CN105670952A - 一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：培养基的制备，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在新制备的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为0.5~3个/cm2，对接种培养基于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，96~120小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞，然后将莱氏野村菌酵母型细胞进行扩大培养；本发明的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，酵母型细胞的生长期持续时间长，酵母型细胞向菌丝状态转换的时间相应的延迟，因而可以提高酵母型细胞的产量，并且在显微镜镜检中检测不到菌丝体，纯度高。

Description

一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及杀虫真菌细胞领域，具体说是一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法。
背景技术
莱氏野村菌作为虫生真菌成为生物防治领域理论研究和生产应用的热点，莱氏野村菌在固体培养基表面出现两型生长现象，即由酵母型细胞状态向菌丝生长状态转换，一方面，莱氏野村菌酵母型细胞类似虫体内的虫菌体，在液体发酵中产生的芽生孢子生长迅速，适用于大规模的工业生产；另一方面，在邵长文研究开发的ATMT系统中酵母型细胞作为受体细胞，因此无论是工业生产或实验室研究，都给莱氏野村菌酵母型细胞的培养提出了现实需求。
目前，莱氏野村菌酵母型细胞的获得方法有两种：一是用接种器在固体培养基表面划线制备，这种方法制备量小，对分生孢子的分散效果不佳，这是由于莱氏野村菌由酵母型细胞向菌丝型的转换受群体密度的影响，往往只能在划线的末端区域会出现酵母型细胞菌落，而且所得的酵母型细胞的纯度不高，在显微镜视野内有大量菌丝体，需要多次转接纯化才能得到高纯度的酵母型细胞；第二种是采用制备分生孢子悬浮液的方法，这种方法虽然孢子的分散效果较好，但是很容易污染，并且酵母型菌落长出时边界不明显，不便于确定刮取酵母型细胞的时间，因此探索获得高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法亟需研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在120~125℃下灭菌20~30分钟，然后均匀倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；
②用灭菌的接种器蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方5~7厘米处，敲击接种器，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为0.5~3个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，96~120小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的工具刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用涂布器涂布均匀，置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，18~24小时后得到5~10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，步骤①为将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，所述接种器为接种环、接种针或玻璃棒。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，涂布器为不锈钢筷子或顶端烧圆的玻璃棒。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，工具为平头镊子。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，步骤②中莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞。
进一步优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml；
②用灭菌的接种环蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方6厘米处，敲击接种环，将莱氏野村菌分生孢子撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用不锈钢筷子涂布均匀，置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，18小时后得到10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，酵母型细胞的生长期持续时间长，酵母型细胞向菌丝状态转换的时间相应的延迟，因而可以提高酵母型细胞的产量，并且在显微镜镜检中检测不到菌丝体，纯度高；本发明的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，由于琼脂的加入量适中，延长了酵母型细胞的生长期，解决了现有技术中培养基表面硬度低，酵母型细胞不易刮取的问题；本发明的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，孢子的分散效果好，生长出的各个菌落相对独立，边界明显，容易确定酵母型细胞的刮取时间，从而能得到高纯度的莱氏野村菌酵母型细胞；采用本发明方法所得的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞可在新制备的培养基进行转接和扩大培养，以获得足量高纯度莱氏野村菌酵母型细胞，为实验室研究和大规模的工业生产提供原料保障。
附图说明
图1为培养基表面莱氏野村菌产生大量分生孢子的照片；
图2为长出酵母型细胞的菌落图片；
图3为400倍显微镜下酵母型细胞的图片；
图4为转接扩大培养的莱氏野村菌酵母型细胞菌落照片。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，通过以下技术方案实现：
一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在120~125℃下灭菌20~30分钟，然后均匀倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；
②用灭菌的接种器蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方5~7厘米处，敲击接种器，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为0.5~3个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，96~120小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的工具刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用涂布器涂布均匀，置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，18~24小时后得到5~10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，步骤①为将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，所述接种器为接种环、接种针或玻璃棒。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，涂布器为不锈钢筷子或顶端烧圆的玻璃棒。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，工具为平头镊子。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，步骤②中莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2。
优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞。
进一步优选的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml；
②用灭菌的接种环蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方6厘米处，敲击接种环，将莱氏野村菌分生孢子撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用不锈钢筷子涂布均匀，置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，18小时后得到10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
重复步骤④的操作，可对步骤④所得的所获得酵母型细胞进行转接和扩大培养，以获得足量高纯度莱氏野村菌酵母形态细胞。
本发明的光照环境是指以24小时为周期的16小时光照，8小时黑暗的自然光照环境。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖20g，蛋白胨8g和酵母膏8g加入到900ml蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉8g搅拌均匀，得到混合液，将混合液在120℃下灭菌20分钟，然后均匀倒在平板上至2毫米的厚度，冷却后得到培养基；
②用灭菌的接种环蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方5厘米处，敲击接种环，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为0.5个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度24℃，湿度为75%的光照环境中，120小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用灭菌的不锈钢筷子涂布均匀，置于温度24℃，湿度为75%的光照环境中，24小时后得到5倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
实施例2
一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖50g，蛋白胨30g和酵母膏30g加入到950ml蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉15g搅拌均匀，得到混合液，将混合液在125℃下灭菌30分钟，然后均匀倒在平板上至3毫米的厚度，冷却后得到培养基；
②用灭菌的玻璃棒蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方7厘米处，敲击玻璃棒，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为3个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度30℃，湿度为90%的光照环境中，116小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用顶端烧圆的玻璃棒涂布均匀，置于温度30℃，湿度为90%的光照环境中，20小时后得到6倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
实施例3
一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖40g，蛋白胨20g和酵母膏15g加入到920ml蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉12g搅拌均匀，得到混合液，将混合液在122℃下灭菌22分钟，然后均匀倒在平板上至2.4毫米的厚度，冷却后得到培养基；
②用灭菌的接种器蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方6厘米处，敲击接种器，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为1个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度28℃，湿度为85%的光照环境中，110小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用涂布器涂布均匀，置于温度28℃，湿度为85%的光照环境中，21小时后得到8倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
实施例4
一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，包括以下步骤：
①将麦芽糖40g，蛋白胨10g和酵母膏10g加入到930ml蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉10g搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；
②用灭菌的接种环蘸取莱氏野村菌分生孢子，培养基表面莱氏野村菌产生大量分生孢子的照片如图1所示，置于步骤①得到的培养基表面上方6厘米处，敲击接种环，将莱氏野村菌分生孢子撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到均一半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞，如图2所示；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用不锈钢筷子涂布均匀，置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，18小时后得到10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞，对所得的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞进行镜检如图3所示，可以看出在显微镜下无菌丝型菌体，纯度高；
⑤重复步骤④的操作，对步骤④所得的所获得酵母型细胞进行转接和扩大培养，以获得足量高纯度莱氏野村菌酵母形态细胞，如图4所示经过转接扩大培养的莱氏野村菌酵母型细胞菌落照片。

