CN115960747A - 一株贝莱斯芽孢杆菌gssn及其在防治松材线虫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌GSSN及其在防治松材线虫中的应用，属于生物技术领域。本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GSSN，其于2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24849。还公开贝莱斯芽孢杆菌GSSN无菌发酵液以及包含贝莱斯芽孢杆菌GSSN和/或其代谢产物的微生物菌剂在抑杀松材线虫、拮抗松材线虫伴生真菌方面来防治松材线虫病中的应用。本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌GSSN及其代谢产物对松材线虫及其伴生真菌拮抗作用明显，为松材线虫病的防治提供新的生防菌类型，对植物线虫的防治具有重要的意义。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌GSSN及其在防治松材线虫中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌GSSN及其在防治松材线虫中的应用。

背景技术

松材线虫病(pine wilt disease)，是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Bubrer)Nickle)引起的一种松树毁灭性病害。松材线虫病是一个复杂的病害系统，发病因素复杂，包括松材线虫、寄主松树、媒介昆虫、真菌、细菌、人为活动和环境等。松材线虫病传播迅速，初期发病部位隐蔽，存在潜伏侵染的现象，导致该病治理难度大，至今未能得到完全控制和根除。自1982年中国南京发现以来，松材线虫病已遍及19个省的731个县，共造成10亿多棵松树死亡，直接和间接的经济、生态损失已达数千亿元(国家林业和草原局2022年第6号公告)。

松材线虫的生活史中，有一个重要的食菌阶段。在这个阶段，松材线虫可以通过取食多种真菌来维持自身的生长和种群的繁殖。目前已知可促进松材线虫生长和繁殖的真菌有很多种，同时也有少量对松材线虫不利的真菌。有研究表明，伴生真菌Sporothrix sp.1与从木质部提取的DAA联合接种至有松材线虫的木段中，可使松材线虫产生大量的后代，且雌雄比差异较大，发育速度较快。除此之外，松材线虫也可以产生线虫蛔甙(Ascarosides)物质促进真菌的生长和产孢，从而增加线虫的种群数量，提高媒介昆虫携带数量，加重病害的发生。

目前，针对松材线虫病，中国主要从病原和传播媒介两个方面，以预防为主，结合物理、化学和生物防治进行综合治理，但都没能完全控制和消除疫区。近年来，随着人们的环保意识逐步提高，生物防治越来越受到重视。目前，针对松材线虫病的生物防治可大致分为以下几方面：

(1)针对媒介昆虫：松墨天牛是松材线虫的主要传播媒介，松墨天牛的防治一方面通过释放生物信息素对其进行诱杀，另一方面通过释放松墨天牛天敌进行捕杀。但目前存在的问题是，释放生物信息素无法回答防治后林间剩余天牛数量，目前，利用病原真菌和昆虫天敌防治松材线虫应用较多。病原真菌包括绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、白僵菌(Beauveria bassiana)等。寄生天敌主要有花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)、管氏肿腿蜂(Scleroderma guani)、川硬皮肿腿峰(Scleroderma sichuanensis)等。但这些方法受林间的生物和非生物因素影响较大，防治效果不具稳定性和确定性。

(2)针对病原线虫：目前在防治松材线虫应用最多的是生物杀菌剂阿维菌素、甲维盐等注干药剂，注药一次能防2-3年。但是这种树干注射剂价格高，注射全程由人工完成，因此仍然成本较高，通常只能应用在重要区域或古树名木上。目前，中国也开始做松树抗松材线虫病的抗性育种，但这是一条长期的道路，无法在短期内实现。

