CN109762747A - 一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异养硝化‑好氧反硝化菌株的筛选方法，包括如下过程：取淤泥，放入筛选培养基中筛选纯化后，得到初步样品；将初步样品先进行富集培养，再进行初筛选得到纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M 2018289；本发明采用先富集培养再筛选的方法，能够大大提高菌株脱氮的能力，提高废水的净化效率和效果，在以氯化铵为唯一氮源的情况下，100mg/L的起始硝酸盐在24h内总氮去除率达到66.9％以上；采用初筛选方法，选出纯菌后，再通过复筛的方法，选出纯菌种中，脱氮效果最好的，从而得到最优菌株。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法。
背景技术
在人类活动下，我国湖泊水库等水资源均存在着污染问题，甚至于有一些不能作为供水资源。今年来的报道显示，全国地表水污染严重，且均不同程度地受到氮化物的污染。这些氮素污染物是造成湖泊水库水资源污染和富营养化的主要原因之一，因此水体去除氮元素对净化水资源具有重要意义。
传统的脱氮工艺如化学法和物理化学法，虽然可以较好的处理废水，但存在着若干缺陷，如造成二次污染、成本较高等。而生物降解法被认为是污水处理领域非常重要的过程。传统生物脱氮，虽然简单易行，但硝化自养菌却通常生长缓慢，适应环境能力差。对此，现代新型的生物脱氮技术和脱氮微生物为焦化废水的脱氮治理提供了新的选择。异养硝化菌氮源广泛，通常有机氮和无机氮都可以利用；生长迅速，环境适应能力强，反硝化作用不再仅仅局限于厌氧环境下，在有氧条件下也可以进行，这样以来，使得硝化作用与反硝化作用在同一环境同时进行成为了可能，大大提高脱氮效果，同时降低经济成本。
在现有的生物脱氮废水处理工艺中，大多发现脱氮细菌去除氨氮，但是细菌由于沉淀性较差容易流失，因而反应时间长，脱氮效率低；而真菌的菌丝有着良好的沉淀性能，容易滞留在反应器中，减少了菌体的流失，从而提高其脱氮效率。另外，在发酵过程中，某些丝状真菌会自然形成一种微生物颗粒，就是俗称的菌丝球。菌丝球有着诸多细菌所不具有的生物学特性，如良好的生物活性、较快的沉降速度、容易固液分离等优点。
针对现有传统技术的缺点，市场需要一种去除氨氮的真菌菌剂制备方法，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，具有同步好氧硝化、反硝化、脱氮的性能；采用先富集培养再筛选Pichiajadinii MA1菌株的方法，能够大大提高菌株脱氮的能力，提高废水的净化效率和效果。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，包括如下过程：
富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中，25-35℃、120-180r/min摇床充分振荡培养8-12h，得到菌悬液，再取菌悬液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h；
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，进行25-35℃、120-180r/min振荡培养12-48h 的训化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在25℃-35℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在25℃-35℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M2018289。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，
富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中，25-35℃、120-180r/min摇床充分振荡培养8-12h，得到第一次富集后的种子液，取第一次富集后的种子液放入富集培养基进行再次富集培养， 25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h，得到第二次富集后的种子液。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中培养，加入灭菌后的玻璃珠，振荡直至样品完全打散并与培养基充分混匀，得到第一次富集后的种子液，再取第一次富集后的种子液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h，得到第二次富集后的种子液。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，富集培养基为LB培养基。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，LB培养基组成有：蛋白胨10份，酵母粉5份，NaCl 10份，pH＝7。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，25-35℃、120-180r/min进行振荡培养12-48h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中，25-35℃、120-180r/min 振荡培养12-48h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在25℃-35℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在25℃-35℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M2018289。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，30℃、125r/min进行振荡培养24h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中，30℃、125r/min振荡培养24h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在30℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在30℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M2018289。
