CN117925420A - 一种莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体地涉及一种莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株及其培养方法和应用，所述莱氏绿僵菌Mryscm2308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年09月22日，保藏编号为CGMCC No.40831，分类命名：莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi，本发明提供的莱氏绿僵菌Mryscm2308培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高，易于在室内大量培养繁殖，是一种能用于防治危害水稻的害虫稻纵卷叶螟的生防真菌。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地涉及一种莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株及其培养方法和应用。
背景技术
稻纵卷叶螟 Cnaphalocrocis medinalis Guenee，隶属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，俗称水稻包叶虫、卷叶虫，是水稻的主要迁飞性害虫，广泛分布于各稻区。稻纵卷叶螟不仅能取食为害水稻，还为害小麦Triticum aestivum、大麦Hordeum vulgare、玉米Zea mays和甘蔗Saccharum officinarum等作物，以及稗草Echhinochloa crusgalli和狗尾萆Setaria viridis等禾本科杂草。稻纵卷叶螟幼虫吐丝卷叶形成虫苞并取食叶肉，水稻叶片被稻纵卷叶螟为害过后呈现白色条状斑纹，引起水稻叶片光合作用减少，抑制水稻分蘖，影响幼穗发育，最终导致水稻减产、减收，一般减产10%～20%，严重达60%以上。
现有技术中，目前对于稻纵卷叶螟的防治主要依靠喷施化学农药进行防治，然而化学农药的大量使用已使该虫产生了较强的抗药性，因而为该害虫防治带来了新的挑战。此外，使用化学农药防治还会带来农药残留、人畜安全隐患和生态环境影响的风险。因此，探求绿色、安全、高效、持续的防治稻纵卷叶螟的措施已势在必行。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株以为稻纵卷叶螟绿色防治方法提供新途径。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
一种莱氏绿僵菌（Metarhizium rileyi）Mryscm2308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年09月22日，保藏编号为CGMCC No.40831，分类命名：莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。
本发明提供了一种莱氏绿僵菌Mryscm2308的培养方法，所述方法为将莱氏绿僵菌Mryscm2308接种至SDAY固体培养基进行培养，待其产生大量的分生孢子后，制备孢子悬浮液。
进一步的，培养条件为：温度26±1℃，相对湿度75％±5%,光周期L：D=14 h：10 h的培养箱中培养。
进一步的，制备孢子悬浮液的方法为：将分生孢子加入浓度为0.05%的吐温-80的无菌水为溶液中，配制成不同浓度的孢子悬浮液。
本发明还提供了一种杀虫剂，所述杀虫剂含所述的莱氏绿僵菌Mryscm2308的孢子。
进一步的，所述杀虫剂含莱氏绿僵菌Mryscm2308的孢子量为1.0×104–1.0×108个/mL。
本发明提供的所述莱氏绿僵菌Mryscm2308或所述杀虫剂在防治稻纵卷叶螟中的应用。
进一步的，提供了一种稻纵卷叶螟的防治方法，于发生稻纵卷叶螟虫害的作物上施用所述的杀虫剂，施用时稻纵卷叶螟处于幼虫期。
进一步的，所述作物包括小麦、大麦、玉米、甘蔗、稗草或狗尾草。
本发明达到的技术效果为：
本发明提供的莱氏绿僵菌Mryscm2308培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高，易于在室内大量培养繁殖，是一种能用于防治危害水稻的害虫稻纵卷叶螟的生防真菌，具有对稻纵卷叶螟幼虫致病性强、对环境安全、不易使害虫产生抗药性的特点，可以用于生物防治稻纵卷叶螟。
附图说明
图1为本发明的莱氏绿僵菌Mryscm2308分生孢子及孢囊梗形态图；
图2为本发明的莱氏绿僵菌Mryscm2308菌落形态图；
图3为本发明的莱氏绿僵菌Mryscm2308自然感染稻纵卷叶螟幼虫的症状图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供的莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年09月22日，保藏编号为CGMCC No.40831，分类命名：莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。
