CN109593763A - 一种FnCpf1介导的体外DNA编辑试剂盒 - Google Patents

一种FnCpf1介导的体外DNA编辑试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种FnCpf1或其突变体介导的体外DNA编辑试剂盒。本发明将crRNA的转录，酶切连接反应结合在同一反应混合物中，一步实现载体和目的片段的组装。而且获得了具有更广PAM识别范围的FnCpf1突变体，可以识别PAM为60/64(PAM‑NNN)选择可以用于该编辑方案的包括YN,TAA,TAC,TGC,CAA，将FnCpf1的识别范围扩大4倍。由于Cpf1的优势，本发明方法只需要有一种消化酶可以取代目前的各种类型的限制性内切酶并且几乎没有序列依赖性，同时酶切和连接反应一步进行。提供了一个广泛DNA靶向范围的CRISPR体外编辑系统,并可以作为一个有效的一步反应的无缝编辑工具。

Description

一种FnCpf1介导的体外DNA编辑试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种FnCpf1介导的体外DNA编辑试剂盒。
背景技术
二型限制限制性内切酶(RE)的发现促进了DNA重组技术的发展与应用。随后,合成生物学的飞速发展触发了对灵活多用的体外DNA组装/编辑策略的需求。体外DNA组装/编辑方法可分为两类:酶切连接和同源序列引导的同源重组。目前,最常用的酶切连接主要包括传统的基于限制性内切酶的酶切连接和Golden Gate组装(Carola,Romy et al.2008,Engler,Gruetzner et al.2009)。Golden Gate是基于IIS的限制性内切酶的一步克隆方法，并已优化用于多片段DNA的按序组装(Werner,Engler et al.2012)。但是，对于既定的DNA序列，IIS内切酶识别位点分布的不确定性和其存在数量的有限性，其编辑会受到限制。对于基于同源重组的体外编辑方法而言，例如Gibson组装(Gibson,Benders et al.2008,Gibson and Al 2009)，片段数的增加或者片段中高GC序列的出现，编辑效率均会受到影响而下降。另外，由于其序列依赖性，我们无法实现对于高相似序列的重复编辑，例如将同一个启动子重复引入至目标基因的不同位置。这些编辑方法中存在的限制也强调了新方法开发的需求性和重要性。
CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)系统自被开发以来，发展迅速并广泛应用于各种有机体的基因编辑(Sander and Joung 2014,Bayat,Modarressi et al.2018,Ferreira,David et al.2018,Hille,Richter et al.2018)。就体外编辑而言，以来自于化脓链球菌的CRISPR/Cas9为例，该系统被设计和优化-用于辅助体外的分子克隆(Jiang,Zhao et al.2015,Liu,Tao et al.2015,Kang,Charlop-Powers et al.2016,Wang,Li etal.2017)，例如CATCH(Cas9-Assisted Targeting of CHromosome),ICE(In vitroCRISPR/Cas9-mediated Editing)(Liu,Tao et al.2015)和exoCET(exonucleaseCombined with RecET recombination)(Wang,Li et al.2017)。以上方法均利用同源重组的方法将cas9剪切产生的平末端与目标载体相连，所以对于序列高相似性的DNA片段的编辑往往会受到一定的局限。2015年，张锋等发现并鉴定了一种新的第二类V型的系统CRISPR-Cpf1(Zetsche,Gootenberg et al.2015)，随后研究者发现并证明了其在多种有机体中的应用潜能和价值(Chen,Ding et al.2017,Xu,Lowder et al.2017,Yu,Qian etal.2017)。相比于cas9的体外编辑，Cpf1具有以下优势：1)Cpf1剪切双链DNA产生特定长度粘性末端；2)Cpf1的引导不需要反向作用的RNA(tracRNA),所以引导crRNA的长度更短(～42bp)；3)Cpf1可以自己加工crRNA簇形成单个成熟的crRNA,使其易于开发用于多基因编辑。因此，基于Cpf1的体外编辑方法可以为Cas9的应用提供另一种选择性。
在众多已经鉴定的Cpf1蛋白中，来源于Francisella novicida的FnCpf1具有一个明显的优势,即识别的PAM较短(3bp),并且当间歇序列的长度为23bp时，特异性的剪切PAM远端的第18个碱基和互补链的第23碱基，产生5bp的粘性末端。由于Cpf1的剪切由crRNA(识别的间歇区通常为23bp)介导,相同的DNA序列出现的概率大大减少，因此很好的规避了识别位点非理想带来的限制。
综上，基于FnCpf1的体外DNA编辑方法可以解决很多现有技术上的缺陷。目前，研究者已成功开发以FnCpf1作为剪切酶的C-brick组装试剂盒和较大DNA编辑的CCTL方法。(Li,Zhao et al.2016,Lei,Li et al.2017)。但是，酶切连接相互的独立操作不仅需要进行DNA片段的纯化，也需要额外的进行体外RNA的转录回收，这些操作均使得操作变得复杂耗时。另外，FnCpf1识别范围限定于TTN也一定程度限制了其灵活应用。
发明内容
为了解决这些问题，我们开发了一种方法iCOPA(improved Cpf1-assisted OnePot Assembly)。
本发明提供了一种基于CRISPR/Cpf1系统的体外DNA编辑试剂盒，它含有如下组分：
DNA片段1；、DNA片段；RNA，或者CrRNA模板DNA与T7 RNA聚合酶；
其中：DNA片段1由a、b、c三段串联组成，a、c段分别为CrRNA的识别切割区；b段为待拼接的核酸序列1；
CrRNA的识别切割区为PAM位点和长度为23bp的任意序列连接而成；
DNA片段2由d、e、f三段串联组成，其中，e段为待拼接的核酸序列2，d、f段分别为CrRNA的识别切割区，d、f剪切后的末端分别与a、c互补；
CrRNA模板DNA：由T7启动子、DR、spacer序列组成，DR为19或36nt，spacer序列长度为23nt。
其中，DNA片段1、2均可以是环状质粒或线性DNA；
T7启动子序列：GAAATTAATACGACTCACTATAGG；
19nt的DR序列：AATTTCTACTGTTGTAGAT；
36nt的DR序列：GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGAT；
CrRNA模板DNA的条数为1条以上，spacer序列分别与a、c、d、f的23nt长度识别区一致。
其中，它还含有T7 RNA聚合酶转录相关试剂，所述相关试剂包含转录buffer和NTP(A+U+C+G)。
