CN103704074A - 绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种绿僵菌喷施堆肥地面防治白星花金龟幼虫的方法，该方法应用金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae对白星花金龟幼虫高效的生物防治，利用白星花金龟成虫在堆肥中产卵，幼虫在堆肥中取食、越冬并在地下5-15cm土层中分布最多的特性，将人工培养的金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae在堆肥前喷施到堆肥场地的地面，使白星花金龟幼虫从堆肥向土层转移的过程中被寄生，并通过被寄生幼虫在堆肥和表土层中的转移、活动将绿僵菌携带和扩散，造成种群的病害流行，进而将该害虫控制在虫源地，减少农药使用，保护环境，为今后大力发展有机农业提供技术支撑。

Description

绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法

技术领域

本发明涉及一种绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法。

背景技术

白星花金龟（Postosia brevitarsis Leiwis）属鞘翅目，多食亚目，花金龟科，白星花金龟属，分布于我国东北、华北、华东、华中等地区。白星花金龟以幼虫在各种畜禽堆肥或腐烂秸秆等有机质含量非常高的土壤中繁殖和越冬，以成虫危害玉米、小麦、果树、蔬菜等多种农作物，取食花器、果实及穗部。桃、李、葡萄等果实成熟时，白星花金龟大量迁入危害，果实受害引起腐烂，散发出发酵的腐败味，同时排泄物极易引起病害的发生，是重要的果树害虫，严重影响果品的产量与品质。2001年郭文超等首次报道了白星花金龟在新疆的危害。2008年，白星花金龟已经扩散到北疆及东疆吐鲁番地区等13个县市的农作物和林果种植区。由于其危害多在果实成熟期，不宜使用化学农药进行防治，并且成虫生活隐蔽、适应性强、善飞翔，能在不同的作物、地块转移危害，防治十分困难。目前，物理诱杀和微生物防治是防治白星花金龟最为有效的方法。绿僵菌是最常用的广谱性昆虫寄生真菌，寄主范围广，包括直翅目、半翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等8个目42个科200多种昆虫，以及螨类和线虫。同时，绿僵菌对人畜无害，具有专一性强，不污染环境、无残留、害虫不会对其产生抗药性等优势，是当前研究和应用最多的虫生真菌之一。国内外对绿僵菌展开了大量研究。2008年，M.Tavassoli等人利用3株绿僵菌对鸡皮刺螨进行控制性研究，结果表明3株菌株均表现高毒力，死亡率在90%-100%。同时，殷幼平等人开展了金龟子绿僵菌CQMa128微粒剂和乳粉剂对花生蛴螬的田间防效试验，防效达到75.58%-86.46%，并且对蛴螬天敌臀钩土蜂的存活未见有明显不良影响。目前，国内关于白星花金龟绿僵菌的研究较少，1984年武觐文等对白星花金龟绿僵菌进行了初步研究。2008年刘玉升等对山东白星花金龟幼虫病原菌进行分离，鉴定出绿僵菌M-08，对白星花金龟有很好的毒力。新疆是典型的干旱区绿洲荒漠生态系统，关于新疆地区的绿僵菌及其防治白星花金龟的研究应用等尚未见报道。

随着新疆农业结构的不断调整，瓜果、蔬菜等园艺作物种植面积逐年增加，到2015年新疆优质林果面积将稳定在1×10⁶hm²以上。白星花金龟的危害也不断上升，每年造成的产量损失达20％左右，已成为制约新疆特色林果产业快速发展亟需解决的问题。利用昆虫病原真菌对白星花金龟幼虫进行防治，不仅经济省力，同时对确保农产品质量和食品安全有着重要的意义。致病力是衡量菌株生防潜力的重要指标，绿僵菌对害虫的致病力很大程度上受环境因素的影响。新疆是典型的干旱区绿洲荒漠生态系统，气候地理条件与我国其它地区有很大的差异。直接从外地引进绿僵菌资源进行开发利用，可能无法适应新疆干旱的气候条件，因此开发本地绿僵菌资源尤为重要。本发明利用分离得到的新疆本土绿僵菌TLF菌株对不同龄期的白星花金龟幼虫进行致病力测定，累计校正死亡率均达到100％，田间通过人工培养的绿僵菌喷施堆肥对白星花金龟幼虫的防效也高达90%以上。