实施例
莱氏绿僵菌Mryscm2308的分离及鉴定
于2023年8月11在云南省保山市腾冲市观自段村旱地稻田（N104.52，E23.93，海拔1423米）罹病稻纵卷叶螟幼虫上采集到菌株样品，经过分离、纯化、毒力测定和筛选确定为莱氏绿僵菌，经测试发现该菌对稻纵卷叶螟幼虫具有强致病性。
1.1材料
1.1.1供试菌株
菌株于2023年8月11日采自云南省保山市腾冲市观自段村旱地稻田罹病稻纵卷叶螟幼虫。
1.1.2菌株的分离培养
将采集到的罹病稻纵卷叶螟虫体置于5 mL无菌EP管中带回实验室，采用划线法，在SDAY固体培养基（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏粉10 g，琼脂20 g，余量为水，1000mL，pH自然）上，于温度26±1℃，相对湿度75％±5%，光周期L：D=14 h：10 h的培养箱中培养。培养7 d后，将分生孢子转接到新的培养基上进行纯化。纯化的菌株采用SDAY斜面培养基保存于4℃冰箱。
1.1.3 菌落形态观察
将分离并纯化的真菌接于SDAY固体培养基（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏粉10 g，琼脂20 g，余量为水，1000mL，pH自然）上，置于温度26±1℃，相对湿度75％±5%，光周期L：D=14 h：10 h的培养箱中培养，于3、7和14 d时，分别测定菌落直径并观察菌落形态特征。
1.2结果
获得纯培养莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株后，对其形态特征进行鉴定。结果如图1、2，该菌株在SDAY培养基上培养至第10d时，菌落直径达9.65~10.45 mm，菌落正面具有白色绒毛，中间略凸起，菌落的背面颜色从边缘到中心由浅至深，从黄绿色到中心1/2处变为黄褐色；菌丝光滑，有分隔，菌丝直径2~3 μm；分生孢子梗直立呈葡萄穗状；生孢子呈长椭圆形，表面光滑，分生孢子一端尖，另一端略钝，大小为4.65μm×1.85μm。采用ITS序列分析法进行分子系统学鉴定，测得莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株的ITS 基因序列如SEQ ID No.1所示，经过多重序列比对，鉴定为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi并进行保藏，保藏编号：CGMCC No.40831。
SEQ ID No.1
GCTTCTTTCCCCTTTTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCGTACCTGATTCGAGGTCAACTCTTGGAGAAGTTTGTGCGTTTTACGGCAGTGGCCGCGCCGCGCTCCTGTTGCGAGGTTGTGCTACTACGCAGAGGAGGCCGCGACGGGGCCGCCAATTCATTTCGGGGGCGGCGCCGCAGGGAACCGCCTGAGCGGCCCAGCTGACAATCGCCGGCCCCCAACACCAAACCGCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTTGTATGATTCCACTCAGACGTGCCAAAGGCTAAGAGATACAGAGTTTCGGTCCCGCGGCGGGCGCCTGTTTCCGGGCGGGCTCTGGACGAGCCCGGTCCGGGGCAAATGACCCGCCGAGGCAACAGGAAAAGGGTATAAGTTCACATGGGGTTTGGGAGTTGTAAGGTCGAGTAATGATCCCTCCGCAGGTCCCCCCTACGGAAA
实施例
莱氏绿僵菌Mryscm2308对稻纵卷叶螟的致病性测定
1材料
1.1.1供试昆虫
稻纵卷叶螟均采集于云南省保山市腾冲市观自段村旱地稻田，并于室内连续饲养3代，在温度26±1℃、相对湿度（RH）75±5%、光周期L：D=14h：10h条件下的智能人工培养箱（RG-300）中进行。稻纵卷叶螟幼虫用新鲜水稻叶进行饲养，幼虫蜕皮5次后发育成为蛹，蛹饲养7天后，即羽化出成虫，成虫产卵后，将卵块在水稻叶上继续饲养，3天左右即能得到稻纵卷叶螟幼虫。供生物测定用。
1.1孢子悬浮液制备
将分离获得的菌株接种于SDAY固体培养基，置于温度26±1℃，相对湿度75％±5%，光周期L:D=14h:10 h的培养箱中培养，待其产生大量的分生孢子后（约20 d），用无菌解剖刀刮取培养基表面的分生孢子置于浓度为0.05%的吐温-80的无菌水溶液中，配制成1.0×104–1.0×108个孢子/mL的孢子悬浮液。
1.1.2浸渍法
