CN112694978A - 一株绿僵菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株绿僵菌及其应用，属于生物技术领域。该菌株已于2021年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.3.19644，分类学命名为：石家庄绿僵菌(Metarhiziumshijiazhuangense)。经过杀虫试验表明该菌株对森林革蜱和长角血蜱具有较好的杀灭作用，尤其是对长角血蜱效果更显著。该菌株可有效控制森林革蜱和长角血蜱的种群数量，减少由其带来的危害，是一株在防治森林革蜱和长角血蜱上具有潜在意义的生防菌株，具有杀虫毒力强、杀虫效果好等特点。

Description

一株绿僵菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株绿僵菌及其应用。
背景技术
蜱类隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨亚纲寄螨总目蜱目，是专性吸血的外寄生动物，传播多种病原体而导致疾病，给人类健康、畜牧业生产及野生动物带来极大危害。蜱类是传播病原体种类最多的媒介节肢动物，蜱传疾病主要包括莱姆病、蜱媒斑点热、Q热和发热伴血小板减少综合征等，且不断有新发的蜱传疾病出现，对人类健康造成的危害仅次于蚊类，如何防治是迫切需要解决的问题。
目前防治蜱的方法主要有：(1)化学农药杀虫剂。毒死蜱、马拉硫磷、水胺硫磷、氟铃脲均为常用杀虫剂，但容易产生抗药性，混合使用防治效果不错(专利号：CN 107751240A)，但容易造成环境污染，且对人和动物的健康危害极大；(2)天然植物精油。作为植物的次生代谢物质，部分植物精油在蜱防治领域具有较好的应用前景，但可选择应用的植物精油种类较少，且大规模应用还存在局限；(3)可侵染蜱类的真菌。暴露于棕色绿僵菌Metarhizium brunneum侵染的农田中，93％的镰形扇头蜱雌蜱在一周内死亡，蜱感染真菌后，卵的孵化率降低35.7％-88.0％。绿僵菌以孢子发芽侵入蜱体内，快速繁殖并产生毒素，导致蜱死亡，僵虫体内的病菌孢子散出后，可侵染其他健康蜱，在种群内重复感染，引起大量蜱死亡，一次施药持续时间长。绿僵菌是一类重要的生防真菌，能够感染致死8目42科200多种昆虫，致病力强、效果好，对人、畜和害虫的天敌昆虫安全，不污染环境，是害虫防治的良好选择，筛选出更多的绿僵菌菌株无疑对蜱的防治有巨大帮助。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株绿僵菌SH3-4，该绿僵菌分离自河北省石家庄市太行山土壤，菌株已于2021年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.3.19644，分类学命名为：石家庄绿僵菌(Metarhizium shijiazhuangense)。
本发明所提供的绿僵菌SH3-4经形态学、培养状态、常规生理生化和DNA序列测定，明确该菌株为黄绿绿僵菌的变种，将其命名为石家庄绿僵菌(Metarhiziumshijiazhuangense)SH3-4，并构建发育树。
上述石家庄绿僵菌SH3-4的基本生物学特性为：
菌株在平板PDAY培养基上划线培养，在25℃培养14天可长出11-19个菌落，其表面形状为絮状，有气生菌丝，菌落最初为白色，由于分生孢子的产生，4天内逐渐变成浅绿色，反向为淡绿色。
本发明的目的之二在于提供所述绿僵菌在防治森林革蜱和长角血蜱中的应用。
本发明的目的之三在于提供所述绿僵菌在制备防治森林革蜱和长角血蜱药物中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种防治森林革蜱和长角血蜱的生物制剂，该生物制剂包含保藏编号为CGMCC No.3.19644的绿僵菌。
进一步的，所述生物制剂中绿僵菌孢子悬浮液的浓度为2×108孢子/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对太行山土壤进行筛选获得一株石家庄绿僵菌(Metarhiziumshijiazhuangense)SH3-4，经过杀虫试验表明该菌株对森林革蜱和长角血蜱具有较好的杀灭作用，尤其是对长角血蜱效果更为显著，其可以有效控制森林革蜱和长角血蜱的种群数量，减少由其带来的危害。该菌株具有杀虫毒力强、杀虫效果好等特点，是一株在防治森林革蜱和长角血蜱上具有潜在意义的生防菌株。
附图说明
图1为实施例1中“黄粉虫诱饵法”诱集的黄绿绿僵菌图。
图2为实施例1中绿僵菌菌落形态图。
图3为实施例1中9株菌的系统发育树图。
图4为实施例2中模式昆虫黄粉虫幼虫感染9株菌的死亡率平均值和标准差。
图5为实施例2中饥饿森林革蜱感染SH3-4菌株死亡的僵虫表型图。