因此，许多国家的研究者们也都在努力寻找防治植物线虫的新途径。开发具有高效、低毒的生物防治剂已经迫在眉睫，利用有益微生物防治线虫成为了发展生物防治剂的重要途径。

芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，杆状、能产生芽孢，是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌。不但在土壤、深海、肠道、植物体中广泛存在，甚至是温泉、南极等极端环境下也常有发现。芽孢杆菌即使在不利的环境因素下也可以产生孢子，在细菌不死亡的情况下孢子可向粉剂转换，这比其他生防细菌具有明显优势。自发现以来，人们对芽孢杆菌进行了大量的研究。芽孢杆菌可以产生多种次生代谢产物，由于它们对多种植物病原体(细菌、真菌、线虫、病毒等)的强活性而成为重要的研究对象。此外，芽孢杆菌属还能够产生多种蛋白类物质，如几丁质酶、胞外蛋白酶等，这些物质能通过作用于真菌细胞壁上相应的底物溶解菌体，造成细胞的解离和消融，以达到防治病害的目的。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是一种需氧的革兰氏阳性菌，作为新型生防芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌能抵抗高温、紫外线，并产生一些稳定的物质。据报道，该物种的菌株可以抑制许多病原体的生长，包括细菌、真菌和线虫。研究发现B.velezensis 504对于植物病原黄单胞菌具明显的拮抗作用。目前，已通过体内及体外试验证实B.velezensis FJAT-46737的拮抗活性与脂肽物质分泌有关，且其对于青枯病有很好的生防潜力。在一种作物中，B.velezensis可同时用于防治害虫和植物真菌性病害。不仅如此，B.velezensis对线虫也有很好的拮抗作用。据报道，B.velezensis Bv-25的脂肽类物质对根结线虫(Meloidogyne spp.)具有较强的拮抗活性，且挥发性有机物对根结线虫有很高的趋避性和麻痹作用。但目前有关贝莱斯芽孢杆菌对松材线虫及其拮抗伴生真菌来防治松材线虫病的研究没有记载。

发明内容

本发明的目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌GSSN及其在防治松材线虫中的应用，为松材线虫病的防治提供新的生防菌类型。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌GSSN，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24849，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏时间为2022年5月9日。

该菌株分离自青海云杉的光臀八齿小蠹虫体表，其菌株发酵产物对松材线虫及其伴生真菌均有很强的拮抗作用，因此能够高效防治由松材线虫引起的松材线虫病。

本发明还提供一种植物病害防治剂，其特征在于，包括所述贝莱斯芽孢杆菌GSSN、其发酵液和/或其代谢产物。

所述贝莱斯芽孢杆菌GSSN的发酵培养条件如下：

(1)培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，去离子水1000ml，121℃灭菌30min，pH 7.2～7.4。

(2)工艺条件：pH 7.2～7.4，接种量2％(v/v)、温度为30℃、转速为180～200r/min，恒温黑暗下震荡培养72h。

通过上述发酵工艺得到的发酵液，在4℃下10000r/min离心10min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤得到无菌发酵液。

本发明还提供一种植物病害的防治方法，将所述植物病害防治剂施用给植物，以抑杀病原线虫并拮抗病原线虫伴生真菌的生长。

进一步地，所述病原线虫包括松材线虫。

进一步地，所述植物病害为松材线虫病。

进一步地，所述病原线虫伴生真菌包括Cytospora sp.1、Diplodia sapinea、Graphilbum xianjuensis、Ophiostoma album、Ophiostoma ips、Ophiostoma massoniana、Ophiostoma taizhouense、Pestalotiopsis sp.1、Phialocephala sp.1、Pseudocosmospora sp.1、Sporothrix macroconidia、Sporothrixzhejiangensis和Xenoacremonium sp.1。

本发明还提供一种所述贝莱斯芽孢杆菌GSSN或所述植物病害防治剂在防治松材线虫病中的应用。

本发明还提供一种所述贝莱斯芽孢杆菌GSSN或所述植物病害防治剂在抑杀松材线虫中应用。

本发明还提供一种所述贝莱斯芽孢杆菌GSSN或所述植物病害防治剂在拮抗松材线虫伴生真菌中的应用。

进一步地，所述松材线虫伴生真菌包括Cytospora sp.1、Diplodia sapinea、Graphilbum xianjuensis、Ophiostoma album、Ophiostoma ips、Ophiostoma massoniana、Ophiostoma taizhouense、Pestalotiopsis sp.1、Phialocephala sp.1、Pseudocosmospora sp.1、Sporothrix macroconidia、Sporothrixzhejiangensis和Xenoacremonium sp.1。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌GSSN对松材线虫拮抗作用显著，对环境友好无污染，对植物线虫的防治具有重要的意义。该菌株对松材线虫伴生真菌拮抗效果显著，对环境友好无污染，对抑制伴生真菌的生长，控制松材线虫种群数量来防治松材线虫病具有重要的意义。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌GSSN培养简单、易保存，便于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株GSSN形态特征，其中a为菌株GSSN的菌落形态特征，b为菌株GSSN菌体形态特征；