其中，转录buffer包含下述组分：100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、30mMDTT、2mM亚精胺、10％二甲亚砜。
其中，所述T7 RNA聚合酶及转录相关试剂来源于基于T7 RNA聚合酶的体外高效转录试剂盒。
其中，它还含有Cpf1酶、RNase抑制剂、T4DNA连接酶；
优选地，所述Cpf1酶为野生型FnCpf1或氨基酸序列为SEQ ID NO：2或3所示的Cpf1突变体。
本发明还提供了上述试剂盒在基因编辑中的用途。
其中，所述基因编辑包含基因敲除、基因突变、靶向基因激活/抑制、DNA连接、DNA多片段组装、DNA片段插入、DNA片段替换、碱基替换。
本发明还提供了一种基于CRISPR/Cpf1系统的DNA连接方法，其特征在于：使用上述试剂盒进行连接，步骤如下：
(1)制备反应体系：每20μl体系中，包含如下组分：
优选地，DNA片段1为环状载体，DNA片段2为线性化的插入片段；
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，1h-8h
b、37℃，5-10min
c、16℃，5-10min
d、重复b和c步骤6-15次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min；
优选地，a步骤中为1h-4h。
其中，步骤如下：
(1)制备反应体系：每20μl体系中，包含如下组分：
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，1h或2h
b、37℃，10或5min
c、16℃，10或5min
d、重复b和c步骤6或12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
DR序列：Direct repeats序列，重复序列。
所述T7 RNA聚合酶及转录相关试剂来源于基于T7 RNA聚合酶的体外高效转录试剂盒。(NEB)
自制的基于T7 RNA聚合酶的体外高效转录试剂盒：
100mM Tris-HCl,pH8.0,
10mM MgCl2,
30mM DTT,
2mM Spermidine(亚精胺),
2.5mM(each)(NTP),
10％dimethylsμlphoxide(二甲亚砜),
T7 RNA polymerase，500-2000nM，优选500nM。
CrRNA模板DNA的条数为1条以上：
例如，2个片段连接需要1-4条，3个片段1-6条，N个片段为1-2N条；
具体地，2个片段连接需要1条的情况为：T7-DR-A-DR-B-DR-C-DR-D串联，需要4条的情况为：T7-DR-A、T7-DR-B、T7-DR-C、T7-DR-D。
SEQ ID NO：1：野生型FnCpf1的氨基酸序列1-1300：MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN*
SEQ ID NO：2：Cpf1突变体EP15的氨基酸序列
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFSGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLARGWDKNKEPNNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYRLLPGANKMLPRVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN*
SEQ ID NO：3：Cpf1突变体EP16的氨基酸序列
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFSGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLARGWDKNVEPNRTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYRLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN*
本发明将crRNA的转录，酶切连接反应结合在同一反应混合物中，一步实现载体和目的片段的组装。而且，本发明方法的编辑效率达到90％-100％。由于Cpf1的优势,iCOPA只需要有一种消化酶可以取代目前的各种类型的限制性内切酶并且几乎没有序列依赖性，同时酶切和连接反应一步进行。总之,这项工作提供了一个广泛DNA靶向范围的CRISPR体外编辑系统,并可以作为一个有效的一步反应的无缝编辑工具。
并且，本发明采用改进后的FnCpf1突变体时，对序列的识别范围广，是野生型FnCpf1识别范围的4倍，可以应用于CRISPR-Cpf1系统，进行DNA编辑。FnCpf1突变型克服了传统野生型FnCpf1识别范围TTN的限制，解决了野生型应用靶点范围窄的问题，应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1野生型FnCpf1及突变体蛋白EP15和EP16的电泳图谱
图2利用iCOPA在mRFP前插入pLac的测序结果图
图3 pUC19质粒上的LacZ基因替换为mRFP的示意图
图4 pUC19质粒上的LacZ基因替换为mRFP的实验设计示意图
图5 pUC19质粒上的LacZ替换为mRFP的测序结果图
图6 pUC19质粒上的氨苄抗性表达基因Amp替换为氯霉素抗性表达基因CM的示意图
图7 pUC19质粒上的amp抗性表达基因序列
图8 pUC19质粒上的Amp替换为CM的测序结果图
图9红景天苷表达质粒上的Aro7基因表达框删除示意图
图10 PCR验证Aro7表达框删除的结果图
图11 Aro7表达框删除的测序结果图
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1基于CRISPR/Cpf1系统的DNA连接方法
一、本发明iCOPA的试剂盒和方法
1.加样
其中，载体和线性化的插入片段上有引导Cpf1酶的CrRNA的识别切割区，CrRNA的识别切割区为PAM位点和长度为23bp的spacer连接而成；
CrRNA模板DNA：由T7启动子、DR、spacer序列组成；
DR为19或36nt，spacer序列长度为23nt；
T7启动子序列：GAAATTAATACGACTCACTATAGG；
19nt的DR序列：AATTTCTACTGTTGTAGAT；
36nt的DR序列：GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGAT；
CrRNA模板DNA的条数为1条以上，spacer序列分别与载体和插入片段上的23nt长度识别区一致。
转录混合液(可采用天根公司的)包含转录buffer和NTP(A+U+C+G)和T7RAN聚合酶，转录buffer包含下述组分：100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、30mMDTT、2mM亚精胺、10％二甲亚砜。
