CN102229892A - 一种莱氏野村菌菌株及其应用 - Google Patents

一种莱氏野村菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

一种莱氏野村菌（Nomuraearileyi）菌株CQNr126，其保藏号为CGMCC No.4610；本发明菌株产孢能力强、在3/4SMAY培养基平板上的产孢量可达2.2×108个孢子/平方厘米、其生产性状好、生长迅速，对稻纵卷叶螟和二化螟杀虫活性强、杀虫效果好，对稻纵卷叶螟与二化螟幼虫致死中时（LT50）分别为6.03天和6.42天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，可有效地控制了稻纵卷叶螟种群与二化螟种群数量。

Description

一种莱氏野村菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种杀虫真菌，具体涉及一种莱氏野村菌菌株及其应用，属于生物农药领域。
背景技术
虫生真菌是最重要的杀虫微生物类群，在自然条件下约70%的昆虫病害是真菌引起的，是唯一具有触杀特性和流行性的病原微生物，其致病机制复杂，因而尽管它是最早应用于害虫防治的微生物，但是仍未发现有抗性害虫产生，对解决害虫的抗药性问题极具潜力。同时，杀虫真菌具有较强的垂直与水平扩散能力，有助于害虫的持续控制与害虫流行病的发生，这对迁飞性害虫稻纵卷叶螟的控制尤为有利。
稻纵卷叶螟、二化螟是水稻主要害虫之一，国内广泛分布于全国各稻区，严重的威胁着我国粮食生产。目前控制稻纵卷叶螟主要是施用广谱性化学农药，这直接威胁人、蓄安全，同时由于稻纵卷叶螟和二化螟抗药性的产生和化学农药大量杀伤稻纵卷叶螟天敌，使稻田生态平衡受到破坏，严重削弱田间自然控制能力，这些导致稻纵卷叶螟的再度猖獗。因此，开发安全、具有持续控制作用的杀虫真菌农药替代化学农药对保护水稻种植区环境安全与生物多样性具有重要意义。 
作为化学农药重要的替代产品之一，杀虫真菌的研究与应用受到广泛关注。迄今为止，国内外先后登记注册杀虫真菌农药100多个。国内对真菌生防的研究始于20世纪50年代，目前在杀虫真菌液固两相生产技术、制剂研发和规模化生产等方面处于国际领先地位。一些杀虫真菌农药已广泛用于森林、草原害虫的防治。但利用虫生真菌同时控制稻纵卷叶螟、二化螟等虫害尚未见到相关报道，其主要原因之一是缺乏高杀虫活性、同时生产性状优良的杀稻纵卷叶螟、二化螟昆虫病原真菌菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对稻纵卷叶螟、二化螟具有好的杀虫效果同时生产性状好的莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126。
本发明菌株是通过采集自然感染的稻纵卷叶螟僵虫直接分离筛选出的一株生产性状好的高效杀虫莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126，其已在北京中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏日期是2011年2月25日，保藏号是CGMCC NO.4610。
本发明CQNr126菌株接种在萨氏麦芽琼脂（SMAY）平板上，25℃培养观察：气生菌丝光滑具分隔，宽2-3μm；分生孢子梗直立，具分隔，产自基质菌丝，长150-180μm，宽2-2.5μm，3-4个轮状分枝簇，分枝上紧密着生2-3个瓶梗，光滑，透明至谈绿色，瓶梗4.7-6.5 ×2.5-3μm，分生孢子广拟椭圆形，光滑，成堆时草绿色，大小为3.5-4.5 ×2-3 μm。
本发明技术方案是经过采集自然感病稻纵卷叶螟僵虫→分离纯化菌株→鉴定菌株的分类地位→确定菌株的培养条件→平板固体发酵→干孢子粉收集→室内、室外杀虫效果测定等步骤，反复筛选出的一株对稻纵卷叶螟、二化螟具有高杀虫活性、生产性状好的莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126。
为了进一步提高本发明菌株的产孢性状、以便更适于孢子批量生产，对本发明菌株发酵优选的培养基为萨氏麦芽琼脂3/4SMAY。在直径为9cm的3/4 SMAY平板上（15mL/皿），接入100μL 浓度为1×107 孢子/mL孢悬液，24℃培养15天，产孢量达到2.2×108个孢子/平方厘米。
本发明虫莱氏野村菌菌株具有如下的有益效果：
本发明从自然感染的稻纵卷叶螟僵虫直接分离筛选的莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126，产孢能力强、产孢率可达3.5%、其生产性状好、生长迅速，对稻纵卷叶螟与二化螟杀虫活性强、杀虫效果好，对稻纵卷叶螟、二化螟幼虫致死中时（LT50）分别为6.03天和6.42天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了稻纵卷叶螟种群和二化螟种群数量。
附图说明
图1（a）： CQNr126菌株产孢结构；
图1（b）： CQNr126菌株孢子形态大小。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1   菌株的分离
将采集到的自然感染的稻纵卷叶螟僵虫用70%酒精表面消毒，放入25℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取微量新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的萨氏麦芽琼脂（SMAY）培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于25℃恒温箱中培养；3—6日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，25℃恒温培养15天。
实施例2   菌株鉴定
（1）形态鉴定
 将分离到的CQNr126菌株接种在萨氏麦芽琼脂（SMAY）平板上，25℃培养观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小。结果显示：在麦芽汁琼脂上菌落生长缓慢，结构致密。培养初期菌落呈淡绿色，随后变深绿，背面无色。气生菌丝光滑具分隔，宽2-3μm。分生孢子梗直立，具分隔，产自基质菌丝，长150-180μm，宽2-2.5μm，3-4个轮状分枝簇，分枝上紧密着生2-3个瓶梗，光滑，透明至谈绿色。瓶梗4.7-6.5 ×2.5-3μm，多为短柱状（图1a）。分生孢子广拟椭圆形，光滑，成堆时草绿色，大小为3.5-4.5 ×2-3 μm（图1b）。从以上特征看，菌株CQNr126应该为莱氏野村菌Nomuraea rileyi。
