CN113243393A - 一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法与应用 - Google Patents

一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法与应用，其特征在于：可湿性粉剂采用的组分,以重量份计，包括：D.flagrans厚垣孢子粉15～20份、亚甲基二萘二磺酸钠3～5份、皂角粉3～5份、十二烷基磺酸钠7～10份和硅藻土60～70份。所述可湿性粉剂在体外对绵羊捻转血矛线虫三期幼虫的杀虫率可达85.62~89.77%。

Description

一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及动植物寄生线虫学领域，具体涉及一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法与应用。
背景技术
随着驱虫药在全世界的广泛使用，动物的寄生线虫对三大类驱虫药如苯并咪唑、阿维菌素/伊维菌素、左旋咪唑的耐药性不断发生，给畜牧业生产造成了严重的损失。为了减少寄生虫对化学药物的抗药性及畜产品中的残留，人们曾推荐轮牧、清理牧场粪便、饲喂天然含有丹宁的植物以及使用隐含抗原的疫苗等化药替代或补充方法来控制家畜的寄生虫病，而利用自然界线虫的天敌——食线虫真菌对家畜常见的线虫病进行生物防治是最有前景的化药替代/补充方法。
利用食线虫真菌对家养动物寄生线虫病的生物防治，其原理是当动物随饲料吞食线虫真菌制剂或生防制剂喷洒于圈舍周围粪便中，真菌的孢子随粪便中虫卵同步发育，在此过程中虫卵孵化出幼虫刺激真菌产生捕食结构，进而捕杀寄生线虫的自由生活阶段的幼虫，致使感染性幼虫的数量不断减少，阻止了感染性幼虫进一步感染家畜。因此，间接的控制和减少了家畜体内的寄生虫数量，达到了生物防治的目的。
在研究家养动物寄生线虫生物防治中，捕食线虫性真菌研究的尤为重要，国内外众多学者进行了大量的菌种分离和筛选研究，其中捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia) flagrans（同物异名Trichotheciumflagrans，为了保持生物防治文献的连贯性，目前仍然习惯上称为D.flagrans）。由于该菌在培养期间能够产生大量的双层壁的厚垣孢子，拥有同类真菌不具备的特性，目前在国外，D.flagrans作为动物胃肠线虫生物防治候选菌种，已取得具有应用前景的成果。然而，国内在动物寄生线虫生物防治优良候选菌种的缺乏，严重制约了在该领域的研究，由于引进外来菌种有基因重组和物种入侵的风险。为此，我们自2011年以来，在全国20个省（自治区/直辖市）、48个县87个位点对食线虫真菌进行了较为广泛的分离、鉴定工作，分离出8属28种的食线虫真菌，在国内首次分离了D.flagrans13株，并对当地分离株的形态学、分子遗传学、捕食机理、体外杀虫试验、体内通过消化道试验以及其它生物学特性进行了研究，同时也对其它食线虫真菌进行了大量菌种筛选工作的研究。
对于家畜寄生线虫的生物防治，研制针对具体菌株所适宜的剂型，制备成可直接供给动物食用，是非常重要的，这包括两方面的要求，一则要保持D.flagrans孢子具有稳定的活性传递到动物的粪便中有效发挥捕杀L3作用，二则是便于保存和运输。可湿性粉剂是农药的四大剂型之一，随着生物农药的不断发展，人们将一些真菌的分生孢子或厚垣孢子加入可湿性粉剂中制成生物农药应用于农业生产中。可湿性粉剂因为其使用时加水稀释，能够形成稳定的悬浮液，喷雾施用与水具有高度亲和性，故称为“可湿性”。可湿性粉剂制备成本低、易于储存和运输、施用范围广，能够很好的附着在叶片表面，还可以将不溶于水的原药加工成可喷雾的可湿性粉剂剂型以提高药效。