前述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，筛选培养基组成有：(NH4)2SO40.5 份，丁二酸钠2.17份,MgSO4·7H2O 0.05份,K2HPO4 0.2份,MnSO4·4H2O 0.01份,NaCl0.05 份,FeSO4·7H2O 0.01份pH＝7。
一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，包括如下过程：
富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中，25-35℃、120-180r/min摇床充分振荡培养8-12h，得到菌悬液，再取菌悬液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h；
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，进行训化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在25℃-35℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在25℃-35℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，此时完成初筛；
菌株复筛选，
将多个纯菌菌落，分别接种于葡萄糖培养基中，25-35℃、120-180r/min振荡培养12-48h 后测定培养基前后氮含量的变化，选取氮含量变化最大的菌落作为最优菌种；
在本次筛选中筛选得菌株MA1，经过送样测序后表明为纯菌株，且该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M 2018289，完成复筛。
前述一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，
葡萄糖培养基组成有：葡萄糖，氯化铵,K2HPO4，微量元素；pH＝7；C：N：P＝100:5:1。
本发明的有益之处在于：
本菌株具有同步好氧硝化、反硝化、脱氮的性能；
采用先富集培养再筛选Pichia jadinii MA1菌株的方法，能够大大提高菌株脱氮的能力，提高废水的净化效率和效果，在以氯化铵为唯一氮源的情况下，100mg/L的起始硝酸盐在24h 内总氮去除率达到66.9％以上；
采用初筛选方法，选出纯菌后，再通过复筛的方法，选出纯菌种中，脱氮效果最好的，从而得到最优菌株；
本菌株生长速率快、细胞产量高、需溶解氧浓度低、培养投资少，其脱氮工艺更简洁、经济有效。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，包括如下过程：
富集培养，
取10g淤泥，放入装有150mL无菌富集培养基的锥形瓶中中溶解，加入几粒灭菌后的玻璃珠，振荡直至样品完全打散并与培养基充分混匀，得到菌悬液，吸取10mL的的菌悬液移至150mL的富集培养基中，30℃、125r/min30℃、125r/min振荡培养12h，得到第一次富集后的种子液，取第一次富集后的10mL种子液移至新的LB培养基中，30℃、125r/min30℃、125r/min振荡培养12h，得到第二次富集后的种子液。作为一种实施例，富集培养基为LB 培养基。LB培养基组成有：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH＝7。
菌株初筛选，
取富集后的种子液10mL，加入到含有100mL无菌筛选培养基的锥形瓶中，30℃125r/min 进行振荡培养24h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中， 30℃、125r/min振荡培养24h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化，作为一种实施例，筛选培养基组成有：(NH4)2SO4 0.5g/L，丁二酸钠2.17g/L,MgSO4·7H2O0.05g/L, K2HPO4 0.2g/L,MnSO4·4H2O 0.01g/L,NaCl 0.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7；
对培养基菌液进行稀释，将训化后的150μL培养基菌液用灭菌后的玻璃珠在固体筛选培养基上进行涂布分离，在30℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在30℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，滴纳氏试剂观察透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株分类命名为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M 2018289；保藏日期：2018年05月18日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉，存活。
菌株复筛选，
将初筛出的多个纯菌菌落挑取单克隆进行富集培养后，分别以5％的接种量接于葡萄糖培养基中，30℃、125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化，选取氮含量变化最大的菌落作为最优菌种。作为一种实施例，葡萄糖培养基组成有：葡萄糖，氯化铵,K2HPO4，微量元素；pH＝7；C：N：P＝100:5:1。
为了证明先进行富集培养再筛选能先让所有淤泥中存在的菌种都能大量增殖或者提高活力，做如下实验进行验证：
实验分别挑取同一MA1单菌落样品接种于培养基再进行扩大培养，以及挑取MA1单菌落先接种于丰富培养基再进行基本培养和扩大培养，对比脱氮效果。
通过如下方法筛选菌株：
富集培养，
