KR20090023626A

KR20090023626A - 프로바이오틱 스트레인 및 그로부터 유도된 항균 펩티드

Info

Publication number: KR20090023626A
Application number: KR1020087031307A
Authority: KR
Inventors: 레온 밀너 테오도르 딕; 스베토슬라브 디미트로브 토도로브; 헨드리에테 크노에츠; 마렐리제 브링크
Original assignee: 시플라 메드프로 리서치 앤드 디벨롭먼트 (피티와이) 엘티디
Priority date: 2006-05-28
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2009-03-05
Also published as: IL250634A0; AU2007266675B2; EA017558B1; JP2009538614A; US7951385B2; EP2021457A2; US8444998B2; WO2007138538A2; EA200802409A1; AP2008004626A0; AU2007266675A1; KR101521123B1; EP2021457B1; IL195520A0; CA2647161A1; US20110268703A1; NZ571619A; NO20084577L; CN101454440A; US20090297482A1

Abstract

본 발명은 항균활성을 갖는 엔테로코커스 문드티아이의 스트레인에 관한 것이다. E. 문드티아이(ST4SA)는 넓은 범위의 박테리아에 대한 항균활성을 나타내는 항균 펩티드를 생산한다. 본 발명은 또한 항균 펩티드(펩티드 ST4SA)를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 시퀀스를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 펩티드를 생산하는 공정에 관계된다. 상기 공정은 상기 펩티드의 회수할 수 있는 양이 생산될 때까지 영양 배지에서 10℃ 내지 45℃의 미생물이 살수 있는 조건(micro-arophilic condition) 하에서 배양하고, 상기 펩티드를 회수하는 것을 포함한다. 본 발명의 분리된 펩티드는 전형적인 치료로서, 액체 포뮬레이션이나 겔 포뮬레이션의 항균제로 사용될 수 있으며, 폴리머에서 캡슐화를 수반하는 항균제로 사용될 수 있다.

항균, 펩티드

Description

프로바이오틱 스트레인 및 그로부터 유도된 항균 펩티드{PROBIOTIC STRAIN AND ANTIMICROBIAL PEPTIDE DERIVED THEREFROM}

본 발명은 엔테로코커스 문드티아이 스트레인으로부터 얻어진 펩티드 및 엔테로코커스 문드티아이 스트레인의 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 엔테로코커스 문드티아이 스트레인으로부터 얻어진 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 펩티드를 생산하는 상기 스트레인의 다양한 응용 및 상기 펩티드 그 자체에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria)은 정상적인 위장관 미생물무리(gastro-intestinal microflora)의 균형을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 식이요법, 스트레스, 미생물 감염, 및 장질환(intestinal diseases)은 미생물 균형을 방해하며, 종종 장관(intestinal tract)에서 생육 가능한 유산균, 특히 락토바실리(lactobacilli) 및 비피도박테리아(bifidobacteria)의 수를 감소시킨다. 그에 따라 수반되는 병원성 박테리아의 제어되지 않은 증식은 이후 설사(diarrhoea)나 다른 임상학적 질병, 예컨대, 암(cancer), 염증성 질환(inflammatory disease) 및 궤양 대장염(ulcerative colitis)을 유발한다.

프로바이오틱 유산균의 중요한 특성 중 하나는 상피세포(epithelial cell)나 장점액(intestinal mucus)으로의 세포 유착(adhesion)이다. 이것은 상피세포 상의 리셉터 분자와 세균 표피 사이에 강한 상호작용을 요구한다. 프로바이오틱 세포의 유착은 병원균(pathogen)의 유착을 방지하고, 면역계(immune system)를 자극한다. 후자는 점액성 막과의 상호작용에 의해 달성되며, 순차적으로 림프계(lymphoids)를 민감하게 한다. 프로바이오틱스의 또 다른 중요한 특성은 낮은 pH와 높은 담즙염(bile salt) 하에서 생존한다는 것이다.

인간과 동물의 소장에 관련되어 있는 비피도박테리아, 락토바실리, 엔테로콕시(enterococci)의 특정 스트레인들은 박테리오신(bacteriocin)(항균 펩티드)를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이 펩티드의 역할과, 장관에서 병원성 박테리아의 증식을 제어하는 데에 있어서의 그들의 중요성은 확실치 않다. 그러나, 그람음성균(Gram-negative bacteria)에 대한 활성을 갖는 박테리오신에 대한 최근의 보고는 결론적으로 이 펩티드와 장 병원균과의 상호 작용에 대한 관심을 다시 새롭게 할 것이다. 근래의 많은 박테리오신들은 장관 내에 정상적으로 존재하는 유산균, 즉, 락토바실러스 액시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus-group), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 이아셀(Lactobacillus easel), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 파라카세이 subsp. 파라카세이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis)에 의해 생산된다.

본 발명은 장 스트레스 조건(예컨대, 낮은 pH, 담즙염, 염, 췌장효소)에 저 항하고, 넓은 스펙트럼의 항균 펩티드(펩티드 ST4SA)를 생산하는 엔테로코커스 문드티아이(Enterococcus mundtii) 스트레인을 개시한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이로부터 분리된 펩티드로서, 하기 아미노산 시퀀스: MSQVVGGKYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS (서열번호 12); 항균 활성을 갖는 그의 단편; 항균 활성을 갖는 그의 뮤테인 및 유도체; 항균 활성을 갖는 그의 공유 결합 브리지 구조물; 또는 상기 아미노산 시퀀스에 약 95% 이상의 상동성을, 바람직하게는 약 85% 이상의 상동성을, 더욱 바람직하게는 약 75% 이상의 상동성을 가지며, 항균 활성을 갖는 시퀀스를 포함하는 펩티드가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이의 펩티드 ST4SA를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 시퀀스가 제공된다.

상기 분리된 뉴클레오티드 시퀀스는 다음의 뉴클레오티드 시퀀스; ATGTCACAAGTAGTAGGTGGAAAATACTACGGTAATGGAGTCTCATGTAATAAAAAAGGGTGCAGTGTTGATTGGGGAAAAGCTATTGGCATTATTGGAAATAATTCTGCTGCGAATTTAGCTACTGGTGGAGCAGCTGGTTGGAAAAGT (서열번호 11); 그의 상보체; 항균 활성을 갖는 펩티드를 생산할 수 있고 그의 발현을 수반하는 그의 단편; 또는 엄격한 혼성화 조건 하에서 그에 혼성화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.

엄격한 혼성화 조건은 50℃에서 2 x SSC, 0.1% SDS의 세정에 상응한다.

상기 뉴클레이티드 시퀀스는 플라스미드의 형태로 발현 벡터(expression vector) 또는 전이 벡터(transfer vector)와 같은 벡터에 포함될 수 있다. 상기 벡터는 항생제 저항성 선택 속성 또는 다른 마커 유전자와 같은 선택 속성을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 미생물 호스트 세포의 형질전환에 적합한 재조합 플라스미드로 확장된다. 상기 플라스미드는 본 발명의 항균 펩티드를 고딩하는 뉴클레오티드 시퀀스로 삽입되는 플라스미드 벡터를 포함한다.

상기 세포는 박테리아 세포 또는 효모 세포와 같은 원핵세포(prokaryotic cell) 또는 진핵세포(eukaryotic cell)일 수 있다. 상기 뉴클레이티드 시퀀스는 상기 세포의 게놈으로 일시적으로 또는 본질적으로 통합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환된 미생물 세포로 확장된다. 상기 플라스미드는 본 발명의 항균 펩티드를 고딩하는 뉴클레오티드 시퀀스로 삽입되는 플라스미드 벡터를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 항균 활성을 가지며, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이로부터 분리된 펩티드가 제공된다.

위에서 동정된 상기 분리된 펩티드를 생산하는 상기 박테리움 문드티아이는 ATCC로 기탁되었고, 기탁번호가 PTA-7278이었다. 위에서 동정된 상기 분리된 펩티드를 생산하는 상기 박테리움 문드티아이의 상기 특정 스트레인은 스트레인 ST4SA로 지정되었다. 따라서, 본 발명은 기탁번호 PTA-7278로 ATCC에 기탁된 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA의 실질적으로 순수한 배양물로 확장된다. 상기 배양물은 동화할 수 있는 탄소, 질소, 및 비유기 물질원을 함유하는 영양 배지에서의 발효에 기초해 회수할 수 있는 양의 펩티드 ST4SA를 생산한다.

본 발명의 또 다른 측면은 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA를 상기 펩티드의 회수할 수 있는 양이 생산될 때까지 영양 배지에서 10℃ 내지 45℃의 미생물이 살수 있는 조건(micro-arophilic condition) 하에서 배양하고, 상기 펩티드를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 펩티드를 생산하는 공정에 관계된다. 바람직하게는 상기 배양은 약 37℃의 온도에서 이루어진다.

상기 영양 배지는 콘 스티프 리쿠어; 치즈 훼이 파우더; MRS 브로스; 효모 추출물; 및 몰라세스를 포함하는 군으로부터 하나 이상이 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 영양 배지는 pH 6 내지 6.5의 MRS 브로스이다.

본 발명의 상기 분리된 펩티드는 예를 들어, 중이 감염과 같은 귀 감염 및 인후, 눈, 또는 피부 감염에 대한 전형적인 처치로서 액체 포뮬레이션(liquid formulation) 또는 겔 포뮬레이션(gel formulation)의 항균제로 사용될 수 있다. 상기 액체 포뮬레이션은 또한 음식에 대한 액체 보충물로 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 굴 감염(sinus infections), 굴염(sinusitis), 비염(rhinitis), 편도선염(tonsillitis) 또는 인후 감염(throat infections)를 치료하는 스프레이 타입의 항균제로 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 또, 냉동건조된 파우더의 형태일 수 있다.

상기 분리된 펩티드는 또한, 폴리머에 캡슐화된 것을 수반하는 항생제로 사용될 수 있다. 본 발명은 그의 또 다른 측면에 따라 펩티드 ST4SA의 향균 양으로 그에 혼입된 폴리머로 확장된다. 이 폴리머는 예컨대 피부 감염과 같은 감염에 대해 전형적으로 치료하기 위한 포뮬레이션으로 사용되거나, 예를 들어, 귀 그로밋(ear grommets), 카테터(catheters), 오스토미 튜브 및 파우치(ostomy tubes and pouches), 스텐트(stents), 봉합물질(suture material), 여성 위생 산물과 같은 위생 산물(hygiene products such as feminine hygiene products), 콘택트 렌즈(contact lenses), 콘택트 렌즈 세정액(contact lens rinsing solutions)과 같은 임플란트(implants), 또는 의약 장치(medical devices)에 혼입되는 용도로 사용되거나, 상처 드레싱에 혼입되는 용도로 사용될 수 있다. 상기 폴리머에서의 상기 항균 펩티드의 캡슐화는 항균 펩티드의 느린 방출과 미생물 감염에 대한 연장된 처치 시간을 유발한다.

상기 분리된 펩티드는 폴리머의 100 000 AU/ml(임의 단위) 내지 300 000 AU/ml의 농도로, 바람직하게는 200 000 AU/ml의 농도로 포함될 수 있다.

상기 펩티드는 또한 연고(ointment), 로션(lotion) 또는 크림(cream) 포뮬레이션으로 혼입되는 것에의해 항생제로 사용될 수 있다. 이 연고, 로션 또는 크림 포뮬레이션은 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 예를 들어 콘택트 렌즈 세정액과 같은 액체 포뮬레이션으로 혼입되는 것에 의해 또한 항생제로서 사용될 수 있다. 또는 상기 펩티드는 콘택트 렌즈 그 자체로 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 그 또 다른 측면으로서, 본 발명의 항균 펩티드를 함유하는 항균 연고, 로션 또는 크림을 제공한다.

본 발명의 또 다른 형태에서 상기 펩티드는 살균 포장 제조에 사용하기 위하여, 예를 들어 플라스틱과 같은 포장 물질로 혼입되는 것에 의해 항생제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 형태에서, 상기 펩티드는 알약 형태 또는 캡슐 형태로 박테리움 엔테로코커스문드티아이의 넓은 스펙트럼을 갖는 프로바이오틱의 일부로서 사용될 수 있다. 또는 그것은 예를 들어 사탕 또는 츄잉검과 같은 식용 형태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따른면, 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA의 치료적으로 유효한 양을 포함하는 생물학적으로 순수한 배양물을 포함하는 프로바이오틱 조성물이 제공된다. 상기 스트레인은 프로바이오틱 조성물의 ml 당 약 10⁶ 내지 10⁹,바람직하게는 약 10⁸의생육 세포(cfu)의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 형태에서, 상기 프로바이오틱 조성물은 동물 또는 인간에서 병원성 박테리아를 감소하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 형태에서, 상기 프로바이오틱 조성물은 동물 또는 인간에서 병원성 바이러스를 감소하기 위해 사용될 수 있다.

상기 프로바이오틱 조성물은 파우더, 액제, 겔, 알약의 형태일 수 이거나, 식료품에 혼입될 수 있다. 액체 형태의 상기 프로바이오틱 조성물은 음식에 대한 액체 보충물로 사용될 수 있다. 상기 스트레인은 액체 보출물의 ml 당 약 10⁶ 내지 10⁹, 바람직하게는 10⁸ 생육세포(cfu)의 농도로 포함될 수 있다.

상기 프로바이오틱 조성물은 10³ 내지 10⁶ cfu/ml, 바람직하게는 10⁵ 내지 10⁶　cfu/ml, 가장 바람직하게는 약 3x 10⁵ cfu/ml의 최종 농도로 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 동물 또는 인간에서 박테리아 감염 조건을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 엔테로코커스 문드티아이 스트레인의 약제학적으로 유효한 양; 및 본 발명의 항균 펩티드의 약제학적으로 유효한 양의 하나 이상을 포함하는 그룹으로부터 선택된 물질 또는 조성물에 동물 또는 인간의 감염된 영역을 노출하는 단계를 포함한다.

따라서, 본 발명은 또한 동물 또는 인간의 박테리아 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 약물을 제조하는 데에 있어서, 본 발명의 엔테로코커스 문드티아이 스트레인의 치료적으로 유효한 양의 용도로 확장된다.

상기 방법은 박테리아 종을 100 000 내지 300 000 AU/ml, 바람직하게는 약 200 000 AU/ml의 농도의 본 발명의 항균 펩티드에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 동물 또는 인간의 박테리아 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 약물을 제조하는 데에 있어서, 본 발명의 항균 펩티드의 치료적으로 유효한 양의 용도로 확장된다.

본 발명은 또한 동물 또는 인간에서 박테리아 감염을 치료하는 방법에 사용되는 물질 또는 조성물을 제공한다. 상기 물질 또는 조성물은 본 발명의 엔테로코커스 문드티아이 스트레인을 포함하고, 상기 방법은 동물 또는 인간에 상기 물질 또는 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 동물 또는 인간에서 박테리아 감염을 치료하는 방법에 사용되는 물질 또는 조성물을 제공한다. 상기 물질 또는 조성물은 본 발명의 항균 펩티드를 포함하고, 상기 방법은 동물 또는 인간에 상기 물질 또는 조성물을 치료적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

상기 박테리아 감염은 다음 중 하나 이상에 의해 유발된 감염일 수 있다: 아시네토박터 바우마니아이(Acinetobacter baumanii); 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); 클로스트리디움 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum); 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae); 이스케리시아 콜라이(Escherichia coli; 대장균); 클레브젤라 뉴모니애(Klebsiela pneumoniae); 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua); 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aruginosa); 스타필로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus); 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus); 스트렙토코커스 카프리너스(Streptococcus caprinus); 스트렙토코커스(엔테로코커스) 페칼리스(Streptococcus (Enterococcus) faecalis); 또는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae).

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 박테리아 종의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 박테리아 종을 본 발명의 항균 펩티드의 유효한 양으로 노출시키는 단계를 포함한다. 상기 박테리아 종은 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다: 아시네토박터 바우마니아이; 바실러스 세레우스; 클로스트리디움 티로부티리쿰; 엔테로박터 클로아케; 이스케리시아 콜라이; 클레브젤라 뉴모니애; 리스테리아 이노쿠아; 슈도모나스 아루지노사; 스타필로코커스 오리우스; 스타필로코커스 카노수스; 스트렙토코커스 카프리너스; 스트렙토코커스(엔테로코커스) 페칼리스; 및 스트렙토코커스 뉴모니애.

본 발명의 일 측면에 따르면, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이로부터 분리된 수송 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드는 서열번호 14의 아미노산 시퀀스; 그의 단편; 그의 뮤테인 및 유도체; 또는 상기 아미노산 시퀀스에 약 90% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 상동성을 가지며, 항균 활성을 갖는 시퀀스를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이의 ST4SA 수송 펩티드를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 시퀀스가 제공된다. 상기 분리된 뉴클레오티드 시퀀스는 서열번호 13의 뉴클레오티드 시퀀스; 그의 상보체; 그의 단편; 또는 엄격한 혼성화 조건하에서 그에 혼성화되는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이로부터 분리된 면역 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드는 서열번호 16의 아미노산 시퀀스; 그의 단편; 그의 뮤테인 및 유도체; 또는 상기 아미노산 시퀀스에 약 90% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 상동성을 가지며, 항균 활성을 갖는 시퀀스를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이의 ST4SA 면역/유착 펩티드를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 시퀀스가 제공된다. 상기 분리된 뉴클레오티드 시퀀스는 서열번호 15의 뉴클레오티드 시퀀스; 그의 상보체; 그의 단편; 또는 엄격한 혼성화 조건하에서 그에 혼성화되는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.

본 발명은 그의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 10을 포함하는 그룹으로부터선택된 프라이머로 확장된다. 따라서, 본 발명은 또한, 다음의 그룹으로부터 선택된 프라이머 쌍으로 확장된다:

서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10을 포함하는 프라이머 쌍.

본 발명은 또한 엔테로코커스 문드티아이의 동정에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍의 용도로 확장된다.

본 발명의 이해를 돕고, 어떻게 동일한 것이 효과적으로 수행될 수 있는지 보여주기 위하여, 수반되는 도면 및 표들이 참조되지만, 이는 예시에 불과하다.

도 1은 SEM(scanning electron microscopy)에 의해 관찰된 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA의 세포 형상 이미지이다.

도 2는 속 특이적 프라이머를 이용하여 얻어진 PCR 산물(DNA 단편)을 보여주는 아가로즈 겔의 사진이다. 엔테로코커스에 특이적인 112kb의 속 특이적 DNA 밴드 가 얻어졌다.

도 3은 종 특이적 프라이머를 이용하여 얻어진 PCR 산물(DNA 단편)을 보여주는 아가로즈 겔의 사진이다. 엔테로코커스 문드티아이에 특이적인 306bp의 종 특이적 DNA 밴드가 얻어졌다.

도 4는 겔 여과(AKTA-퓨리파이어)에 의해 분리된 펩티드 ST4SA의 개략적인 그래프이다.

도 5는 펩티드 ST4SA의 위치를 보여주는 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 사진이다.

도 6a는 E. 문드티아이 ST4SA의 플라스미드 프로파일을 보여주는 아가로즈 겔의 사진이다.

