CN111302860A - 一种多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用，特种肥包括多粘芽孢杆菌菌粉；所述多粘芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2019116，命名为LTPP03，16srRNA序列如SEQ ID No.1所示；制备过程包括：称量、混合及包装的过程，该特种肥可以有效地防治柑橘溃疡病，降低该病的发病率，同时，可有效促进植物的生长。

Description

一种多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物肥技术领域，更具体地说是涉及一种多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用。

背景技术

柑橘溃疡病是由黄极毛杆菌所致的疾病，多发病于柑橘；该病危害柑橘叶片、枝梢和果实，苗木和幼树受害严重时造成落叶、枯梢，影响树势；果实受害重者落果，轻者带有病疤不耐贮藏，发生腐烂，大大降低果实商品价值，使果农增加病虫防治成本，经济效益受损。

现阶段，通常以对柑橘叶片喷洒农药的方式防治黄极毛杆菌，但是农药一方面容易使病原菌产生抗药性，降低防治难度；另一方面，会对环境造成污染。

多粘芽孢杆菌是一类具有广泛宿主的根际促生菌，对真菌、细菌、线虫等引起的植物病害具有防治效果；其可产生多种抗生素、多粘菌素及各种水解酶等拮抗物质，这些拮抗物质是多粘芽孢杆菌发挥生物防治作用的重要机制之一。同时，多粘芽孢杆菌能够诱导植物产生水杨酸，从而引发诱导性系统抗性(ISR)；多粘芽孢杆菌还可以合成植物生长素、细胞分裂素及胞外多糖，具有溶磷、固氮的活性。如果可以将多粘芽孢杆菌制备成特种肥，用于柑橘溃疡病的防治，既可以有效对抗病原菌，又可以防治环境污染。

因此，如何提供一种可以有效防治柑橘溃疡病的多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用，该特种肥可以有效地防治柑橘溃疡病，降低该病的发病率，同时，可有效促进植物的生长。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种多粘芽孢杆菌特种肥，包括：多粘芽孢杆菌菌粉；所述多粘芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2019116，命名为LTPP03，16srRNA序列如SEQ ID No.1所示。

以上技术方案达到的技术效果是：多粘芽孢杆菌LTPP03相较于其它芽孢杆菌，具有更强的抗病害能力；其能增强土壤的固氮能力，并有效促进植物生长，因此，将其制备成水溶性肥，对植物叶面进行喷施，可有效防治柑橘溃疡病的发生。

作为本发明优选的技术方案，菌粉中LTPP03菌体的含量为50亿芽孢/g。

作为本发明优选的技术方案，所述特种肥还包括：磷酸二铵85-130g、硫酸钾60-170g、磷酸二氢钾25-100g、一水硫酸镁79-224g、五水硼砂25g、腐植酸原粉240g、解淀粉芽孢杆菌菌粉1g、亚甲基双萘磺酸钠20g和木质素磺酸钠40g，且所述LTPP03菌粉的质量为30g。

作为本发明优选的技术方案，所述特种肥还包括：氮钾肥90-150g、硫酸铵50-240g和水溶性防结粉40g。

以上技术方案达到的技术效果是：将大量元素、中量元素、微量元素组合在一起，为植物的生长发育提供必要的营养支持；腐植酸由死亡生物物质，如木质素，经微生物降解产生，具有肥料增效、改良土壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能；防结粉可以防止各组分间粘结成块，不影响肥效；由于防结粉一般由有机物质组成，其与大量元素、中量元素、微量元素等无机物质不相容，而表面活性剂具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降，进而使防结粉与无机物质相容。

作为本发明优选的技术方案，所述水溶性防结粉包括：聚丙烯酰胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和乙醇中的任意两种或三种组成。