Claims (8)

1.一种高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在120~125℃下灭菌20~30分钟，然后均匀倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；
②用灭菌的接种器蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方5~7厘米处，敲击接种器，将莱氏野村菌分生孢子均匀撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为0.5~3个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，96~120小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的工具刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用涂布器涂布均匀，置于温度24~30℃，湿度为75~90%的光照环境中，18~24小时后得到5~10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
2.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：步骤①为将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml。
3.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：所述接种器为接种环、接种针或玻璃棒。
4.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：所述涂布器为不锈钢筷子或顶端烧圆的玻璃棒。
5.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：所述工具为平头镊子。
6.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：步骤②中莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2。
7.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞。
8.根据权利要求1所述的高纯度莱氏野村菌酵母型细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
①将麦芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸馏水中溶解，然后加入琼脂粉搅拌均匀，得到混合液，将混合液在121℃下灭菌25分钟，然后均匀倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷却后得到培养基；所述麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和蒸馏水的重量体积比为4g：1g：1g：1g：93ml；
②用灭菌的接种环蘸取莱氏野村菌分生孢子，置于步骤①得到的培养基表面上方6厘米处，敲击接种环，将莱氏野村菌分生孢子撒在步骤①得到的培养基上，得到莱氏野村菌分生孢子接种的培养基，所述莱氏野村菌分生孢子接种培养基的分布密度为2个/cm2；
③将步骤②所得莱氏野村菌分生孢子接种的培养基置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，96小时后在培养基表面得到半透明液滴状的莱氏野村菌酵母型细胞；
④用灭菌的平头镊子轻轻刮取步骤③所得的莱氏野村菌酵母型细胞至步骤①所得的培养基表面，用不锈钢筷子涂布均匀，置于温度26℃，湿度为80%的光照环境中，18小时后得到10倍接种量的高纯度莱氏野生菌酵母型细胞。
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