MX2007011503A - Bacteriocinas y cepas bacterianas novedosas. - Google Patents

Abstract

Las bacteriocinas novedosas y/o las cepas novedosas productoras de acido lactico se utilizan para reducir al menos los niveles de colonizacion por al menos una bacteria objetivo en animales, en especial aves de corral.

Description

BACTERIOCINAS Y CEPAS BACTERIANAS NOVEDOSAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención Esta invención se refiere al control de enfermedades en animales, en especial aves de corral, a través del uso de bacterias novedosas productoras de ácido láctico que producen bacteriocina y/o bacteriocinas novedosas producidas a través de otras especies. También se refiere a bacteriocinas novedosas, secuencias de aminoácido de las bacteriocinas novedosas, y a las cepas de las bacterias productoras de ácido láctico que producen las bacteriocinas novedosas. Además, la invención se refiere a composiciones terapéuticas que contienen las bacteriocinas novedosas y/o las cepas de bacterias productoras de ácido láctico que las producen y a los usos de las composiciones terapéuticas.

Descripción de la Técnica Relacionada El consumo de productos de aves de corral inapropiadamente preparados ha dado como resultado enfermedades intestinales en seres humanos. Se ha reconocido enormemente que Salmonella spp. es un agente causante de tales enfermedades y más recientemente, Campylobacter spp., en especial Campylobacter jejuni, también se ha visto implicada. Ambos microorganismos pueden colonizar los tractos gastrointestinales de aves de corral sin ningún efecto dañino en las aves, y aunque algunas aves colonizadas pueden ser detectadas, los portadores asintomáticos pueden diseminar libremente los microorganismos durante la producción y procesamiento, dando como resultado una contaminación adicional tanto de aves vivas como de muertas. Las aves de corral sirven como el depósito primario para Salmonella y Campylobacter en el suministro alimenticio (Jones et al., Journal of Food Protection, Volume 54, No. 7,502-507, July, 1991). La prevención de colonización en aves de corral vivas durante la producción de crecimiento puede disminuir el problema de contaminación de aves de corral. Un número de factores contribuyen a la colonización y presencia continua de bacterias dentro del tracto digestivo de los animales. Estos factores han sido extensamente revisados por Savage (Progress in Food and Nutrition Science, Volume 7, 65-74, 1983). Incluidos entre estos factores se encuentran: (1) Acidez gástrica (Gilliland, Journal of Food Production, Volume 42, 164-167, 1979); (2) sales biliares (Sharpe & Mattick, Milchwissenschaft, Volume 12, 348-349, 1967; Floch et al., American Journal of Clinical Nutrition, Volume 25, 1418-1426, 1972; Lewis & Gorbach, Archives of Interna! Medicine, Volume 130, 545-549, 1972; Gilliland and Speck, Journal of Food Protection, Volume 40, 820- 823, 1977); Hugdahl et al., Infection and Immunity, Volume 56, 1560-1566, 1988); (3) peristalsis; (4) enzimas digestivas (Marmur, Journal of Molecular Biology, Volume 3, 208-218, 1961); (5) respuesta inmune; y (6) microorganismos indígenos y los compuestos antibacterianos que producen. Los primeros cuatro factores dependen del fenotipo de huésped y no pueden ser prácticamente variables controlables La respuesta inmune en el tracto gastrointestinal (Gl) no es fácilmente modulada Los factores que involucran microorganismos indígenos y sus metabohtos dependen de la flora normal del tracto gastrointestinal Un aspecto potencial para controlar la colonización de Campylobacter y/o Salmonella es a través del uso de exclusión competitiva (CE) Nurmí y Rantala (Nature, Volume 241, 210-211, 1973) demostraron un control efectivo de infección por Salmonella dando cebadura de bacterias de materiales intestinales de aves de corral saludables a polluelos jóvenes cuya microflora no ha sido aún establecida, contra la colonización de Salmonella La administración de preparaciones de CE no definidas a polluelos aceleran la maduración de la flora intestinal en aves recientemente empollados y proporciona un sustituto para el proceso natural de transmisión de microflora de la gallina adulta a su progenie Los resultados de investigaciones en laboratorio y de campo proporcionan evidencia de beneficios en el control de Campylobacter administrando microflora normal a pollos, frecuencia reducida de bandadas infectadas por Campylobacter (Mulder and Bolder, IN Colonization Control of human bacterial enteropathogens in poultry, L C Blankenship (ed ), Academic Press, San Diego, Cahf , 359-363, 1991) y niveles reducidos de Campylobacter jejum (C jejum) en las heces fecales de aves colonizadas, han sido reportados (Stern, Poultry Science, Volume 73, 402-407, 1994) Schoeni and Wong (Appl Environ Microbiol, Volume 60, 1191- 1197,1994) reportaron una reducción importante en la colonización de pollos tiernos por C. jejuni a través de la aplicación de suplementos de carbohidratos junto con tres antagonistas identificados: Citrobacter diversus 22, Klebsiella pneumoniae 23, y Escherichia coli 25. También existe evidencia de una reducción importante de C. jejuni en muestras intestinales de pollos tiernos infectados después de tratamiento con cultivos de Lactobacillus acidophilus y Streptococcus faecium aislados de aves de corral (Morishita et al., Avian Diseases, Volume 41, 850-855, 1997). Snoeyenbos et al. (Patente de E.U.A. No. 4,335,107, Junio de 1982) desarrollaron una técnica de microflora de exclusión competitiva (CE) para prevenir colonización de Salmonella