一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法，包括下述步骤：

1)称量：按照上述称量原料，备用；

2)混合：将称量得到的一水硫酸镁、五水硼砂、解淀粉芽孢杆菌菌粉、LTPP03菌粉、亚甲基双萘磺酸钠和木质素磺酸钠在搅拌机中混匀，得混合物；

3)混合：将硫酸铵、氮钾肥、硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸二铵在搅拌机中搅拌，期间，向其中加入腐植酸原粉和混合物，搅拌均匀后，加入水溶性防结粉，混匀，得到半成品；

4)包装：将半成品包装，得到特种肥。

一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法制备得到的特种肥在预防柑橘溃疡病中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种以LTPP03为主要成分的微生物特种肥，该特种肥可以有效防治柑橘溃疡病的发生，提高柑橘的抗病能力，进而提高柑橘的品质与产量。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所用到的菌种为多粘芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019116，分类学命名为多粘芽孢杆菌LTPP03(PaenibacilluspolymyxaLTPP03)，且多粘芽孢杆菌LTPP03的16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例1-6中1000亿芽孢/g解淀粉芽孢杆菌菌粉购自山东蔚蓝绿源生物科技有限公司。

实施例1多粘芽孢杆菌LTPP03的筛选

1)样本采集：采集土壤(南宁市兴宁区四塘镇林地)，并将其置于容器中；

2)稀释、水浴加热：取10g土壤放入250ml烧杯中，向烧杯中加入90ml无菌水，振荡，制成浓度为10^-1的土壤稀释液A；将土壤稀释液A置于80℃水浴锅中加热10min；

3)梯度稀释：

(1)取装有9mL无菌水的试管3支，分别标记为：10^-2、10^-3及10^-4；

(2)将土壤稀释液A振荡，静止30s，以移液器吸取1mL土壤稀释液加入标有10^-2的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即得到土壤稀释液B；

(3)同理，吸取1mL土壤稀释液B加入编号为10^-3的试管中，吹吸混匀，即得土壤稀释液C；同法得到土壤稀释液D。

4)涂布平板：

由低浓度开始，各吸取土壤稀释液A、B、C、D 100ul，对应地涂布到标记有A、B、C、D且盛有培养基的平板中，每种稀释液涂布2个平板，用涂布器涂匀，而后将平板置于37℃环境中恒温培养20h；直至平板中长出菌落，停止培养；

5)划线接种：选取长有菌落的平板进行平板划线，先在平板培养基的一边平行划线3条，再转动培养皿40°角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和第4次平行划线，将划线完成后的平板置于培养箱中继续培养，直至划线处长出菌落，停止培养；

6)革兰氏染色镜检：

(1)制片：挑取步骤5)中得到的菌落，将其于载玻片上干燥、固定，得到涂片；

(2)初染：在步骤(1)所得的涂片上滴加草酸铵结晶紫染液，染0.5min，倾去染液，流水冲洗至紫色褪去；

(3)媒染：用碘液冲去步骤(2)所得涂片上的残水，而后用相同浓度的碘液覆盖涂面0.5min，流水冲洗；

(4)脱色：除去步骤(3)所得涂片的残水，向涂片上滴加95％酒精，脱色15s后立即用流水冲洗；

(5)复染：向步骤(4)所得涂片上滴加番红染色液，染3min，水洗后用吸水纸吸干；

(6)镜检：油镜观察，细胞核被染成蓝色，细胞质被染成粉红色。

7)收集菌株，即得多粘芽孢杆菌LTPP03。

实施例2多粘芽孢杆菌LTPP03的鉴定

中国典型培养物保藏中心于2019年03月15日对多粘芽孢杆菌LTPP03菌株进行鉴定。鉴定包括多粘芽孢杆菌LTPP03菌株的形态观察、生理生化特性试验、16SrRNA基因序列的测定与分析，并根据鉴定结果确定菌株的分类地位。经鉴定该菌株为：多粘芽孢杆菌LTPP03(Paenibacillus polymyxa LTPP03)。生理生化特性检测结果见表1-表2；