目前国内外研究者们已经研制出木霉菌（Trichoderma）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、莱氏野村菌（Nomuraearileyi）、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)等生物防治的可湿性粉剂。木霉菌属(Hypocreales)的一些物种被认为是重要的线虫生物调节剂，可在不造成环境问题的情况下在农业土壤上使用,也是目前国内研究者们研究最多的生防菌，这些可湿性粉剂全部是应用于农业，目前还没有一种用于畜牧生产上寄生线虫防治的可湿性粉剂。另外，国内报道了关于食线虫真菌粉状制剂的研制及应用，将捕食线虫性真菌分离株接种在培养基上，温度25～28℃，相对湿度80%以上，进行厚垣孢子批量培养，15～25d终止培养并收获含孢子的培养物。将收获含孢子的培养物连同谷粒，置容器中摊薄，于35℃风干，风干时间3～5d；或者真空干燥，温度35℃～40℃，真空度为0.082～0.085MPa；或者自然风干，最后收获干燥物备用配置和粉碎。将干燥后培养物按照质量比为1:1混合，再把干燥的菌株培养物与麸皮按照质量比为1:5～1:10混合，混合物经粉碎机粉碎并搅拌均匀获得捕食线虫性真菌粉状制剂。但上述粉状制剂无法长期保存贮藏。经以前的研究，我国分离的D.flagrans菌株在形态学、培养特性方面不同于国外菌种，证明是适应我国地理特征的新分离株，与其它菌种相比具有诸多优良性能，适合于作为研制生防制剂的菌种。如果将D.flagrans厚垣孢子制备成可湿性粉剂，在能够保持其活性的前提下，则在畜牧业或农业的病虫害防治方面有广阔的应用前景。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法与应用，实现以下发明目的：对动物寄生线虫的有效生物防治，易于贮藏存和运输、生产工艺简单且易于规模化生产，能在生产中方便应用、成本低。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，可湿性粉剂采用的组分,以重量份计，包括：D.flagrans厚垣孢子粉15～20份、亚甲基二萘二磺酸钠3～5份、皂角粉3～5份、十二烷基磺酸钠7～10份和硅藻土60～70份。
进一步的，可湿性粉剂采用的组分,以重量份计，包括：D.flagrans厚垣孢子粉20份、亚甲基二萘二磺酸钠4份、皂角粉4份、十二烷基磺酸钠8份和硅藻土64份。
所述D.flagrans厚垣孢子粉：含有的厚垣孢子数为5×106~107个/g。
所述的制备方法包括食线虫性真菌D.flagrans分离株SDH035厚垣孢子的制备：将捕食线虫性真菌鞭式节丛孢D.flagrans分离株SDH035在玉米-小麦联合谷培养基上进行批量培养，温度25～30℃，相对湿度80～100%，15～25 d终止培养。
所述的制备方法包括D.flagrans厚垣孢子粉的制备：
采用0.05%吐温-80将玉米-小麦联合谷培养基上的培养物洗脱下来，将洗下的厚垣孢子及菌丝，用搅拌器在300~350r/min的转速时持续搅拌1~1.5min，再经双层纱布过滤以除去菌丝，再经3000~3500r/min离心4.5~5.5min去上清，得到孢子浓缩液；将浓缩后的孢子液与硅藻土按3：1的比例混合并搅拌均匀，进行干燥；得到D.flagrans厚垣孢子粉。
所述干燥：干燥温度为34~38℃，真空干燥，干燥时间为2.5~3.5 h。
所述的可湿性粉剂：含水量0.45%~0.64%，厚垣孢子含量1.21×106~1.487×106个/g。润湿时间为56s~67s，孢子悬浮率60.45%~74.0%，pH6.7~6.8。制剂中的厚垣孢子在24h内的萌发率为33.92~34.4%。
一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的应用，所述可湿性粉剂在体外对绵羊捻转血矛线虫三期幼虫的杀虫率可达85.62~89.77%。
本发明采用的菌种：鞭式节丛孢Arthrobotrys（Duddingtonia）flagrans分离株SDH 035保藏编号为CGMCC NO.11210，保藏日期为2015年8月31日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其简称为CGMCC；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。SDH035分离株在NCBI（GenBank）获取的序列登录号为KP2575930。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂：厚垣孢子数含量1.21×106~1.487×106个/g，润湿时间为56s~67s，孢子悬浮率60.45%～74.0%，pH6.7～6.8，含水量0.45%~0.64%，细度（300目）>98%，所配置的可湿性粉剂性能指标符合商品制剂要求，制剂中的厚垣孢子在24h内的萌发率为33.92%~34.4%。