도 6b는 스트레인 ST4SA의 염색체(게놈) 상의 구조 유전자의 위치를 보여주는 서던 블롯(Southern blot)이다.

도 7은 E. 문드티아이 펩티드 ST4SA의 아미노산 시퀀스의 개략적인 다이어그램이다.

도 8은 펩티드 ST4SA 구조 유전자(A), 수송 유전자(B), 및 면역 유전자(C)의 DNA 시퀀스이다.

도 9a 및 도 9b는 펩티드 ST4의 생산에 대한 성장 배지 구성성분의 영향을 도시한다.

도 10은 MRS 브로스에서 펩티드 ST4SA의 생산에 대한 개략적인 그래프이다.

도 11은 추정 유착 유전자(putative adhesion gene)를 포함하는 DNA 단편을 보여주는 아가로즈 겔의 사진이다.

도 12는 여러 온도에서 펩티드 ST4SA(멸균 증류수에 현탁된 천연 추출물)의 안정성을 보여주는 그래프이다.

도 13은 아가 플레이트 상에서 슈도모나스 sp.에 대해 기록된 억제 영역의 사진이다.

도 14는 펩티드 ST4SA(409 600 AU/ml)로 처치된 스트렙토코커스 뉴모니애의 사진이다. 세포질(cytoplasm)의 누출이 화살표로 지시되어 있다.

도 15는 스트렙토코커스 뉴모니애(병원균 27)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 16은 스트렙토코커스 뉴모니애(병원균 29)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 17은 클레브젤라 뉴모니애(병원균 30)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 18은 중이 분리물(middle ear isolate; 병원균 40)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 19는 중이 분리물(병원균 BW)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 20은 중이 분리물(병원균 E)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 22는 중이 분리물(병원균 GW)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 23은 중이 분리물(병원균 HW)의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.

도 24는 리스테리아 이노쿠아 LMG 13568의 존재 하에서 스트레인 ST4SA의 성 장 및 펩티드 ST4SA의 생산을 보여주는 그래프이다. 기호:

= L. 이노쿠아 LMG 13568의 존재 하에서 스트레인 ST4SA의 성장,

= L. 이노쿠아 LMG 13568의 성장 억제,

= pH의 변화,

= 펩티드 ST4SA의 생산.

도 25는 프로바이오틱 스트레인 ST4SA의 평가를 위해 개발된 위장관 모델(GIM)의 개략도이다.

도 27은 반코마이신에 의한 리피드 II 표적 사이트의 차단 및 펩티드 ST4SA의 행동(항균 활성) 모드에 대한 그 영향을 보여주는 개략도이다. %누출은 세포질 누출을 의미하고, 증가된 DNA 및 β-갈락토시데이즈 활성 레벨에 의해 기록된다.

도 27은 아미노산 9(시스테인) 및 14(시스테인)에 공유 결합되는 펩티드로 도입된 이황화 브리지의 개략도이다.

도 28은 ST4SA의 소수성 도표를 나타낸다.

도 29는 시험관 내 GIT 모델에서 L. 모노사이토젠스에 ST4SA를 접종한 결과 및 생존을 도시한다.

도 30은 MRS 브로스 및 CSL 배지에서 E. 문드티아이 ST4SA의 성장 커브를 보여준다.

도 31은 (A) 대조구 결장 (B) 스트레인 ST4SA가 공급된 결장 (C) 대조구 회장 (D) 스트레인 ST4SA가 공급된 회장 (E) 대조구 간 (F) S스트레인 ST4SA가 공급된 간 (G) 대조구 비장 (H) 스트레인 ST4SA가 공급된 비장의 헤모라이신 및 에오신 염색 섹션을 40배로 도시한다.

도 32는 각 실험 래트 그룹에 대해 매일 측정된 체중을 표시하는 그래프이다. 화살표는 리스테리아 감염 시간을 나타낸다.

도 33은 매일 측정된 래트의 음식 섭취를 표시하는 그래프이다.

도 34는 각 실험 래트 그룹에 대해 매일 측정된 물 소비를 표시하는 그래프이다.

도 35는 스트레인 ST4, 스트레인 423, 및 대조구 물이 투여된 각 실험 래트 그룹의 배설물 습윤 내용물을 표시하는 그래프이다.

도 36은 각 실험 래트 그룹으로부터 감염 하루 전 및 감염 후 이틀 째에 수집된 배설물 샘플에서의 리스테리아 수를 도시한다.

표 1은 스트레인 ST4SA의 표현 특성(phenotypic characteristics)을 나타낸다(당 발효 반응).

표 2는 스트레인 ST4SA의 여러 특성을 나타낸다.

표 3은 스트레인 ST4SA에 대한 요소, 온도, pH 및 용제(detergent)의 영향을 나타낸다.

표 4는 펩티드 ST4SA의 활성 스펙트럼을 나타낸다.

표 5는 종이 디스크 상에서의 펩티드 ST4SA의 활성을 나타낸다.

표 6은 펩티드 ST4SA와 일반적으로 사용되는 항생제의 비교를 나타낸다.

표 7은 병원균에 대한 펩티드 ST4SA의 유착을 나타낸다.

표 8은 펩티드 ST4SA로 병원균을 처치한 후 기록된 세포외 DNA를 나타낸다.

표 9는 펩티드 ST4SA로 병원균을 처치한 후 기록된 β-갈락토시데이즈의 활 성을 나타낸다.

표 10은 (컴퓨터화된) GIM의 동작을 나타낸다.

표 11은 GIM(리스테리아 모노사이토젠스가 표적 미생물(병원균)로 사용됨)에서 스트레인 ST4SA의 생존 및 펩티드 ST4SA의 생산을 나타낸다. 수치는 3회의 시도에 대한 평균값이다. 사용된 영양분은 각각 NAN 펠아르곤(Nestle) 및 MRS (De Man Rogosa medium, Biolab)였다.

표 12는 스트레인 ST4SA의 항생제 저항을 나타낸다.

표 13은 여러 농도의 트리메토프림-설파메톡사졸(Trimethoprim-sulfamethoxazole, TMP-SMX) 및 메트로니다졸(Metronidazole)의 존재 하에서 스트레인 ST4SA의 성장을 나타낸다.

표 14는 평가된 독성 인자를 나타낸다.

표 15는 플레이트 카운팅에 의한 스트레인 ST4SA의 카코-2 세포주에의 유착을 나타낸다(대조구).

표 16은 스트레인 ST4SA 및 L. 모노사이토젠스의 경쟁 배타를 나타낸다.

표 17은 스트레인 ST4SA, 락토비타 또는 비보충수가 투여된 래티의 체중 수치를 나타낸다.

도 18은 (A) 107일 락토비타 연구 및 (B) 50일 스트레인 ST4SA 연구 동안, 위스타 래트 수놈의 배설물 샘플에서의 β-글루쿠로니데이즈 활성을 나타낸다. 수치는 2 시간 당 방출된 ρ-니트로페놀의 mM로 표시된다. 표준 에러 수치가 괄호로 표시되었다.

표 19는 MRSf(MRS 여과) 배지에서의 펩티드 ST4SA의 정제를 나타낸다.

표 20은 펩티드 ST4SA의 생산에 대한 성장 배지로서 테스트된 순수 CSL, 몰라세스 및 CWp의 결과를 나타낸다.

표 21은 펩티드 ST4SA 생산에 가장 유의적인 영향을 갖는 배지를 측정하기 위한, 구성 성분으로 CSL 및 CWp를 갖는 풀 팩토리알 디자인(FFD)을 나타낸다.

표 22는 ST4SA 활성 최적화를 위해 MRS 구성성분이 보충된 CSL의 결과를 나타낸다.

표 23은 MRS 구성성분 및 CSL의 높고 낮은 농도를 나타낸다.

표 24는 2^10-5 FrFD 디자인을 나타낸다.

표 25는 2^10-5 FrFD 디자인에 대한 변수 테이블의 분석을 나타낸다.

표 26은 CSL 및 YE 농도를 측정하기 위해 3개의 중앙 포인트를 갖는 2² FFD를 나타낸다.

표 27은 발효 동안의 탄소 섭취를 나타낸다.

표 28은 항생제 및 항염증 약물에 대한 E. 문드티아이 ST4의 저항성 테스트 결과를 나타낸다.

표 29는 ST4SA의 카코-2 세포에의 유착에 대한 항생제 및 항염증 약물의 영향을 나타낸다.

본 발명은 장관 스트레스 조건(예컨대, 낮은 pH, 담즙염, 염, 췌장효소)에 저항하고, 넓은 스펙트럼의 항균 펩티드 즉, 펩티드 ST4SA를 생산하는 박테리움 엔테로코커스 문드티아이(Enterococcus mundtii) 스트레인을 개시한다. 펩티드 ST4SA를 생산하는 엔테로코커스 문드티아이의 스트레인은 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되었다. 상기 기탁번호는 PTA-7278이다. 대부분 중이 감염 및 장으로부터 분리된 매우 많은 수의 그람 양성 및 그람 음성균에 대한 활성이 관찰되었다. 억제된 박테리아의 예는 다음과 같다: 아시네토박터 바우마니아이(Acinetobacter baumanii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 이스케리시아 콜라이(Escherichia coli, 대장균), 클레브젤라 뉴모니애(Klebsiela pneumoniae), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aruginosa), 스타필로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus), 스트렙토코커스 카프리너스(Streptococcus caprinus), 스트렙토코커스(엔테로코커스) 페칼리스(Streptococcus (Enterococcus) faecalis), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 및 감염된 중이 용액 샘플에서 분리된 미확인 그람 양성 및 음성균의 다수의 임상적 스트레인. 이것은 특히 다양한 인간 병원균에 대해 넓은 스펙트럼의 활성을 나타낸다.

그람 음성균에 대한 활성을 갖는 매우 넓은 스펙트럼의 항균 펩티드가 개시되었다; 예를 들어, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)에 의해 생산된 펜토신(pentocin) 35d, 락토바실러스 펜토수스 ST151 BR에 의해 생산된 박테리 오신 ST151 BR, 락토바실러스 파라카세이 subsp. 파라카세인에 의해 생산된 박테리오신, 스트렙토코커스 써모필러스(termophylus)에 의해 생산된 써모필린(thermophylin), 엔테로코커스 패칼리스에 의해 생산된 펩티드 AS-48, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 의해 생산된 박테리오신 KCA2386 및 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)에 의해 생산된 엔테로신(enterocin) CRL35. 그러나, 이 펩티드들의 활성 스펙트럼은 위에 나열된 펩티드 ST4SA에 민감한 종에서 알 수 있는 것처럼, 펩티드 ST4SA보다 훨씬 좁다. 넓은 스펙트럼 활성, 특히 병원성 박테리아에 대한 넓은 스펙트럼 활성으로 인해, 펩티드 ST4SA가 세균 감염, 특히 2차 상처 감염에 관계된 병원균(상기 펩티드는 다수의 이 병원균의 성장을 억제한다) 뿐만 아니라, 중이감염에 대해 (상기 펩티드가 다양한 중이 병원균에 대해 활성을 가지므로) 이상적이게 된다. 감염된 중이 용액으로부터 분리된 병원균은 아시네토박터 바우마니아이, 이스케리시아 콜라이, 클레브젤라 뉴모니애, 슈도모나스 아루지노사, 스타필로코커스 오리우스, 스타필로커커스 카노수스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 및 다수의 미확인된 그람 양성 및 음성균이었다.

물질 및 방법

스트레인 ST4SA의 분리와 종 레벨로의 동정

멸균 증류수(sterile distilled water)에 4시간 동안 담근 콩(soy bean)으로부터 얻어진 콩 추출물(Soy bean extract)이 MRS 아가(agar) (Biolab; Biolab Diagnostics, Midrand, SA) 상에 순차적으로 희석 및 평판배양되었다. 이때, 곰팡 이 생장을 억제하기 위해 50 mg/l의 나타마이신(Delvocid®; Gist-brocades, B.V., Delft, The Netherlands)이 보충되었다. 플레이트가 30℃ 내지 37℃에서 2일 동안 인큐베이션되었다.

플레이트로부터 50 내지 300cfu(colony forming units; 콜로니 형성단위)의 콜로니가 랜덤하게 선택되었고, Delvocid®(50 mg/l)가 보충되면서, MRS 아가의 제2 층(second layer)에 상기 콜로니들을 오버레이(overlay)하는 것에 의해 항균 활성이 스크린되었다. 플레이트는 가스 생성 키트(Gas Generation Kit, Oxoid)의 존재 하에 혐기성 플라스크(Oxoid, New Hampshire, England) 내에서 30℃ 내지 37℃, 48시간 동안 인큐베이션되었다. 락토바실러스 카세이, 엔테로코커스 패칼리스, 스타필로코커스 오리우스, 슈도모나스 아에루지노사, 클레브젤라 뉴모니애, 스트랩토코커스 뉴모니애, 및 스타필로코커스 오리우스 각각의 활성 성장 세포(예컨대, 10⁶ cfu/ml) 1ml가 보충되면서, 상기 콜로니는 제3 층(예컨대, 10ml)의 반고체(1.0% 아가, w/v) BHI 배지(Merck, Darmstadt, Germany)로 덮였다. 상기 플레이트는 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션되었다.

상기 콜로니의 하나는 테스트 패널(표 4)에 포함된 가장 큰 여러 병원균을 억제했고, MRS 브로스(MRS broth, Biolab)으로 재접종되었다. 후속하여 순수한 배양물(culture)을 얻기 위해 재스트리킹(re-streaking)되었다. 분리물은 스트레인 ST4SA로 지정되었다. 항균 활성이 아가 스폿 테스트(agar-spot test)법을 이용하여 확인되었다.

스트레인 ST4SA의 세포 형상이 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM)에 의해 연구되었다(도 1 참조). 원심분리에 의해 초기 기하급수적 상(early-exponential phase)(OD_600nm = 0.2)의 스트레인 ST4SA 배양물 10ml가 수집되었고, 멸균 증류수로 5회 세정되었다(3 000 x g, 10분, 4℃). 펠렛이 500㎛의 멸균 밀리큐 워터(MilliQ water; Waters, Milipore)에 재현탁된 후, 현미경 관측을 위해 배치되었다.

추가적인 동정이 생리학적(표 2) 및 생화학적 특성에 의해 이루어졌다. 트립틱 소이 브로스 (Tryptic Soy Broth; Merck) 상에서 색소 형성(pigment formation)이 테스트되었다. 이동도 테스트도 수행되었다. API 50 CHL와 API 20 스트렙 테스트 스트립스(Strep test strips) (Biomerieux, Marcy-l'Etiole, France)를 이용하여 당 발효 반응(표 1)이 기록되었고, 엔테로콕사이(enterococci)에 대해 리스트된 반응과 비교되었다.

표 1.

화합물/유도체(compound/derivative)	E. 문드티아이 ST4SA 발효
대조구(control)
글리세롤(Glycerol)	+
에리트리톨(Erythritol)
D-아라비노즈(D-arabinose)
L-아라비노즈(L-arabinose)	++
리보즈(Ribose)	+++
D-자일로즈(D-xylose)	++
L-자일로즈(L-xylose)
아도니톨(Adonitol)
메틸-자일로시드(Methyl-xyloside)
갈락토스(Galactose)	++
D-글루코스(D-glucose)	+++
D-프럭토스(D-fructose)	+++
D-만노스(D-mannose)	++
L-소르보스(L-sorbose)
람노스(Rhamnose)	++
둘시톨(Dulcitol)
이노시톨(Inositol)
마니톨(Mannitol)	++
소르비톨(Sorbitol)	++
메틸-D-마노스(Methyl-D-mannoside)	++
메틸-D-글루코시드(Methyl-D-glucoside)
아세틸 글루코사민(Acetyl glucosamine)	++
아미그달린(Amygdaline)	+++
아르부틴(Arbutine)	+++
에스쿨린(Esculine)	+++
살리신(Salicine)	+++
셀로비오스(Cellobiose)	+++
말토즈(Maltose)	+++
락토즈(Lactose)	+++
멜리비오즈(Melibiose)	++
사카로즈(Saccharose)	+++
트레할로즈(Trehalose)	++
이뉼린(Inuline)
멜레지토즈(Melezitose)
D-라피노즈(D-raffinose)
아미돈(Amidon)	+
글리코겐(Glycogen)
자일리톨(Xylitol)
B 젠티비오즈(B Gentiobiose)	+++
D-투라노즈(D-turanose)
D-라익소스(D-lyxose)
D-타가토즈(D-tagatose)
D-푸코스(D-fucose)
L-푸코스(L-fucose)
D-아라비톨(D-arabitol)
L-아라비톨(L-arabitol)
글루코네이트(Gluconate)
2 세토-글로코네이트(2 ceto-gluconate)
5 세토-글로코네이트(5 ceto-gluconate)

표 2.

특성	ST4SA 스트레인
글루코스로부터의 CO₂	-
10℃에서의 성장	+
45℃에서의 성장	+
6.5% NaCl에서의 성장	+
18% NaCl에서의 성장	-
pH 4.4에서의 성장	+
pH 9.6에서의 성장	+
유산 형상(Lactic acid configuration)	L

엔테로코커스(도 2) 및 엔테로코커스 문드티아이(도 3)에 특이적인 프라이머에 의해 생성된 DNA 줄무늬 유형(DNA banding patterns)에 의해 추가적인 동정이 수행되었다. 50bp의 DNA 단편(DNA fragment; Arnersharn Bioscience, UK Limited, UK)이 마커로 사용되었다. 306bp의 단편(도 3에 도시)을 생성하는데 사용된 프라이머가 16S rDNA 상에 적절히 보존된 영역(conserved region)으로부터 디자인되었다.

서열번호 1 : 순방향 프라이머: AACGAGCGCAACCC;

서열번호 2: 역방향 프라이머: GACGGGCGGTGTGTAC

DNA 단편의 시퀀싱은 진뱅크(GenBank)의 보존된 16S rDNA 단편과 98%의 상동성(homology)을 나타냈다.

항균 활성의 표현

항균 활성이 무세포 상층액(cell-free supernatant) ml당 임의 단위(AU, arbitrary units)로 표현되었다. 1 AU는 성장 억제의 깨끗한 영역(clear zone)를 나타내는 가장 큰 희석도의 역수로 정의되고, 아래와 같이 계산된다:

a^b x 100. 여기서, "a"는 희석인자를 표시하고, "b"는 적어도 2mm의 직경의 억제 영역(inhibition zone)을 생성하는 최후의 희석도를 표시한다. 활성도는 ml당 100배로 표현된다. 락토바실러스 카세이 LHS가 인티케이터 스트레인으로 사용되었다.