然而在进行绿僵菌堆肥处理时，传统的施用方法需要将堆肥进行翻混施药，工作量非常大；同时，施用人员要忍受粪肥散发的难闻的气味和堆肥肮脏的环境等；更重要的是在进行翻混法喷施堆肥时需要的绿僵菌液量非常大，成本很高，因此，虽然该方法在田间应用中获得理想的防治效果，但在推广应用中难度很大，成为该项技术进行大面积推广应用的瓶颈，必须改进施用技术。通过对白星花金龟生物学特性的研究发现，该害虫的成虫主要在各种堆肥中产卵，然后以幼虫取食堆肥中的有机质和腐殖质。虽然该害虫幼虫在地面堆肥中取食，但是有向地下转移的习性，最主要的活动和化蛹区域在粪土交界处上下5-15cm内，因此，利用这个习性，将绿僵菌在堆肥前喷施在堆肥地面面，当幼虫向土壤中移动时接触绿僵菌而被寄生，然后通过被寄生幼虫在堆肥和表土层中的转移、活动将绿僵菌携带和扩散，造成种群的病害流行，进而将该害虫控制在虫源地。田间调查表明，堆肥前应用绿僵菌喷施堆肥场地地面，在施用后25天，堆肥东、西、南、北4个不同方位对白星花金龟幼虫的寄生率达6.25-69.23%；施用绿僵菌38天后，效果显著提高，寄生率高达38-96%。因此，堆肥前应用绿僵菌处理堆肥场地的地面更简便和易于推广，可以有效地控制堆肥中白星花金龟幼虫的虫口基数，从源头上控制白星花金龟的危害。

发明内容

本发明目的在于，提供一种绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法，该方法应用金龟子绿僵菌对白星花金龟幼虫高效的生物防治。防治的原理是利用白星花金龟成虫在堆肥中产卵，幼虫在堆肥中取食、越冬并在地下5-15cm土层中分布最多、做土室化蛹的特性，在堆肥前将人工培养的金龟子绿僵菌喷施到堆肥场地的地面，在白星花金龟幼虫从堆肥向土层转移的过程中被寄生，并通过被寄生幼虫在堆肥和表土层中的转移、活动将绿僵菌携带和扩散，造成种群的病害流行，进而将该害虫控制在虫源地，减少农药使用，保护环境，为今后大力发展有机农业提供技术支撑。

一种绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法，其特征在于按下列步骤进行：

a.采用金龟子绿僵菌在堆肥前处理白星花金龟幼虫虫源地为农家肥堆肥地面；

b.在堆肥前测量堆肥场地地面的面积，然后依据测量的面积准备人工培养的金龟子绿僵菌；

c.将人工培养的金龟子绿僵菌采用浓度为0.1%吐温-80稀释液，配制成孢子悬浮液；

d.将步骤c中配制的悬浮液用喷雾器均匀喷洒到测量的堆肥场地地面，然后立刻在处理的地面进行堆肥即可。

步骤c中配制孢子悬浮液的浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁸。

步骤d中用喷雾器的喷液量为2L/m²。

本发明所述的绿僵菌喷施堆肥地面防治白星花金龟幼虫的方法，该方法中所述的绿僵菌为本课题组分离培养的新疆本土金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae TLF菌株，2011年从新疆吐鲁番地区采集自然罹病死亡的白星花金龟（Potosia brevieasis）幼虫僵虫，将表面的杂物洗净，用5％次氯酸钠表面消毒4-5min，灭菌水洗净后，将虫体接入结晶紫培养基中，温度25℃培养7d。挑取虫体上长出的菌丝体接入马铃薯琼脂培养基平板培养基，产孢后进行单孢分离。将分离纯化的菌株接入蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面培养基，温度25℃培养7d后存于4℃冰箱中备用。该菌株能够很好地适应新疆干旱的气候条件，春季处理堆肥，对白星花金龟幼虫的寄生死亡率可达90-100％。关于该菌株的分离鉴定及对白星花金龟的致病力测定已投稿《中国生物防治学报》，论文题目为“新疆白星花金龟绿僵菌分离鉴定及致病力测定”；