（2）CQNr126菌株的I TS序列扩增、序列测定及分子分类
将CQNr126在萨氏麦芽（SMA）液体培养基摇瓶培养3天（200rpm，25℃），离心(10000 g，20min)收集菌丝，液氮研磨破碎后采用DNA提取试剂盒提取菌株CQNr126的总DNA。以总的DNA为模板，参照Curran扩增绿僵菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区域。所用引物为TW81 5’-gtttccgtaggtgaacctgc -3’和AB28 5’-atatgcttaagttcagcgggt -3’，产生609bp扩增条带。PCR反应在PCR仪上的反应程序：95℃ 4min，1个循环；94℃ 0.5min，53℃ 0.5min，72℃ 0.5min，30循环；最后72℃ 10min。将扩增产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，由上海生工进行双向脱氧法测序。CQNr126菌株 ITS1-5.8S-ITS2测序结果见SEQ ID NO.1。
该序列与NCBI数据库中已之序列比对，符合预期长度。该序列5’端包含18S rDNA部分基因序列（1-33），3’端包含部分28S rDNA基因序列（565-609），其余的分别为ITS1区域(34-214), 5.8S rDNA基因全序列（215-372）以及ITS2区域(373-564)。在NCBI上进行Blast比对，发现该序列与莱氏野村菌Nomuraea rileyi 的ITS序列（AF368501.1、AB268359.1、FJ824809.1、AB100361.1）相似率为99%，E值为0.00。证实：CQNr126菌株的为莱氏野村菌Nomuraea rileyi。    
实施例3    CQNr126对稻纵卷叶螟与二化螟室内杀虫活性
收集在萨氏麦芽琼脂（SMAY）平板上培养的CQNr126成熟孢子，用0.05%（W/V）吐温-80分散，配置成终浓度为1×108个孢子/ml的悬浮液。采用点滴法稻纵卷叶螟和二化螟幼虫，每头试虫用微量点样器点滴药剂2μl，接种30头，接种后在室温25℃，湿度50-70%的条件下饲养，设5个重复，以清水为空白对照。记录死虫数，计算存活率，经DPS2000软件统计分析得到真菌LT50（致死中时）。
表1  CQ Nr126菌株对稻纵卷叶螟和二化螟幼虫室内杀虫活性
Figure 882946DEST_PATH_IMAGE001
接种后5-7天，稻纵卷叶螟、二化螟幼虫进入死亡高峰期，感病死亡后虫体僵硬，保湿培养3天后长出白色菌丝，5-7天虫体长满绿色孢子。统计分析见表1，结果表明，CQNr126菌株对稻纵卷叶螟和二化螟幼虫有明显的杀虫活性，致死中时（LT50）分别为6.03天和6.42天。
实施例4  CQNr126菌株产孢特性
将浓度为1×108个孢子/ml的CQNr126孢子悬浮液接种在萨氏麦芽琼脂（SMAY）平板上（100μL/皿），在不同温度（15℃，20℃，24℃，26℃，28℃，30℃，37℃）的培养条件下培养15天后测定单位面积上的产孢量，确定CQNr126菌株在24℃条件下产孢最佳。分别配制初始pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的1/4SDA平板，按上述方法测定产孢量，确定CQNr126菌株在pH为6.0条件下产孢最佳，达到1.7×108个孢子/平方厘米。
实施例5  CQNr126菌株产孢培养基的优化
配置的1/4SMAY、2/4SMAY、3/4SMAY和SMAY平板（直径为9cm），将浓度为1×107个孢子/ml的CQNr126孢子悬浮液涂布在不同含量的萨氏麦芽琼脂平板上（100μL/皿）。置于24℃的培养箱中培养12-15天，用打孔器随机打取1平方厘米培养基，放入装有20mL 0.05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混匀后用血球计数板测定的含孢量。确定CQNr126的固体产孢培养基为3/4SMAY，24℃培养15天，产孢量达到2.2×108个孢子/平方厘米。 
实施例6   CQNr126菌株的室外防治效果
收集在萨氏麦芽琼脂（SMAY）平板上培养的CQNr126成熟孢子，放入玻璃干燥器中干燥至含水量小于5%，干孢子用用色拉油配制成终浓度为2×1010个孢子/mL油悬浮剂。  
分别选择稻纵卷叶螟和二化螟幼虫发生较重的稻田，随机选择4个10m×10m小区，间隔5米。采用泰山-18型机动喷雾器进行超低容量喷施CQNr126孢子油悬浮剂(2×1013个孢子/公顷)。以喷施清水为空白对照。施药后7、15、21天调查网罩内防治效果。
稻纵卷叶螟调查方法是：在每个小区随机3点，每点调查0.67m2，计算每平方米水稻叶总片数与总的束叶数，计算出保叶效果。
二化螟调查方法是：在每个小区随机3点，每点调查1m2，计算每平方米水稻总丛数与枯心数，计算出防治效果，结果见表2、3。
表2   CQNr126对稻纵卷叶螟防治效果
从表2可以看出，CQNr126室外对稻纵卷叶螟具有好的防治效果，施药后保叶率逐渐提高，7天时仅为49.0%，21天时达到81.5%。
表3   CQNr126对二化螟防治效果
Figure 176918DEST_PATH_IMAGE003
从表3可以看出，CQNr126室外对二化螟具有好的控制作用，15天时为68.1.0%，21天时达到76.2%。
实施例7  CQNr126菌株固体平板产孢条件优化
配置的1/4SMAY、2/4SMAY、3/4SMAY和SMAY平板（直径为9cm），将浓度为1×107个孢子/ml的CQNr126孢子悬浮液涂布在不同含量的萨氏麦芽琼脂平板上（100μl/皿）。置于24℃的培养箱中培养15天，用打孔器随机打取1平方厘米 培养基，放入装有20mL 0.05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混匀后用血球计数板测定的CQNr126的产孢量。 
表4   CQNr126菌株固体平板产孢效率
Figure 2011101335390100002DEST_PATH_IMAGE004
从表4可以看出：以3/4SMAY为培养料，CQNr126菌株的产孢特性较好，产孢量达到2.2×108个孢子/平方厘米，较SMAY提高约30%，达到极显著水平。
序 列 表
 
