CN112481171A - 一种低温脱氮菌及其筛选方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于在冬季的农村含氨氮生活污水分散式处理设备中的低温脱氮菌及其筛选方法、应用，本发明通过富集驯化、高通量筛选和迭代培养出低温脱氮复合菌群，硝化效能最好，可用于在冬季的农村含氨氮生活污水分散式处理设备中。
Description
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，涉及一种脱氮菌，尤其涉及一种用于在冬季的农村含氨氮生活污水分散式处理设备中的低温脱氮菌及其筛选方法、应用。
背景技术
水是生命生存进化的基础，全球可供人类利用的水资源仅占全球总水量的十万分之七。然而，人类社会的快速发展，水环境的污染日趋严重。其中来源于生活污水、工业废水、养殖废水、垃圾渗滤液和农田氮肥等的高浓度水污染因子-氮引起水体富营养化，使水体中硝酸盐和亚硝酸盐浓度过高，人畜若长期饮用会引起中毒，而一些有毒藻类的生长与大量繁殖会排放大量毒素于水体中，导致水生动物的大量死亡，从而严重破坏水体的生态平衡。
生物脱氮技术是目前应用广泛且经济效益较高的脱氮方法，传统的生物脱氮由好氧自养硝化作用和厌氧异养反硝化作用共同完成，而近些年来异养硝化和好氧反硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，与传统生物脱氮相比，不仅可以使硝化和反硝化在同一反应器中完成，加快反应过程，减小反应器容积，缩短水力停留时间，降低运行成本，提高系统抗冲击能力，处理高浓度的含氮废水，还可以在反硝化过程中同步除磷。因而逐渐成为目前生物脱氮研究的热点。
然而，我国大多数地区的冬季污水进水温度普遍低于硝化及反硝化功能菌群的适宜生长温度，导致冬季低温条件下微生物的生长和代谢活性以及菌群数量均显著降低。已研究表明：当水温下降到15-7℃时，系统硝化效果会明显下降利用传统的活性污泥法为主的工艺技术的处理效能大幅下降，出水水质达标保障率极低，特别是对氮、磷的去除尤为困难。工程中常采用降低负荷、延长水力停留时间、保温等措施来使冬季的出水水质达标，但这些措施增加了运行成本，处理效果不稳定。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有生物脱氮技术对于低温条件下污水处理效率低与处理效果差的缺陷而提供一种用于在冬季的农村含氨氮生活污水分散式处理设备中的低温脱氮菌。
本发明第二个目的是为了提供该低温脱氮菌的筛选方法。
本发明第三个目的是为了提供该低温脱氮菌的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种低温脱氮菌，所述低温脱氮菌名称为假单胞菌Pseudomonas sp.LT-6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 2020502，保藏日期2020年9月14日。
作为本发明的一种优选方案，所述低温脱氮菌的菌落形态为30℃在LB平板培养12h，菌落呈光滑圆形，直径2～3mm，饱满隆起，菌落呈淡黄色，边缘整齐，光滑湿润有光泽，菌落随时间的延长而增大，若干天后直径＞4mm。
作为本发明的一种优选方案，所述低温脱氮菌含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
本发明另一个方面是提供了该低温脱氮菌的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
a.筛选分离：取活性污泥样品于无菌生理盐水中，制备菌悬液；吸取菌悬液移至驯化培养基中，振荡培养，为第一个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化；
b.低温脱氮验证：取步骤a驯化完成、培养的菌液，按梯度稀释法分别将样品稀释成 10-1～10-8的8种不同梯度的菌悬液，并用各自的固体选择培养基进行平板涂布，放入振荡器培养；从平板中挑取低温脱氮菌，在96孔板中培养后，进行验证，从96孔板中各取菌液至 NH4 +与NO2 -验证板中，加入氨氮，亚硝酸盐显色剂，观察颜色变化，选取优质菌株；
c.迭代低温培养：从96孔板中挑选显色明显的菌株，克隆混合后以氨氮为唯一氮源，进行低温迭代培养，定时期取样测定培养液中的氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，进一步筛选低温高效脱氮菌；
d.复筛：将上述初筛菌株的菌液接入含氯化铵的LB培养基中培养，测氨氮浓度，选取氨氮去除率最高的一株，将该低温菌接种至发酵培养基中进行扩培，得到低温脱氮菌。
作为本发明的一种优选方案，将筛选出的低温脱氮菌接入液体LB培养基，摇床培养后，将培养好的菌剂和培养基混合后，密封冷藏。
作为本发明的一种优选方案，所述培养基按下述比例配制：1L水中，蛋白胨8-12g，酵母粉2-7g，氯化钠5-15g，pH 7.2，118-125℃湿热灭菌25-35min。
作为本发明的一种优选方案，步骤a中所述驯化周期为2天。
本发明的第三方面，提供了低温脱氮菌的应用，上述低温脱氮菌在脱氮中的应用。
作为本发明的一种优选方案，上述低温脱氮菌在生活污水中的应用。
作为本发明的一种优选方案，取污水处理站的进水，将氨氮与总氮浓度均控制到50 mg/L-60mg/L，然后将低温脱氮菌菌剂按1％的量接入调配后的生活污水中。
本发明的菌株保藏信息如下：
菌株名称：假单胞菌Pseudomonas sp.LT-6；
保藏编号：CCTCCNO：M 2020502；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏日期：2020年9月14日。
保藏地址为中国武汉。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过富集驯化、高通量筛选和迭代培养出低温脱氮复合菌群，硝化效能最好，可用于在冬季的农村含氨氮生活污水分散式处理设备中。
附图说明
图1是实施例3中低温脱氮菌的生长曲线；
图2是实施例4中低温脱氮菌以氨氮为唯一氮源培养时氨氮的去除率；
图3是实施例4中低温脱氮菌以氨氮为唯一氮源培养时总氮的去除率；
图4是实施例4中低温脱氮菌在不同碳氮比条件下脱氮效果图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明中提供的低温脱氮菌：假单胞菌Pseudomonas sp.LT-6，其保藏编号：CCTCCNO：M 2020502；