（2）本发明一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂对捻转血矛线虫的杀虫效果显著；实验证明，本发明可湿性粉剂在体外对绵羊捻转血矛线虫三期幼虫的杀虫率可达85.62%～89.77%。
（3）本发明一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂耐储性显著，室温条件下保存8个月，可湿性粉剂对绵羊胃肠线虫的杀虫率达到86%以上；室温避光条件下存放6～8个月，仍保持60%以上的杀虫率，这正好满足了一般日常使用时的保存条件，既不需要大型的仪器设备，节省了电力，降低了成本，方便于今后推广时保存和运输。
（4）本发明一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂在野外条件下使用，防治绵羊胃肠线虫效果显著，对圈舍土壤中的幼虫减少率为41.03%～94.68%。
（5）动物寄生线虫对驱虫药的抗药性基因在全世界的养殖业当中广泛地扩散，已对畜牧业生产造成了巨大的威胁。人们积极推荐寄生虫病替代化药方法，即利用食线虫真菌进行生物防治等。应用食线虫真菌D.flagrans厚垣孢子可湿性粉剂通过喷雾等来减少环境中寄生虫的自由生活阶段如卵、1~3期幼虫，该制剂相对开发疫苗来说，技术难度小、成本低、有效期长，而是直接针对源头感染进行控制，因而是最有应用前景的化学替代或补充方法，也是一种符合自然生态平衡的控制方法。D.flagrans厚垣孢子与载体、分散剂及润湿剂混合，制备方法简单，操作流程少，不需用复杂的设备，降低了成本，更利于大规模生产和保存、运输。另外，该法制备的可湿性粉剂，其有效成分厚垣孢子溶于水后，悬浮性和分散性较好，可以在生产实践中推广应用。
附图说明
图1为本发明一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的外观图；其中，A图为可湿性粉剂袋装图；B图为可湿性粉剂直观图；
图2为实施例2中不同干燥条件下孢子粉的孢子萌发率分析图；
图3为实施例7中20180413批次可湿性粉剂在4种条件下保存5-8个月的体外杀虫效果统计表。
实施例1一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法
步骤1、食线虫性真菌D.flagrans分离株SDH035的分离、纯化及鉴定
2013年9月，从来源于宁夏吴忠地区羊粪堆样品和黑龙江省伊春市绵羊粪便样品中，采用改良的平板撒布法分离，分离时在平皿中加入绵羊线虫第三期幼虫作诱饵，25℃温度下孵化，每天或隔天在倒置显微镜下检查一次，持续3周，待有分生孢子长出后，挑取单个的分生孢子置于另一个0.2%麸皮单个的捕食结构或被捕食的线虫，转接入含有0.2%麸皮琼脂培养基中，25℃培养直至获得纯培养物。通过玻片插入法获得该菌株分生孢子的形态和数据测量，并提取菌株DNA，用引物ITS1和ITS4进行扩增rDNA中5.8S、ITS-1和ITS-2序列。其结果从5份绵羊粪堆样品中分离纯化获得SDH035菌种一株，形态学和分子学鉴定表明所获分离株与A.flagrans相一致。该菌的形态特征为：在2%玉米粉琼脂中菌落为白色，菌丝较为稀疏，菌丝透明、分隔、分枝，当培养2～3 d可产生分生孢子，至第7 d时就可产生大量的厚垣孢子，而分生孢子相对很少；分生孢子梗透明、直立、分隔，长117.5～387.5（平均为241.59）μm，基部宽5～7.5μm，端部宽2.5～5μm；分生孢子呈卵圆形、长卵圆形和椭圆形，以1个分隔为主，偶有2个分隔或3～4个分隔，0个分隔的也时常可见；分生孢子长20～55.5（平均为35.89）μm、宽10～17（平均为12.87）μm。该菌于28℃培养在玉米与小麦粒联合培养基时，3 d可产生大量的圆形或椭圆形的厚垣孢子（产量可达6×104个/g），厚垣孢子直径14～30 (平均25.0) μm。