表1 菌株LTPP03生理生化特性–酶活、碳源同化

+：阳性反应；-：阴性反应；w:弱阳性反应

表2 菌株LTPP03生理生化特性—利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；

实施例3

一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法，包括下述步骤：

1)称量：称量50亿芽孢/gLTPP03菌粉30g、1000亿芽孢/g解淀粉芽孢杆菌菌粉1g、磷酸二铵100g、氮钾肥150g、硫酸钾100g、磷酸二氢钾50g、一水硫酸镁224g、五水硼砂25g、亚甲基双萘磺酸钠20g、木质素磺酸钠40g、腐植酸原粉240g、聚丙烯酰胺10g和脂肪醇聚氧乙烯醚10g；

2)混合：将一水硫酸镁、五水硼砂、解淀粉芽孢杆菌菌粉、LTPP03菌粉、亚甲基双萘磺酸钠和木质素磺酸钠在搅拌机中混匀，得混合物；

3)混合：将硫酸铵、氮钾肥、硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸二铵在搅拌机中搅拌，期间，向其中加入腐植酸原粉和混合物，搅拌均匀后，加入水溶性防结粉，混匀，得到半成品；

4)包装：将半成品包装，得到特种肥。

实施例4

一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法，包括下述步骤：

1)称量：称量50亿芽孢/gLTPP03菌粉30g、1000亿芽孢/g解淀粉芽孢杆菌菌粉1g、磷酸二铵85g、氮钾肥90g、硫酸钾100g、磷酸二氢钾50g、一水硫酸镁99g、硫酸铵200g、五水硼砂25g、亚甲基双萘磺酸钠20g、木质素磺酸钠40g、腐植酸原粉240g、聚丙烯酰胺10g和乙醇10g；

2)混合：将一水硫酸镁、五水硼砂、解淀粉芽孢杆菌菌粉、LTPP03菌粉、亚甲基双萘磺酸钠和木质素磺酸钠在搅拌机中混匀，得混合物；

3)混合：将硫酸铵、氮钾肥、硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸二铵在搅拌机中搅拌，期间，向其中加入腐植酸原粉和混合物，搅拌均匀后，加入水溶性防结粉，混匀，得到半成品；

4)包装：将半成品包装，得到特种肥。

实施例5

一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法，包括下述步骤：

1)称量：称量50亿芽孢/gLTPP03菌粉30g、1000亿芽孢/g解淀粉芽孢杆菌菌粉1g、磷酸二铵130g、氮钾肥90g、硫酸钾60g、磷酸二氢钾25g、一水硫酸镁79g、硫酸铵240g、五水硼砂25g、亚甲基双萘磺酸钠20g、木质素磺酸钠40g、腐植酸原粉240g、脂肪醇聚氧乙烯醚10g和乙醇10g；

2)混合：将一水硫酸镁、五水硼砂、解淀粉芽孢杆菌菌粉、LTPP03菌粉、亚甲基双萘磺酸钠和木质素磺酸钠在搅拌机中混匀，得混合物；

3)混合：将硫酸铵、氮钾肥、硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸二铵在搅拌机中搅拌，期间，向其中加入腐植酸原粉和混合物，搅拌均匀后，加入水溶性防结粉，混匀，得到半成品；

4)包装：将半成品包装，得到特种肥。

实施例6

一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法，包括下述步骤：

1)称量：称量50亿芽孢/gLTPP03菌粉30g、1000亿芽孢/g解淀粉芽孢杆菌菌粉1g、磷酸二铵95g、硫酸钾170g、磷酸二氢钾100g、硫酸铵50g、一水硫酸镁209g、五水硼砂25g、亚甲基双萘磺酸钠20g、木质素磺酸钠40g、腐植酸原粉240g、脂肪醇聚氧乙烯醚10g和乙醇10g；

2)混合：将一水硫酸镁、五水硼砂、解淀粉芽孢杆菌菌粉、LTPP03菌粉、亚甲基双萘磺酸钠和木质素磺酸钠在搅拌机中混匀，得混合物；

3)混合：将硫酸铵、硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸二铵在搅拌机中搅拌，期间，向其中加入腐植酸原粉和混合物，搅拌均匀后，加入水溶性防结粉，混匀，得到半成品；