进一步地，菌落形态为30℃在LB平板培养12h，菌落呈光滑圆形，直径2～3mm，饱满隆起，菌落呈淡黄色，边缘整齐，光滑湿润有光泽，菌落随时间的延长而增大，若干天后直径＞4mm。
实施例1
低温脱氮菌的分离、筛选和性能鉴定
(1)富集培养：从活性污泥中提取污泥样品，加入生理盐水制成菌悬液，取菌悬液加入驯化培养基中，振荡培养规定时间，为第一期培养；第二个驯化周期中的培养菌液移至第二期的驯化培养基中，振荡规定时间，为第二期培养，继续进行多次驯化；
(2)菌株96孔板筛选：取驯化完成的菌液，按梯度稀释法分别将样品稀释成不同梯度菌悬液，进行固体平板划线培养，得到纯种单菌落后，挑取96个菌落进行高通量96孔板筛选，振荡规定时间，加入氨氮、亚硝酸盐显色剂，挑选显色明显的菌株进行下一步试验；
(3)迭代低温培养：从96孔板中挑选显色明显的菌株共29株，克隆混合后以氨氮为唯一氮源，进行低温迭代培养，定时期取样测定培养液中的氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，进一步筛选低温高效脱氮菌；
(4)复筛与性能鉴定：
进一步，驯化培养基成分为1000mL水中，葡萄糖5g；NH4Cl 2g；K2HPO4 1g；KH2PO41g； MgSO4 0.2g，微量盐溶液1mL，pH 7.2，115℃、湿热灭菌20min；其中微量盐溶液：乙二胺四乙酸50g；ZnSO4 2.2g；CaCl2 5.5g；CuSO4·5H2O 1.57g；MnCl2·4H2O 5.06g；FeSO4·7H2O5g；CoCl2·6H2O 1.61g；蒸馏水1000mL；pH 7.0-7.2。
按10％(v/v)的量将上述初筛菌株的菌液接入上述培养基中，于10℃培养72h，测氨氮浓度，选取氨氮去除率最高的一株，将此低温菌接种至发酵培养基中进行扩培，得到低温菌剂。转入LB斜面2～8℃冷藏。
实施例2
低温脱氮菌株分子生物学鉴定
采用16Sr DNA分析，鉴定该低温脱氮菌为假单胞菌；学名Pseudomonas sp.。
测序结果SEQ ID NO.1：
ataacaaagctaccatgcagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatgc ctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggg gaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgat ccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggga atattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagt tgggaggaagggcagttacctaatacgtgattgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagca gccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttagttaagttggat gtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcaaaactgactgactagagtatggtagagggtggtggaatttcctg tgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtg cgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggagcctt gagctcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattga cgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatg aactttctagagatagattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagat gttgggttaagtcccgtaacgagcgcaccccttgtccttagttaccagaacgttatggtgggcactctaaggaactggcg gggacaaccggaagaaggggggatgacgtcaagcatc。
实施例3
生长曲线
保持生活污水中初始氨氮浓度50-60mg/L不变，调整污水中碳源浓度，使得C/N为4。将低温菌在LB培养基中活化培养24h，菌液以1％接种量接种于生活污水中，放置于10℃条件下搅拌培养并测其生长曲线，见图1所示。
由72h内低温菌生长曲线可知，OD600值在培养24h后达到最高值0.52，菌株KSND-3的指数生长期为0～24h，在24h～48h生长进入平稳期。
实施例4
低温条件下脱氮性能验证
取两组相同生活污水，第一组控制生活污水中氨氮浓度为50-60mg/L，不另外添加碳源；第二组控制生活污水中氨氮浓度为50-60mg/L，并添加葡萄糖控制COD为200mg/L。将低温菌在LB培养基中活化培养24h，菌液以1％接种量接种于两组生活污水中，放置于10℃条件下搅拌培养。
保持生活污水中初始氨氮浓度50-60mg/L不变，调整污水中碳源浓度，使得C/N分别为 2、3、4、5、8、12。将低温菌在LB培养基中活化培养24h，菌液以1％接种量接种于不同碳氮比的生活污水中，放置于10℃条件下搅拌培养。
参见图2与图3，低温菌脱氮实验结果显示，氨氮与总氮的降解趋势具有一致性，且只添加氮源实验组与添加氮源与碳源实验组脱氮效果相差不大。其中，氨氮最大降解效率为 43.62％，且24h后降解效率增加不明显。同样的，总氮降解效率最大降解率为43.70％，且在 24h后无明显增涨。
参见图4，在不同碳氮比条件下的氨氮与总氮去除效果趋势一致，在碳氮小于4时，低温菌脱氮效果偏低，且随着碳氮比的增加其脱氮效果逐渐升高，在碳氮比为5、8、12时的降解效果最好，氨氮去除率分别为53.30％，52.23％，51.23％；总氮去除率分别为53.36％、52.98％， 51.65％。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 浙江双良商达环保有限公司
<120> 一种低温脱氮菌及其筛选方法、应用