对上述SDH035分离株的主要生理、生物学特性进行研究：
SDH035分离株在12℃～35℃范围内能生长，最佳生长温度范围为25℃～30℃；在pH为3～12范围内能够生长，最佳生长pH值范围为7～9；生长的相对湿度范围以90%～100%为最佳；在水琼脂上产生厚垣孢子而不产生分生孢子；厚垣孢子能够耐受紫外线照射12 h；干燥和缺氧能引起厚垣孢子的萌发率快速下降进入休眠状态；厚垣孢子能够耐受40℃～50℃水浴处理1 h，但60℃水浴作用30 min后仅个别萌发，60℃以上作用30 min后不能萌发；pH1-3和pH13-14作用12 h不能使孢子死亡，饱和的高渗盐溶液处理24 h不能使孢子死亡，甘油能抑制孢子萌发。分离株与绵羊三期幼虫和秀丽新杆线虫互作后，产生三维粘性网并捕捉线虫。
步骤2、食线虫性真菌D.flagrans分离株SDH035厚垣孢子的制备
将捕食线虫性真菌鞭式节丛孢D.flagrans分离株SDH035在玉米-小麦联合谷培养基上进行批量培养，温度25℃～30℃，相对湿度80～100%，15 d～25 d终止培养置4℃备用。
步骤3、D.flagrans厚垣孢子粉的制备
采用0.05%吐温-80将玉米-小麦联合谷培养基上的培养物洗脱下来，将洗下的厚垣孢子及菌丝，用搅拌器在300r/min的转速时持续搅拌1min，再经双层纱布过滤以除去菌丝，再经3000r/min离心5min去上清，得到孢子浓缩液。将浓缩后的孢子液与硅藻土按3:1的比例（v/w）混合并搅拌均匀，进行干燥，然后经粉碎机粉碎；得到D.flagrans厚垣孢子粉。
实施例2 厚垣孢子粉的制备步骤中干燥条件的测定实验
分别采用两种干燥方式，烘干箱干燥和真空干燥箱干燥，进行实验，每种方式分别设定温度为35 ℃、40 ℃和45 ℃；同时以干燥的厚垣孢子粉置于4℃条件下为对照，具体干燥条件如表1所示；
Figure 763970DEST_PATH_IMAGE001
上述温度干燥完成时，分别计算孢子萌发率；
计算孢子萌发率的计算方法如下：取干燥完成的孢子粉加蒸馏水进行10倍稀释，取100 μL稀释的孢子液均匀涂布于水琼脂平板平面，每个实验设置3个平行，将平板置于28℃培养36h，分别计数萌发的孢子与未萌发的孢子数量，萌发率计算公式如下：
将整个平皿中的琼脂块切成条状，取出后用棉蓝染液染色，光镜下观察并计数整个平皿的厚垣孢子萌发数和不萌发数，从而得到总数。其中，孢子萌发的判定标准为由萌发管长出的菌丝长度大于孢子的半径时可作为孢子萌发。与此同时，取等量的干燥孢子粉进行孢子萌发率的测定，从而作为对照组，方法同上，孢子萌发率测定公式如下：
孢子萌发率（%）=
Figure 957447DEST_PATH_IMAGE002
×100%
此外，根据如下公式来预测样本容量：
Figure 632142DEST_PATH_IMAGE003
：其中p为某一事件预计的频率，q=1-p，L为允许误差
当厚垣孢子的萌发率为8%–30%，样本容量n为736~2100时，才有95%的可靠性达到允许误差为2%的精确度。为了减少误差，因此每个试验所计厚垣孢子总数大于2000个。
由于孢子培养24 h后产生的菌丝相互交织，并且早已萌发的厚垣孢子开始消失，此外，部分孢子经培养结束后，经干燥会造成孢子进入休眠状态。因此，本法所获得孢子的萌发率低于实际萌发率。
经计算，实验1-6组的孢子萌发率如表2所示；
Figure 765314DEST_PATH_IMAGE004
不同干燥条件下孢子粉的孢子萌发率的实验结果见图2。从图中可知，干燥条件对孢子萌发率存在显著影响；干燥条件优选为：35℃真空干燥3 h，效果最好；干燥后的孢子粉所含有的厚垣孢子数为5×106~107个/g。
实施例3一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的润湿剂筛选实验
将十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、拉开粉作为润湿剂，与D.flagrans厚垣孢子粉及硅藻土混合均匀得到试验样品，润湿剂在试验样品中的占比分别为2%、4%和8%（w/w），硅藻土在实验样品中的占比为20%；以不加润湿剂的厚垣孢子粉为对照；进行以下实验：