2.反应样品的反应程序
37℃，1h或2h
37℃，10或5min
16℃，10或5min
重复2和3步骤6或12次；
50℃，10min(final digestion)
65℃，10min(heat inactivation)
本发明试剂盒中，Cpf1酶可以是任意的Cpf1酶，优选本发明Cpf1突变体。其中，本发明Cpf1突变体FnCpf1蛋白按照如下方法制备：
1、制备突变质粒
1)FnCpf1(WP003040289)表达质粒来源于上海中科院。随后FnCpf1突变体的表达质粒以此为基础，进行定点突变PCR，拟突变制备突变体EP15和EP16，其中EP15的突变为：Lys180Ser、Asn607Arg、Asp616Asn、Lys660Arg和Lys671Arg突变，EP16的突变为：Lys180Ser、Asn607Arg、Lys613Val、Asp616Asn、Asn617Arg和Lys660Arg。
2)根据拟突变的氨基酸序列进行设计引物，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，所用引物见表1：
表1应用于FnCpf1突变体构建的引物
利用所得的引物进行定点突变PCR，模板为pET28TEV-FnCpf1质粒，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，3min；72℃，5min；4℃，保存；运行25个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214)，随后利用限制性内切酶Dpn I(NEB公司，货号R0176L)去除模板(37℃，2h)，将上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含50μg/mL卡那抗生素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。挑取平板中的单克隆，测序(北京擎科新业生物技术有限公司)，获得含有目标突变(目标片段如)的正确克隆。
2、野生型及突变体蛋白的表达纯化
蛋白纯化的步骤为：
1)将表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)；
2)挑单克隆加到3ml含有50ug/ml kanamycin的LB液体培养基中37℃，220rpm过夜培养16小时；
3)将过夜培养菌液按1：1000加到含有50ug/ml kanamycin的LB液体培养基中，在37℃,200rpm培养至OD600＝0.2左右，随后将培养箱降温至20℃,继续220rpm培养直到OD600达到0.6-0.8；
4)加入IPTG诱导剂，随后进行20℃,220rpm过夜培养；
5)将过夜菌液4℃,3800rpm离心10分钟收菌，弃上清，将装有菌块的离心瓶置于冰上，用30ml含有1mM DTT和1mM PMSF的预冷1xCpf1lysis buffer重悬菌块；
6)将重悬后的菌液转入50ml国产BD管中，置于冰上，随后使用sonicator进行超声破菌(参数设置为30％强度，开3秒，停6秒，超声15分钟)；
7)将细菌裂解液转入高速塑料离心管中，进行40C,18000rpm,30分钟高速离心；
8)高速离心期间，用5-10CV预冷的1x Cpf1washing buffer对镍柱进行平衡；
9)将7)中的上清液转入50ml BD管中，并加入8)中平衡过的镍胶与其混合，在层析柜中旋转混合一个小时使his-tag与镍结合；
10)将9)中的蛋白镍胶混合液重新转入空柱中，用250ml预冷的1xCpf1washingbuffer洗掉未与镍胶结合的杂蛋白，收集第一批穿出样本用于跑胶的阴性对照；
11)随后加入20ml预冷的1x Cpf1elution buffer洗脱目标蛋白,保留少量洗脱样本用于跑胶；
12)使用nanodrop测量蛋白浓度，然后按照1mg的TEV酶去切100mg的目标蛋白的比例加TEV酶进行过夜剪切；
13)使用millipore离心浓缩管将TEV酶过夜酶切的目标蛋白样本浓缩至0.2-0.5ml，随后加入50ml预冷的1XCpf1washing buffer稀释样本中的咪唑浓度；
14)样本浓缩期间，用5-10CV预冷的1X Cpf1washing buffer对镍柱进行平衡，为反挂镍做准备；
15)将13)和14)混合，按照9进行操作；
16)将15)中的样本重新转入空柱中，收集含有切掉his-tag的目标蛋白的穿出液，随后用1x elution buffer洗脱镍胶，洗脱液做为TEV酶的酶切效果的阴性对照；
17)测量16)中收集的穿出液，按照浓度进行进一步的浓缩；
18)进行12％SDG-PAGE检测蛋白纯度；
19)制备50％(v/v)甘油Cpf1蛋白储存样本，速冻并保存在-80℃中。
采用上述方法，制备得到野生型FnCpf1及突变体蛋白EP15和EP16，采用电泳等方式验证的确得到了野生型FnCpf1及突变体蛋白EP15和EP16(如图1)。
实施例2本发明基于CRISPR/Cpf1系统的DNA连接方法的筛选实验
一、优化Cpf1体外剪切的条件
野生型FnCpf1相比于剪切TTT,更倾向于剪切TTV PAM)。为了获得一个对应PAMTTN合适的反应条件平衡，以方便后续工具盒实验设计的普适性和高效性。我们首先选择了2组spacer(E-SP3:TTT PAM；E-SP15:TTA PAM)进行体外酶活测试。线性化的DNA TPAM1和TRed1分别用作对应于spacer E-SP3和spacer E-SP15的消化底物。剪切后的产物片段分别为527bp和707bp或者802bp和2233bp。
根据前述体系，进行如下筛选，确定CRISPR/Cpf1系统的各个参数：
1、测试crRNA浓度对于剪切效率的影响，包括10nM,100nM,500nM,1μM,2μM,3μM,4μM,and 5μM，其中最佳剪切crRNA浓度为1μM；
2、测试FnCpf1浓度(从100nM到2500nM),结果在消化时间3h时，500nM为最佳FnCpf1浓度.同时，测试了反应时间对于反应效率的影响，检测结果发现2h的反应时间为最佳反应条件；
2、考虑到反应参数之间的相互影响，对FnCpf1的浓度和反应时间进行了正交测试：根据实验结果，500nM FnCpf1反应2h更适合用于后续的反应系统构建；进一步测试了反应buffer对于效率的影响，包括水,BLK buffer,NEB buffer 2-4,CutSmart(NEB),T4Ligase buffer(NEB)和Taq ligase buffer(NEB)，结果显示Taq ligase buffer>CutSmart>NEB buffer 2>T4ligase buffer>NEB buffer 4，但是对于CutSmart,NEBbuffer 2,T4ligase buffer和NEB buffer 4之间的反应效率差异不大。