항균 물질의 특성화

스트레인 ST4SA가 MRS 브로스(Biolab)에서 30℃의 온도로 24시간 및 48시간 동안 배양되었다. 세포가 수집되었고(8 000 x g, 4℃, 15분), 무세포 상층액이 6M NaOH을 이용하여 pH 6.0으로 조정되었다. 각 상층액 1ml가 카탈레이즈(catalase) (Boehringer Mannheim) 0.1 mg/ml (최종 농도)로, 프로키네이즈(Proteinase) K(Roche, Indianopoiis, IN, USA), 프로네이즈(pronase), 파파인(papain), 펩신(pepsin) 및 트립신(trypsin) 각각 1mg/ml 및 0.1mg/ml(최종 농도)로 처리되었다. 인큐베이션 후, 효소(enzyme)가 열-비활성화(heat-inactivated)되었고(100℃에서 3분), 이전에 기재된 방법으로 항균 활성이 테스트되었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

펩티드 ST4SA의 부분 표본(aliquot)들이 3O℃, 60℃ 및 100℃에서 각각 10, 30, 90분간, 그리고 121℃에서 20분간 열처리에 노출되었다(표 3). 이후, 상기 샘플들은 이전에 기재된 방법으로, 항균 활성이 테스트되었다.

표 3.

처리	펩티드 ST4SA
효소: α-아밀레이즈(α-amylase) 프로티네이즈 K (Proteinase K) 펩신 프로네이즈(pronase)	+ - - -
pH: 2.0 - 12.0	+
열(Heat): 30, 60, 100℃에서 10분 30, 60, 100℃에서 30분 30, 60, 100℃에서 90분 121℃에서 20분	+ + + -
세정제(detergents) (1%): SDS 트윈(Tween) 20, 트윈 80 요소(urea) 트리톤(Triton) X-100 트리톤 X-114	+ + + + -
EDTA: 0.1mM, 1.0mM, 2.0mM	+

"-"는 비활성; "+"는 적어도 직경 5mm의 활성 영역

별도의 실험에서, 펩티드 ST4SA의 샘플은 pH값이 2-12가 되도록 조정되고, 37℃에서 30분간 인큐베이션되고, pH 7로 중성화된 후, 항균 활성이 테스트되었다(표 3).

펩티드 ST4SA의 분리 및 정리

스트레인 ST4SA의 24시간 배양물(24h-old culture)이 MRS 브로스(Biolab)로 접종되었다(2%, v/v, OD_600nm = 8.0). 37℃에서 교반없이 20시간 동안 인큐베이션되었다. 세포가 수집되었고(8 000 x g, 10분, 4℃), 80%의 포화 암모니움 설페이트(saturated ammonium sulphate)로 무세포 상층액으로부터 펩티드가 침전되었다. 침전물은 1/10 부피로 25mM 암모니움 아세테이트(ammonium acetate) (pH 6.5)에 재 현탁되고, 1000Da 컷오프 투석막(cut-off dialysis membrane; Spectrum Inc., CA, USA)를 사용하여 증류수에 대해 탈염되고, 셉팩 C18 컬럼(SepPak C18 column, Water M[upsilon]lipore, MA, USA) 상에 로딩되었다. 상기 컬럼은 25mM 암모니움 아세테이트(pH 6.5)에서 20%(v/v)의 이소프로파놀로 세정되었고, 상기 박테리오신은 25mM 암모니움 아세테이트(pH 6.5)에서 40% (v/v)의 이소프로파놀로 추출되었다(eluted). 진공(Speed-Vac; Savant)에서 건조된 후, 단편이 모였고(pooled), pH 6.5인 50mM 인산 버퍼에 용해되었다. 계속해서, 활성 단편이 AKTA퓨리파이어(AKTApurifier, Amersham)에 링크된 수퍼덱스(Superdex^tm) 75컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)에서 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)에 의해 분리되었다(도 4). 컬럼으로부터의 펩티드 추출은 pH 6.5에서 50mM 인산 버퍼 및 400mM NaCl에 의해 수행되었다. 펩티드는 254nm 및 280nm에서 각각 검출되었다. 활성 펩티드를 함유하는 단편이 수집되고, 진공에서 건조되고, -2O℃에서 저장되었다. 아가 스폿(agar spot)법을 이용하여 활성 테스트가 수행되었다.

사이즈 측정

스트레인 ST4SA가 MRS 브로스(Biolab)에서 30℃, 20시간동안 성장되었다. 원심분리(8 000 x g, 10분, 4℃)에 의해 세포가 수집되고, 80%의 포화 암모니움 설페이트(ammonium sulphate로 무세포 상층액으로부터 펩티드 ST4SA가 침전되었다. 침전물은 1/10 부피로 25mM 암모니움 아세테이트(pH 6.5)에 재현탁되고, 1000Da 컷오 프 투석막을 사용하여 증류수에 대해 탈염되고, 트리신(tricine)-SDS-PAGE에 의해 분리되었다(도 5a). 2.35 내지 46 kDa 범위의 사이즈를 갖는 저분자 중량 마커(Amersham International, UK)가 사용되었다. 겔이 고정되고, 절반은 L. 카세이(casei) LHS(10₆ cfu/mL)로 오버레이되었으며, 활성 박테리오신의 위치를 측정하기 위해 브레인 하트 인퓨전(Brain Heart infusion, BHI) 아가에 임베디드되었다(도 5b).

펩티드 ST4SA에 대한 세포독성 테스트

펩티드 ST4SA가 세포 독성 특성을 갖는지 측정하기 위하여, 원숭이 신장 베로(Vero) 세포의 융합 단층(confluent monolayer) 3중웰(triplicate well)이 조직 배양 플레이트에서 48시간 동안 성장된 후, 다양한 농도의 항균 펩티드에 노출되었다. 48시간의 인큐베이션 후, 테트라졸리움염(tetrazolium salt) MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-gamma-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (Sigma)으로 처리하는 것에 의해 세포 생육력(cell viability)이 테스트되었다. 석시네이트 디하이드로제네이즈(succinate dehydrogenase)에 의한 MTT의 분할(cleaving) 후에 형성되는 청색 생성물(포르마잔, formazan)의 생산이 기록되었다.

50%의 세포독성 레벨(CC₅₀)이 세포 생육력을 50% 감소시키는데 필요한 펩티드 농도(㎍/ml)로 정의되었다. CC₅₀의 결과(세포독성 레벨)에 따르면, 세포독성이 기록되지 않았다. 즉, 펩티드는 제로(0)의 CC₅₀를 갖는다.

플라스미드 분리

전체 DNA가 분리되었다. 플라스미드 DNA가 분리되었고, 그 후 상기 DNA는 CsCl 밀도기울기원심법(density gradient centrifugation)에 의해 더욱 정제되었다. 상기 DNA는 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 분리되었다(도 6). EcoRI와 HindIII(Promega, Madison, USA)로 소화된 람다 DNA가 분자 중량 마커로 사용되었다.

플라스미드 큐어링

큐어링 실험이 수행되었다. Ent. 문드티아이 ST4SA의 세포가 노보바이오신(novobiocin)의 존재 하(1-25㎍ ml^-1)에 37℃, 72시간 동안 인큐베이션되었다. 가장 높은 노보마이신 농도에서 성장한 배양물이 순차적으로 멸균 식염수(saline)로 희석되고, MRS 아가 플레이트 상에 평판배양되었다. 37℃에서 하루밤 인큐베이션 후, 콜로니가 복제-평판배양되고(replica-plated), 원래의 플레이트는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMG 13566 세포로 오버레이되었다. 37℃, 16시간의 추가 인큐베이션 후, 콜로니는 항균 활성이 상실되었는지 체크되었다.

접합 전이 실험

필터 메이팅(Filter mating) 실험이 수행되었다. Ent. 문드티아이 ST4SA와 Ent. 패칼리스 FA2-2의 하루밤 성장 배양액(0.25ml)이 4.5ml MRS에 첨가되고, 혼합된 후, 0.45㎛의 포어사이즈를 갖는 멸균막 필터(HAWP, Miliipore)를 통해 필터링되었다. 상기 막은 MRS 아가 플레이트 상에 배치되었고, 37℃에서 하루밤 인큐베이션되었다. 세포가 1ml MRS 내로 필터를 통해 세정되었고, 순차적으로 희석되고, 25㎍ ml^-1의 후시딕 산(fusidic acid), 25㎍ ml^-1의 리팜피신(rifampicin) 및 2000 AU ml^-1의 천연 펩티드(crude peptide) ST4SA를 함유하는 MRS 아가 플레이트 상으로 평판배양되었다. 상기 실험은 레시피언트(recipient)로서 Ent. 패칼리스 OGX1에 대하여 반복되었다. 이 경우, 1mg ml^-1의 스트렙토마이신(streptomycin)과 2000AU ml^-1의 천연 펩티드 ST4SA를 함유하는 플레이트 상에서 선택이 수행되었다. 이전에 기술된 것처럼, 콜로니는 랜덤하게 선택되었고, 펩티드 ST4SA의 생산에 관해 체크되었으며, 플라스미드 내용물에 관해 스크린되었다. pST4SA를 함유하는 Ent. 패칼리스 OGX1의 접합 세포의 콜로니가 배양되었고, 이전에 기술된 것처럼 무세포 상층액이 활성 테스트의 대상이 되었다.

펩티드 ST4SA를 인코딩하는 유전 요소의 검출 및 DNA 시퀀싱

전체 DNA가 분리되었다. 구조 유전자(structural gene), 수송 유전자(transporter gene) 및 면역 유전자(immunity gene) (아래에 리스트됨)를 PCR에 의해 증폭하는데 사용된 DNA 프라이머는 다른 항균 펩티드에 대해 공개된 부분 시 퀀스에 기초하여 디자인되었다. 시퀀싱은 ABI 프리즘(ABI Prism^TM) 377 DNA 시퀀서 (PE Applied Biosystem, Foster City, USA) 상에서 ABI 프리즘^TM 빅다이^TM 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리액션 키트(ABI Prism^TM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit)로 수행되었다. NCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD 20894, USA)의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램을 이용하여 데이터베이스 서치가 수행되었다.

구조 유전자 프라이머:

서열번호 3: SG-a: TGAGAGAAGGTTTAAGTTTTGAAGAA (순방향)

서열번호 4: SG-b: TCCACTGAAATCCATGAATGA (역방향)

ABC 수송 프라이머:

서열번호 5: ABC1-a: TGATGGATTTCAGTGGAAGT (순방향)

서열번호 6: ABC1-b: ATCTCTTCTCCGTTTAATCG (역방향)

서열번호 7: ABC2-a: GTCATTGTTGTGGGGATTAT (순방향)

서열번호 8: ABC2-b: TCTAGATACGTATCAAGTCC (역방향)

면역 프라이머:

서열번호 9: Immun-a: TTCCTGATGAACAAGAACTC (순방향)

서열번호 10: Immun-b: GTCCCCACAACCAATAACTA (역방향)

여러 성장 배지 및 여러 초기 성장 pH값에서의 펩티드 ST4SA의 생산

스트레인 ST4SA의 18시간 배양물이 MRS 브로스, BHI 브로스, M17 브로스(Merck, Darmstadt, Germany)에 각각 접종되었다(2%, v/v). 인큐베이션은 교반없이 30℃ 및 37℃에서 28시간 동안 각각 수행되었다. 매시간 샘플이 취해졌고, 박테리아 성장(600nm에서의 OD), 배양물 pH의 변화 및 L. 카세이 LHS에 대한 항균 활성(AU/ml)이 검사되었다. 이전에 기술한 것처럼, 아가 스폿 테스트가 사용되었다.

별도의 실험에서, 펩티드 ST4SA의 생산에 대한 초기 배지 pH의 영향이 측정되었다. 300ml 부피의 MRS 브로스가 6M HCl 또는 6M NaOH를 이용하여 pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5로 각각 조정되었고, 이후 오토클레이브되었다(도 9a). 각 플라스크는 스트레인 ST4SA의 18시간 배양물 2%(v/v)로 접종되었고, 30℃에서 20시간동안 교반없이 인큐베이션되었다. 배양 pH 및 펩티드 ST4SA의 생산 변화가 이전에 기술된 것처럼 한시간마다 확인되었으며 AU/ml로 표현되었다. 모든 실험은 3회씩 수행되었다.

펩티드 ST4SA의 생산에 대한 배지 조성물의 영향

스트레인 ST4SA가 10 ml MRS 브로스에서 30℃의 온도로 18시간 동안 성장되었다. 원심분리(8000 x g, 10분, 4℃)에 의해 세포가 수집되었고, 펠렛이 10ml의 멸균 펩톤수(sterile peptone water)에 재현탁되었다. 이 세포 현탁액의 4ml가 이하의 배지 200ml를 접종하기 위해 사용되었다:

(a) 유기 영영분은 없고, 트립톤(tryptone) (20.0g/l), 미트 추출물(meat extract) (20.0g/l), 효모 추출물(yeast extract) (20.0g/l), 트립톤 (12.5g/l)과 미트 추출물 (7.5g/l)의 혼합물, 트립톤 (12.5g/l)과 효모 추출물 (7.5g/l)의 혼합물, 미트 추출물 (10.0g/l)과 효모 추출물 (10.0g/l)의 혼합물 또는 트립톤 (10.0g/l), 미트 추출물 (5.0g/l) 및 효모 추출물 (5.0g/l) 조합이 각각 보충된 MRS 브로스 (De Man, Rogosa and Sharpe);

(b) 20.0g/l의 글루코스를 갖는 MRS 브로스 (Bioiab);

(c) 글루코스가 없고, 20.0g/l의 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 만노스(mannose), 및 말토스(maltose)가 각각 보충된 MRS 브로스 (De Man, Rogosa and Sharpe);

(d) 유일한 탄소원으로 0.1-40.0g/l의 프럭토스를 갖는 MRS 브로스;

(e) 2.0 - 50.0g/l K₂HPO₄ 또는 2.0 - 50.0g/l KH₂PO₄을 갖는 MRS 브로스 (De Man, Rogosa and Sharpe); 및

(f) 0 - 50.0g/l 글리세롤(glycerol)이 보충된 MRS 브로스 (De Man, Rogosa and Sharpe).

별도의 실험에서, 시아노코발라민(cyanocobalamin) (Sigma, St. Louis, Mo.) L-아스코빅산(L-ascorbic acid) (BDH Chemicals Ltd, Poole, UK), 티아민(thiamine) (Sigma), DL-6,8-티오틱산(DL-6,8-thioctic acid) (Sigma) 및 비타민 K₁(Fluka Chemie AG, CH-9471 Buchs, Switzerland)의 비타민들이 필터멸균되었고, 1.0mg/ml(최종 농도)로 MRS 브로스에 첨가되었다. 모든 테스트에 대한 인큐베이션은 30℃에서 20시간 동안 수행되었다. 이전에 기술한 바와 같이, 펩티드 ST4SA의 활성 수준이 확인되었다. 모든 실험은 3회씩 실시되었다.

스트레인 ST4SA가 도 1에 도시된 바와 같은 형상과, 비이동성(non-motility), 색소형성의 부재 및 속특이적(genus-specific) 프라이머(도 2)와 종특이적(species-specific) 프라이머(도 3)를 이용한 PCR에 기초하여 엔테로코커스속(genus Enterococcu)의 스트레인으로 동정되었다. 종 수준으로의 추가 동정이 표 1에 도시된 당 발효패턴 및 상기 표 2에 도시된 생리학적 특성에 의해 수행되었다.

펩티드 ST4SA는 표 3에서 알 수 있듯이, 프로티올리틱(proteolytic) 효소(프로티네이즈 K, 펩신, 프로네이즈, 파페인 및 트립신), 트리톤(Triton X-114)의 처치 및 121℃, 20분간 열처리에 의해 불활성화되었다. 펩티드는 100℃, 90분 처치 후와 트윈 20, 트윈 80, 요소, EDTA 및 트리톤 X- 100의 처치시 활성이 잔류하였다(표 3). pH값 2.0 내지 12.0의 범위에서 인큐베이션 한 후에는 활성이 유실되지 않았다(표 3).

펩티드 ST4SA는 표 4에 기재된 다수의 그람 양성 및 그람 음성균을 억제했다.

표 4.

미생물	온도(℃)	배지, 인큐베이션	펩티드 활성도
아시네토박터 바우마니아이(Acinetobacter baumanii) AB 16	37	BHI, 호기성(aerobic)	+
바실러스 세레우스(Bacillus cereus) LMG 13569	37	BHI, 호기성	+
클로스트리디움 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) LMG 13571	30	RCM, 혐기성(anaerobic)	+
엔테로박터 글로아케(Enterobacter cloacae) 26	37	BHI	+
엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) LMG 1357113566, E77, E80, E9FA2, 20, 21	37	MRS, 호기성	+
이스케리시아 콜라이(Escherichia coli) EC1	37	BHI	+
클레브젤라 뉴모니애(Klebsiela pneumoniae) KP31	37	BHI	+
락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LMG 13550	37	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) LMG 13551	37	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) LMG 13552	37	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) LMG 13553	30	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMG 13554	37	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) LMG 13555	42	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LMG 13556	37	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) LMG 13557	37	MRS, 혐기성	-
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LMG 13558	30	MRS, 혐기성	+
류코노스톡 메센테고리데스 subsp. 크레모리스(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris) LMG 1	30	MRS, 혐기성	-
리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) LMG 13568	30	BHI, 호기성	+
페디코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) LMG 13560	30	MRS, 혐기성	-
Prop. 아시도프로피오니치(Acidipropionici) LMG 13572	32	GYP, 혐기성	-
프로피오니박테리움(Propionibacterium) sp. LMG 13574	32	GYP, 혐기성	+
슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 1, 7	37	BHI, 호기성	+
스타필로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus) 6, 13, 33-38	37	BHI,	+
스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus) LMG 13567	37	BHI, 호기성	+
스트렙토코커스 카프리너스(Streptococcus caprinus) TS1, TS2	37	BHI, 호기성	+
스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 3, 4, 27, 29	37	BHI, 호기성	+
스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) LMG 13565	42	MRS, 혐기성	-

펩티드 ST4SA는 도 4에 도시된 겔 여과에 의해 정제되었고, 도 4 및 도 5로부터 알 수 있는 것처럼, 3400Da의 범위에 있다. 펩티드는 이전에 기술된 것처럼 베로 세포(Vero cell) 상에서 테스트되었을 때, 세포독성이 없었다.

스트레인 ST4SA는 도 6a에 도시된 것처럼 2개의 플라스미드를 갖는다. 이 플라스미드 스트레인의 큐어링은 향균 활성의 상실을 유발하지 않는다. 구조 유전자를 인코딩하는 DNA 단편에 의한 염색체(chromosome) 및 플라스미드 DNA의 탐침(probing)은 염색체(게놈, genome)와의 명확한 혼성화(hybridization)를 나타냈다(도 6b). 이것은 펩티드 ST4SA를 인코딩하는 구조 유전자가 게놈 상에 위치한다는 것을 증명한다. 더욱이, 이 플라스미드가 E. 패칼리스(미도시)로의 접합은 스트레인을 펩티드 ST4SA 생산자로 전환시키지 않아, 펩티드 ST4 생산을 인코딩하는 유전자가 스트레인 ST4SA의 게놈 상에 위치함을 확인시켰다.

펩티드 ST4SA의 시퀀스가 도 7에 도시되어 있고, 시퀀스 리스트는 본 발명의 목적을 위하여 서열번호 12로 색인되어 있다. 수송 및 면역 펩티드의 시퀀스는 본 발명의 목적을 위하여 각각 서열번호 14 및 16으로 색인되어 있다.