取容量为150 mL的烧杯加入100 mL自来水，称取上述样品0.1 g，从烧杯与烧杯口齐平位置一次均匀地倒入样品液面上，同时立即用秒表计时，至样品全部湿润为止，并记录好时间。重复5次取平均值。实验条件和实验结果具体见表3；
Figure 631377DEST_PATH_IMAGE006
由上表可知，润湿剂优选十二烷基磺酸钠，其所需时间最短且效果最佳，而且随着加入比例的增大时间逐渐缩短，其效果更加明显。
实施例4一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的分散剂筛选实验
将质量百分含量为8%的十二烷基磺酸钠、质量百分含量为20%的孢子粉、质量百分含量为72%的硅藻土混合均匀制备成原粉，然后分别向原粉中加入木质磺酸钙、亚甲基二萘二磺酸钠、皂角粉、亚甲基二萘二磺酸钠与皂角粉质量比1:1的混合物，共四组分散剂进行试验，每组分散剂分别按照5%、8%和12%的质量百分含量与原粉进行混合；实验具体如下：
将各组混合物经粉碎机粉碎后，取适量样品置于盛有50 mL标准硬水的量筒中，参照GB/T14825-93标准所述方法，取上层悬液和下层液体，使用称量好的滤纸分别过滤上下层液体，并将其烘干称重，每个样品设置3个平行，结果取其平均值，测定其悬浮率，计算公式如下：
Figure 810685DEST_PATH_IMAGE007
各组实验条件和实验结果具体见表4；
Figure 757913DEST_PATH_IMAGE008
由表4可知，在润湿剂含量8%的情况下，以上4组分散剂试验结果表明，以亚甲基二萘二磺酸钠+皂角粉联合使用对D.flagrans孢子的悬浮率高于其它3组，而且在加入比例为8%和12%的情况下，其悬浮率分别为73.51%和75.12%。
实施例5 一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法
采用实施例1的方法制备D.flagrans厚垣孢子粉，其中干燥的方法为：干燥温度为35℃，真空干燥，干燥时间为3 h。孢子粉含有的厚垣孢子数为7.435×106个/g。
采用的可湿性粉剂配方为，以质量百分比计，20%D.flagrans厚垣孢子粉、4%亚甲基二萘二磺酸钠、4%皂角粉、8%十二烷基磺酸钠和64%硅藻土。按照质量百分比称取上述各种成分，经粉碎机搅拌均匀即可。
用本法生产2批（20180413批和20180621批）可湿性粉剂（如图1所示），肉眼观察成品，无硬结块，略带刺激性气味，易溶于水；经检测，厚垣孢子含量1.487×106个/g，润湿时间为58s，孢子悬浮率74.0%，pH值6.7，含水量0.45%，细度为通过200目筛子99%。制剂中的厚垣孢子在24h内的萌发率为34.4%。
实施例6可湿性粉剂对绵羊粪便中感染性幼虫杀虫效果实验
采用实施例5的方法新制备的可湿性粉剂3批，每次测定时称取1g可湿性粉剂。
用粪袋收集人工感染有捻转血矛线虫的绵羊粪便，将粪便碾碎后，按照Cai等（2017）所描述的方法，称取10 g粪便样品置于直径为5.5 cm平皿中，试验组每个平皿加入1g的可湿性粉剂，并加约4mL的蒸馏水混合均匀，设置三个平行，对照组称取相同量的粪便，加入1g没有真菌孢子的粉剂，同样设置三个平行。将上述平皿置于直径为9 cm平皿中并在该平皿底部添加10 mL左右的蒸馏水以保持培养湿度，平皿加盖后，置于28 ℃培养箱培养14 d，期间观察粪便湿度，始终保持较大平皿底部的水分。待培养终止后，每个平皿中的粪便培养物分别转入贝尔曼漏斗的筛子中，同时添加40 ℃温水淹没粪便样品，静置12 h使第三期幼虫（L3）与粪便分离，按Cai等（2017）所描述的方法进行幼虫计数，分别计算各组中所获L3的平均数，杀虫率计算公式如下：
Figure 604646DEST_PATH_IMAGE009
采用SPSS（Version 23.0）软件计算照组和试验组中L3的平均数，通过方差分析在5%的概率水平判断差异的显著性。
3批可湿性粉剂（标记为20180413批，20180621批，20180627批）在实验室进行体外效力试验结果见表5。所有批次可湿性粉剂均可以使粪便中捻转血矛线虫L3数量减少，20180413批次的幼虫杀虫率为89.77%，20180621批次的幼虫杀虫率为85.62%，20180627批次的幼虫杀虫率为92.06%，对照组与试验组未被捕捉的L3的数量差异显著（p＜0.05）。