挑选同日羽化的大小一致、健康的稻纵卷叶螟3龄幼虫，采用浸渍法进行接种，挑选3龄稻纵卷叶螟幼虫用于试验。接种后将稻纵卷叶螟幼虫放置到自制的保鲜膜养虫笼中(20 cm×20 cm×20 cm)，每天定时放入新鲜水稻叶。每组试验分别设置5个重复，每个处理重复10头。接种后每天定时观察幼虫死亡情况以及感染情况，当发现有死亡虫体时，及时将死亡虫体取出放入底部垫有灭菌滤纸的直径9 cm的灭菌培养皿中，盖上培养皿盖，再放置于（25±1）℃、相对湿度(75％±5%)、L:D=14 h:10 h的光照培养箱中培养，每天定时观察虫体表面菌丝或分生孢子生长情况，并镜检分生孢子及菌丝形态，以确定虫体上长出的菌为接种处理的菌。
1.1.3数据分析
采用Excel 2010进行数据整理，累积死亡率采用DPS数据处理系统14.0软件进行计算。
2.结果
2.1稻纵卷叶螟的累积死亡率
由表1可知，在莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株1.0×108个孢子/mL浓度接种处理后第3、5、7、9天时，稻纵卷叶螟幼虫的死亡率分别为23.33%、53.33%、96.67%和100%。表明到接种后第10天时，稻纵卷叶螟幼虫的死亡率即可达到100.00%。由此可以看出，莱氏绿僵菌Mryscm2308对稻纵卷叶螟幼虫具有很强的致死作用。莱氏绿僵菌Mryscm2308对稻纵卷叶螟幼虫的累积死亡率（%）如表1所示：
表 1
2.2莱氏绿僵菌Mryscm2308对稻纵卷叶螟的致死时间效应
对稻纵卷叶螟3龄幼虫的致病性测定结果表明，该菌株对稻纵卷叶螟的致病力符合时间-剂量死亡率模型，LT50随孢子悬浮液浓度的增加而缩短，在浓度为1.0×104个孢子/mL时，对稻纵卷叶螟幼虫的LT50为3.5天；浓度为1.0×107个孢子/mL时，对稻纵卷叶螟幼虫的LT50仅为1.6天（表2）。
稻纵卷叶螟3龄幼虫被莱氏绿僵菌Mryscm2308感染致死后，体色由黄绿色逐渐变深褐色，之后虫体变僵硬；将死亡虫体在26℃进行保湿培养，第3天时稻纵卷叶螟幼虫气门以及节间部位开始长出微量菌丝；第5天时虫体腹节部分基本被菌丝覆盖；培养第7天后，除头部外，虫体胸腹部均长满白色菌丝，如图3；第8天开始有橄榄色分生孢子产生；第10天时，整个虫体胸部和腹部都长满分生孢子，呈深绿色。
表 2
2.3莱氏绿僵菌Mryscm2308对稻纵卷叶螟的致死剂量效应
根据莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株孢子悬浮液对稻纵卷叶螟幼虫的感染致病效应，计算获得莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株对稻纵卷叶螟幼虫的LC50，如表3所示，在接种后分别在第1、2、3、4、5和第6天使稻纵卷叶螟幼虫致死的LC50分别为1.20×108、2.70×106、4.57×104、2.66×103、6.11×10和1.40×10个孢子/mL。
表 3
本发明研究课题组于2023年8月，在云南省保山市腾冲市观自段村稻田测试发现的莱氏绿僵菌Mryscm2308菌株对稻纵卷叶螟幼虫具有强致病性。
综上所述，本发明提供的莱氏绿僵菌Mryscm2308对稻纵卷叶螟幼虫具有强致死效应。莱氏绿僵菌Mryscm2308是一种能用于绿色防治稻纵卷叶螟的生防真菌，具有对稻纵卷叶螟致病性强、环境无污染、害虫不易产生抗药性的特点，可以广泛用于生物防治稻纵卷叶螟。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种莱氏绿僵菌Mryscm2308，其特征在于，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年09月22日，保藏编号为CGMCC No.40831，分类命名：莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi。
2.权利要求1所述的莱氏绿僵菌Mryscm2308的培养方法，其特征在于，所述方法为将莱氏绿僵菌Mryscm2308接种至SDAY固体培养基进行培养，待其产生大量的分生孢子后，制备孢子悬浮液。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，培养条件为：温度26±1℃，相对湿度75％±5%，光周期L：D=14 h：10 h的培养箱中培养。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，制备孢子悬浮液的方法为：将分生孢子加入浓度为0.05%的吐温-80的无菌水溶液中，配制成不同浓度的孢子悬浮液。
5.一种杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂含权利要求1所述的莱氏绿僵菌Mryscm2308的孢子。
6.根据权利要求5所述的杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂含莱氏绿僵菌Mryscm2308的孢子量为1.0×104–1.0×108个孢子/mL。
7.权利要求1所述的莱氏绿僵菌Mryscm2308或权利要求5所述的杀虫剂在防治稻纵卷叶螟中的应用。
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