구조, 수송, 면역 유전자의 DNA 시퀀스가 도 8에 도시되어 있고, 본 명세서의 목적을 위하여 각각 서열번호 11, 13, 및 15로 색인되어 있다.

여러 성장 배지에서의 펩티드 ST4SA의 생산이 도 9a 및 9b에 나타나 있다. 펩티드 ST4SA의 생산에 대한 초기 성장 pH의 영향이 도 9a에 나타나 있다. 이 결과 로부터 펩티드 ST4SA가 초기 pH 6.0 및 6.5에서 MRS 브로스 내에서 최적으로 생산되고, 10-20g/l K₂HPO₄, 15.0-20.0g/l 프럭토스의 존재에 의해 또는 비타민 C, B1 및 DL-6,8-티오틱산의 존재 하에서 자극받는다는 것이 입증된다.

펩티드 ST4SA의 생산이 도 10에 나타나 있다. 최대 생산은 14시간 성장 후에 기록되었다.

유착/면역(adhesion/immunity) 유전자를 함유하는 DNA 단편이 도 11에 도시되어 있고, 본 명세서의 목적을 위해 서열번호 15로 색인되어 있다.

엔토로코커스 문드티아이 ST4SA는 많은 병원균에 대해 활성을 갖는 넓은 스펙트럼의 항균 펩티드(펩티드 ST4SA)를 생산한다. 리더 펩티드(leader peptide) 및 프로펩티드(propeptide) (총괄적으로 프리펩티드(prepeptide)로 알려짐)를 인코딩하는 구조 유전자는 스트레인 ST4SA의 게놈 상에 위치한다(도 6b 참조). 그러한 유전자 구조는 오직 하나만이 검출되었다. 이는 단지 하나의 펩티드가 넓은 스펙트럼의 항균 활성에 관여함을 암시한다. 50kb 및 100kb 플라스미드(도 1)로부터 스트레인 ST4SA를 큐어링하려는 노력이 행하여졌지만, 실패하였다. 이것은 플라스미드가 펩티드 ST4SA에 면역성을 부여하는 데 중요한 역할을 하거나, 하버스(harbours) 유전자가 핵심 대사 반응(key metabolic reaction)에 중요함을 암시한다.

ST4SA가 엔테로코커스 문드티아이 스트레인라는 것에 대한 추가 증거가 16S rDNA 상의 보존 영역으로부터 디자인된 하기 프라이머로 종 특이적 PCR(species-specific polymrase chain reation)을 하는 것에 의해 얻어졌다:

서열번호 16: 순방향 프라이머: AACGAGCGCAACCC;

서열번호 17: 역방향 프라이머: GACGGGCGGTGTGTAC.

306 염기쌍 단편이 증폭되었다(도 3 참조). DNA 단편의 시퀀싱은 진뱅크(GenBank)의 보존된 16S rDNA 단편과 98%의 상동성(homology)을 나타냈다.

구조 유전자(프로펩티드 ST4SA를 인코딩함), 수송 유전자 및 면역 유전자가 시퀀싱되었고, DNA 시퀀스로부터 각각의 아미노산 시퀀스가 번역되었다(도 8).

멸균 증류수에 현탁된 펩티드 ST4SA의 안정성이 -20℃ 내지 60℃에서 42일 동안 테스트되었다(도 12). 상기 펩티드는 -20℃에서 42일 동안, 4℃에서 3주 동안 안정성을 유지하였다. 안정성은 37℃에서 일주일이 지난 후 감소하였다. 그러나, 파우더 형태의 펩티드 ST4SA는 상온(25℃)에서 6개월 동안 안정성을 유지하였다. 펩티드 ST4SA는 파우더 형태로 생산되고 그 형태로 거래될 것이다. 펩티드 ST4SA는 일단 멸균 증류수에 용해되면, 4℃에서 3주간 유지될 수 있다(도 12 참조).

종이 디스크(paper disk) 상에서의 펩티드 ST4SA의 활성이 표 5에 나타나 있다. 표 6에는 항생제(antibiotics)와의 활성 비교가 나타나 있다. 감염된 중이 용액으로부터 분리된 슈도모나스 sp.에 대한 활성이 테스트되었다. 억제 영역(inhibition zone)의 이미지가 도 13에 도시되어 있다.

표 5. 종이 디스크에 대한 펩티드 ST4SA의 활성

	펩티드 ST4SA(AU/ml)
Feeze dried (AU/ml)	409600
종이 디스크 (2 cm x 2 cm; 700㎕)	286720
종이 디스크(직경 0.6cm)	20263

표 6. 펩티드 ST4SA와 일반적으로 사용되는 항생제의 활성 비교

항생제	억제 영역의 직경(mm)
암피실린(Ampicillin) (10㎍)	24
바시트라신(Bacitracin) (10 units)	10
클로람페니콜(Chloramphenicol) (30㎍)	28
에리트로마이신(Erythromycin) (15㎍)	없음
테트라사이클린(Tetracycline) (30㎍)	35
펩티드 ST4SA	25

펩티드 ST4SA가 표적 세포에 결합하는 것은 펩티드의 침투(penetration)를 보증하는 데에 중요하다. 펩티드 ST4SA가 병원균에 유착하는 능력이 연구되었고, 그 결과가 병원균에 결합하는 퍼센티지로 표시되었다(표 7). 이 결과로부터의 결론은 적어도 75%의 펩티드 ST4SA가 테스트된 병원균에 결합한다. 펩티드 ST4SA가 표적 세포에 유착되면, 세포막의 침투 및 붕괴가 야기된다(도 14).

표 7. 병원균에 대한 펩티드 ST4SA의 유착

병원균

표적 세포(병원균)에 대한 펩티드 ST4SA의 결합 퍼센티지

6 400 AU/ml의 펩티드 ST4SA

204 800 AU/ml의 펩티드 ST4SA

0

50

75

88

94

100

0

50

75

88

94

100

스트렙토코커스 뉴모니애

27

+

29

+

D

+

스트렙토코커스 파이오젠스

20

+

21

+

슈도모나스 아에루지노사

E

+

클레브젤라 뉴모니애

30

+

중이 분리물 (unknown)

13

+

17

+

25

+

40

+

BW

+

CW

+

DW

F

+

HW

+

I

+

J

+

GW

+

K

+

L

+

M

+

세포막 손상 및 세포 성분의 누출에 관한 추가 증거가 세포외(extracellular) DNA 및 세포외 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성에 대한 실험에 의해 얻어졌다. 그 결과가 각각 표 8 및 9에 나타나 있다. 상기 결과는 DNA 및 β-갈락토시데이즈가 펩티드 ST4SA에 의해 손상된 세포로부터 누출되었음을 나타낸다. 모든 종(species)이 상기 효소에 대해 높은 세포내(intracellular) 레벨을 갖는 것은 아니므로, β-갈락토시데이즈 누출이 모든 병원균에 대해 기록되지는 않았다.

표 8. 병원균을 펩티드 ST4SA로 처리한 후에 기록된 세포외 DNA

병원균	DNA-누출 (O.D., 260 nm에서 독출)
스트렙토코커스 뉴모니애
27	1.670
29	1.182
D	1.160

스트렙토코커스 파이오젠스
20	0.930

슈도모나스 아에루지노사
E	0.187

스타필로코커스 오리우스
36	0.892

클레브젤라 뉴모니애
30	1.01

중이 분리물 (unknown)
40	0.801
BW	1.186
DW	1.153
F	1.428
HW	1.559
GW	0.751
K	0.455
L	0.592
M	0.326

대조구
엔테로코커스 spp. HKLHS	1.395

표 9.

병원균	OD ₄₂₀ 에서 기록된 β-갈락토시데이즈
스트렙토코커스 뉴모니애
27	누출없음
29	누출없음
D	누출없음

스트렙토코커스 파이오젠스
20	누출없음

스타필로코커스 오리우스
36	누출없음

클레브젤라 뉴모니애
30	누출없음

중이 분리물 (unknown)
40
BW	0.370
DW	0.293
F	0.318
HW	0.235
GW	0.373
K	누출없음
L	누출없음
M	누출없음
대조구
엔테로코커스 spp. HKLHS	누출없음

펩티드 ST4SA의 처치 후 여러 병원균의 세포 융해(lysis)가 도 15 내지 23에 도시되어 있다. 0.2%(v/v)의 하루밤 병원균(overnight pathogen) 접종원(inoculum)이 BHI 브로스에 접종되었다. 펩티드 ST4SA는 중간 기하급수 상(mid-exponential phase)에서 각 병원균에 첨가되었다. 여기에 제공된 결과(도 15 내지 23)로부터 펩티드 ST4SA가 대부분의 병원균에 대해 살균 방식(bactericidal manner)으로 작용한 것이 명백하다.

리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 존재하에서 펩티드 ST4SA의 생산이 연구되었다(도 24). 이 결과에 기초하면, L. 이노쿠아가 스트레인 ST4SA의 펩티드 ST4SA 생산을 자극하였고, 그 동안 L. 이노쿠아는 억제되었다.

프로바이오틱으로서의 엔테로코커스 문드티아이 ST4SA

엔테로코커스 문드티아이 ST4SA의 생존이 컴퓨터화된 위장관 모델(computerized gastrointestinal model, GIM; 도 25에 도시됨)에서 평가되었다.

GIM에서 제1관(vessel)은 위를, 제2관은 십이지장을, 제3관은 공장 및 회장을, 제4관은 결장을 시뮬레이션한다. 영양분의 흐름은 전용 소프트웨어에 의해 조절되었다. GIM의 여러 섹션에서의 pH는 멸균된 1N HCl 또는 1N NaOH의 연동 첨가(peristaltic addition)에 의해 조절되었다. 각 섹션은 감수성이 높은 pH 프로브에 맞추어져, 제어 유닛과 컴퓨터에 연결되었다. GIM을 통한 영양분의 유속(flow rate)은 유아 장관(infant's intesinal tract)을 따라서 조정되었다. 짧은 소화관을 시뮬레이션하는 조건은 더 큰 변동(fluctuation)이 가능하도록 선택되었고, 그에 따라 프로바이오틱 상으로의 스트레스가 증가하였다. 4개의 유아 포뮬라(락토겐(Lactogen2), NAN 펠아르곤(NAN Pelargon), ALL110 및 알페어(Alfare))가 평가되었다. 프로바이오틱 박테리움(ST4SA)에 대한 용량은 처방(즉, ml당 10⁸ 생육 세포(cfu))에 따랐다. 프로바이오틱 세포는 타액에 현탁되었다. NaHCO₃, 판크리아틴(pancreatin) 및 옥시갈(oxgal)l을 함유한 취장-담즙 용액이 증류수에 용해되었다. GIM에 사용된 조건이 표 10 및 11에 요약되었다.

표 10.

시간 (분)	pH	성장 배지	췌장-담즙 용액
0 - 4		위관으로 펌핑된 영양분. 스테리인 ST4SA (10⁸ cfu/ml)을 갖는 용량
4 - 44	5.2	위에서 인큐베이션
44 - 64	4.9
64 - 108	4.5
108 - 128	4.1
128 - 154	3.7
154 - 156			십이지장으로 펌핑된 췌장-담즙 용액
154 - 158		십이지장으로 펌핑된 위 내용물
158 - 274	6.5	십이지장에서 인큐베이션
274 - 280		공장으로 펌핑된 십이지장 내용물
280 - 394	6.5	공장에서 인큐베이션
394 - 401		회장으로 펌핑된 공장 내용물
401 - 520	6.0	회장에서 인큐베이션

표 11.

GIM 섹션	NAN 펠아르곤에서의 Cfu ^a /ml	박테리오신 활성 (> 25 600 AU ^b /ml)	MRS 브로스에서의 Cfu/ml	박테리오신 활성 (> 25 600 AU/ml)
접종원	1.6 x 10⁸	+	6.0 x 10⁷	+
위	1.2 x 10⁷	+	3.7 x 10⁷	+
십이지장	2.5 x 10⁶	+	1.0 x 10⁸	+
공장	1.0 x 10⁷	+	1.3 x 10⁸	+
회장	5.0 x 10⁷	+	1.0 x 10⁸	+

^aCfu = 콜로니 형성 단위(colony froming units; 즉, 생육 세포의 수)

^bAU = 임의 단위(arbitrary units; 항균 활성을 반영)

GIM을 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes)으로 감염시키는 것에 의해 병원균에 대한 스트레인 ST4SA의 생존이 테스트되었다. GIM 내에서 균주 ST4SA의 생존 및 항균 펩티드를 생산하는 능력이 모니터링되었다(표 12에 결과가 나타남).

표 12.

항생제	ST4
암피실린(Ampicillin)	+++
바시트라신(Bacitracin)	++
세파졸린(Cephazolin)	+
클로람페티콜(Chloramphenicol)	+++
시프로플록스신(Ciprofloxzcin)	+++
Cd. 술폰아미드(Cd. Sulphonamides)	-
클록사실린(Cloxacillin)	-
에리쓰로마이신(Erythromycin)	+++
메트로니다졸(Metronidazole)	-
메티실린(Methicillin)	-
네오마이신(Neomycin)	-
노보비오신(Novobiocin)	+++
니스타틴(Nystatin)	-
오플락사신(Oflaxacin)	++
옥사실린(Oxacillin)	-
리팜피신(Rifampicin)	+++
테트라사이클린(Tetracyclin)	+++
스트렙토마이신(Streptomycin)	-
반코마이신(Vancomycin)	++
페니실린(Penicillin)	+++

기호: - = 없는 영역 (항생제에 저항성); + = 억제 영역, 직경 1 내지 11mm; ++ = 억제 영역, 직경 12 내지 16mm; +++ = 억제 영역, 직경 17mm 이상.

표 12의 결과로부터 알 수 있듯이, 균주 ST4SA는 장관의 모든 섹션에서 생존하였다. 항균 펩티드 생산은 장관의 모든 섹션에서 ml 당 25 600 AU을 초과하였다. NAN 펠아르곤에서의 성장은 MRS보다 다소 최적에 미달하였다. 그러나, 양 실험에서 세포수는 1 대수 사이클(logarithmic cycle) 이상 감소하지 않았다(표 13 참조).

표 13.

항생제 (mg)	스트레인 ST4SA의 생육 세포의 수
대조구	1 x 10⁸
TMP-SMX 20/100	7 x 10⁴
TMP-SMX 40/200	8 x 10⁴
TMP-SMX 60/300	8 x 10⁴
TMP-SMX 80/400	1.8 x 10⁴
메트로니다졸(Metronidazole) 50	1.3 x 10⁴
메트로니다졸 100	6 x 10⁴
메트로니다졸 200	3 x 10⁴

다양한 항생제에 대한 스트레인 ST4SA의 저항이 표준 공정(항생제 디스크(antibiotic discs), Oxoid)에 따라 테스트되었다. 상기 결과의 결론으로서, 스트레인 ST4SA는 술폰아미드(sulphonamides), 클록사실린(cloxacillin), 메트로니다졸(metronidazole), 메티실린(methicillin), 네오마이신(neomycin), 니스타틴(nystatin), 옥사실린(oxacillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)에 저항성이 있다(표 13).

설사를 방지하기 위하여 HIV/AIDS를 갖는 아이들이 트리메토프림-설파메톡사졸(Trimethoprim-sulfamethoxazole) (TMP-SMX) 및/또는 메트로니다졸(Metronidazole)로 처치되었다. NAN 펠아르곤이 후자 항생제의 다양한 농도로 보충되었고, 스트레인 ST4SA의 효과는 최적 성장 온도(37℃)에서 18시간 후에 측정되었다.

상기 표 4의 결과로부터 알 수 있듯이, TMP-SMX 및 메트로니다졸은 스트레인 ST4SA의 세포수를 4 로그 사이클로 감소시켰다. 그러나, 증가된 농도가 생육 가능성에 대해 강한 영향을 갖지는 않았다.

ST4SA에서 악성 인자의 발생

스트레인 ST4SA를 항생제로 개발하기 위해서는, 그와 관련된 악성 인자가 있는지 여부를 아는 것이 중요하다. 이하의 악성 인자를 인코딩하는 유전자에 대하여 프라이머가 디자인되었다: 반코마이신 저항(Vancomycin resistance) (VanA/VanB); 겔라티네이즈(gelatinase)의 생산 (Gel); 집합 물질(aggregation substance) (AS); 엔테로콕사이로부터 콜라겐의 유착(adhesin of collagen from enterococci) (Ace), 엔테로코커스 표면 단백질(enterococcus surface protein) (Esp); 헤모라이신/박테리오신(haemolysin/bacteriocin) (Cyl) 및 무-시토라이신 베타 헤모라이신 유전자(non-cytolysin beta hemolysin genes). 후자의 프라이머로 증폭된 스트레인 ST4SA의 DNA는 상기 스트레인이 반코마이신 저항성, 겔리티네이즈 활성, 집합 물질, 및 콜라겐 유착을 인코딩하는 유전자를 갖지 않는다는 것을 나타냈다. 본 결과에 기초하면, 스트레인 ST4SA는 병원성이 아니고, 섭취시 알러지 반응을 유발하지 않을 것이다.

펩티드 ST4SA는 넓은 스펙트럼의 항균 활성을 갖고, 다수의 그람 양성 및 그람 음성균에 대해 작용하기 때문에, 펩티드 ST4SA의 작용 모드는 유산균에 대해 기술된 다른 항균 펩티드와 상이한 것으로 보인다. 또한, 감수성이 있는 세포의 세포벽에 대한 인지 사이트(site)는 출원인이 알고 있는 다른 펩티드에 의해 사용되는 일반적인 리피드 II 고정(Lipid II anchor) 사이트와 다를 것이다(도 26).

위 가정을 테스트하기 위하여, 락토바실러스 사케이 DSM 20017(펩티드 ST4SA에 감수성이 있음)의 리피드 II 표적 사이트가 반코마이신에 의해 차단되었다(도 26의 개략도 참조). 반코마이신은 리피드 II 분자의 아미노산 체인에 부착하여, 이론적으로 펩티드 ST4SA가 동일 사이트에 결합하는 것을 방해한다(즉, 리피드 II가 리셉터로 작용한다면). 그러나, 표적 세포(L. 사케이 DSM 20017)를 반코마이신과 펩티드 ST4SA의 조합으로 처치하면, 성장 억제가 유발된다(세포질의 누출; 도 26 참조). 이는 리피드 II와는 다른 표적 사이트가 펩티드 ST4SA의 리셉터로 작용함을 암시한다. 펩티드 ST4SA가 감수성 세포 상의 하나 이상의 고정 사이트(anchoring site)에 결합한다는 사실은 그것이 왜 넓은 스펙트럼의 항균활성(그람 양성 및 그람음성균을 억제하는)을 갖는지를 설명할 수 있다. 출원인은 도 26에 도시된 것처럼, 니신(Nisin, 항생제)이 리피드 II에 결합한다는 사실을 알고 있다. 도 26에서 L. 사케이 DSM 20017을 반코바이신으로 처치하면, 니신이 리피드 II 표적 사이트에 결합하는 것이 방지되었다.