绿僵菌TLF菌株的分离鉴定：

从吐鲁番地区获得1个菌株，记为TLF；将TLF回接至未感病的白星花金龟幼虫，发病后再次分离，虫体感染特征、培养性状、菌体形态和回接菌株完全一致，根据柯赫氏法则，确认所分离菌株为白星花金龟致病菌；

虫体感染特征：白星花金龟幼虫感染TLF菌株后，在光照条件下行动迟缓，逐渐停止取食，死后虫体稍膨胀。虫尸僵化，不腐烂，无异味，初期虫体长出白色菌丝。老熟幼虫化蛹时死于蛹室中体被白色菌丝(图1A)，后期全体长满粉状墨绿色孢子(图1B）；

绿僵菌TLF菌株的菌落及菌体形态特征及鉴定：

菌落形态特征：TLF菌株在PPDA培养基上培养。初期菌丝白色絮状，菌落圆形呈放射状扩展(图3A)，产孢期菌落中央为橄榄绿色分生孢子层，边缘为白色菌丝(图3B)，后期分生孢子层由绿色逐渐变为墨绿色附着于菌落表面，菌落背面呈深黄色（图3C）；

菌体形态特征：在显微镜下观察，菌丝宽1.4μm-1.7μm，具分枝和分隔，透明(图4A)。分生孢子梗宽1.9μm-2.7μm单生或分枝(图4B)，末端产生瓶形小梗(图4C)。从小梗基部形成念珠状排列的分生孢子，部分单生(图4D)。分生孢子单细胞，圆柱形（7.8-10.2μm×2.6-3.8μm），淡绿色，脱落的孢子常聚集为不规则块状，墨绿色。通过形态学初步鉴定TLF菌株为子囊菌亚门，核菌纲，球壳菌目，麦角菌科，绿僵菌属，金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae。

TLF菌株致病力测定：

配制TLF分生孢子悬浮液，对白星花金龟3个龄期的幼虫进行了毒力测定。

在处理15d时（表1），菌株TLF对白星花金龟2龄幼虫的LC₅₀为2.07×10⁶，斜率为0.635。对白星花金龟3龄幼虫的LC₅₀为43.02×10⁶，斜率为0.814；

表1菌株TLF和ANQ对白星花金龟幼虫的致病力（15d）

注：*不同小写字母表示差异达5%显著水平。

在接种21d后，菌株TLF对1龄幼虫都表现出高致病力，校正死亡率达100%。菌株TLF对白星花金龟2龄幼虫的累计校正死亡率均达100%，对白星花金龟3龄幼虫的累计校正死亡率均达90%。该菌株对1、2龄幼虫的侵染能力强于3龄幼虫，差异显著（表2）；

表2孢子悬液浓度为5.0×10⁷孢子·mL^-1菌株TLF对白星花金龟幼虫的致病力

注：*不同小写字母表示差异达5%显著水平。

本发明所述的绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法，该方法主要目的是为了解决在进行绿僵菌堆肥处理时，需要将堆肥进行翻混施药，工作人员需要忍受难闻的气味和肮脏的工作环境，同时对堆肥整体处理需要的绿僵菌液量也很大，因此在推广应用中难度很大，必须改进施用技术。通过对白星花金龟生物学特性的研究发现，该害虫虽然在地面堆肥中取食，但是有向地下转移的习性，最主要的活动和化蛹区域在粪土交界处上下5-10cm内，因此，利用这个习性，将绿僵菌在堆肥前喷施在堆肥场地地面，当幼虫向土壤中移动时接触绿僵菌而被寄生。本发明所述的绿僵菌喷施堆肥地面防治白星花金龟幼虫的方法，不仅解决了绿僵菌翻混法处理堆肥时遇到的问题，还大大简化了施药技术，节省了喷液量，成为一项高效、经济、简便、易行的白星花金龟幼虫生物防治方法，能够被广大的农民、技术人员掌握和应用。