以下通过实验例的方式来证明本发明的有益效果：
实验例1采用本发明试剂盒进行编辑：基于FnCpf1进行片段的插入
实验目的：在荧光蛋白表达基因mRFP前加入启动子plac,从而激活荧光蛋白mRFP的表达；
1.选择原始载体上的spacer，同时设计可应用于启动子上对应的spacer
(表1-1)
表1-1应用于mRFP荧光蛋白激活的spacer
2.PCR获得crRNA制备底物模板DNA
根据T7转录试剂盒要求，设计对应的引物(表1-2)
表1-2应用于mRFP激活的crRNA制备底物模板DNA
利用所得的引物进行PCR富集，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，7s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),分别命名为T7-SP1，T7-SP2，T7-SP3，T7-SP4；采用体外转录，获得对应的RNA，命名为C-SP1，C-SP2，C-SP3，C-SP4；
3.PCR获得启动子片段
为了获得匹配实验设计的启动子片段，设计对应的引物(表1-3)
表1-3应用于mRFP荧光蛋白激活的启动子扩增引物
利用所得的引物进行PCR富集，采用模板为pSB1C3-lac所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，15s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),命名为pLac-mRFP。
4.iCOPA加样与反应
(2)进行如下反应程序：
b、37℃，10min
c、16℃，10min
d、重复b和c步骤12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
g、4℃，hold
5.反应液转化与验证
1)取10μl上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含100μg/mL氨苄抗生素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。
2)计数：分别计量荧光下，红色克隆和白色克隆的比例，整理如(表1-4)
表1-4 mRFP荧光蛋白激活的实验结果
采用WTCpf1与EP16的实验效率相差不大；故EP16可以替代WT应用于该实验。
3)测序估算正确率，整理如图2
选择颜色指示正确的克隆(每组实验7个样本)进行测序，结果说明正确率为100％，并且WT和突变体EP16的在正确率无差异。
实验例2采用本发明试剂盒进行编辑
实验目的：在荧光蛋白表达基因amilCP前加入启动子plac,从而激活荧光蛋白的表达；
1.选择原始载体上合适的spacer，同时设计可应用于启动子上对应的spacer(表2-1)
表2-1应用于amilCP荧光蛋白激活的spacer
2.PCR获得crRNA制备底物模板DNA
根据T7转录试剂盒要求，设计对应的引物(表2-2)
表2-2应用于amilCP激活的crRNA制备底物模板DNA
利用所得的引物进行PCR富集，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，7s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),分别命名为T7-SP5，T7-SP6，T7-SP7，T7-SP8；采用体外转录，获得对应的RNA，命名为C-SP5，C-SP6，C-SP7，C-SP8；
3.PCR获得启动子片段
为了获得匹配实验设计的启动子片段，设计对应的引物(表2-3)
表2-3应用于amilCP荧光蛋白激活的启动子扩增引物
利用所得的引物进行PCR富集，采用模板为pSB1C3-lac所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，15s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),命名为pLac-amilCP
4.iCOPA加样与反应
(2)进行如下反应程序：
b、37℃，10min
c、16℃，10min
d、重复b和c步骤12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
g、4℃，hold
5.反应液转化与验证
4)取10μl上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含100μg/mL氨苄抗生素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。
5)计数：分别计量蓝色克隆和白色克隆的比例，整理如(表2-4)
表2-4荧光蛋白amilCP激活的实验结果
采用WTCpf1与EP16的实验效率相差不大；故EP16可以替代WT应用于该实验。
实验例3采用本发明试剂盒进行编辑
实验目的：在荧光蛋白表达基因eYFP前加入启动子plac,从而激活荧光蛋白的表达；
1.选择原始载体上合适的spacer，同时设计可应用于启动子上对应的spacer(表3-1)
表3-1应用于eYFP荧光蛋白激活的spacer
2.PCR获得crRNA制备底物模板DNA
根据T7转录试剂盒要求，设计对应的引物(表3-2)
表3-2应用于eYFP激活的crRNA制备底物模板DNA
利用所得的引物进行PCR富集，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，7s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),分别命名为T7-SP9，T7-SP10，T7-SP11，T7-SP12；采用体外转录，获得对应的RNA，命名为C-SP9，C-SP10，C-SP11，C-SP12；
3.PCR获得启动子片段
为了获得匹配实验设计的启动子片段，设计对应的引物(表3-3)
表3-3应用于eYFP荧光蛋白激活的启动子扩增引物
利用所得的引物进行PCR富集，采用模板为pSB1C3-lac所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，15s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),命名为pLac-eYFP
4.iCOPA加样与反应
(2)进行如下反应程序：
b、37℃，10min
c、16℃，10min
d、重复b和c步骤12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
g、4℃，hold
5.反应液转化与验证
6)取10μl上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含100μg/mL氨苄抗生素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。
