，1μL的10μmol/L FxLB2，1μL 的10μmol/L FxRB2，50～200ng的模板 DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s， 94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第二次PCR扩增完成后，产物4-10℃下保存;  

③PCR扩增产物鉴定：采用1×TAE电泳缓冲液、1%琼脂糖水平电泳鉴定第一、二次PCR反应产物；

（6）巢式PCR产物的克隆及其T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列分析：将所得第二次PCR扩增产物经电泳后切胶回收，克隆到pMD19-T 载体上并测序，所测得DNA序列经去除载体序列、T-DNA右边界序列后，即为T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列。

8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）所述酶切采用50μL酶切反应体系：1U/μL restriction enzyme 1μL，10×buffer 5μL，基因组DNA 1-20μg，加去离子水补充至50μL；反应程序为：基因组DNA在37℃酶切4h。

9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（4）所述连接反应采用30μL反应体系：纯化产物20μL，10×T4 Buffer 3μL，T4 ligase 1μL，ddH₂O 6μL；反应程序为：16℃条件下连接4h。

10.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（6）所述克隆、测序包括以下步骤：

①在200μL离心管中配制5μL DNA溶液，其中pMD19-T载体1μL，PCR回收产物0.1～0.3 pmol，补充去离子水至5μL；

②加入5μL的solution I，16℃条件下反应4h；

③将所得连接反应液加入100μL JM109感受态细胞中，在冰中放置30min；然后，在42℃加热45s后，再在冰中放置1 min；

④加入890μL SOC培养基，37℃条件下振荡培养60min后，再在含有X-Gal、IPTG、Amp⁺的LB平板上培养，直至形成单菌落，计数白色和蓝色菌落；

⑤挑选白色菌落，采用M13 primers引物对，PCR扩增插入DNA片段，确认载体中插入片段的长度大小；

⑥PCR产物克隆鉴定正确后，进行测序；

⑦从测得DNA序列中去除pMD19-T载体序列和T-DNA右边界序列后，所得到的序列即为T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列。