<110>   重庆大学
 
<120>　一种莱氏野村菌菌株及其应用
 
<160>   1
 
<210>  1
<211>  608
<212>  DNA
<213>  莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126 ITS1-5.8S-ITS2序列
<400>  1
 
gtttccgtag   gtgaacctgc   ggagggatca   ttaccgagtt   tacaactccc  aaaccccatg  60
tgaacttata    cccttttcct    gttgcctcgg   cgggtcattt   gccccggacc gggctcgtcc   120
agagcccgcc  cggaaacagg  cgcccgccgc   gggaccgaaa  ctctgtatct  cttagccttt   180
ggcacgtctg  ggtggaatca   tacaaaaatg    aatcaaaact   ttcaacaacg  gatctcttgg   240
ttctggcatc   gatgaagaac   gcagcgaaat   gcgataagta  atgtgaattg  cagaattcag   300
tgaatcatcg   aatctttgaa    cgcacattgc   gcccgccagt  attctggcgg  gcatgcctgt    360
tcgagcgtca   tttcaaccct   caagcccccg   cggtttggtg   ttgggggccg gcgattgtca    420
gctgggccgc  tcaggcggtt  ccctgcggcg   ccgcccccga   aatgaattgg  cggccccgtc  480
gcggcctcct  ctgcgtagta   gcacaacctc   gcaacaggag   cgcggcgcgg ccactgccgt  540                  
aaaacgcaca  aacttctcca    agagttgacc  tcgaatcagg    taggaatacc   cgctgaactt   600    
aagcatat                                                                                                       608
 

Claims (6)

1.一种莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126， 保藏号为CGMCC NO. 4610。
2.一种莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）菌株CQNr126，其ITS1-5.8S-ITS2序列为SEQ ID NO.1。
3.如权利要求1或2所述菌株在制备防治稻纵卷叶螟和二化螟的真菌制剂中的应用。
4.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：该菌株的适宜产孢温度为24℃、适宜产孢pH为6.0。
5.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：所述菌株适宜产孢培养基为3/4SMAY。
6.如权利要3所述的菌株，其特征在于：所述菌株适宜产孢培养基为3/4SMAY。
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