附图说明

图1为本发明白星花金龟幼虫被绿僵菌感染症状图，其中A为老熟幼虫化蛹时死于蛹室中；B为感染绿僵菌的幼虫症状；

图2为本发明处理堆肥地面后被绿僵菌寄生的白星花金龟幼虫图；

图3为本发明不同培养时期绿僵菌菌落形态特征图，其中A为菌落初期形态（7d）；B为菌落产孢期形态（15d）；C为菌落背面形态（15d）；

图4为本发明绿僵菌菌体形态特征图，其中A为菌丝；B为分生孢子梗；C为分生孢子梗小梗；D:分生孢子；

图5为本发明处理堆肥地面后25天绿僵菌对白星花金龟幼虫的防效图，其中横坐标为堆肥的不同方向调查点，纵坐标为田间防效（%），其中代表推广中心试验点的田间防效；□代表五一农场试验点的田间防效；

图6为本发明处理堆肥地面后38天绿僵菌对白星花金龟幼虫的防效图，其中横坐标为堆肥的不同方向调查点，纵坐标为田间防效（%），

代表推广中心试验点的田间防效；□代表五一农场试验点的田间防效。

具体实施方式

实施例

材料与方法：

试剂：绿僵菌孢子粉，性状：绿色粉末，无特殊气味，Tween-80，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，规格：500ml；

仪器和试剂：喷雾器，量筒；

方法：

2013年9月13日，选取推广中心和五一肥料厂两个有合适白星花金龟幼虫虫源的农家肥堆肥场所作为试验地，在堆肥前测量堆肥场地的面积，然后准备足量的新疆本地人工培养的金龟子绿僵菌，将培养的绿僵菌孢子粉按等分分为两份，其中1份为对照，将新疆本地人工培养的金龟子绿僵菌采用浓度为0.1%吐温-80稀释液，配制成浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁸孢子悬浮液，再将配制的悬浮液用喷雾器以2L/m²的喷液量均匀分别喷洒于两个试验地点直径3米的的堆肥地面面，然后在地面面立刻堆肥。并在对照组喷洒15L的水，在施用第25天和38天共调查两次，先调查对照组，分别在东、西、南、北4个方向各取一个样点，每个样点长宽高各50cm的体积，分别记录各处理被寄生和未寄生虫量以及各虫的龄期，计算绿僵菌菌株对白星花金龟幼虫的寄生率和校正防效；

结果与分析：

田间调查表明，推广中心和五一肥料厂两个试验点的对照区均未发现绿僵菌寄生白星花金龟幼虫，自然寄生率为0；由图5显示，绿僵菌施用后25天，推广中心和五一肥料厂两个试验点已经表现寄生作用，其中推广中心试验点的田间防效达40-60%，而五一肥料厂的寄生率为6.25-69.23%，其中南面和西面寄生率较低，分别为6.25%和25%，东面的防效最高，达到69.23%。

施用绿僵菌38天后，效果显著提高。推广中心试验点除了西向调查点没有被寄生的幼虫外，东、南和北向的田间防效达到50-67%，五一肥料厂四个调查点的寄生率为38-96%，其中仍然是西、南方向的防效最低，东向的防效最高，达到96%；（图6）应用绿僵菌处理堆肥地面更简便和易于推广，可以有效地控制废料堆的虫口基数，从源头上控制白星花金龟的危害。

Claims (3)

1.一种绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法，其特征在于按下列步骤进行：

a. 采用金龟子绿僵菌在堆肥前处理白星花金龟幼虫虫源地为农家肥堆肥地面；

b. 在堆肥前测量堆肥场地地面的面积，然后依据测量的面积准备人工培养的金龟子绿僵菌；

c. 将人工培养的金龟子绿僵菌采用浓度为0.1%吐温-80稀释液，配制成孢子悬浮液； 

d. 将步骤c中配制的悬浮液用喷雾器均匀喷洒到测量的堆肥场地地面，然后立刻在处理的地面进行堆肥即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中配制孢子悬浮液的浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁸。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤d中用喷雾器的喷液量为2L/m² 。

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