4)包装：将半成品包装，得到特种肥。

实施例7

以实施例4制备得到的特种肥对植物进行喷施，以验证其防治柑橘溃疡病的效果，过程如下：

(1)供试制剂

实施例4制备得到的特种肥(复合微生物肥料)，复合微生物肥料(保罗蒂姆汉)，50亿芽孢/gLTPP03菌剂，10亿芽孢/克解淀粉芽孢杆菌菌剂(先农生物)，清水对照。

(2)试验设计

试验设7个处理，4次重复。其中特种肥设置3个浓度，分别为兑水稀释200倍、250倍、300倍，复合微生物肥料(保罗蒂姆汉)兑水稀释至300倍，50亿个/gLTPP03菌剂兑水稀释至1000倍，10亿芽孢/克解淀粉芽孢杆菌菌剂(先农生物)兑水稀释500倍，对照为清水。在沃柑新梢3-5cm时，喷施第一次，共喷施3次，每次间隔14天。

(3)试验方法

试验地设置在南宁市武鸣区大凌武沃柑基地，树龄为4年树。每处理小区为2棵沃柑树，重复4次，随机区组排列，各处理间设置1棵果树相隔，周围设保护行。试验地沃柑老叶有溃疡病斑，发病均匀，试验地其他农事管理一致。

每小区调查2株柑橘，每株调查东西南北中5个方向，每个方向固定调查2个枝条上的所有叶片。叶分级方法为：0级：无病；1级：每叶病斑1-5个；3级：每叶病斑6-10个；5级：每叶病斑11-15个；7级：每叶病斑16-20个；9级：每叶病斑21个以上。

上述每小区调查2株柑橘，每株调查东西南北中5个方向，每个方向固定调查2个枝条，在最后一次叶面喷施后14天，调查新梢数、新梢长度、新梢直径。

(4)计算方法

最后一次叶面喷施后14天调查防治效果，分级标准执行中华人民共和国国家标准《农药田间药效试验准则(二)》，以病情指数计算防治效果。

药效计算方法：

空白对照药后病情指数-处理区药后病情

(5)试验结果

表3 特种肥对柑橘溃疡病的防治效果

编号	试剂	稀释倍数	病情指数	防效(％)
					1	特种肥	200	18.11	66.46b
2	特种肥	250	18.60	65.56b
					3	特种肥	300	19.55	63.80b
4	复合微生物肥料(保罗蒂姆汉)	300	42.44	21.41a
					5	LTPP03菌剂	1000	21.55	60.09b
6	解淀粉芽孢杆菌菌剂(先农)	500	43.78	18.93a
					7	清水	/	54.00	/

试验结果表3表明，与清水对照相比较，特种肥兑水稀释至200-300倍液，随着稀释倍数的增加，对沃柑溃疡病的防效相对稳定；第3次叶片喷施后14天防效可以达到63.80％-66.46％。而复合微生物肥料(保罗蒂姆汉)防效则为21.41％，而LTPP03菌剂稀释至1000倍液，则对沃柑溃疡病的防效为60.09％，解淀粉芽孢杆菌菌剂(先农)稀释至500倍，对沃柑溃疡的防效为18.93％。从上述结果可以看出，与清水对照及解淀粉芽孢杆菌菌剂(先农)比较，LTPP03菌剂对沃柑溃疡病有显著的防效作用；而加入LTPP03菌粉的特种肥稀释200-300倍，对沃柑叶片溃疡病防效显著，且防效稳定，可见实施例4特种肥加入LTPP03菌对柑橘溃疡病防效显著且防效稳定。