Figure 644539DEST_PATH_IMAGE010
实施例7 一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的保存期测定实验
（1）采用实施例5的方法新制备的可湿性粉剂20180413批次。将刚制备的可湿性粉剂分别装入3个150 mL三角烧瓶中，标记后每个瓶子装入100 g；在裁剪好的24块尼龙布中，每块布装有5 g可湿性粉剂，用线绳扎紧后进行标记。分4个条件进行可湿性粉剂的保存期研究，组1：将一个三角烧瓶盖好后置于室温干燥条件下避光保存；组2：将一个三角烧瓶密封后置于4 ℃冰箱中保存；组3：将一个三角烧瓶密封后置于-20 ℃冰箱中保存；组4：在校园花坛内采集一定量的土壤，装入较大的纸箱中，将24块用尼龙布包扎好的可湿性粉剂埋藏于采回的土壤中保存。以上各组中用未加D. flagrans厚垣孢子的空白可湿性粉剂在相同条件下保存作为对照组。
（2）不同保存条件下杀虫效果的检测：4组可湿性粉剂保存后，每隔一个月取样一次，检测杀虫率。按照实施例6中所用的方法章进行粪便培养，贝尔曼法分离三期幼虫，幼虫计数，计算杀虫率。在测定过程中每隔1个月监测试验绵羊的每克粪便虫卵数（EPG），EPG超过500时的粪便样品作为试验样品。
（3）数据处理：实验数据均采用SPSS software（22.0）进行方差分析，其中两两比较选择 Duncan (D)法。
（4）保存期测定结果
20180413批次可湿性粉剂在4种条件下保存5-8个月的体外杀虫效果表如附图3所示；
表中可知，所有的分组以及在不同时间点，试验组（含有真菌的可湿性粉剂）粪便中L3 的数量显著地低于对照组（p＜0.05）。在室温、4 ℃、-20 ℃和土壤条件下保存的可湿性粉剂对粪便中L3的体外杀虫率分别为86.84%~97.13%、47.58%~93.94%、46.74%~98.63%和28.50%~98.75%；保存8个月后，室温条件下保存的可湿性粉剂杀虫率为86.84%。
综上，4种不同条件下保存情况，室温避光保存，其存放8个月时仍保持60%以上的杀虫率，这正好满足了一般日常使用时的保存条件，既不需要大型的仪器设备，节省了电力，降低了成本，方便于今后推广时保存和运输。
实施例8 一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂防治绵羊胃肠线虫的野外试验
（1）试验羊群
实地考察兰州市榆中县新堡子村两家养羊农户，和畜主协商后确定为野外试验点。对照组：圈舍面积约40平米，25只绵羊，3月龄至48月龄不等，品种均为小尾寒羊，羊群全年放牧，自由采食和饮水，每年驱虫两次。试验组：圈舍面积约1000平米，95只绵羊，2月龄至60月龄不等，品种包括小尾寒羊和兰州大尾羊，羊群半舍饲半放牧，自由采食和饮水，每年大规模驱虫两次，此后畜主还会不定期对个别动物进行驱虫。试验未开始前采集对照组和试验组羊圈地表的羊粪样品，实验室检测羊只携带虫卵情况，对照组EPG40-4500，试验组EPG30-300。根据以往研究该地区绵羊主要自然感染胃肠线虫有捻转血矛线虫、蛇形毛圆线虫、马歇尔线虫和细颈线虫。
（2）试验方法
试验组：实验室称取25 g 20180621批次可湿性粉剂，倒入喷雾器中，加5000 mL水进行200倍稀释，即每毫升水中约744个厚垣孢子，前往试验组羊圈，用电动喷雾器将可湿性粉剂喷洒在羊圈的地面上，包括羊群采食区域和休息区域，每隔半个月喷洒一次。25-38 d取样一次，试验点采样为随机采样，随机采集10份羊粪样品，监测绵羊排出虫卵的变化，喷雾给药后第一次采样时间为2018年6月20日。在羊群采食区和休息区的地表分别采集10份土壤样品，将采集样品带回实验室进行处理，土壤样品每份定量为20 g，贝尔曼法分离土壤中的幼虫，倒置显微镜计数幼虫数量。
对照组：不做可湿性粉剂喷洒处理，每月取样时间、次数同试验组，随机取10份羊粪样品。监测虫卵的变化。由于是放牧羊群，圈舍内羊群不采食，因此对照组只随机采集羊圈地面10份土壤样品。实验室样品处理方法均和试验组相同。
幼虫减少率计算公式：
Figure 311144DEST_PATH_IMAGE011
（3）数据处理