图2为基于16S rDNA基因序列的系统发育分析；

图3为基于gyrA基因序列的系统发育分析；

图4为菌株GSSN发酵液处理松材线虫后虫体形态特征，其中，a为对照，b为线虫体液外渗，c为线虫断裂，d为线虫体腔内物质消融；

图5为菌株GSSN无菌发酵液对松材线虫伴生真菌的拮抗作用，其中，A为Cytosporasp.、B为D.sapinea、C为G.xianjuensis、D为O.album、E为O.ips、F为O.massoniana、G为O.taizhouense、H为Pestalotiopsis sp.1、I为Phialocephala sp.、J为Pseudocosmosporasp.、K为S.macroconidia、L为S.zhejiangensis、M为Xenoacremonium sp.。

图6为菌株GSSN脂肽类物质对松材线虫伴生真菌拮抗效果图，其中a-1到k-1依次为Bo.Cinerea、Cytospora sp.1、D.sapinea、G.xianjuensis、O.album、O.ips、O.taizhouense、Pestalotiopsis sp.1、Pseudocosmospora sp.1、S.macroconidia和Xenoacremonium sp.1。

图7为菌株GSSN蛋白类物质对松材线虫伴生真菌拮抗效果图，其中a-2到k-2依次为Bo.Cinerea、Cytospora sp.1、D.sapinea、G.xianjuensis、O.album、O.ips、O.taizhouense、Pestalotiopsis sp.1、Pseudocosmospora sp.1、S.macroconidia和Xenoacremonium sp.1。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌GSSN的分离与鉴定

1、菌株的分离

从入侵青海云杉的光臀八齿小蠹虫体表上分离得到细菌菌株GSSN，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24849，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。

2、菌株的鉴定

GSSN形态特征鉴定：菌株GSSN在LB固体培养基上培养，菌落为圆形，边缘不规则，乳白色，表面褶皱，边缘隆起，中间内陷，不透明，细胞杆状(图1)。

生理生化鉴定：用高温灭菌过的棉签将细菌GSSN转移至IF-B接种液中并调整悬浊度为90％～98％。转移至GenⅢ鉴定板中，30℃培养24H。利用Biolog微生物鉴定系统进行鉴定。结果表明，菌株GSSN可以利54种碳源。对11种化学物质敏感(表1)。

表1菌株GSSN的生理生化指标

注：“+”表示可以利用，“-”表示不可以利用，“B”表示弱反应。

综合菌株的形态特征和生理生化特征，参照《常见细菌鉴定手册》，确定菌株GSSN属于芽孢杆菌属。

分子生物学方法鉴定GSSN菌株：

测得16S rDNA和gyr A序列分别为1471bp和947bp，具体如SEQ ID No：1和No：2所示。序列均提交到GenBank数据库，登记号分别为ON797328和ON033177。

将所测16Sr DNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与菌株GSSN相似性最高的是解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)和暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)序列，同源性均高达99％以上，利用MEGA7.0软件通过邻接法进行1000次相似度重复计算并构建系统发育树(图2)。结果显示菌株GSSN也与这三种细菌聚在一起，节点支持率高于95。我们继续构建了gyrA的系统发育树，发现菌株GSSN与贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis FZB24^T)聚集在一个分支上，节点支持率为100(图3)。综合形态特征、生理生化指标检测和系统发育分析，我们将菌株GSSN鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)。该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存时间为2022年5月9日，保存地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌GSSN无菌发酵液对松材线虫的拮抗作用

无菌发酵液制备：将菌株接种于100mL/250mL的LB液体培养基中，于30℃、180r/min恒温培养24h，获得种子液。将种子液按2％的接种量，接种于100mL/250mL的LB液体培养基中，于30℃、200r/min恒温培养48h，然后将发酵液于4℃、10000rpm下离心10min后收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后即为贝莱斯芽孢杆菌GSSN无菌发酵液，保存在4℃备用。

线虫液制备：将本实验室保存的灰葡萄孢接种至PDA平板中，25℃培养7d。然后将试验室保存的松材线虫接种至长满灰葡萄孢的平板上，并置于25℃黑暗条件下培养7d。然后采用贝尔曼漏斗法收集松材线虫，并用质量分数0.1％的次氯酸钠进行表面消毒，随后在显微镜下进行计数，得到线虫液(每20ul约160条)。

