CN106119222A - 一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于体外同源重组的混合蛋白酶体系，包括基于该体系的体外同源重组无缝克隆试剂盒及其使用方法。本发明中混合蛋白酶体系可在37‑55℃下对目标片段(单片段及多片段)进行重组反应，与其它相同功能的酶或酶体系相比，本发明的混合蛋白酶体系在37‑55℃下具有较高的活性，从而提高了重组反应的特异性，可有效地避免突变的产生，且反应完成后无需进行冰浴即可直接进行转化实验，极大地提高了反应的特异性、准确性并且简化了实验操作。

Description

一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物、试剂盒及体外同源重组无缝克隆方法。
背景技术
在现代生物学研究中，克隆技术已成为实验室中一种必不可少的方法，无论是基因表达分析，还是合成生物学都有着广泛的应用，特别是针对将所需的DNA分子克隆到载体特定位置中。将目标DNA克隆至载体中的传统方法包括五个步骤：1)酶切以得到纯的线性化载体；2)通过聚合酶链反应得到目标DNA，其中扩增引物在所扩增的目标DNA的5’端和3’端引入酶切载体所用的酶切识别位点；3)利用酶切载体所用的酶对已引入酶切位点的目标DNA进行酶切，并进行纯化；4)通过DNA连接酶对纯化的目标DNA片段及载体进行连接；5)对连接产物进行转化。从上述步骤方法可以看出，传统的克隆方法不仅受到载体酶切位点的限制同时其缺点还有费时、繁琐且克隆效率相对较低。
近几年来，基于同源重组的克隆方法得到了长足的发展，其优点在于简便、快速、高效。其基本步骤包括：1)酶切载体得到纯化后的载体片段2)设计一种与载体具有同源序列的引物对目标DNA进行PCR扩增；3)将带有同源序列的目标DNA与载体在一定条件下进行同源重组；4)将重组产物转化到感受态细胞中。
然而现有的同源重组技术还存在着一些不成熟的方面，如大多数同源重组方法要求在较低的温度(例如37℃)下进行，这就容易造成同源臂之间非特异性退火，因而造成实验的准确性的下降，同是多数产品的重组液保存于-20℃下出现冻结现象，反复冻融后必然造成酶活力的下降。
鉴于以上问题，如何开发一种用于高保真的基因克隆的酶体系及基于该酶体系的试剂盒及使用方法是目前急要解决的任务。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物、试剂盒及体外同源重组无缝克隆方法。其具体技术方案如下：
本发明提供了一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物，其特征在于，所述蛋白酶组合物包括外切酶T5、连接酶Taq和Pfu聚合酶。
进一步地，所述外切酶T5、所述连接酶Taq和所述Pfu聚合酶的含量比为1-3：40-60：50-150。
本发明还提供了一种用于体外同源重组的试剂盒，所述试剂盒包括上述蛋白酶组合物和反应缓冲液。
进一步地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油和聚乙二醇。
进一步地，所述反应缓冲液包括0.15-0.25mM的Tris-HCl、45-55mM的MgCl2、45-55mM的二硫苏糖醇、4.5-5.5mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、30％-50％的甘油、1％-3％的聚乙二醇(优选为PEG-8000)，所述缓冲液的pH为7.0-8.0(优选为7.5)。
本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1、制备线性化载体；
步骤2、通过在引物5’端引入所述线性化载体的末端同源序列进行PCR扩增，得到5’端和3’端分别带有与所述线性化载体的相应末端序列完全一致的目标片段；
步骤3、使用上述蛋白酶组合物，将步骤1中的所述线性化载体与步骤2中的所述目标片段进行重组反应，形成重组产物；
步骤4、将步骤3中的所述重组产物直接转化到感受态细胞中。
进一步地，所述步骤2中，所述末端同源序列长度为15-20bp，设计方式为：
正向扩增引物
5’-上游末端载体同源序列+目标片段特异性正向扩增序列-3’
反向扩增引物
5’-目标片段特异性正向扩增序列+下游末端载体同源序列-3’。
进一步地，所述步骤3中，所述重组反应在37-55℃下进行。
进一步地，所述步骤3中，所述目标片段与所述线性化载体的摩尔比为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1。
更进一步地，所述目标片段与所述线性化载体的摩尔比为1.5:1或2:1。
更进一步地，所述线性化载体的用量为30ng-200ng，所述重组反应的时间为15-60min，单片段为20min。
与现有技术相比本发明至少具有以下效益：
1)本发明中三种混合蛋白酶所配制的反应缓冲液在-20℃下不冻结，避免了反复冻融使得酶活力下降的缺点；
2)本发明的三种酶混合体系在37-55℃下仍具有较高的重组克隆效率，使得克隆结果准确，突变率低。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了本发明的克隆与组装原理图；
图2示出了本发明一个较佳实施例中转化后的克隆生长情况；
图3示出了本发明一个较佳实施例中的菌液PCR验证阳性克隆率结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。除非另有规定，否则本申请中所有的科技术语的含义具有本发明所涉及的行业普通技术人员所普遍理解的相同含义。
实施例
设计合适的PCR引物从pGEX-4T-1基因中调取长度为0.5kb的目标片段并克隆到pUC19载体上。
载体pUC19的制备：选取EcoR I和HindIII两个酶切位点对载体pUC19进行双酶切，并对酶切产物进行割胶纯化