<141> 2020-12-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataacaaagc taccatgcag tcgagcggta gagagaagct tgcttctctt gagagcggcg 60
gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg gataacgttc ggaaacggac 120
gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag 180
atgagcctag gtcggattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatccgt 240
aactggtctg agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg 300
gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt 360
gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg aggaagggca gttacctaat 420
acgtgattgt tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc taactctgtg ccagcagccg 480
cggtaataca gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg 540
gttagttaag ttggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt caaaactgac 600
tgactagagt atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 660
aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca cctggactga tactgacact gaggtgcgaa 720
agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact 780
agccgttggg agccttgagc tcttagtggc gcagctaacg cattaagttg accgcctggg 840
gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat ccaatgaact 960
ttctagagat agattggtgc cttcgggaac attgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaccccttg tccttagtta 1080
ccagaacgtt atggtgggca ctctaaggaa ctggcgggga caaccggaag aaggggggat 1140
gacgtcaagc atc 1153
Claims (10)
1.一种低温脱氮菌，其特征在于，所述低温脱氮菌名称为假单胞菌Pseudomonassp.LT-6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 2020502，保藏日期2020年9月14日。
2.根据权利要求1所述的一种低温脱氮菌，其特征在于，所述低温脱氮菌的菌落形态为30℃在LB平板培养12h，菌落呈光滑圆形，直径2～3mm，饱满隆起，菌落呈淡黄色，边缘整齐，光滑湿润有光泽，菌落随时间的延长而增大，若干天后直径＞4mm。
3.根据权利要求1所述的一种低温脱氮菌，其特征在于，所述低温脱氮菌含有如SEQ IDNO.1所示的基因序列。
4.一种低温脱氮菌的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
a.筛选分离：取活性污泥样品于无菌生理盐水中，制备菌悬液；吸取菌悬液移至驯化培养基中，振荡培养，为第一个驯化周期，以此类推，进行多次的驯化；
b.低温脱氮验证：取步骤a驯化完成，经过培养的菌液，按梯度稀释法分别将菌液稀释成10-1～10-8的8种不同梯度的菌悬液，并用各自的固体选择培养基进行平板涂布，放入振荡器培养；从平板中挑取低温脱氮菌，在96孔板中培养后，进行验证，从96孔板中各取菌液至NH4 +与NO2 -验证板中，加入氨氮，亚硝酸盐显色剂，观察颜色变化，选取优质菌株；
c.迭代低温培养：从96孔板中挑选显色明显的菌株，克隆混合后以氨氮为唯一氮源，进行低温迭代培养，定时期取样测定培养液中的氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，进一步筛选低温高效脱氮菌；
d.复筛：将上述初筛菌株的菌液接入含氯化铵的LB培养基中培养，测氨氮浓度，选取氨氮去除率最高的一株，将该低温菌接种至发酵培养基中进行扩培，得到低温脱氮菌。
5.根据权利要求4所述的一种低温脱氮菌的筛选方法，其特征在于，将筛选出的低温脱氮菌接入液体LB培养基，摇床培养后，将培养好的菌剂和培养基混合后，密封冷藏。
6.根据权利要求4所述的一种低温脱氮菌的筛选方法，其特征在于，所述培养基包括：1L水中，蛋白胨8-12g，酵母粉2-7g，氯化钠5-15g，pH 7.2，118-125℃湿热灭菌25-35min。
7.根据权利要求4所述的一种低温脱氮菌的筛选方法，其特征在于，步骤a中所述驯化周期为2天。
8.一种低温脱氮菌的应用，其特征在于，权利要求1-3任一项所述的低温脱氮菌或权利要求4-7任一项筛选得到的低温脱氮菌在脱氮中的应用。
9.根据权利要求8所述的一种低温脱氮菌的应用，其特征在于，权利要求1-3任一项所述的低温脱氮菌或权利要求4-7任一项筛选得到的低温脱氮菌在生活污水中的应用。
10.根据权利要求8所述的一种低温脱氮菌的应用，其特征在于，取污水处理站的进水，将氨氮与总氮浓度均控制到50mg/L-60mg/L，然后将低温脱氮菌菌剂按1％的量接入调配后的生活污水中。
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2020
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