펩티드 ST4SA는 세포벽의 리셉터 사이트와 반응을 형성한 후 인지질-농후(phospholipid-rich) 세포막으로 삽입될 수 있는 2개의 소수성 영역(도 27)을 포함한다. 2개의 소수성 영역 사이의 상기 영역, 특히 아미노산 29(세린, serine)과 아미노산 30(알라닌, alanine) 사이의 상기 영역(도 27)은 상기 구조물의 나머지보다 더 유연하며, 경첩 영역(hinge area)으로 작용할 수 있어, 펩티드의 C-말단(C-terminal) 절반이 구부려지고, 그 자체로 인지질 농후 세포막으로 통합(incorporate)되도록 할 것이다. 본 가정을 테스트하기 위하여, 구조 유전자의 DNA 시퀀스로부터 추론된(deduced) 아미노산 시퀀스에 기초하여 두개의 섹션의 펩티드 ST4SA(도 27)가 합성되었다.

아래에 나타난 것처럼, 단편 1은 경첩 영역(즉, 포지션 29의 세린(serine)과 포지션 30의 알라닌(alanine) 사이) 바로 전의 첫번째 29개의 아미노산(라이신(lysine)으로부터 세린까지)으로 구성된다. 이황화 브리지(disulfide bridge)가 도입되어(연결선, 아래에 도시), 아미노산 9(시스테인, cysteine) 및 14(시스테인)를 공유결합으로 연결하였다. 아래에 전체 길이의 펩티드 시퀀스가 도시된다.

이황화 브리지는 펩티드 구조물을 안정화시키는 작용을 한다. 제1 소수성 영역을 함유하는 단편 1은 상기 둘러싼 영역(encircled region) (포지션 21 내지 26의 6개의 아미노산, 즉 AIGIIG)으로 표시되었다. 상기 분자의 본 파트(part)는 (감수성이 있는) 표적 미생물(organism)의 세포벽 상 리셉터를 인지한다.

단편 2는 경첩 영역의 제2 소수성 루프 하류(downstream)에서의 마지막 13개의 C-말단 아미노산 및 경첩 영역(세린과 알라닌 사이) 바로 전에 선행하는 11개의 아미노산을 포함한다:

단편 2: KAIGIIGNNS AANLATGGAAGWK S

감수성이 있는 세포를 펩티드 ST4SA의 상기 2개의 단편으로 처리하는 것은 분자의 양 단편(섹션) 모두가 항균 활성에 필요하다는 것을 나타낸다. 따라서, 세포막의 붕괴(disruption)은 N-말단이 세포 표면의 리셉터에 고정된 때에만 가능할 것으로 보인다.

펩티드 ST4SA의 폴리에틸렌(PE)과의 결합

폴리에틸렌(PE)에 대한 펩티드 ST4SA의 결합이 테스트되었다. PE 필름은 5 x 5 cm의 섹션으로 절단되었고, 60% 이소프로파놀 및 펩티드 ST4SA의 용액(활성 레벨: 102 400 AU/ml)에서 1시간 동안 담그어졌다. PE 섹션은 대기 건조되었고(60℃, 20분간), 표준 아가 확산법을 이용하여 항균 활성에 대해 분석되었다. L. 사케이 DSM20017가 접종된 플레이트가 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션되었고, 성장 억제 영역이 검사되었다.

항균 활성(PE 섹션을 둘러싸는 넓은 억제 존)을 갖는 필름을 생산하기 위해, 펩티드 ST4SA가 60초 내에 PE에 흡착되었다. 펩티드 코팅된 PE 필름을 SDS 버퍼에 담그고, 후속으로 필름으로부터 펩티드 ST4SA를 30mA의 전류로 2시간 동안(상온, 즉, 약 25℃) 전기 용출(electro-eluting)하는 것에 의해 결합력이 측정되었다. 샘플은 일상 시간 간격(regular time interval)으로 채취되었고, 항균 활성에 대해 테스트되었다. 단백질 농도는 브래드포드법(Bradford method)을 사용하여 결정되었다. 전기 용출된 필름은 앞서 기술한 아가 확산법을 사용하여 항균 활성이 테스트되었다.

펩티드 ST4SA는 PE 필름에 강하게 유착한다. 그 역반응도 가능해 보인다. PE 표면으로부터 펩티드 ST4SA의 방출은 30mA의 전류로 1시간 동안 처리된 뒤에야 비로서 가능하였다. 모델로서 레드 미트(red meat)를 사용한 도전적 연구에서, 표면 (PE)-부착 단백질 ST4SA는 병원성 박테리아(리스테리아, 바실러스, 스타필로코커스)의 성장을 방지하였다. 이것은 펩티드 ST4SA가 미생물 감염을 방지하거나 완화하기 위하여 상처 드레싱(wound dressing)에 사용될 수 있음을 시사하며, 다른 의약 또는 살균 응용분야, 예를 들면 임플란트(implants), 귀 그로밋(ear grommets), 카테터(catheters), 오스토미 튜브 및 파우치(ostomy tubes and pouches), 스텐트(stents), 봉합물질(suture material), 여성 위생 산물과 같은 위생 산물(hygiene products such as feminine hygiene products), 콘택트 렌즈(contact lenses), 콘택트 렌즈 세정액(contact lens rinsing solutions) 등과 같은 살균 응용분야에서의 용도를 발견한다. 폴리머에서 항균 펩티드의 피막형성(encapsulation)은 항균 펩티드의 느린 방출(slow release) 및 미생물 감염 치료 기간의 연장을 유발한다. 더우기, 펩티드 ST4SA가 PE에 강하게 부착한 것은 그것이 느린 방출 항균제(slow-release antimicrobial agent)로 작용함을 보여준다.

펩티드 ST4SA는 미생물 세포의 하나 이상의 리셉터 사이트에 결합하며, 넓은 스펙트럼 항균제로부터 예상되는 전형성을 갖는다. 펩티드 ST4SA의 (힌지 영역의 앞의) 제1 섹션은 리셉터에 결합한다. (힌지 영역의 하류의 )제2 파트는 더 큰 소수성 영역을 가지며, 세포막으로 삽입되고, 투과성을 왜곡하며, 세포사를 유발한다(DNA 및 효소 누출에 의해 가시적으로 확인됨). 펩티드 ST4SA는 안정적이고 느린 방출의 양식으로 PE에 결합하며, 상처 드레싱에 혼입하기에 적합하다.

엔테로코커스 문드티아이 ST4SA의 프로바이오틱으로의 개발

엔테로코커스 문드티아이 ST4SA의 생존이 도시된 컴퓨터화된 위장관 모델에서 평가되었다. 본 단계는 시험관 내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 프로바이오틱으로서의 스트레인 ST4SA를 평가하는 것을 더 포함하였다. 인간 세포주(human cell lines)를 이용하여 점액 및 상피세포에의 유착이 시험관 내에서 연구되었다. 생체 내 연구는 래트(rat)에서 수행되었다.

상기 연구에 사용된 인간 장관 세포주는 인간 결장 선암종(adenocarcinoma)으로부터 유래하였고, 카코-2(Caco-2) 세포주, HT-29 및 HT29-MTX(점액 분비 세포) 를 포함하였다. 상기 세포주는 표준 배양 조건에서 성장하였을 때, 형상학적, 기능적 분화를 발현하고, 분극(polarization), 기능성 브러쉬 오더(functional brush order) 및 선단 장관 하이드롤레이스(apical intestinal hydrolases)를 포함하는 성숙한 장세포(enterocytes)의 특성을 나타낸다.

호스트 세포에 대한 스트레인 ST4SA의 유착은 병원성(pathogenicity)에 관계된 세포 표면 탄수화물, Efa A 단백질, Ace(엔테로콕사이로부터 콜라겐의 유착; adhesin of collagen from enterococci) 단백질 및 집합물질(AS, aggregation substance)에 의해 영향을 받는다. AS는 성 페로몬 플라스미드(그 위에 AS가 인코드됨)의 고효율 수송을 가능하게 하는 세포 응괴(cell clumps)의 형성을 중개하는 유착소(adhesin)이다.

본 연구에서, 스트레인 ST4SA는 독성 특성(virulence traits), 담즙염 하이드롤레이즈(BSH; bile salt hydrolase) 활성, 및 카코-2 세포에 유착하는 동안 시험관 내의 위장관(GIT) 모델 내에서 경쟁 배타적으로 인간 장세포양(human enterocyte-like) 세포주 카코-2에 유착하는 능력에 대해 스크린되었다. 또한 ST4SA의 세포 표면 소수성이 측정되었다.

독성 인자(Virulence factors)

독성 인자의 존재, 즉 반코마이신 저항성(VanA/VanB/VanC1/VanC2/VanC3), 겔라티네이즈(Gel)의 생산, 집합물질(AS), 엔테로콕사이로부터의 콜라겐 유착(Ace), 엔테로코커스 표면 단백질(Esp; enterococcus surface protein), 헤모라이신/박테 리오신(Cyl) 및 무-시토라이신(non-cytolysin) 베타 헤모라이신 유전자가 시험관 내 테스트 및/또는 PCR 스크리닝에 의해 연구되었다. DNA는 표준 방법에 따라 E. 문드티아이 ST4로부터 추출되었다. 후자 유전자(latter genes)의 증폭을 위해 디자인된 프라이머는 기술된 바와 같다. 그 결과가 표 14에 나타나 있다.

표 14.

	VanA	VanB	Van C1/2/3	Gel	Efa- Afm	Efa- Afs	AS	Ace	Cyl	Esp	Non-cyt
ST4SA	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+

기호:

VanA/VanB: 반코마이신 저항(Vancomycin resistance)

Gel: 겔라티네이즈 생산(Gelatinase production)

EfaAfm: E. 패시움 심내막염 항원(E. faecium endocarditis antigen)

EfaAfs: E. 패칼리스 심내막염 항원(E. faecalis endocarditis antigen)

As: 집합물질(Aggregation substance)

Ace: E. 패칼리스로부터의 콜라겐 유착(Adhesin to collagen from E. faecalis)

Cyl: 시토라이신(Cytolysin; β-헤모라이신 활성)

Esp: 엔테로코커스 표면 단백질(Enterococcus surface protein)

Non-Cyt: 무-시토라이신 베타 헤모라이신 III(non-cytolysin beta hemolysin III)

집합물질(AS)의 생산

성 페로몬의 존재 하에, AS의 생산이 응괴 분석(clumping assay)으로 연구되었다. 성 페로몬은 페로몬 생산자인 엔테로코커스 패칼리스 JH2-2를 MRS 브로스에서 37℃, 18시간 동안 성장시키는 것에 의해 얻어졌다. 페로몬 생산자 E. 패칼리스 OG1X의 상층액이 미량 역가판(microtiter plate)에서 응괴 분석을 수행하는 데에 사용되었다. 200㎕가 스트레인 ST4SA으로 접종(0.5%, v/v)되었고, 2, 4, 8, 24시간 후에 세포 응괴가 현미경으로 검사되었다. 세포 응괴는 관찰되지 않았다.

겔라티네이즈의 생산

30g 겔라틴/liter를 포함하는 MRS 아가 상에서 겔리티네이즈의 생산이 테스트되었다. 37℃에서 18시간 후 콜로니를 둘러싸는 깨끗한 영역이 양성 반응으로 고려되었다. 겔라티네이즈의 생산은 발견되지 않았다.

베타 헤모라이신(β-hemolysin)의 생산

베타 헤모라이신의 생산은 블러드 아가 플레이트 상의 콜로니를 둘러싸는 깨끗한 영역의 형성으로 암시되었다. 혈액 아가 플레이트는 5% 양 혈액(sheep blood)을 갖는 콜럼비아 블러드 아가 베이스(Columbia Blood Agar Plate)를 사용하여 준비되었다. 베타 헤모라이신의 생산은 관찰되지 않았다.

출원인이 스트레인 ST4SA가 반코마이신 저항성, 겔리티네이즈 생산, 심내막염 항원의 생산(production of the endocarditis antigen), 세포 응집의 형 성(forming of cell aggregates), 콜라겐으로의 유착 및/또는 표면 단백질의 생산을 인코딩하는 유전자를 갖지 않는다는 것을 보여줬다는 것은 명백하다. 베타 헤모라이신 활성 및 무-시토라이신 베타 헤모라이신 III을 인코딩하는 유전자가 검출되었다. 그러나, 후자 2개의 유전자는 발현되지 않는다. (헤모라이틱 활성이 혈액 아가 플레이트에서 관찰되지 않음- 이하 참조)

담즙염 히드롤라이틱(BSH) 활성의 측정

0.5% (w/v) 타우로데옥시콜릭 산의 나트륨염(sodium salt of taurodeoxycholic acid; TCDA) 및 0.37g/l의 CaCl₂가 보충된 MRS 아가 플레이트 상에 하루밤 배양물(overnight culture) 10ml를 스포팅하는 것에 의해 스트레인 ST4SA의 BSH 활성이 테스트되었다. 플레이트는 혐기성 항이리에서 37℃, 72시간 동안 인큐베이션되었다. 침전 영역의 형성은 BSH 양성으로 간주되었다.

스트레인 ST4SA에 대한 담즙염 히드롤라이틱(BSH) 활성은 관찰되지 않았다. BSH 활성은 십이지장에서 접합된(conjugated) 담즙염의 독성에 대한 유산균의 저항성에 기여할 수 있다. 그러나, 담즙염 히드롤라이즈 활성 및 담즙염에 대한 저항성은 일반적으로 관계가 없는 것으로 받아들여진다.

세포 표면 소수성의 측정

E. 문드티아이 ST4SA의 하루밤 배양물(overnight culture)이 쿼터-스트렝스 링거 용액(quarter-strength Ringer's solution; QSRS)으로 2회 세정되었고, OD_580nm가 측정되었다. 동일한 부피의 현탁액 및 n-헥사데칸이 함께 첨가되고, 2분간 혼합되었다. 상들(phases)이 상온에서 30분동안 분리되도록 허용되었고, 그 이후, 1ml의 수상(water-phase)이 제거되고, OD_580nm가 측정되었다. 2회의 OD_580nm 평가치의 평균이 소수성의 계산에 사용되었다:

% 소수성 = [( OD_580nm 1차독출 - OD_580nm 2차독출)/ OD_580nm 1차독출] x 100.

도 28에 도시된 결과로부터, 스트레인 ST4SA는 소수성의 상징을 나타내지 않은 것이 명백하다. 따라서, 세포는 GIT 내에서 표면에 영구히 부착되지는 않는다. 세포는 장(gut) 내에서 자유로이 이동하며(부유 세포(planctonic cells)처럼), 그에 따라 양호한 프로바이오틱으로의 그 유용성이 증진된다.

E. 문드티아이 ST4SA 및 리스테리아 모노사이토젠스의 카코-2 세포주로의 유착

집합(confluence)을 얻기 위하여 카코-2 세포(하이벨드 바이올로직 사이언스, Highveld Biological Sciences)가 웰당 5 x 10⁵ 세포 농도로 접종되었다. 100㎕의 박테리아 현탁액(1 x 10⁵ cfu/ml 의 스트레인 ST4SA 및 1 x 10³ cfu/ml의 L. 모노사이토젠스)을 웰에 추가하여 유착성이 검사되었다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 세포주가 PBS로 2회 세척되었다. 박테리아 세포가 트리톤-X 100(Trition-X 100)으로 융해되고, MRS 및 BHI 아가 상으로 각각 평판배양되었다. 초기 생육 수 및 세포 융해로부터 유착성이 계산되었다.

세포 단층에 각 스트레인 100㎕를 접종하는 것에 의해 스트레인 ST4SA와 리스테리아 모노사이도젠스의 경쟁배타(competitive exclusion)가 측정되었다. 2시간의 인큐베이션 후, 세포가 융해되고, 엔테로코커스 및 리스테리아 특이 배지 상으로 각각 평판배양되었다.

카코-2 세포 단층이 12-웰 조직 배양 플레이트 내의 글래스 커버슬립(glass coverslip) 상에 준비되었다. 상기 웰에 ST4SA 세포의 현탁액이 첨가되었다. 2시간의 유착 기간 후, 세포주가 PBS로 2회 세척되고, 10% 포르말린으로 고정된 후, 그람 염색되었다. 유착 박테리아가 현미경으로 조사되었다. 그 결과가 표 15 및 표 16에 나타나 있다.

표 15.

Cfu/ml	ST4의 접종원	ST4의 유착	L. 모노사이토젠스의 접종원	L. 모노사이토젠스의 유착
실험 1	1 x 10⁶	2 x 10⁴	1 x 10⁵	3 x 10²
실험 2	1 x 10⁶	1 x 10⁴	3 x 10⁴	1 x 10³

표 16.

Cfu/ml	ST4의 접종원	ST4의 유착	L. 모노사이토젠스의 접종원	L. 모노사이토젠스의 유착
실험 1	1 x 10⁶	8 x 10³	1 x 10⁵	4 x 10¹
실험 2	1 x 10⁶	1 x 10⁴	3 x 10⁴	3 x 10³

표 15 및 16 상의 결과로부터 E. 문드티아이 ST4SA 세포가 카코-2 세포에 대한 리스테리아의 유착을 방지하고, 상기 세포가 인간 세포주의 인지 사이트에 대해 리스테리아와 성공적으로 경쟁함이 명백하다. 따라서, 스트레인 ST4SA는 리스테리 아에 대해 경쟁할 수 있다.

ST4SA가 접종된 L. 모노사이토젠스 및 시험관 내 GIT 모델에서의 생존

시험관 내 위장관 모델에서 L. 모노사이토젠스에 대한 ST4SA의 항균 활성이 측정되었다. 이전에 기술한 것처럼, ST4SA가 위장 혈관(stomach vessel)으로 접종되었다. L. 모노사이토젠스(1 x 10⁴)가 GIT의 십이지장 혈관(duodenum vessel)으로 접종되었다. 각 혈관(vessels)으로부터 샘플이 취해졌고, 각각 엔토로코커스 및 리스테리아 특이적 배지 상에 평판 배양되었다. 대조구로서, L. 모노사이토젠스만이 GIT 모델 내로 접종되었다.

시험관 내 GIT 모델에서 ST4SA로 접종된 L. 모노사이토젠스는 ST4가 L. 모노사이토젠스에 항균 효과가 있음을 드러냈다. 공장 혈관(jejunum vessel)에서 8 x 10⁴으로부터 2 x 10⁴으로 성장이 감소되었고, 도 29에 도시된 바와 같이, L. 모노사이토젠스는 대조구와 비교하였을 때, 회장 혈관(ileum vessel)에서 1 x 10¹cfu/ml 더 낮았다.

경구 투여된 E. 문드티아이 ST4SA의 생체 내에서의 안전성 평가, 박테리아 위치 이동(bacterial translocation), 생존 및 면역 조절 용량: 락토비타(Lactovita)와 비교

물질 및 방법

동물

318g 내지 335g 사이의 체중을 갖는 위스타 래트(Wistar rat) 수놈 10마리가 12시간 주야 사이클과 제어된 분위기(온도 20℃±3℃) 하에, 플라스틱 케이지에서 5 그룹으로 사육되었다. 동물들은 프로바이오틱이 보충된, 또는 임의로(ad lib) 비보충된 역삼투수(reverse osmosis water) 뿐만 아니라, 표준 식이식단을 공급받았다.