取10g淤泥，放入装有150mL无菌富集培养基的锥形瓶中中溶解，加入几粒灭菌后的玻璃珠，振荡直至样品完全打散并与培养基充分混匀，得到菌悬液，吸取10mL的的菌悬液移至 150mL的富集培养基中，30℃、125r/min振荡培养12h，得到第一次富集后的种子液，取第一次富集后的10mL种子液移至新的LB培养基中，30℃、125r/min振荡培养12h，得到第二次富集后的种子液。作为一种实施例，富集培养基为LB培养基。LB培养基组成有：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH＝7。
菌株初筛选，
取富集后的种子液10mL，加入到含有100mL无菌筛选培养基的锥形瓶中，30℃125r/min 进行振荡培养24h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中， 30℃、125r/min振荡培养24h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化，作为一种实施例，筛选培养基组成有：(NH4)2SO4 0.5g/L，丁二酸钠2.17g/L,MgSO4·7H2O0.05g/L, K2HPO4 0.2g/L,MnSO4·4H2O 0.01g/L,NaCl 0.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7；
对培养基菌液进行稀释，将训化后的150μL培养基菌液用灭菌后的玻璃珠在固体筛选培养基上进行涂布分离，在30℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在30℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，滴纳氏试剂观察透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，得到纯菌；
样品实施例1，选取一株即MA1单菌落，以1％接种量接种于100mL葡萄糖培养基中，30℃、 125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化。
样品实施例2，选取同一株作为MA1单菌落，以5％接种量接种于100mL葡萄糖培养基中， 30℃、125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化。
样品实施例3，选取同一株作为MA1单菌落，以10％接种量接种于100mL葡萄糖培养基中，30℃、125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化。
得到如下结果：
样品实施例1结果：根据国标HJ535-2009通过分光光度法测得：培养基初始氨氮为100ppm， 24h菌剂处理后培养基氨氮为29.9ppm，去除率为70.1％。
样品实施例2结果：根据国标HJ535-2009通过分光光度法测得：培养基初始氨氮为100ppm， 24h菌剂处理后培养基氨氮为27.8ppm，去除率为72.2％。
样品实施例3结果：根据国标HJ535-2009通过分光光度法测得：培养基初始氨氮为100ppm， 24h菌剂处理后培养基氨氮为24.6ppm，去除率为75.4％。
由以上三个实施例的结果表明，使用不同的接种比例接种，先放入丰富培养基中丰富后，再接种于筛选培养基培养24h后氨氮去除效果都在70％以上。
对比实验，采用与上一实验相同的接种比例，采用的筛选方法不同，看结果：
采用如下的筛选过程：
直接筛选菌株
取10g初步样品，放入到含有100mL无菌筛选培养基的锥形瓶中，30℃125r/min进行振荡培养24h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中，30℃、 125r/min振荡培养24h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化，作为一种实施例，筛选培养基组成有：(NH4)2SO4 0.5g/L，丁二酸钠2.17g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,K2HPO4 0.2g/L,MnSO4·4H2O 0.01g/L,NaCl 0.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH＝7；
对培养基菌液进行稀释，将训化后的150μL培养基菌液用灭菌后的玻璃珠在固体筛选培养基上进行涂布分离，在30℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在30℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，滴纳氏试剂观察透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，得到纯菌；
样品实施例1，选取一株作为MA1单菌落，以1％接种量接种于100mL葡萄糖培养基中， 30℃、125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化。
样品实施例2，选取同一株作为MA1单菌落，以5％接种量接种于100mL葡萄糖培养基中， 30℃、125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化。
样品实施例3，选取同一株作为MA1单菌落，以10％接种量接种于100mL葡萄糖培养基中，30℃、125r/min振荡培养24h并测定培养基前后氮含量的变化，得到如下结果：
对比实施例1结果：根据国标HJ535-2009通过分光光度法测得：培养基初始氨氮为100ppm， 24h菌剂处理后培养基氨氮为69.3ppm。去除率为30.7％。
对比实施例2结果：根据国标HJ535-2009通过分光光度法测得：培养基初始氨氮为100ppm， 24h菌剂处理后培养基氨氮为65.6ppm。去除率为34.4％。
对比实施例3结果：根据国标HJ535-2009通过分光光度法测得：培养基初始氨氮为100ppm， 24h菌剂处理后培养基氨氮为62.9ppm。去除率为37.1％。
由以上三个实施例的结果表明，使用不同的接种比例接种，直接接种于筛选培养基培养 24h后氨氮去除效果都低于40％。
由以上两个实验对比可知，先富集培养，在筛选菌株，能够大大提高菌株的脱氮能力。
本发明提供一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，具有同步好氧硝化、反硝化、脱氮的性能；采用先富集培养再筛选Pichia jadinii MA1菌株的方法，能够大大提高菌株脱氮的能力，提高废水的净化效率和效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下过程：