7)计数：分别计量黄色克隆和白色克隆的比例，整理如(表3-4)
表3-4 eYFP荧光蛋白激活的实验结果
采用WTCpf1与EP16的实验效率相差不大；故EP16可以替代WT应用于该实验。
实验例4采用本发明试剂盒进行基因替换
实验目的：将pUC19质粒上的LacZ基因替换为mRFP，如图3；
1.根据如图选择原始载体上合适的spacer以便剪切LacZ(图4)，同时设计可应用于mRFP上对应的spacer(表4-1)
表4-1应用于LacZ替换为mRFP的spacer
2.PCR获得crRNA制备底物模板DNA
根据T7转录试剂盒要求，设计对应的引物(表4-2)
表4-2应用于LacZ替换为mRFP的crRNA制备底物模板DNA
利用所得的引物进行PCR富集，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，7s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),
分别命名为T7-SP13，T7-SP14，T7-SP15，T7-SP16；
3.PCR获得启动子片段
为了获得匹配实验设计的启动子片段，设计对应的引物(表4-3)
表4-3应用于LacZ替换为mRFP的mRFP片段扩增引物
利用所得的引物进行PCR富集，采用模板为pSB1C3-lac所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，15s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),命名为F-mRFP
4.iCOPA加样与反应
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，2h
b、37℃，10min
c、16℃，10min
d、重复b和c步骤12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
g、4℃，hold
5.反应液转化与验证
1)取10μl上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含100μg/mL氨苄抗生素+IPTG+X-gal)平板中，置于37℃培养箱中过夜。
2)计数：分别计量蓝色克隆和红色色克隆的比例，整理如(表4-4)
表4-4 LacZ替换为mRFP的实验结果
该实验采用野生型的Cpf1无法实现一步反应的无缝克隆，因此采用突变体，体现了其应用灵活性和广泛性的优点；
3)测序估算正确率，其中一组的结果整理如图5。选择颜色指示正确的克隆(每组实验8个样本)进行测序，结果说明正确率为100％，并且WT和突变体EP16的在正确率无差异。
实验例5采用本发明试剂盒进行基因替换
实验目的：将pUC19质粒上的amp抗性表达基因替换为氯霉素CM抗性表达基因(如图6)；
1.根据如图7选择原始载体上合适的spacer以便剪切氨苄霉素抗性表达基因，同时设计可应用于替换氯霉素抗性表达基因上对应的spacer(表5-1)
表5-1应用于氨苄抗性表达基因替换为氯霉素抗性表达基因的spacer
2.PCR获得crRNA制备底物模板DNA
根据T7转录试剂盒要求，设计对应的引物(表5-2)
表5-2应用于Amp替换为CM的crRNA制备底物模板DNA
利用所得的引物进行PCR富集，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，7s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),
分别命名为T7-SP17，T7-SP18，T7-SP19，T7-SP20；
3.PCR获得启动子片段
为了获得匹配实验设计的启动子片段，设计对应的引物(表5-3)
表5-3应用于Amp替换为CM的CM扩增引物
利用所得的引物进行PCR富集，采用模板为pSB1C3-lac所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，15s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),命名为F-CM
4.iCOPA加样与反应
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，2h
b、37℃，10min
c、16℃，10min
d、重复b和c步骤12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
g、4℃，hold
5.反应液转化与验证
1)取10μl上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含100μg/mL氯霉素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。
2)测序估算效率和正确率，整理如(图8)
随机挑选克隆(三组实验，每组实验8个样本)进行测序，结果说明效率与正确率为100％，该实验无法用野生型的Cpf1进行实验，也证明了突变体的作用优势；
实验例6采用本发明试剂盒进行基因删除
实验目的：将红景天苷红景天苷表达质粒上的Aro7基因表达框进行删除，如图9。
1.根据如图选择原始载体上合适的spacer以便剪切Aro7表达框并且使剪切末端可进行互补(表6-1)
表6-1应用于Aro7表达框删除的spacer
2.PCR获得crRNA制备底物模板DNA
根据T7转录试剂盒要求，设计对应的引物(表6-2)
表6-2应用于Aro7表达框删除的crRNA制备底物模板DNA
利用所得的引物进行PCR富集，所用酶为Q5高保真酶(NEB公司，货号M0491)。具体配置体系如下：
反应程序为：98℃，2min；反应98℃，10s；退火，10s；60℃，7s；72℃，5min；4℃，保存；运行30个循环。
对PCR产物进行胶回收(北京天根生化科技有限公司，货号DP214),
分别命名为T7-SP21，T7-SP22；
3.iCOPA加样与反应
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，2h
b、37℃，10min
c、16℃，10min
d、重复b和c步骤12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
g、4℃，hold
4.反应液转化与验证
1)取10μl上述所得反应液转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中，涂布于LB(含100μg/mL氨苄抗生素)平板中，置于37℃培养箱中过夜。
PCR验证：三组实验平行分别挑取11组进行验证，PCR结果如图10。
2)总结效率如下表
表6-3 Aro7表达框删除的实验结果
该实验采用野生型的Cpf1无法实现一步反应的片段自定义删除，因此采用突变体，体现了其应用灵活性和广泛性的优点；