目标片段的制备：设计引物进行目标片段的PCR扩增，引物设计要保证目标片段两端有至少15bp序列与载体的两端序列同源，以利于重组反应的进行。PCR每条引物长度在35-45bp，包括5’端与载体同源的15-25bp，及目标片段特异序列20-30bp。选用任意PCR酶(Taq酶或高保真酶)进行扩增，并对产物进行割胶纯化。
同源重组：反应体系组成包括蛋白酶组合物、反应缓冲液、线性化载体、目标片段和脱氧核糖核苷三磷酸(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。反应缓冲液包含：pH7.5的0.25MTris-HCl、50mM的MgCl2、50mM的二硫苏糖醇(DTT)、5mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、35％的甘油和2％的聚乙二醇8000(PEG-8000)。
将目标DNA片段与线性化载体按照2:1的摩尔比加到试管中进行反应，载体的用量在30-100ng，重组反应时间为20min。
引物：
上游引物：AAAACGACGGCCAGTGAATTC ACTGGCTCAAATGTAGAA
下游引物：GACCATGATTACGCCAAGCTT CTGGCGAGTCCCTATTGT
序列：
ACTGGCTCAAATGTAGAAGACAGAAGTAGCTCAGGGTCCTGGGGGAATGGAGGACATCCAAGCCCGTCCAGGAACTATGGAGATGGGACTCCCTATGACCACATGACCAGCAGGGACCTTGGGTCACATGACAATCTCTCTCCACCTTTTGTCAATTCCAGAATACAAAGTAAAACAGAAAGGGGCTCATACTCATCTTATGGGAGAGAATCAAACTTACAGGGTTGCCACCAGCAGAGTCTCCTTGGAGGTGACATGGATATGGGCAACCCAGGAACCCTTTCGCCCACCAAACCTGGTTCCCAGTACTATCAGTATTCTAGCAATAATCCCCGAAGGAGGCCTCTTCACAGTAGTGCCATGGAGGTACAGACAAAGAAAGTTCGAAAAGTTCCTCCAGGTTTGCCATCTTCAGTCTATGCTCCATCAGCAAGCACTGCCGACTACAATAGGGACTCGCCAG
反应体系如下：
混匀后放置于PCR仪中，50℃20min，结束后只需冷却至室温即可进行感受态细胞转化实验，剩余产物放于-20℃下保存待用。
转化：从-80℃冰箱中取出TOP10感受态细胞，体积约为100ul，冰上融化，将4ul重组液加入到感受态细胞中，冰上放置30min，然后42℃下45s，接着冰上放置2min；加入450ul不含抗生素的LB或SOC，37℃,220rpm下震荡培养50min，然后离心弃去约450ul上清液，将剩余约100ul菌液混匀后均匀涂板于含有抗生素的LB板上，37℃烘箱中过夜。第二日观察板上菌落并计数，挑10个菌落进行菌液PCR验证。
图2及图3分别显示了克隆菌落数及菌液PCR结果，表明其克隆率及阳性率均较高。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物，其特征在于，所述蛋白酶组合物包括外切酶T5、连接酶Taq和Pfu聚合酶。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶组合物，其特征在于，所述外切酶T5、所述连接酶Taq和所述Pfu聚合酶的含量比为1-3：40-60：50-150。
3.一种用于体外同源重组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1所述的蛋白酶组合物和反应缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油和聚乙二醇。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括0.15-0.25mM的Tris-HCl、45-55mM的MgCl2、45-55mM的二硫苏糖醇、4.5-5.5mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、30％-50％的甘油、1％-3％的聚乙二醇，所述缓冲液的pH为7.0-8.0。
6.一种体外同源重组无缝克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、制备线性化载体；
步骤2、通过在引物5’端引入所述线性化载体的末端同源序列进行PCR扩增，得到5’端和3’端分别带有与所述线性化载体的相应末端序列完全一致的目标片段；
步骤3、使用根据权利要求1所述的蛋白酶组合物，将步骤1中的所述线性化载体与步骤2中的所述目标片段进行重组反应，形成重组产物；
步骤4、将步骤3中的所述重组产物直接转化到感受态细胞中。
7.根据权利要求6所述的体外同源重组无缝克隆方法，其特征在于，所述步骤2中，所述末端同源序列长度为15-20bp，设计方式为：
正向扩增引物
5’-上游末端载体同源序列+目标片段特异性正向扩增序列-3’
反向扩增引物
5’-目标片段特异性正向扩增序列+下游末端载体同源序列-3’。
8.根据权利要求6所述的体外同源重组无缝克隆方法，其特征在于，所述步骤3中，所述重组反应在37-55℃下进行。
9.根据权利要求6所述的体外同源重组无缝克隆方法，其特征在于，所述步骤3中，所述目标片段与所述线性化载体的摩尔比为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1。
10.根据权利要求9所述的体外同源重组无缝克隆方法，其特征在于，所述目标片段与所述线性化载体的摩尔比为1.5:1或2:1。
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