测定方法：将实施例2制备的无菌发酵液与线虫液分别按1:1和1:3的比例进行实验(处理组)，以相同比例LB液体培养基和无菌水替换无菌发酵液为对照(对照组)，置于25℃黑暗恒温培养箱中，分别于12h、24h和36h计算线虫的死亡率，每种处理3次重复。

松材线虫死亡判定：每次吸取20μl的线虫悬浮液于载玻片上，添加相同体积的无菌水，室温下放置30min，然后用10倍物镜观察，如果观察到线虫不动且呈大“C”或“J”型，且轻轻敲击身体不引起任何反应，则认定线虫死亡；当线虫虫体运动呈“S”型、卷曲状或螺旋状时则判定为活虫。根据以下公式计算松材线虫死亡率与校正死亡率：

死亡率(％)＝(线虫死亡数/线虫总数)×100％

校正死亡率(％)＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100％

不同发酵时间无菌发酵液对松材线虫拮抗活性的影响结果见表2-3。

表2不同发酵时间无菌发酵液对松材线虫拮抗活性影响(1:1)

注：表内数据为3次重复平均值，同列数据后标有相同字母者表示在P＜0.05水平差异不显著(DMRT法)。活性级别判定；“－”表示NA≤10％；“+”表示10％<NA<30％；“++”表示30％<NA<50％；“+++”表示50％<NA<80％；“++++”表示NA＞80％，NA表示线虫校正死亡率，下同。

表3不同发酵时间发酵液对松材线虫拮抗活性影响(1:3)

通过浸渍法对细菌GSSN不同发酵时间无菌发酵液拮抗线虫活性进行测定。结果表明，无菌发酵液对松材线虫有很强的拮抗作用，对照组LB和无菌水的死亡率均在10％以下，且无显著性差异(表2，3)。在1:1的试验中，48h的无菌发酵液在12h和24h的拮抗活性显著高于同时期的其它无菌发酵液。在36h时，所有供试线虫全部死亡。在1:3的试验中，我们也得到了类似的试验结果，但24h、36h和48h无菌发酵液中松材线虫校正死亡率均比1:1试验中对应的低，且24h的无菌发酵液中的供试线虫直到48h才全部死亡。这说明发酵液里的抑菌物质浓度对拮抗效率也有一定影响。在三种不同发酵时间的无菌发酵液拮抗试验中，均能观察到松材线虫体壁消融、断裂和体腔内物质溶解等现象(图4)。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌GSSN无菌发酵液、蛋白类和脂肽类物质对松材线虫伴生真菌的拮抗作用

1、贝莱斯芽孢杆菌GSSN无菌发酵液对松材线虫伴生真菌的拮抗作用

本实施例中用于松材线虫取食试验的伴生真菌是中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所森林病理学科组实验室提供，见表4。

表4用于松材线虫取食试验的伴生真菌信息表

无菌发酵液制备：将菌株接种于100mL/250mL的LB液体培养基中，于30℃、180r/min恒温培养24h，获得种子液。将种子液按2％的接种量，接种于100mL/250mL的LB液体培养基中，于30℃、200r/min恒温培养48h，然后将发酵液于4℃、10000rpm下离心10min后收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后即为贝莱斯芽孢杆菌GSSN无菌发酵液，保存在4℃备用。

PDA毒板制备：将菌株GSSN的无菌发酵液与冷却至50℃的PDA培养基按1:5的比例混合后，倒入90mm的培养皿中，制得PDA毒板(处理组)。以相同体积的无菌水替换无菌发酵液制成的PDA毒板为对照(对照组)。

伴生真菌培养：将表4中的松材线虫伴生真菌接种至PDA平板中，倒置于25℃黑暗恒温培养箱中培养7d，用直径7mm的无菌打孔器制备表4中伴生真菌菌饼，备用。

无菌发酵液抑菌活性测定：采用菌丝生长速率法，分析菌株GSSN无菌发酵液对伴生真菌的拮抗作用，用无菌接种针挑取伴生真菌菌饼，分别接种于PDA毒板(处理组与对照组)中央，置于25℃黑暗恒温培养箱中培养7d。采用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑菌率。每种处理三次重复。抑菌率计算公式为：