图6为实施例2中饱血长角血蜱感染SH3-4菌株死亡的僵虫表型图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供黄绿绿僵菌SH3-4的分离和形态鉴定。
一、绿僵菌的分离
将在河北省石家庄市西柏坡采集的土壤样本带回实验室，用无菌ddH2O湿润后，200g土壤转移至500mL聚乙烯塑料杯中，每个塑料杯中放入10只黄粉虫，每杯用带有2-2.5mm氧孔的通风盖子盖好，每天旋转塑料杯，利用黄粉虫的蠕动，增加与土壤中真菌接触的机会，每周监测黄粉虫的存活情况。取出采用“黄粉虫诱饵法”诱集的黄绿绿僵菌的僵虫(如图1所示)，分别用无菌ddH2O洗涤后，置于铺有湿润滤纸的无菌培养皿(35×10mm)中，使用无菌牙签从每一只感染的僵虫中分离真菌，分别转入含有0.6g硫酸链霉素(MPBiomedicals，美国)和0.5g氯霉素(MP Biomedicals，美国)的PDAY培养基。初期(培养4天)，菌落没有特定颜色，5-7天后逐渐变成淡黄的橄榄色，成熟的分生孢子变成浅绿色，菌落最中央偶有白点。三周后，根据菌落形态特征、产孢结构和孢子形状与大小(如图2所示)，初步判断应该为黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)的变种。每一只黄粉虫僵虫分离出的绿僵菌为一个菌株，分别记为SH3-1、SH3-2、SH3-3、SH3-4、SH3-5、SH3-6、SH3-7、SH3-8和SH3-9。纯化后，取出一小块带菌的琼脂置于含20％灭菌甘油的2mL无菌离心管中，保存在-80℃冰箱中，供进一步研究。
二、绿僵菌的序列测定与系统发生分析
28个检测标识序列为EF1T、EFjmetaR、983F、2218R、BT1_clav、BT22、ITS1、ITS4、Mz_FG543igs_1F、Mz_FG543igs_4R、RPB1-Af、RPB1-6R1asc、RPB1-DF2asc、RPB1-G2R、RPB2_5F、fRPB2_7CR、fRPB2_7CF、fRPB2-11aR、APN_clavF2、APN_clavR8、NS1、NS4、LROR、LR6、MAT111_1F、MAT111_3R、MAT121_3F和MAT121_4R基因，由北京华大基因科技服务有限公司进行引物合成，并测序鉴定。将获得的菌株序列提交到Genbank中利用Blast程序进行相似序列比对，选取黄绿绿僵菌属的几种菌株构建系统发育树，结果如图3所示。结果表明，本发明所述9个菌株与瘿绵蚜绿僵菌(M.pemphigi)和高黎贡绿僵菌(M.gaoligongensis)亲缘关系相近。根据菌株的形态特征和系统发育分析，将菌株命名为石家庄绿僵菌(Metarhiziumshijiazhuangense)。
实施例2
用9株菌感染模式昆虫黄粉虫的幼虫，实验结果如图4所示，选取杀虫活性高的SH3-4菌株对森林革蜱和长角血蜱进行杀虫活性测定，步骤如下：
将SH3-4菌株接种于加有1％酵母的PDAY平板上，置于恒温恒湿培养箱(25℃，相对湿度90％)避光培养15d。用消毒后的木质抹刀将真菌孢子转移至0.01％吐温-20溶液中，消毒纱布过滤除去大块的菌丝体，得到真菌分生孢子悬液，随即用血细胞计数板确定最终孢子浓度，石家庄绿僵菌SH3-4的孢子萌发率为95％。将1mL稀释后的孢子溶液(2×108孢子/mL)喷洒到饱血期长角血蜱(90头)和饥饿期森林革蜱(90头)体表，然后将蜱分成3组，对照组用0.01％的吐温-20溶液处理。每组处理三个重复，每个重复30头蜱，置于50mL离心管和90mm无菌培养皿中，放于25℃，相对湿度90％，光照周期L：D(12h∶12h)的恒温恒湿培养箱中培养，每两天取出并记录饱血期长角血蜱和饥饿期森林革蜱死亡情况，其死亡僵虫分别如图5和图6所示，其死亡率的统计结果如表1所示。由表1可知，感染绿僵菌SH3-4的森林革蜱21天后死亡率达到40.5％(±1.9％，±SD)，长角血蜱在感染5天后开始死亡，18天后死亡率增加到78％(±2.1％，±SD)。
表1
Figure BDA0002936873890000041
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一株绿僵菌，该菌株已于2021年01月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.3.19644。
2.权利要求1所述的绿僵菌在防治森林革蜱和长角血蜱中的应用。
3.权利要求1所述的绿僵菌在制备防治森林革蜱和长角血蜱药物中的应用。
4.一种防治森林革蜱和长角血蜱的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含权利要求1所述的绿僵菌。
5.如权利要求4所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中绿僵菌孢子悬浮液的浓度为2×108孢子/mL。
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