3)测序估算正确率，整理如图11。选择颜色指示正确的克隆(每组实验6个样本)进行测序，结果说明正确率为100％，应用突变体EP16进行实验，不影响剪切和连接的正确性。
综上，本发明试剂盒和方法可以实现准确编辑，且操作简便。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种FnCpf1介导的体外DNA编辑试剂盒
<130> GY026-2019P013442CC
<150> 201810393544.7
<151> 2018-04-27
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1300
<212> PRT
<213> Francisella novicida（野生型FnCpf1的氨基酸序）
<400> 1
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu
195 200 205
Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln
370 375 380
Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr
385 390 395 400
Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn
420 425 430
Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn
450 455 460
Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
465 470 475 480
Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys
485 490 495
Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys
500 505 510
Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp
515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
530 535 540
Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
545 550 555 560
Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser
580 585 590
Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly
595 600 605
Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys
610 615 620
Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
625 630 635 640
Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys
645 650 655
Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val
660 665 670
Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
675 680 685
Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln
690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp
725 730 735
Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu
740 745 750
Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn
755 760 765
Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr
770 775 780
Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg
785 790 795 800
Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn
805 810 815
Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr
820 825 830
Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala
835 840 845
Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu
850 855 860
Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
865 870 875 880
His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
885 890 895
Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
930 935 940
Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn
965 970 975
Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile
980 985 990
Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu
995 1000 1005
Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val
1010 1015 1020
Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu
1025 1030 1035
Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg
1040 1045 1050
Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly
1055 1060 1065
Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser
1070 1075 1080
Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys