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％

2、贝莱斯芽孢杆菌GSSN脂肽类物质对松材线虫伴生真菌的拮抗作用

脂肽类物质制备：将菌株GSSN种子液(无菌发酵液制备步骤中获得)按2％的接种量接种至LB液体培养基中，30℃，180r/min条件下培养48h，于4℃，10000rpm离心10min，弃菌体，取上清液，用6mol/mL的盐酸调节无菌发酵液pH值至2，进行酸化沉淀，于4℃静置24h。再次4℃，10000rpm下离心10min，收集上清液，将沉淀物用无水甲醇进行溶解，二者比例为固：液＝1:10，置于摇床，30℃，120r/min条件下放置2h后取出，4℃，10000rpm下离心，分别收集上清溶液和沉淀；重复此步骤再次进行抽提；将所得上清溶液进行旋转蒸发，40℃蒸至瓶中液体余约1/6，收集溶液，保存在-20℃备用。

分生孢子悬浮液制备：将松材线虫伴生真菌接种于MEA培养基中(表4)，置于25℃黑暗恒温培养箱中，培养10d。在超净工作台上，向培养皿中加入适量的无菌水，用无菌接种针轻刮菌落表面，静置10min，最后轻轻晃动培养皿，用无菌脱脂棉过滤掉菌丝，获得孢子悬浮液。用无菌水调节分生孢子悬浮液浓度为1×10⁶个/mL备用。

脂肽类物质抑菌活性测定：采用琼脂孔扩散法测定抑菌活性。吸取真菌分生孢子悬浮液200μl涂布于PDA培养基中，待晾干后用直径7mm无菌打孔器打孔，分别吸取制备的酯肽类物质100μl注入孔中，于25℃黑暗恒温培养箱中培养5～10d，每天观察并记录抑菌活性，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。分别以加入相同体积的无菌水和无水甲醇为对照，每种处理三次重复。菌株GSSN脂肽类提取物对松材线虫伴生真菌拮抗作用如表5所示。

表5菌株GSSN脂肽类提取物对松材线虫伴生真菌拮抗作用

注：“++++”表示抑菌圈直径大于22mm，抑菌活性强；“+++”表示抑菌圈直径17～21mm，抑菌活性较强；“++”表示抑菌圈直径12～16mm，抑菌活性中等；“+”表示抑菌圈直径7～11mm，抑菌活性弱。

3、贝莱斯芽孢杆菌GSSN蛋白类物质对松材线虫伴生真菌的拮抗作用

蛋白类物质制备：将菌株GSSN种子液接种至LB液体培养基中，30℃，180r/min条件下培养48h，于4℃，10000rpm离心10min，得到1.1L发酵上清液。将上清液转移到2L的烧杯中，分批缓慢加入硫酸铵粉末，每次加入的量不超过10g，待上一次加入的硫酸铵完全溶解后再次添加，直到溶液的饱和浓度为30％时停止添加，期间用玻璃棒不断搅拌。将溶液于4℃静置24h，在4℃，10000rpm条件下离心10min，分别收集上清和蛋白沉淀。用pH＝7.4的1×PBS溶液溶解蛋白沉淀，得到蛋白液。将得到的上清液转移至干净烧杯中，继续添加硫酸铵粉末，直至溶液饱和度为60％。将溶液于4℃静置24h，在4℃，10000rpm条件下离心10min，分别收集蛋白沉淀和上清液。用ph＝7.4的1×PBS溶液溶解蛋白沉淀，与第一次得到蛋白液合并，并保存在-20℃备用。

蛋白类物质抑菌活性测定：采用琼脂孔扩散法测定抑菌活性。吸取真菌分生孢子悬浮液200μl涂布于PDA培养基中，待晾干后用直径7mm无菌打孔器打孔，分别吸取制备的蛋白类物质100μl注入孔中，于25℃黑暗恒温培养箱中培养5～10d，每天观察并记录抑菌活性，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。分别以加入相同体积的无菌水和1×PBS溶液为对照，每种处理三次重复。菌株GSSN蛋白类提取物对松材线虫伴生真菌拮抗作用如表6所示。