野外试验虫卵减少率数据采用双尾T-Text方法检验，其它实验数据均采用SPSSsoftware（22.0）进行方差分析，其中两两比较选择 Duncan (D)法。
（4）实施结果
野外试验土壤分离幼虫结果见表6和表7。
Figure 593221DEST_PATH_IMAGE012
Figure 28881DEST_PATH_IMAGE013
由试验结果可以看出，6~9月对照组与试验组均存在显著差异（p＜0.05），10~11月对照组与试验组差异不显著（p＞0.05）。在喷洒可湿性粉剂后，试验组（休息区）幼虫减少率为41.03%~94.68%，试验组（采食区）幼虫减少率为63.36%~94.21%。10月末对照组中部分绵羊发病，畜主用伊维菌素驱虫，在11月份检查虫卵时，因此对照组与试验组的幼虫差异不显著（p＞0.05）。本实验结果表明，在喷洒可湿性粉剂后，对圈舍土壤中的幼虫减少率为41.03%~94.68%，证明该制剂在野外田间试验条件下使用后表现出可靠有效的对绵羊胃肠线虫的生防作用。
除特殊说明外，本发明所述的比例均为重量比，所述的百分含量均为质量百分含量。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：采用的组分,以重量份计，包括：D.flagrans厚垣孢子粉15～20份、亚甲基二萘二磺酸钠3～5份、皂角粉3～5份、十二烷基磺酸钠7～10份和硅藻土60～70份。
2.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：采用的组分,以重量份计，包括：D.flagrans厚垣孢子粉20份、亚甲基二萘二磺酸钠4份、皂角粉4份、十二烷基磺酸钠8份和硅藻土64份。
3.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述D.flagrans厚垣孢子粉：含有的厚垣孢子数为5×106~107个/g。
4.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括食线虫性真菌D.flagrans分离株SDH035厚垣孢子的制备：将捕食线虫性真菌鞭式节丛孢D.flagrans分离株SDH035在玉米-小麦联合谷培养基上进行批量培养，温度25～30℃，相对湿度80～100%，15～25 d终止培养。
5.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括D.flagrans厚垣孢子粉的制备：采用0.05%吐温-80将玉米-小麦联合谷培养基上的培养物洗脱下来，将洗下的厚垣孢子及菌丝，用搅拌器在300~350r/min的转速时持续搅拌1~1.5min，再经双层纱布过滤以除去菌丝，再经3000~3500r/min离心4.5~5.5min去上清，得到孢子浓缩液；将浓缩后的孢子液与硅藻土按3：1的比例混合并搅拌均匀，进行干燥；得到D.flagrans厚垣孢子粉。
6.根据权利要求5所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述干燥：干燥温度为34~38℃，真空干燥，干燥时间为2.5~3.5 h。
7.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：
所述的可湿性粉剂：含水量0.45%~0.64%，厚垣孢子含量1.21×106~1.487×106个/g。
8.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：
所述的可湿性粉剂：润湿时间为56s~67s，孢子悬浮率60.45%~74.0%，pH6.7~6.8。
9.根据权利要求1所述的一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：
所述的可湿性粉剂：制剂中的厚垣孢子在24h内的萌发率为33.92~34.4%。
10.一种食线虫真菌厚垣孢子可湿性粉剂的应用，其特征在于：所述可湿性粉剂在体外对绵羊捻转血矛线虫三期幼虫的杀虫率可达85.62~89.77%。
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