박테리아 스트레인 및 프로바이오틱

스트레인 ST4SA가 MRS 브로스에서 30℃, 18시간동안 배양되었다; 광학 밀도는 600nm에서 1.8로 조정되었다. 원심분리에 의해 세포들이 수집되었고, 20mM 인산 버퍼(pH 7.5)에서 세정되었다. 세정된 세포들은 100mM 수크로즈에 재현탁되고, 액체 질소에서 동결되고, 하루밤(overnight) 냉동 건조(lyophilized)되었다. 인산 버퍼 1ml에 주어진 양의 세포를 현탁하고, MRS 고형 배지 상에 희석액을 퍼지도록 평판 배양하는 것에 의해 cfu/ml 값이 측정되었다. 스트레인 ST4SA가 약 2 x 10⁸ cfu/ml의 농도로 음료수에 첨가되었다.

락토비타(Lactovita)라는 상표로 상업적으로 이용가능한 프로바이오틱을 함유하는 3개의 캡슐이 개봉되었고, 각 음료수 병에 추가되었다. 결과적으로, 약 3 x 10⁵ cfu/ml이 투여되었다.

실험 디자인

2개의 별개의 연구가 수행되었다. 각 연구에서 10마리의 래트가 랜덤하게 2 그룹(그룹별 다섯마리)으로 나뉘어졌다. 제1 그룹은 대조구로 작용하고, 비보충된 물을 제공받았다; 제2 그룹은 락토비타 캡슐 또는 냉동건조된 스트레인 ST4SA가 보충된 물을 제공받았다. 각 래트는 연구 기간 동안 총 9.89 x 10¹¹ cfu의 스트레인 ST4 또는 3.1 x 10⁹ cfu의 락토비타를 제공받았다. 상기 래트는 어떤 비정상적인 활동성, 행동 및, 러플 코트(ruffled coat), 굽은 포즈(hunched posture), 불안정한 움직임(unstable movement), 떨림 또는 동요(tremors or shaking), 기침 또는 호흡 곤란(coughing or breathing difficulties), 사지 색상(colour of extremities)을 포함하는 일반 건강 상태에 대해 매일 모니터링되었다. 활동성이 3-스케일 방법을 이용하여 모니터링되었다: 1=게으름, 느리게 움직임; 2=중간; 3= 적극적인 움직임 또는 수색. 실제 체중과 소비된 물의 부피가 매일 측정되었다. 상기 스트레인 ST4SA 연구는 50일 이상 수행되었고, 상기 락토비타 연구는 108일 이상 수행되었다. 그 결과를 표 17에 나타내었다.

표. 17

	대조구	ST4	대조구	락토비타
증가(g)	144 (7.22)	150.60 (9.34)	255.2 (21.88)	246 (44.42)
증가(%)	69.46 (1.10)	69.19 (1.05)	56.04 (2.59)	57.21 (5.60)

β-글루쿠로니데이즈 활성

특정 샘플링 포인트에서 래트들가 단일 케이지에 하루밤(overnight) 배치되 었고, 박테리아의 수와 β-글루쿠로니데이즈 활성을 측정하기 위해 24시간 배설물 샘플이 수집되었다. 배설물 샘플은 20mM 인산 버퍼에서 100mg 배설물/ml 버퍼의 농도로 균질화되었다. 샘플들은 분석시까지 -20℃에서 저장되었다. 배설물 샘플은 원심분리에 의해 펠렛화되었고, 1ml GUS 추출물 버퍼(50　mM NaHPO₄, 5　mM DTT, 1　mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100)에 재현탁되어, 혼합되고, 22℃에서 10분간 인큐베이션되었다. 샘플들은 -20℃에서 하루밤 동결되었고, β-글루쿠로니데이즈의 활성 측정 전에 해동되었다. 900㎕의 반응 버퍼(1mM ρ-니트로페닐 글루쿠로니드(ρ-nitrophenyl glucuronide)를 함유하는 추출물 버퍼)를 갖는 처리된 배설물 현탁액 100㎕를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하는 것에 의해 β-글루쿠로니데이즈 활성이 평가되었다. 상기 반응은 pH 10.4인 1M Tris 2.5ml를 첨가하는 것에 의해 정지되었다. 415nm에서 흡광도가 측정되었고, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 10mM ρ-니트로페놀을 사용하여 표준 커브가 구축되었다.

박테리아 위치이동(translocation), 독성 연구 및 조직

동물들은 특정 시간 동안 테스트 스트레인을 공급받은 후, 과용량의 펜토바비톤 소듐(pentobarbitone sodium)에 의해 안락사되었다. 혈액 샘플이 우심실의 심장 천자(cardiac puncture)에 의해 얻어졌다. 각 래트 내장 조직의 전체 해부가 체크되고 기록되었다. 간, 비장 회장, 맹장, 결장 조직의 샘플들이 절개되었다. 조직 샘플은 카세트에 수집되고, 4% 포름알데히드(PBS) 용액 내에 배치된 후, 조직 분석 및 FISH 연구를 위해 파라핀 왁스 내에 임베디드되었다. 회장 및 공장의 섹션은 액체 질소 내에 동결되었다. 혈액 샘플은 BHI 고형 배지 상에 퍼지도록 평판 배양되고, 37℃에서 하루밤 인큐베이션되었다.

면역 조절

트리졸 시약(Trizol reagent)을 사용하여 동결된 회장 및 결장 샘플로부터 전체 RNA가 추출되었다. RNA의 농도는 DNA 분해효소(DNase) 처리가 완료된 후, 나노드롭 분광 측광계(Nanodrop spectrophotometer)를 이용하여 260nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정되었다. 각 RNA 샘플은 42ng/㎕의 농도로 희석되었다. 슬롯 블롯 장치(slot blot apparatus)를 이용하여, 각 샘플의 총 5㎍이 나일론막 상으로 3배 이동되었다. 이후, 상기 막은 종양 괴사 인자(tumour necrosis factor; TNF), 인터페론 γ(IFN) 또는 래트 유전자 DNA로부터 증폭되고 DIG로 라벨링된 β-액틴 DNA 프로브에 의해 조사되었다. 상기 막은 X-레이 필름에 노출되고 현상되었다.

결과

일반 건강 상태 및 증체

연구 기간을 통해서 래트로부터 주목할 만한 행동 또는 활동도 변화는 없었고, 실험 그룹 및 대조구 그룹간 주목할 만한 차이는 없었다. 처치 관련 질명 또는 사망은 발생하지 않았다.

β-글루쿠로니데이즈 활성

β-글루쿠로니데이즈를 포함하는 박테리아 효소는 GIT에서 발견되는 전구체(precursors)로부터 뮤타젠(mutagens), 발암물질(carcinogens) 및 종양 프로모터를 생성하는 데에 관계된 것으로 알려져 있고, 그 존재는 박테리아 스트레인의 독성을 암시하며, 따라서, 잠재적인 프로바이오틱스의 안정성에 대한 표지로 사용될 수 있다. 스트레인 ST4SA 및 락토비타 현탁액은 모두 시험관 내에서 β-글루쿠로니데이즈 활성을 나타내지 않았다(데이터 나타내지 않음). 그러나, 대조구 래트와 비교하였을 때, 락토비타 현탁액이 주어진 래트는 배설물 샘플에서 β-글루쿠로니데이즈 활성의 증가를 나타냈다(표 18a). 대조구 동물은 또한 연구 56일과 비교하였을 때, 107일에 활성 감소를 나타냈고, 실험 동물은 연구 56일과 비교하였을 때, 107일에 다소 수치가 증가하는 것으로 나타났다. ST4 보충물이 주어진 래트는 대조구 그룹과 비교할 때, 더 높은 β-글루쿠로니데이즈 활성을 나타냈지만(표 18b), 이 활성은 연구 0일에서의 수치와 비교할 때, 연구 마지막에서의 수치가 훨씬 낮았다. 대조구 그룹은 또한 0일에 비해 연구 마지막에서 더 낮은 활성을 나타냈다.

표 18.

표 18a.

	56일	77일	107일
락토비타	6.58 (0.34)	7.49 (0.23)	7.88 (0.36)
대조구	7.52 (0.26)	8.17 (0.08)	6.70 (0.32)

표 18b.

	0일	14일	30일	50일
ST4	6.43 (0.52)	1.78 (0.45)	5.25 (0.57)	5.14 (0.83)
대조구	5.78 (0.50)	2.40 (0.76)	4.02 (0.62)	2.68 (0.15)

박테리아 위치이동, 독성 연구 및 조직

동물 그룹 어디에서도 균혈증(bacteraemia)은 발견되지 않았다. 내장 기관에 대한 육안 조사(macroscopic examination)는 스트레인 ST4SA가 주어진 래트가 대조구 래트와 비교할 때, 유의적으로 더욱 분명한 MLN을 보유함을 암시하였다. MLN은 대조구 래트에서 동정하기 매우 어려웠다. 대조구 그룹에서 비장은 더 협소하였고, 근육량과 복부 지방은 실험 그룹과 비교하였을 때 더 적었다. 락토비타가 주어진 동물들에서 MLN은 덜 분명하였고, 비장은 대조구 그룹과 비교할 때 더 작았다.

임파구는 비장으로 들어가서 혈액 항원에 대해 면역 반응을 촉진한다. 확대된 비장은 면역 시스템의 활성도가 증가하였음을 암시한다. 이것은 또한 분명한 MLN과 상호 관련이 있다. MLN은 또한 면역 작용과 연관이 있고, 염증 또는 감염의 결과로서 확대된다. 이러한 확대는 그들이 예상된 기능을 수행하고 있음을 보여주는 징표이다. 따라서, 스트레인 ST4SA는 면역 자극제(stimulant)로 작용할 수 있다. 락토비타 보충을 받은 래트는 대조구 래트와 비교하였을 때, 더 작은 비장과 덜 분명한 MLN을 나타냈다. 이것은 락토비타가 면역 반응을 유도하지 않음을 암시한다. 그러나, 대조구 래트의 MLN과 비장은 확대되었고, 면역 자극제가 없는 가운데에서 어떠한 질환 징후도 관측되지 않았다.

면역 조절

노던 혼성화(Northern hybridization) 연구는 실험 ST4SA 그룹 또는 대조구 그룹에서 시토카인(TNF 또는 IFN) 발현을 암시하지 않았다. RNA 존재를 지시하는 β-액틴 DNA 프로브로 RNA가 조사되었을 때, 상대적으로 동일한 밀도의 양성 신호가 검출되었다.

시토카인은 세포 성장, 염증, 면역, 분화, 및 수선을 조정하는 단백질을 분비한다. 그들은 종종 그들이 필요로 하는 효과를 양산하기 위해 펜토몰라 농도(femtomolar concentration)를 필요로 한다. 종종, 그들은 세포 표면 리셉터와 조합하여 작용하여 RNA와 단백질 합성의 패턴 상 변화를 양산한다. 그들은 보통 낮은 농도로 존재하기 때문에, 이 단백질의 영향 하에 있는 추가 유전자의 발현을 측정하는 것이 더 유리할 수 있다.

여기에 제시된 결과는 테스트된 프로바이오틱스 중 어느 것도 수놈 위스타 래트의 일반적인 건강 상태에 부정적인 영향을 갖지 않음을 암시한다.

요약컨대, 스트레인 ST4SA는 반코마이신 저항성을 인코딩하는 유전자를 소유하지 않는다. β-헤모라이신 활성 및 무-시토라이신 베타 헤모라이신 III(non-cytolysin beta hemolysin III)를 인코딩하는 유전자가 검출되었지만, 그들은 발현되지 않았다. 스트레인 ST4SA는 담즙염 히드롤리틱(BSH) 활성을 갖지 않는다. 이것은 상기 스트레인이 GIT의 더 낮은 섹션(회장 및 결장)에서 더 양호하게 수행할 것임을 암시한다. 위에서 보여진 바와 같이, 데이터는 E. 문드티아이 스트레인 ST4SA가 GIT를 통해 자유로이 움직이고, 리스테리아가 카코-2 세포에 유착되는 것을 방지하며, 그 동안 인간 세포 상의 리셉터에 결합하는 것에 대해 성공적으로 리스테리아와 경쟁함을 암시한다. 위장관 모델(GIM) 연구에서 스트레인 ST4SA는 L. 모노 시토겐스에 대한 항균 효과를 가졌다. 스트레인 ST4SA는 래트 연구에서 보여진 바와 같이, 독성이 없다. 처치 관련 질병이나 사망도 발생하지 않았다. 스트레인 ST4SA는 또한 락토비타보다 더 양호하게 수행하여, 락토비타가 주어진 래트는 β-글루쿠로니데이즈 활성의 증가를 보여주었고; 따라서, 스트레인 ST4SA는 래트에서 면역 반응을 자극한다. 락토비타 보충을 받은 래트는 대조구 래트와 비교하였을 때, 더 작은 비장 및 덜 분명한 MLN을 나타냈다. 이는 락토비타가 면역 반응을 유도하지 않음을 암시한다.이상에서 암시된 것처럼, 펩티드 ST4SA는 다양한 박테리아의 성장을 억제한다. 펩티드 ST4SA의 최대 생산(51 200 AU/ml)은 MRS 브로스(Biolab)에서 20시간 성장 후 기록되었으며, 이것은 발효를 통해 유지되었다.

스트레인 ST4SA의 18시간 된 배양물이 MRS 브로스(Biolab) 및 필터링된 MRS 브로스에 각각 접종되었다(2%, v/v, OD_600nm = 2.0). MRS 브로스(Biolab)는 포어 사이즈 6000 내지 8000Da의 니트로셀룰로스 막을 구비한 미니탄 시스템(Millipore, BioSciences International)을 통해 필터링되었다. 이후, 8000Da이하의 단백질을 함유하는 MRS 여과물(MRS filtrate, MRSf)이 오토클레이브되고, 이전에 기술된 방법으로 접종되었다. MRS 브로스 및 MRSf에서의 인큐베이션은 교반없이 30℃ 및 37℃에서 29시간동안 수행되었다. 펩티드 ST4SA 활성이 2시간마다 측정되었다.

펩티드 ST4SA의 정제

1 리터의 MRSf가 엔테로코커스 문드티아이 ST4SA (OD_600nm = 1.8)으로 접종되 었고, 30℃에서 24시간동안 인큐베이션되었다. 원심분리(8 000 x g, 4℃, 15분)에 의해 세포가 수집되었고, 무세포 상층액이 80℃에서 10분간 인큐베이션되었다. 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)가 4℃에서 포화 레벨 60%로 무세포 상층액에 서서히 첨가되었다. 4시간 동안 천천히 휘저은 후, 침전물을 원심분리(20 000 x g, 1시간, 4℃)에 의해 수집하였다. 상기 펠렛이 1/10 부피의 25mM 암모니움 아세테이트(ammonium acetate) (pH 6.5)에 재현탁되고, 1.0kDa 컷오프 스펙트라/포어 투석막(cut-off Spectra/Por dialysis membrane, Spectrum Inc., CA, USA)을 사용하여 멸균 밀리큐 워터(sterile MilliQ water)에 대해 탈염되었다. 이후, 이전에 기술한 것처럼, 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)에 의해 AKTA퓨리파이어(AKTApurifier, Amersham)을 갖는 1ml 리소스 S 컬럼(Resource S column, Amersham Biosciences)에서 분리(separation)가 이루어졌다.

각 정제 단계 후 얻어진 펩티드 ST4SA 활성 레벨이 표 19에 표시되어 있다.

표 19.

샘플	활성	총 단백질	특이적 활성	수율	정제
	(AU/ml)	(㎍/ml)	(AU/㎍ 단백질)	(%)	인자
무세포 상층액	12 800	10.77	1 188.49	100	1
(450ml)
암모니움 설페이트 침전물	102 400	82.31	1 244.08	80	1.1
(45ml)
투석액(Dialysate)	102 400	35.77	2 862.73	80	2.4
(45ml)

AKTA퓨리파이어로부터 수집된 활성 단편(active fraction)은 ST4SA 피크에 대응하였고, ST4SA의 예상 사이즈로인 42-아미노산 펩티드를 생산하였다.

펩티드 ST4SA의 이소-일렉트릭 포커싱

펩티드 ST4SA의 이소-일렉트릭 포커싱(iso-electric focusing)이 로토포어-일렉트로 포커싱 세포 (Rotofor electro-focusing cell; Bio-Rad, Hercules, California, USA)를 사용하여 수행되었다. MRSf에서 배양된 스트레인 ST4SA에서 얻어지고, 이전에 기술한 것처럼 준비된, 1 리터의 무세포 상층액이 제조자의 지시에 따라 냉동건조되고, 암폴라이트(ampholytes; pH 범위 3-10, Bio-Rad)를 갖는 10ml 멸균 증류수에 재현탁되었다. 8℃에서 5시간 동안 12W의 일정한 전류가 공급되었다. 분리 후, 각 수집된 단편 소량의 부피가 3N NaOH 또는 3N HCl에 의해 pH 7.0으로 조절되었고, 락토바실러스 카세이 LHS에 대한 항균 활성이 테스트되었다. 테스트 결과 양성으로 판정된 단편들이 수집되고, 탈이온화수에 전체 부피가 50ml가 되도록 재현탁되고, 다시 일렉트로 포커싱에 종속된 후, 상기 단편이 수집되고, 항균 활성이 테스트되었다. 샘플들은 -20℃에서 저장되었다.

배양 배지의 비용 절감은 배지 최적화의 중요한 부분을 구성한다. 배지 비용은 탄소 및/또는 질소원으로서 산업 배지(industrial media)를 사용하는 것에 의해 절감될 수 있다. 콘 스티프 리쿠어 (Corn steep liquor, CSL), 치즈 훼이 파우더(cheese whey powder, CWp) 및 몰라세스(molasses)는 성장 배지의 일부로서 일반적으로 사용된다. CSL은 옥수수를 제분하는 동안 형성되는 부산물이다. 그것은 주로 질소원이지만, 또한 당(주로 수크로즈), 비타민 및 미네랄을 함유한다. 낙농업에서 발생하는 부산물인 치즈 훼이는 유산(lactic acid, LA) 생산을 위한 가장 일반적인 발효 배지로서, 주로 락토즈, 단백질 및 염을 함유한다. 몰라세스는 주로 수크로즈와 미량의 다른 미네랄을 함유하는 부산물이다.

배양 및 배지

스트레인 ST4SA가 MRS 브로스(Biolab)에서 배양되었고, CSL, CWp, 및 몰라세스에 각각 접종되었다.

발효

10ml의 배지를 포함하는 테스트 튜브에서 발효가 수행되었다. pH는 멸균((121℃, 15분) 전 NAOH로 조정되었다. NAOH의 농도는 배지의 버퍼 용량에 의존한다. 24시간 배양물이 접종(2% v/v)에 사용되었다. 배치 발효(batch fermentation)가 30℃, pH 6.5-7.0인 테스트 튜브에서 16시간 동안 수행되었다. 상기 pH는 제어되지 않았다. 광학 밀도(OD)는 600 nm에서 측정되었다.