表6细菌GSSN蛋白类提取物对松材线虫伴生真菌拮抗作用

注：“++++”表示抑菌圈直径大于22mm，抑菌活性强；“+++”表示抑菌圈直径17～21mm，抑菌活性较强；“++”表示抑菌圈直径12～16mm，抑菌活性中等；“+”表示抑菌圈直径7～11mm，抑菌活性弱。

结果表明：

通过生长速率法，分析菌株GSSN无菌发酵液对伴生真菌的抑菌活性。结果表明，菌株GSSN无菌发酵液对伴生真菌的生长有明显的抑制作用，抑菌率均超过60％(图5)。其中对真菌Cytospora sp.1、G.xianjuensis、O.ips、O.taizhouense、Pestalotiopsis sp.1、Phialocephala sp.1的抑菌率都超过90％。对优势真菌O.ips和O.taizhouensis也有很强的抑菌活性，抑菌率分别为97.86％和94.02％。

通过抑菌圈法，分析脂肽类物质对松材线虫伴生真菌的拮抗作用。结果表明，脂肽类物质对所有供试真菌均表现出明显的抑菌活性，且有抑菌圈出现，而甲醇溶液对伴生真菌没有抑制作用(表5)。通过分析，发现脂肽类提取物对病原菌D.sapinea和优势真菌O.taizhouense的抑菌活性最强，差异极显著，抑菌圈直径分别为23.6mm和25mm，抑菌活性强度均为“++++”。对优势真菌O.ips也有较强的抑制作用，抑菌直径为20.6mm，抑菌活性强度为“+++”。对松材线虫有很好繁殖效率的真菌Bo.cinerea和Pestalotiopsis sp.1，也有较强的抑制作用，抑菌圈直径分别为21.8mm和18.5mm，抑菌活性强度均为“+++”。在这些真菌中，对S.macroconidia的抑菌效率最低，抑菌圈直径为11.3mm，抑菌活性强度仅为“++”。

通过抑菌圈法，分析蛋白类物质对伴生真菌的抑菌活性。结果表明，蛋白类提取物对松材线虫伴生真菌均有抑制作用(表6)。其中对菌株Cytospora sp.1的抑制作用最强，差异极显著，抑菌圈直径为23.1mm，抑菌活性强度为“++++”。其次是菌株B.cinerea，抑菌圈直径为19mm，活性强度为“+++”。对优势真菌O.taizhouense和O.ips也有抑制作用，抑菌圈直径分别为14.5mm和17.4mm，抑菌活性强度分别为“++”和“+++”。此外，对其它真菌也有明显的抑菌活性，抑菌活性强度都在“++”以上。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GSSN，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24849，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏时间为2022年5月9日。

2.一种植物病害防治剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌GSSN、其发酵液和/或其代谢产物。

3.一种植物病害的防治方法，其特征在于，将权利要求2所述的植物病害防治剂施用给植物，以抑杀病原线虫并拮抗病原线虫伴生真菌的生长。

4.根据权利要求3所述的防治植物病害的方法，其特征在于，所述病原线虫包括松材线虫。

5.根据权利要求3所述的防治植物病害的方法，其特征在于，所述植物病害为松材线虫病。

6.根据权利要求3所述的防治植物病害的方法，其特征在于，所述病原线虫伴生真菌包括Cytospora sp.1、Diplodia sapinea、Graphilbum xianjuensis、Ophiostoma album、Ophiostoma ips、Ophiostoma massoniana、Ophiostoma taizhouense、Pestalotiopsissp.1、Phialocephala sp.1、Pseudocosmospora sp.1、Sporothrix macroconidia、Sporothrix zhejiangensis和Xenoacremonium sp.1。

7.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌GSSN或权利要求2所述的植物病害防治剂在防治松材线虫病中的应用。

8.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌GSSN或权利要求2所述的植物病害防治剂在抑杀松材线虫中的应用。

9.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌GSSN或权利要求2所述的植物病害防治剂在拮抗松材线虫伴生真菌中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述松材线虫伴生真菌包括Cytosporasp.1、Diplodia sapinea、Graphilbum xianjuensis、Ophiostoma album、Ophiostoma ips、Ophiostoma massoniana、Ophiostoma taizhouense、Pestalotiopsis sp.1、Phialocephala sp.1、Pseudocosmospora sp.1、Sporothrix macroconidia、Sporothrixzhejiangensis和Xenoacremonium sp.1。

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