富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中，25-35℃、120-180r/min摇床充分振荡培养8-12h，得到菌悬液，再取菌悬液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h；
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，进行25-35℃、120-180r/min振荡培养12-48h的训化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在25℃-35℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在25℃-35℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M2018289。
2.根据权利要求1所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，
富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中，25-35℃、120-180r/min摇床充分振荡培养8-12h，得到第一次富集后的种子液，取第一次富集后的种子液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h，得到第二次富集后的种子液。
3.根据权利要求2所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中培养，加入灭菌后的玻璃珠，振荡直至样品完全打散并与培养基充分混匀，得到第一次富集后的种子液，再取第一次富集后的种子液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h，得到第二次富集后的种子液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，所述富集培养基为LB培养基。
5.根据权利要求4所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，所述LB培养基组成有：蛋白胨10份，酵母粉5份，NaCl 10份，pH＝7。
6.根据权利要求1所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，25-35℃、120-180r/min进行振荡培养12-48h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中，25-35℃、120-180r/min振荡培养12-48h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化；
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在25℃-35℃的培养箱中培养；挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在25℃-35℃的培养箱中培养；
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M2018289。
7.根据权利要求1所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，30℃、125r/min进行振荡培养24h，此为第一个驯化周期，取上一次的培养物移至第二期的驯化培养基中，30℃、125r/min振荡培养24h，此为第二个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在30℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在30℃的培养箱中培养，
将点板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M2018289。
8.根据权利要求1所述的一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，所述筛选培养基组成有：(NH4)2SO4 0.5份，丁二酸钠2.17份,MgSO4·7H2O 0.05份,K2HPO4 0.2份,MnSO4·4H2O 0.01份,NaCl 0.05份,FeSO4·7H2O 0.01份pH＝7。
9.一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下过程：
富集培养，
取淤泥样品，放入富集培养基中，25-35℃、120-180r/min摇床充分振荡培养8-12h，得到菌悬液，再取菌悬液放入富集培养基进行再次富集培养，25-35℃、120-180r/min振荡培养8-12h；
菌株初筛选，
取富集后的种子液，加入到筛选培养基中，进行训化，
将训化后的培养基菌液在固体筛选培养基上进行涂布分离，在25℃-35℃的培养箱中培养，
挑取培养基上的菌落在新的筛选培养基上进行点板，在25℃-35℃的培养箱中培养，
将电板后长出的菌落，在新的筛选培养基上划线分离，同时对点板后的固体平板上长出的菌落分别滴纳氏试剂，并观察每个菌落形成的透明圈大小，做好标记，
选择透明圈大的对应的菌落，重复在新的筛选培养基上划线分离，直到平板上的菌落无差异，即为纯菌，此时完成初筛；
菌株复筛选，
将多个纯菌菌落，分别接种于葡萄糖培养基中，25-35℃、120-180r/min振荡培养12-48h后测定培养基前后氮含量的变化，选取氮含量变化最大的菌落作为最优菌种；
在本次筛选中筛选得菌株MA1，经过送样测序后表明为纯菌株，且该菌株为杰丁毕赤酵母Pichia jadinii MA1，保藏号为CCTCC M 2018289，完成复筛。
10.根据权利要求9所述一种异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，
所述葡萄糖培养基组成有：葡萄糖，氯化铵,K2HPO4，微量元素；pH＝7；C：N：P＝100:5:1。
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