10, 20 및 50g.l ^-1 의 몰라세스 및 CSL가 펩티드 ST4SA 생산을 위한 가능성 있는 배지로 평가되었다(표 20). 발효 동안 몰라세스의 pH가 떨어졌지만(따라서, 세포 성장을 암시함), 펩티드 ST4SA 활성은 상층액에서 기록되지 않았다. 반면 CSL은 최소 농도 20g.l ^-1 에서 3200AU.ml ^-1 까지의 활성을 갖는 상층액을 생산하였다. 이 결과로부터 추론할 수 있는 것처럼, 질소원(CSL)이 펩티드 ST4SA 생산을 유지하는 데에 필요하다.

표 20.

후속 실험에서, CWp가 산업 배지의 리스트에 추가되었고, 10, 20 및 50g TS.l^-1에서 발효되었다(표 20). 1600 AU.ml^-1까지의 펩티드 ST4SA의 활성이 CWp에 기록되었다(표 20).

구성요소로서 CSL 및 CWp를 갖는 풀 팩토리얼 디자인(full factorial design, FFD)이 사용되어 어떤 배지가 펩티드 ST4SA 생산에 가장 유의적인 효과를 갖는지 측정되었다(표 21). FFD는 또한 영양분 사이에 상호작용이 있는지에 관한 징표를 나타낸다.

표 21.

CSL 및 CWp를 갖는 2² FFD

당의 이용이 다음의 방법을 사용하여 측정되었다:

전체 당에 대한 페놀-설푸릭 산(Phenol-sulphuric acid) 분석

페놀(500㎕, 5%, v/v) 및 농축된 설푸릭 산(2.5ml)이 테스트 튜브 내 희석 샘플 500㎕에 첨가되었다. 용액은 철저히 혼합되었고(thoroughly vortexed), 흡광도 독출은 490nm(상온)에서 행해졌다. 표준 그래프를 이용하여 당 농도(g 글루코스.l^-1)가 계산되었다.

당 모노머의 디오넥스(dionex) 측정

카보팩(CarboPac) PA100 컬럼을 갖는 디오넥스 DX500 분석기가 당 모노머의 샘플을 분석하기 위해 사용되었다. 사용된 용리액(eluent)은 유속 1ml.min^-1의 250mM NaOH, H₂O 및 1M NaOAc이었다. 디오넥스는 자동 샘플러를 구비하였고, 주입 부피는 10㎕이었다.

전체 당 농도는 5 및 10g TS.l^-1(각각 "-1" 및 "1"로 표상됨)사이에서 변화하였다. 상기 결과(실험은 2배수로 수행됨)는 CSL 및 CWp의 농도가 펩티드 ST4SA의 생산에 영향이 없음을 암시하였다(표 21). 5 및 10g TS.l^-1에서의 CSL은 CSL 및 CWp 조합(표 21)에서 기록된 것과 유사하며, 50 g.l^-1 CSL로 기록된 것보다 4배가 되는 펩티드 ST4SA 활성을 양산했다. 이 결과로부터 명백하게, CSL은 펩티드 ST4SA의 생산에 유의적인 영향을 가졌다.

CSL의 최적화

12800AU ml^-1까지의 펩티드 ST4SA 활성이 10g TS.l^-1농도의 순수 CSL 내에서 기록되었다. 그러나, 이것은 MRS에서 기록된 펩티드 ST4SA 활성(51200 AU.ml^-1)과 비교하면 낮았다. 예비 실험에서 MRS 구성성분(글루코스 제외)이 10 및 40g TS.l^-1의 CSL 및 CWp에 각각 추가되었다(표 22). 순수 CSL과 비교하여 10g TS.l^-1 CSL의 보충시 2배의 활성 증가가 관찰되었다. 반대로 40g TS.l^-1으로 CSL을 보충한 경우는 낮은 활성을 양산하였다. 높은 농도의 CSL은 성장을 억제하였고(pH가 다소 감소), 또한 펩티드 ST4SA의 생산도 억제하였다. 이것은 CSL에서 억제 구성성분(inhibiting component) 때문일 것이다. 동일한 실험이 CWp에 대해 수행되었다 (표 22). CWp 농도의 증가(10g TS.l^-1부터 40g TS.l^-1까지)가 있었지만, 펩티드 ST4SA 생산에 대한 영향은 기록되지 않았다.

표 22.

MRS 구성성분이 보충된 CSL

10g TS.l^-1에서 CSL은 CWp(25600 AU.ml^-1)와 비교하였을 때, 펩티드 ST4SA 활성을 2배로 생산하였다. 따라서, CSL이 향후 실험 배지로 선택되었다.

모든 MRS 구성성분이 펩티드 ST4SA 생산을 향상시키는 역할을 하는 것은 아니므로, 유의적인 구성요소를 동정하기 위한 스크린 실험이 수행되었다. 이 스크린 실험은 2^10-5 프랙셔널 팩토리얼 디자인(fractional factorial design, FrFD)을 통해 수행되었다. 상기 디자인은 일반적인 1024런(run) 대신 단지 32런(run)에서 10개의 인자에 대한 테스트가 가능하게 하였다(표 23 및 24). 또한 구성성분 사이에 상호작용이 있었는지 측정하는 것이 가능하였다. 결과는 ANOVA로 분석되었다(표 25).

표 23.

MRS 구성성분 및 CSL의 높은 농도 및 낮은 농도

코드값으로 환산된 선형 모델(Linear model in terms of coded values):

R² = 0.73

선형 모델(linear model)을 이용한 펩티드 ST4SA 생산이 기술되었다. 선형 모델이 정확하게 활성을 예측할 수는 없었지만(R² = 0.73), 여전히 구성 성분의 영향(포지티브 또는 네가티브)을 평가하는 데에는 사용될 수 있었다. 비프 추출물(Beef extract; B), 인산 칼륨(potassium phosphate; E), tri-암모니움 시트레이트(tri-ammonium citrate; G) 및 소듐 아세테이트(sodium acetate; K)가 선형 모델(방정식 2)에서 음의 계수(negative coefficient)를 가져, 반응 변수의 감소를 유발하였다. 이것은 펩티드 ST4SA 생산에 대한 그들의 네가티브한 영향을 반영하였 다. 이는 단지 효모 추출물(yeast extract, YE; C) 및 CSL(D)가 펩티드 ST4SA 생산을 증가시켰음을 의미하였다.

표 24. 2^10-5 FrFD 디자인

표 25. 2^10-5 FrFD 디자인에 대한 변수 테이블의 분석

CSL 및 YE의 농도는 2² FFD로 설정되었다(표 26). 펩티드 ST4SA 활성을 측정하기 위해 사용된 임계 희석법(critical dilution method)은 정확한 결과를 양산하지 않았다. 이것은 CSL 및 YE의 농도에 관련된 모델을 활성에 적합하도록 하는 것을 불가능하게 하였다. 실험 결과는 구성 성분을 고정하는데 사용되었다. 표 26으로부터 낮은 또는 높은 농도의 CSL 및 YE를 사용할 때 명백한 영향은 없는 것으로 보여질 수 있다. CSL 7.5 g TS.l ^-1 및 YE 6.5 g.l^-1의 조합에 관한 평균값이 최선으로 선택되었다.

표 26.

CSL 및 YE 농도를 측정하기 위해 3개의 중앙 포인트를 갖는 2² FFD

최적 배지를 갖는 성장 곡선이 도 30에 도시되어 있다. CSL 기반 배지(CSL-based media) 및 MRS는 유사한 성장 동태를 양산하였다.

배치 대 배치의 변화(Batch to batch variation)

CSL 조성물은 그것이 여분의 생산물이므로, 매일마다 상이하다. 조성물의 차이는 결과의 유의적인 차이를 유발할 가능성을 갖는다. 이것은 CSL 제2 배치(batch)에 대해 동일한 실험을 함으로써 조사되었다. 이번의 ANOVA 분석은 박테리오신 생산(P < 0.1)에 가장 유의적인 영향을 갖는 구성 성분으로서 YE, CSL, 트윈 80, MnSO₄, 및 소듐 아세테이트를 동정하였다. 연속된 최적화는 MnSO₄은 비유의적인 반면, 소듐 아세테이트가 활성의 감소를 유발함을 나타냈다.

최종 배지는 다음의 세개의 구성성분으로 구성되었다: YE (C), CSL (D) 및 트윈 80 (F). 효모 추출물이 유의적인 구성 성분의 하나로 다시 사용되었다는 것은 놀라운 일이 아니었다. 트윈 80은 유제화(emulsifying) 특성을 갖는다. 최종 농도 는 2³ FFD 디자인에서 설정된 것처럼 다음과 같았다: YE: 7.5g.l^-1, CSL: 10g.l^-1 및 트윈 80: 2g.l^-1.

성장 한계

CSL 배지의 당 내용물이 발효를 전후하여 측정되었다. 발효 시작 시점에서, CSL은 7.5g　TS.l^-1의 농도로 구성되었다. 존재하는 주요 당 모노머는 글루코스 및 프럭토즈로 전체 농도는 3.883g.l^-1이었다. 전체 당의 약 51.8%만이 발효가능한 형태이고, 모든 당이 발효 동안 대사되지는 않았다. 발효 말미에(일정한 OD) pH는 4.6이었고, 남은 잔여 당은 8.8%였다. 성장 제한은 낮은 pH 때문이었고, 질소, 미네랄, 비타민 또는 다른 영양분의 결핍 때문은 아니었다. 표 27은 발효 동안의 탄소 섭취(carbon uptake)를 나타낸다.

표 27.

발효 동안의 탄소 섭취

시간 [h]	글루코스 [g/l]	프럭토즈 [g/l]	전체 당 [g/l]	당 발효 %
0	1.747	2.136	3.883	0.0
10	0.391	0.899	1.290	66.8
19	0.041	0.301	0.342	91.2

따라서, YE를 보충받은 CSL은 상업적인 MRS 브로스에서 얻어진 높은 펩티드 ST4SA 레벨에 상응할 수 있음이 명백하다. 유리하게도, 이것은 배양 배지와 관계된 비용을 유의적으로 절감하는 가능성을 갖는다. CSL이 펩티드 ST4SA의 산업적 생산 을 위한 성장 배지로 선택되었다.

엔테로코커스 문드티아이 ST4SA의 프로바이오틱으로의 개발

프로바이오틱 스트레인을 선택하는 중요한 기준은 상피세포로의 유착이다. 프로바이오틱 박테리아는 또한 유착 사이트에 대해 병원성 박테리아와 경쟁할 수 있다. 인간 결장 선암종으로부터 유래하는 카코-2 세포가 E. 문드티아이 ST4SA의 상피세포로의 유착 및 경쟁배타 능력을 조사하기 위한 시험관 내 모델로 사용되었다.

그 결과가 접종원에 대한 유착 퍼센티지로 표현되어 있다. E. 문드티아이 ST4SA 및 L. 모노사이토젠스 스코트(Scott) A는 유착할 수 있었고, 양자는 카코-2 세포에 대해 5%의 유착을 나타냈다. E. 문드티아이 ST4SA의 유착은 인큐베이션 시간이 단지 1시간일 때, 1% 낮아졌다. 음식물은 소장에서 2시간동안 체류하므로, E. 문드티아이 ST4가 상피세포에 유착할 충분한 시간을 가질 수 있다. 그러나, E. 문드티아이 ST4SA는 병원균과의 인큐베이션하기 전, 하는 중 또는 한 후에 첨가되었는지 여부에 상관없이 L. 모노사이토젠스 스코트 A의 유착에 영향을 주지 않았다. 배타 및 치환 테스트(exclusion and displacement tests)에서, L. 모노사이토젠스 스코트 A는 5%의 유착을 나타냈다. 경쟁 테스트(competition test)는 대조구에서와 동일한 유착 퍼센티지로 유착 경쟁을 하지 않음을 보여줬다. 이것은 E. 문드티아이 ST4SA 및 L. 모노사이토젠스 스코트 A가 상피세포 상의 서로 다른 리셉터에 결합할 것이라는 사실에 의해 설명될 수 있다. 따라서, E. 문드티아이 ST4SA 및 L. 모노사 이토젠스 스코트 A는 동일한 리셉터에 경쟁하지 않는다.

항생제 및 항염증 약물에 대한 E. 문드티아이 ST4SA의 저항

E. 문드티아이 ST4SA는 2개의 항생제(세파신 및 유틴, Cefasyn and Utin)와 염증 약물인 류게식(Rheugesic), 콘스플람(Coxflam), 및 핀메드(Pynmed)에 대해 저항성을 나타냈다. 이 결과가 표 28에 나타나 있다. E. 문드티아이 ST4SA에 대해 가장 큰 성장 억제를 갖는 항생제는 프로목실(Promoxil), 시파두르(Cipadur), 록시비드(Roxibidd) 및 독시말(Doximal)이다.

프목실, 독시말, 세파신 및 유틴은 대조구와 비교할 때, ST4SA 세포가 카코-2 세포로 유착하는데 영향을 갖지 않았다. 표 29에 나타난 바와 같이 시파두르, 록시버드 및 이부게스틱 시럽(Ibugestic syrup)의 존재하에서 유착이 10% 감소하였고, 더 높은 세파신 농도에서 14%의 감소를 보였다.

표 28.

약물	스트레인 ST4SA
이부프로펨(Ibuprofen), 5mg/ml	++
아스피린(Aspirin), 5mg/ml	+
프로목실(Promoxil), 100mg/ml	++++
시파두르(Cipadur), 50mg/ml	+++
세파신(Cefasyn), 100mg/ml	-
록시비드(Roxibidd), 30mg/ml	+++
독시말(Doximal), 20mg/ml	+++
시플록스(Ciploxx), 100mg/ml	+
유틴(Utin), 80mg/ml	-
류게식(Rheugesic), 4mg/ml	-
콕스플람(Coxflam), 1.5mg/ml	-
K-페낙(K-fenak), 5mg/ml	++
프리플람(Preflam), 3mg/ml	+
이부게식(Ibugesic)	++
핀메드(Pynmed)	-

- = 없는 영역; + = 직경이 1mm 내지 11mm; ++ = 직경이 12mm 내지 16mm; +++ = 직경이 17mm 이상.

표 29.

약물	스트레인 ST4SA 유착
접종원(Inoculum)	1 x 10⁷
대조구	5 x 10⁴
시파두르(Cipadur) (5 mg/ml)	6 x 10³
록시비드(Roxibidd) (10 mg/ml)	3 x 10³
프로목실(Promoxil) (8 mg/ml)	1.25 x 10⁴
독시말(Doximal) (2 mg/ml)	1 x 10⁴
세파신(Cefasyn) (10 mg/ml)	1.2 x 10⁴
세파신(Cefasyn) (50 mg/ml)	7 x 10²
유틴(Utin) (8 mg/ml)	4 x 10⁴
유틴(Utin) (40 mg/ml)	3 x 10⁴
이부게스틱 시럽(Ibugestic syrup) (100 ml)	6 x 10³
K-페낙(K-fenak) (0.5 mg/l)	3 x 10⁴

구강으로 투여된 E. 문드티아이 ST4SA 세포의 안정성, 독성, 박테리아 위치 이동 및 생존, 면역 조절 능력 및 효능에 대한 생체 내 평가- 락토비타와 비교

동물

150g 내지 180g의 체중을 갖는 36마리의 위스타 래트 수놈이 제어된 대기(온도: 20±3℃) 조건 및 12시간 주/야 사이클로 플라스틱 케이지에서 6개의 그룹으로 나뉘어 사육되었다. 동물들은 표준 식이식단 및 즉흥 식단(ad lib)을 공급받았다.

박테리아 스트레인 및 프로바이오틱

E. 문드티아이 스트레인 ST4SA가 MRS 브로스에서 30℃, 18시간 동안 배양되었다; 광학 밀도는 600nm에서 1.8로 조정되었다. 원심분리에 의해 세포가 수집되었 고, 20mM의 인산 버퍼(pH 7.5)에서 세정되었다. 세정된 세포는 100mM 수크로즈에서 재현탁되고, -80℃에서 동결된 후, 하루밤(overnight) 냉동건조되었다. 1ml의 인산 버퍼에 주어진 양의 세포를 현탁하고, MRS 고형 배지 상에 희석액을 퍼지도록 평판배양하는 것에 의해 cfu/vial값이 측정되었다. 냉동 건조된 세포는 멸균된 탈지유(skim milk, 10%) 내에 재현탁되었고, 2 x 10⁸ cfu의 스트레인 ST4SA가 위내관(intragastric gavage)를 통해 투여되었다.

락토비타 캡슐이 병(vial)으로 옮겨졌고, 멸균 탈지유(10%)에 재현탁되고, 2 x 10⁸ cfu의 스트레인 ST4SA가 위내관(intragastric gavage)을 통해 투여되었다.

리스테리아 모노사이토젠스 스코트 A가 BHI 브로스에서 37℃, 18시간동안 배양되었다. 원심분리에 의해 세포가 수집되었고, 20mM 인산 버퍼(pH 7.5)에서 세정되었다. 세정된 세포는 100mM 수크로즈에서 재현탁되고, -80℃에서 동결된 후, 하루밤 냉동건조되었다. cfu/vial의 수가 위에 기재된 방식으로 측정되었다. 냉동 건조된 세포는 멸균 탈지유(10%)에서 재현탁되었고, 10⁴ cfu가 위내관(intragastric gavage)을 통해 투여되었다.

실험 디자인

실험 7일동안 2 그룹의 동물이 위내관을 통해 스트레인 ST4를 공급받았고, 2 그룹이 락토비타를, 나머지 2 대조구 그룹은 물을 공급받았다. 8일째, 양 대조구 그룹은 리스테리아 모노사이토젠스로 감염되었고, 스트레인 ST4SA과 락토비타 그룹 들로부터 각각 한 그룹은 위내관을 통해 L. 모노사이토젠스로 감염되었다. 이때, 동물들은 또한 E. 문드티아이 스트레인 ST4SA, 락토비타 또는 물을 공급받았다. 프로바이오틱 또는 물이 다시 9일 및 10일째에 투여되었다. 대조구 그룹들이 증상을 보이기 시작했을 때, 상기 그룹들 중 하나에 E. 문드티아이 스트레인 ST4SA가 위내관을 통해 투여되었다. 상기 그룹은 이후, 증상 완화가 모니터링되었다.

동물들은 리스테리아병의 증상에 대해 매일 2회씩 모니터링되었다. 동물들은 11일째 (이제 E. 문드티아이 스트레인 ST4SA를 제공받는 대조구 그룹을 제외하고) 희생되었다. 혈액이 우심실로부터 샘플링되었다. 전체 혈액수가 병리 실험으로 측정되었고, 혈액 샘플이 BHI 고형 배지 및 리스테리아 선택 아가 베이스(Listeria selective agar base)로 접종되었으며, 상기 cfu/ml이 측정되었다. 플라즈마(plasma)가 수집되었고, 시토카인(IL-6 및 IFN-α 레벨 뿐만 아니라 엔도톡신(endotoxin) 레벨도 측정되었다. 간, 비장 및 위장관 섹션이 절개되고, 파라핀에 임베디드되기 전에 포름 알데히드에 고정되었다.