以实施例4制备得到的特种肥对植物进行喷施，以验证其促生长效果，过程如下：

表4 特种肥对新梢数、新梢长度、新梢直径生长的影响

从表4结果可以看出，在沃柑抽梢开始，对其进行上述不同处理的叶面喷雾预防溃疡病，每次约间隔15天，待新梢转绿后，大约45天，对各处理新梢生长进行了调查比较，特种肥稀释200-300倍液，平均抽梢均在4.0-4.1条，显著高于清水对照和LTPP03菌剂；而新梢抽梢长度、叶片数、新梢基部1cm处直径，特种肥处理200-300倍液的也显著优于其他处理。

综上所述，含LTPP03菌的特种肥，不仅可以有效地预防及防治沃柑溃疡病，在沃柑抽梢促生长方面也效果显著，具有防治沃柑溃疡与促生长双重效果。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广西乐土生物科技有限公司

<120> 一种多粘芽孢杆菌特种肥及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcggggtgc tatacatgca agtcgagcgg ggttagttag aagcttgctt ctaactaacc 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc aacctgccca caagacaggg ataactaccg 120

gaaacggtag ctaatacccg atacatcctt ttcctgcatg ggagaaggag gaaaggcgga 180

gcaatctgtc acttgtggat gggcctgcgg cgcattagct agttggtggg gtaaaggcct 240

accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatgggc gaaagcctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgccagggaa 420

gaacgctttg tagagtaact gctcttgaag tgacggtacc tgagaagaaa gccccggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagcgcg cgcaggcggc tctttaagtc tggtgtttaa tcccgaggct caacttcggg 600

tcgcactgga aactggggag cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct gggctgtaac 720

tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gaatgctagg tgttaggggt ttcgataccc ttggtgccga agttaacaca 840

ttaagcattc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 900

cccgcacaag cagtggagta tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc ctttgaccgg tctagagata gatctttcct tcgggacaga ggagacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttatg cttagttgcc agcaggtcaa gctgggcact ctaagcagac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtactaca atggccggta caacgggaag cgaaggagcg atctggagcc aatcctagaa 1260

aagccggtct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaattgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttacaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccgcaaggag ccagccgccg 1440

aagt 1444

Claims (7)

1.一种多粘芽孢杆菌特种肥，其特征在于，包括：多粘芽孢杆菌菌粉；所述多粘芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2019116，命名为LTPP03，16srRNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种多粘芽孢杆菌特种肥，其特征在于，每克菌粉中LTPP03菌体的含量为50亿芽孢/g。

3.根据权利要求2所述的一种多粘芽孢杆菌特种肥，其特征在于，还包括：磷酸二铵85-130g、硫酸钾60-170g、磷酸二氢钾25-100g、一水硫酸镁79-224g、五水硼砂25g、腐植酸原粉240g、解淀粉芽孢杆菌菌粉1g、亚甲基双萘磺酸钠20g和木质素磺酸钠40g，且所述LTPP03菌粉的含量为30g。

4.根据权利要求3所述的一种多粘芽孢杆菌特种肥，其特征在于，还包括：氮钾肥90-150g、硫酸铵50-240g和水溶性防结粉40g。

5.根据权利要求4所述的一种多粘芽孢杆菌特种肥，其特征在于，所述水溶性防结粉包括：聚丙烯酰胺、脂肪醇聚氧乙烯醚、乙醇中的任意两种或三种组成。

6.一种多粘芽孢杆菌特种肥的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)称量：按照权利要求4-5任一所述多粘芽孢杆菌特种肥称量原料，备用；

2)混合：将称量得到的一水硫酸镁、五水硼砂、解淀粉芽孢杆菌菌粉、LTPP03菌粉、亚甲基双萘磺酸钠和木质素磺酸钠在搅拌机中混匀，得混合物；

3)混合：将硫酸铵、氮钾肥、硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸二铵在搅拌机中搅拌，期间，向其中加入腐植酸原粉和混合物，搅拌均匀后，加入水溶性防结粉，混匀，得到半成品；

4)包装：将半成品包装，得到特种肥。

7.根据权利要求6所述的制备方法制备得到的特种肥在预防柑橘溃疡病中的应用。