1085 1090 1095
Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp
1100 1105 1110
Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe
1115 1120 1125
Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr
1130 1135 1140
Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp
1145 1150 1155
Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu
1160 1165 1170
Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly
1175 1180 1185
Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe
1190 1195 1200
Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg
1205 1210 1215
Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
1235 1240 1245
Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu
1265 1270 1275
Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu
1280 1285 1290
Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
1295 1300
<210> 2
<211> 1300
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP15的氨基酸序列
<400> 2
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Ser Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu
195 200 205
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210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
530 535 540
Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
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Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser
580 585 590
Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Arg Gly
595 600 605
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610 615 620
Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
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Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys
645 650 655
Ile Val Tyr Arg Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Arg Val
660 665 670
Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
675 680 685
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690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
865 870 875 880
His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
885 890 895
Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
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Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn
965 970 975
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Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val
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Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu
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Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp
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<211> 1300
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EP16的氨基酸序列
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Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
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Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
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Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
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Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Ser Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser
180 185 190
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210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
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Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
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Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
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Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr
385 390 395 400
Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
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Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
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Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
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Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys
485 490 495
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500 505 510
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1280 1285 1290
Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
1295 1300

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cpf1系统的体外DNA编辑试剂盒，其特征在于：它含有如下组分：
DNA片段1；DNA片段2；RNA，或者CrRNA模板DNA与T7RNA聚合酶；
其中：DNA片段1由a、b、c三段串联组成，a、c段分别为CrRNA的识别切割区；b段为待拼接的核酸序列1；
CrRNA的识别切割区为PAM位点和长度为23bp的任意序列连接而成；
DNA片段2由d、e、f三段串联组成，其中，e段为待拼接的核酸序列2，d、f段分别为CrRNA的识别切割区，d、f剪切后的末端分别与a、c互补；
CrRNA模板DNA：由T7启动子、DR、spacer序列组成，DR为19或36nt，spacer序列长度为23nt。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：DNA片段1、2均可以是环状质粒或线性DNA；
T7启动子序列：GAAATTAATACGACTCACTATAGG；
19nt的DR序列：AATTTCTACTGTTGTAGAT；
36nt的DR序列：GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGAT；
CrRNA模板DNA的条数为1条以上，spacer序列分别与a、c、d、f的23nt长度识别区一致。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还含有T7RNA聚合酶转录相关试剂，所述相关试剂包含转录buffer和NTP(A+U+C+G)。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：转录buffer包含下述组分：100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、30mMDTT、2mM亚精胺、10％二甲亚砜。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述T7RNA聚合酶及转录相关试剂来源于基于T7RNA聚合酶的体外高效转录试剂盒。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还含有Cpf1酶、RNase抑制剂、T4DNA连接酶；
优选地，所述Cpf1酶为野生型FnCpf1或氨基酸序列为SEQ ID NO：2或3所示的Cpf1突变体。
7.权利要求1-6任意一项所述的试剂盒在基因编辑中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因编辑包含基因敲除、基因突变、靶向基因激活/抑制、DNA连接、DNA多片段组装、DNA片段插入、DNA片段替换、碱基替换。
9.一种基于CRISPR/Cpf1系统的DNA连接方法，其特征在于：使用权利要求1-6任意一项所述的试剂盒进行连接，步骤如下：
(1)制备反应体系：每20μl体系中，包含如下组分：
DNA片段1 0.01-0.1pM
DNA片段2 与DNA片段1的摩尔比1：1-20：1
CrRNAs模板DNA 20-200ng/crRNA，或者RNA 1μM
转录混合液 6-12μl
Cpf1 500nM-1μM
RNase抑制剂 2U-10U
T4DNA连接酶 5U-40U
余量为RNase free H2O；
优选地，DNA片段1为环状载体，DNA片段2为线性化的插入片段；
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，1h-8h
b、37℃，5-10min
c、16℃，5-10min
d、重复b和c步骤6-15次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min；
优选地，a步骤中为1h-4h。
10.根据权利要求9所述的DNA连接方法，其特征在于：步骤如下：
(1)制备反应体系：每20μl体系中，包含如下组分：
(2)进行如下反应程序：
a、37℃，1h或2h
b、37℃，10或5min
c、16℃，10或5min
d、重复b和c步骤6或12次；
e、50℃，10min；
f、65℃，10min。
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