섹션들은 조직 분석을 위하여 헤모라이신(hemolysin)과 에오신(eosin)으로 염색되었다. 헤모라이신과 에오신 분석은 스트레인 ST4SA의 경구 투여가 간, 비장, 또는 GIT에 구조적 손상을 유발하지 않음을 암시한다(도 31 참조). 스트레인 ST4SA를 투여받은 동물들과, 단지 비보충수를 공급받은 동물들간 차이는 관측되지 않았다.

여기에 기재된 것처럼, 콩 추출물로부터 분리된 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA가 다수의 병원성 미생물, 예를 들어 인간의 중이 감염 및 인간의 장 으로부터 분리된 다수의 병원성 미생물에 대해 활성을 갖는 유용한 항균 펩티드, 펩티드 ST4SA를 생산한다는 것이 본 출원인에 의해 발견되었다. 유리하게도 펩티드 ST4SA는 세포독성이 없다. 출원인은 당 발효 반응, 다수의 생화학적 테스트, 2 플라스미드의 존재(pST4SA1 and pST4SA2), 장 상피세포 및 점액의 유착을 인코딩하는 유일한 유전자(AdhST4SA)를 통해 엔테로코커스 문드티아이 ST4SA 스트레인을 E. 문드티아이의 다른 스트레인과 구별하였다. 펩티드 ST4SA는 정제 및 시퀀스되었고, 2개의 큰 소수성 영역을 포함한다. 출원인은 펩티드 ST4SA를 세포막으로 수송하는 것을 인코딩하는 핵산 시퀀스 뿐만 아니라, 펩티드 ST4SA를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 분리 및 시퀀스하였다. 그것은 그 자신의 펩티드에 대항하여 생산자 세포에 면역성을 부여할 수 있도록 작용한다. 모든 후자 유전자는 그 플라스미드의 스트레인의 큐어링이 항균 활성의 상실을 유발하지 않기 때문에, 게놈 상에 위치한다. 더욱이, 엔테로코커스 패칼리스로의 플라스미드의 형질변환은 수취자(recipient)를 펩티드 ST4SA 생산자로 전환하지 않았고, 그것은 유전자가 플라스미드 상에 위치하지 않는다는 증거가 된다. 펩티드를 프로티올리틱 효소로 처치한 후 항균 활성이 상실한 것은 활성이 펩티드 구조에 기인한 것이고, 분자에 링크된 지방이나 탄수화물에 기인한 것이 아님을 확인한다. 놀라게도, 상기 펩티드는 pH 2.0-12.0의 버퍼에서 30분의 인큐베이션 후, 그리고 100℃에서 90분 후에도 잔류하였다. 더욱 놀라운 것은 EDTA, SDS, 트윈 20, 트윈 80 및 트리톤 X-100의 처리에도 항균 활성의 상실이 유발되지 않았다는 점이다. 스트레인 ST4SA는 낮은 pH 조건(pH 2.5)에서 생존하고, 6.5% NaCl의 존재 하에서 pH가 4.0부터 9.6까지 조정된 배지에서 성장하고, 1.0%(w/v)의 담즙염 및 췌장액에 대해 저항한다. 스트레인 ST4SA의 성장은 10℃(비록 느리지만), 및 45℃에서 발생하며, 최적 성장은 37℃에서 이루어진다. L(+)-유산만이 글루코스로부터 생산된다. 이 스트레인의 특징, 스트레인이 환경 스트레스에 노출된 때에도 펩티드 ST4SA의 신속하고 안정한 생산, 펩티드가 비-세포독성인 사실, 및 그것이 GRAS(일반적으로 안전한 것으로 간주되는, generally regarded as safe)로 미생물에 의해 생산된다는 사실은 상기 스트레인을 유용한 프로바이오틱으로 적용가능하게 한다.

또한, 상기 펩티드는 예컨대 중이감염에 대한 전형적인 치료제로서 액체 포뮬레이션(liquid formulation)의 항균제로서의 용도를 갖는다. 이 액체 포뮬레이션은 이어 드롭 어플리케이터(ear drop applicator)를 사용하여 귀에 적용될 수 있다. 상기 액체 포뮬레이션은 또한 음식에 대한 액체 보충제의 용도로서, 엔테로코커스 문드티아이의 프로바이오틱의 액상에 포함된다. 또한 상기 펩티드는 예컨대 굴 감염(sinus infections) 또는 굴염(sinusitis)을 치료하기 위해 비내 분무(nasal spray)되는 액상 또는 흡기상(aspirated form)의 항균제로서의 용도가 발견된다. 상기 펩티드는 또한 폴리머로 캡슐화된 항균제로서 사용된다. 이 폴리머는 예를 들어 피부 감염과 같은 감염에 대한 전형적인 처치를 위한 포뮬레이션으로서 사용되거나, 또는 예컨대 귀 그로밋(ear grommets)과 같은 임플란트에의 혼입이나, 상처 드레싱에의 혼입을 위해 사용될 수 있다. 상기 폴리머에서의 항균 펩티드의 캡슐화는 항균 펩티드의 느린 방출 및 미생물 감염에 대한 치료 기간의 연장을 유발한다. 펩티드는 또한 연고(ointment), 로션(lotion), 또는 크림 포뮬레이 션(cream formulations)으로 혼입되고 감염 치료에 사용되는 것에 의해 항균제로서의 용도가 발견된다. 또, 상기 펩티드는 예컨대 콘텍트 렌즈 세정액과 같은 액체 포뮬레이션으로 혼입되거나 콘택트 렌즈 자체로 혼입되는 것에 의해 항균제로서의 용도가 발견된다. 상기 펩티드는 살균 포장 공정에서 사용되는 플라스틱과 같은 포장 물질로 혼입되는 것에 의해 항균제로서의 용도가 발견된다. 본 발명의 다른 형태에서 상기 펩티드는 알약(tablet) 또는 캡슐 형상으로 넓은 스펙트럼을 갖는 엔테로코커스 문드티아이의 프로바이오틱의 일부로 사용될 수 있다. 또는 식용품 형태 예컨대, 사탕이나 츄잉검의 형태로 사용될 수도 있다.

<110> CIPLA MEDPRO RESEARCH AND DEVELOPMENT (PTY) LTD <120> PROBIOTIC STRAIN AND ANTIMICROBIAL PEPTIDE DERIVED THEREFROM <130> 10511 <160> 16 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 1 aacgagcgca accc 14 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 2 gacgggcggt gtgtac 16 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 3 tgagagaagg tttaagtttt gaagaa 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 4 tccactgaaa tccatgaatg a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 5 tgatggattt cagtggaagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 6 atctcttctc cgtttaatcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 7 gtcattgttg tggggattat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 8 tctagatacg tatcaagtcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> ENTEROCOCCUS MUNDTII ST4SA <400> 9 ttcctgatga 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Claims

서열번호 12;

항균 활성을 갖는 그의 단편;

항균 활성을 갖는 그의 뮤테인 및 유도체;

항균 활성을 갖는 그의 공유 결합 브리지 구조물; 및

상기 아미노산 시퀀스에 약 75% 이상의 상동성을 가지며, 항균 활성을 갖는 시퀀스를 포함하는 군으로부터 선택된 분리된 펩티드.
제1 항에 있어서,

상기 펩티드는 상기 분리된 펩티드에 분리된 펩티드에 약 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 분리된 펩티드.
제1 항에 있어서,

상기 펩티드는 상기 분리된 펩티드에 분리된 펩티드에 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 분리된 펩티드.
서열번호 11;

그의 상보체;

항균 활성을 갖는 펩티드를 생산할 수 있고 그의 발현을 수반하는 그의 단 편; 또는

엄격한 혼성화 조건 하에서 그에 혼성화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 분리된 뉴클레오티드.
미생물 호스트 세포의 형질 변환에 적합화된 재조합 플라스미드로서,

상기 플라스미드는 상기 제1 항의 항균 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스로 삽입되는 플라스미드 벡터를 포함하는 플라스미드.
재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환된 미생물 세포로서,

상기 플라스미드는 상기 제1 항의 항균 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스로 삽입되는 플라스미드 벡터를 포함하는 미생물 세포.
ATCC로 기탁되고, 기탁번호가 PTA-7278인 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA의 실질적으로 순수한 배양물로서,

상기 배양물은 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 비유기 물질원을 함유하는 영양 배지에서의 발효에 기초해 회수할 수 있는 양의 펩티드 ST4SA를 생산할 수 있는 배양물.
엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA를 상기 펩티드의 회수할 수 있는 양이 생산될 때까지 영양 배지에서 10℃ 내지 45℃의 미생물이 살수 있는 조 건(micro-arophilic condition) 하에서 배양하고, 상기 펩티드를 회수하는 것을 포함하는 제1 항에 따른 펩티드를 생산하는 방법.
제8 항에 있어서,

상기 배양은 약 37℃의 온도에서 이루어지는 방법.
제8 항 또는 제9 항에 있어서,

상기 영양 배지는 콘 스티프 리쿠어; 치즈 훼이 파우더; MRS 브로스; 효모 추출물; 및 몰라세스를 포함하는 군으로부터 하나 이상 선택되는 방법.
제10 항에 있어서,

상기 영양 배지는 10 내지 20g/l의 K₂HPO₄ 및/또는 15.0 내지 20.0g/l의 프럭토스를 함유하는 MRS 브로스인 방법.
동물 또는 인간의 감염 영역을 치료적으로 유효한 양의 제7 항에 따른 배양된 엔테로코커스 문드티아이 스트레인; 및/또는제1 항에 따른 항균 펩티드를 포함하는 물질 또는 조성물에 노출하는 단계를 포함하는 동물 또는 인간의 박테리아 감염을 치료하는 방법.
제12 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 ml 당 약 10⁶ 내지 10⁹ cfu(콜로니 형성 단위)의 농도로 포함되는 방법.
제13 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 ml 당 약 10⁸ cfu(콜로니 형성 단위)의 농도로 포함되는 방법.
제12 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 펩티드는 ml 당 약 100 000 AU 내지 300 000 AU의 농도로 포함되는 방법.
제15 항에 있어서, 상기 펩티드는 200 000 AU/ml의 농도로 포함되는 방법.
동물 또는 사람의 박테리아 감염을 치료하는 방법에 사용되는 약물의 제조에서의 제7 항에 따른 배양된 엔테로코커스 문드티아이 스트레인의 치료적으로 유효한 양의 용도.
제17 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 10⁶ 내지 10⁹cfu/ml의 농도로 투여되는 용도.
제18 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 10⁸ cfu/ml의 농도로 투여되는 용도.
동물 또는 사람의 박테리아 감염을 치료하는 방법에 사용되는 약물의 제조에서의 제1 항에 따른 항균 펩티드의 치료적으로 유효한 양의 용도.
제20 항에 있어서,

상기 펩티드는 100 000 AU/ml 내지 300　000 AU/ml의 농도로 투여되는 용도.
제20 항에 있어서,

상기 펩티드는 200 000 AU/ml의 농도로 투여되는 용도.
동물 또는 사람의 박테리아 감염을 치료하는 방법에 사용되는 물질 또는 조성물로서,

상기 물질 또는 조성물은 제7 항에 따른 배양된 엔테로코커스 문드티아이 스트레인을 포함하고,

상기 방법은 상기 물질 또는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 동물 또는 사 람에게 투여하는 것을 포함하는 물질 또는 조성물.
제23 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 ml 당 10⁶ 또는 10⁹ cfu의 농도로 투여되는 물질 또는 방법.
제24 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 10⁸cfu/ml의 농도로 투여되는 물질 또는 방법.
동물 또는 사람의 박테리아 감염을 치료하는 방법에 사용되는 물질 또는 조성물로서,

상기 물질 또는 조성물은 제1 항에 따른 항균 펩티드를 포함하고,

상기 방법은 상기 물질 또는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 동물 또는 사람에게 투여하는 것을 포함하는 물질 또는 조성물.
제26 항에 있어서,

상기 분리된 펩티드는 100 000 AU/ml 내지 300 000 AU/ml의 농도로 투여되는 물질 또는 조성물.
제27 항에 있어서,

상기 분리된 펩티드는 200 000의 농도로 투여되는 물질 또는 조성물.
제23 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 물질 또는 조성물은 액체 포뮬레이션, 연고 포뮬레이션, 로션 포뮬레이션, 크림 포뮬레이션, 겔 포뮬레이션, 액체 스프레이, 냉동건조된 파우더, 냉동건조된 스프레이, 입 세정(mouth wash) 또는 가글(gargle)의 형태인 물질 또는 조성물.
제23 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 박테리아 감염은 아시네토박터 바우마니아이(Acinetobacter baumanii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 이스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 클레브젤라 뉴모니애(Klebsiela pneumoniae), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aruginosa), 스타필로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus), 스트렙토코커스 카프리너스(Streptococcus caprinus), 스트렙토코커스(엔테로코커스) 페칼리스(Streptococcus (Enterococcus) faecalis), 또는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 중 하나 이상에 의해 유발된 감염인 물질 또는 조성물.
박테리아 종을 제1 항에 따른 항균 펩티드의 유효한 양에 노출하는 단계를 포함하는 박테리아 종의 성장 억제 방법.
제31 항에 있어서,

상기 박테리아 종은 100 000 내지 300 000 AU/ml의 농도에서 상기 항균 펩티드에 노출되는 방법.
제32 항에 있어서,

상기 박테리아 종은 200 000 AU/ml의 농도에서 상기 항균 펩티드에 노출되는 방법.
제18 항에 있어서,

상기 박테리아 종이 아시네토박터 바우마니아이(Acinetobacter baumanii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 티로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 이스케리시아 콜라이(Escherichia coli, 대장균), 클레브젤라 뉴모니애(Klebsiela pneumoniae), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aruginosa), 스타필로코커스 오리우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 카노수스(Staphylococcus carnosus), 스트렙토코커스 카프리너스(Streptococcus caprinus), 스트렙토코커스(엔테로코커스) 페칼리스(Streptococcus (Enterococcus) faecalis), 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
액체, 연고, 로션, 또는 크림 포뮬레이션, 액체 스프레이, 냉동건조된 스프레이, 입 세정(mouth wash) 또는 가글(gargle)의 형태로의 항균제 제조에서의 제1 항에 따른 분리된 펩티드의 용도.
굴 감염(sinus infections), 굴염(sinusitis), 비염(rhinitis), 편도선염(tonsillitis) 또는 인후 감염(throat infections)를 치료하는 항균 스프레이의 제조에서의 제1 항에 따른 분리된 펩티드의 용도.
그 내에 제1 항에 따른 분리된 단백질의 항균 양이 혼입된 폴리머.
제37 항에 있어서,

그 내에 100 000 AU/ml 내지 300 000 AU/ml의 농도로 제1 항의 분리된 펩티드가 포함된 폴리머.
제38 항에 있어서,

그 내에 200 000 AU/ml의 농도로 제1 항의 분리된 펩티드가 포함된 폴리머.
제37 항 내지 제39 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 폴리머는 포장 물질(packaging materials), 임플란트(implants), 의약 장치(medical devices), 귀 그로밋(ear grommets), 카테터(catheters), 오스토미 튜브 및 파우치(ostomy tubes and pouches), 스텐트(stents), 봉합물질(suture material), 위생 산물(hygiene products), 콘택트 렌즈(contact lenses), 콘택트 렌즈 세정액(contact lens rinsing solutions), 및 상처 드레싱(wound dressings)으로 혼입되는 폴리머.
제7 항에 따른 엔테로코커스 문드티아이 스트레인 ST4SA의 생물학적으로 순수한 배양물을 치료적으로 유효한 농도로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
제41 항에 있어서,

상기 박테리아 스트레인은 프로바이오틱 조성물의 ml 당 약 10⁵ 내지 10⁹ 생육세포(cfu)의 농도로 포함되어 있는 프로바이오틱 조성물.
제42 항에 있어서,

상기 박테리아 스트레인은 프로바이오틱 조성물의 ml 당 약 2 x 10⁸ 생육세포(cfu)의 농도로 포함되어 있는 프로바이오틱 조성물.
제41 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조성물은 액체(liquid), 알약(tablet), 캡슐(capsule), 사탕(sweet), 츄잉검(chewing gum), 또는 다른 식용품(edible foodstuff)의 형태인 프로바이오틱 조성물.
동물 또는 인간에게서 병원 박테리아 또는 바이러스의 레벨을 감소시키는 방법으로서,

동물 또는 인간에게 제41 항 내지 제44 항 중 어느 한 항에 따른 프로바이오틱 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제45 항에 있어서,

상기 프로바이오틱 조성물은 동물 또는 인간에게 10³ 내지 10⁶ cfu/ml 범위의 최종 농도로 투여되는 방법.
제46 항에 있어서,

상기 프로바이오틱 조성물은 동물 또는 인간에게 10⁵ 내지 10⁶ cfu/ml 범위의 최종 농도로 투여되는 방법.
제47 항에 있어서,

상기 프로바이오틱 조성물은 동물 또는 인간에게 약 3 x 10⁵의 최종 농도로 투여되는 방법.
동물 또는 인간에게서 병원성 박테리아 또는 바이러스의 레벨을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 프로바이오틱 제조에서의 제7 항에 따른 스트레인 엔테로코커스 문드티아이의 생물학적으로 순수한 배양물의 용도.
제49 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 10⁶ 내지 10⁹ cfu/ml의 농도로 투여되는 용도.
제50 항에 있어서,

상기 배양된 스트레인은 10⁸ cfu/ml의 농도로 투여되는 용도.
서열번호 1 내지 서열번호 10을 포함하는 그룹으로부터 선택된 프라이머.
서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 프라이머 쌍.
엔테로코커스 문드티아이의 동정에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍의 용도.
서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 프라이머 쌍.
서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 프라이머 쌍.
서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 프라이머 쌍.
서열번호 9 및 서열번호 10을 포함하는 프라이머 쌍.
서열번호 14;

그의 단편;

그의 뮤테인 및 유도체; 또는

상기 아미노산 시퀀스에 90% 이상의 상동성을, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 상동성을 가지며, 항균 활성을 갖는 시퀀스를 포함하는, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이로부터 분리된 수송 펩티드.
서열번호 13;

그의 상보체;

그의 단편; 또는

엄격한 혼성화 조건 하에서 그에 혼성화되는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이의 ST4SA 수송 펩티드를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 시퀀스.
서열번호 16;

그의 단편;

그의 뮤테인 및 유도체; 또는

상기 아미노산 시퀀스에 90% 이상의 상동성을, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 상동성을 가지며, 항균 활성을 갖는 시퀀스를 포함하는, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이로부터 분리된 면역 펩티드.
서열번호 15;

그의 상보체;

그의 단편; 또는

엄격한 혼성화 조건 하에서 그에 혼성화되는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는, 박테리움 엔테로코커스 문드티아이의 ST4SA 면역 펩티드를 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 시퀀스.