liofilizando heces fecales y cultivando esta preparación anaerobicamente. Mikola et al. (Patente de E.U.A. No. 4,657,762, Abril de 1987) utilizaron contenidos fecales y cecales intestinales como una fuente de microflora CE para prevenir la colonización por Salmonella. Stern et al. (Patente de E.U.A. No. 5,451,400, Septiembre de 1995 y Patente de E.U.A. No. 6,241,335, Abril del 2001) describen una composición de CE de mucosa para la protección de aves de corral y Ganado contra colonizaciones por Salmonella y. Campylobacter en donde la capa de mucina del cecal (intestino ciego) prelavado es raspada y las raspaduras, mantenidas en un ambiente libre de oxígeno, son cultivadas anaerobicamente. Nisbet et al. (Patente de E.U.A. No. 5,478,557, Diciembre de 1996) describen un probiótico definido que puede ser obtenido de una variedad de animales domésticos, el cual se obtiene a través de un cultivo continuo de un cultivo intermitente o por lote producido directamente de heces fecales, contenidos cecales y/o del intestino grueso del animal adulto objetivo. Los microorganismos producen una variedad de compuestos que demuestran propiedades anti-bacterianas. Un grupo de estos compuestos, las bacteriocinas, consisten de proteínas bactericidas con un mecanismo de acción similar a antibióticos de ionóforo. Las bacteriocinas por lo regular son activas contra especies que están estrechamente relacionadas con el productor. Su ocurrencia bien diseminada en especies bacterianas aisladas de comunidades microbianas complejas tales como el tracto intestinal, las superficies orales u otras superficies epiteliales, sugiere que las bacteriocinas pueden tener un papel regulador en términos de dinámica de población dentro de ecosistemas bacterianos. Las bacteriocinas son definidas como compuestos producidos por bacterias que tienen una porción de proteína biológicamente activa y acción bactericida (Tagg et al., Bacteriológica! Reviews, Volume 40, 722-256, 1976). Otras características pueden incluir: (1) un estrecho espectro inhibidor de actividad centrada alrededor de especies estrechamente relacionadas; (2) unión a receptores de célula específicos; y (3) determinantes genéticos llevados por plásmido de producción de bacteriocina y de inmunidad de bacteriocina de célula huésped. Las sustancias antagonísticas incompletamente definidas han sido denominadas como "sustancias de tipo bacteriocina". Algunas bacteriocinas efectivas contra bacterias Gram-positivas, en contraste a bacterias Gram-negativas, tienen un espectro más amplio de actividad. Se ha sugerido que el término bacteriocina, cuando se utilice para describir agentes inhibidores producidos por bacterias Gram-positivas, debe satisfacer el mínimo criterio de (1) ser un péptido y (2) poseer actividad bactericida (Tagg et al., supra). Las bacterias de ácido láctico se encuentran entre los microorganismos prebióticos más importantes. Son organismos Gram-positivos, sin esporas, negativos a catalasa, carentes de citocromas. Son anaeróbicos pero so aerotolerantes, fastidiosos, tolerantes a ácido, y estrictamente fermentadores con ácido láctico como el producto final principal de fermentación del azúcar. Las bacterias productoras de ácido láctico incluyen Lactobacillus species, Bifidobacterium species, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, etc. Estas especies son de interés particular en términos de ocurrencia bien diseminada de bacteriocinas dentro del grupo y también se encuentran en amplio uso a través de las industrias de lácteos fermentados, de procesamiento de alimentos y carne. Su parte en la conservación y característica de sabor de alimentos ha estado bien documentado. La mayoría de las bacteriocinas producidas por este grupo son activas solamente contra otras bacterias de ácido láctico, pero varias exhiben actividad anti-bacteríana hacia bacterias Gram-posítivas filogenéticamente distantes y, bajo ciertas condiciones, bacterias Gram-negativas. Los lactobacilos han sido extensamente estudiados para la producción de antagonistas. Estos incluyen las bacteriocinas bien caracterizadas (DeKIerk, 1967; Upreti and Hinsdill 1975; Barefoot and Klaenhammer 1983; Joerger and Klaenhammer 1986); sustancias de tipo bacteriocina potenciales (Vincent et al., 1959), y otros antagonistas no necesariamente relacionados con bacteriocinas (Vakil and Shahni 1965; Hamdan and Mikolajcik 1974; Mikolajcik and Hamdan 1975; and Shahni et al., 1976). Klaenhammer (1993) ha clasificado las bacteriocinas de bacterias de ácido láctico conocidas hasta la fecha en cuatro grupos principales: Clase I - Lantibióticos que son pequeños péptidos de < 5kDa que contienen los aminoácidos inusuales, lantionina y ß-metil lantionina. Estos son de interés particular ya que tienen espectros muy amplios de actividad con relación a otras bacteriocinas. Los ejemplos incluyen Nisina, Nisina Z, carnocina U 149, lacticina 481, y lactocina 5. Clase II - Péptidos que contienen no-lantionina pequeña: un grupo heterogéneo de péptidos pequeños de <10kDa. Esto grupo incluye péptidos activos contra Listeria spp. Clase lll - Proteínas lábiles al calor >30kDa. Un ejemplo es Helveticina. Clase IV - Bacteriocinas-proteínas de complejo conteniendo porciones adicionales tales como lípidos y carbohidratos.

La presente invención proporciona composiciones novedosas que contienen por lo menos una cepa novedosa de una cepa bacteriana productora de ácido láctico y/o bactepocinas novedosas producidas por al menos una cepa novedosa, un método para utilizar la cepa o bactepocina, las cepas novedosas, las secuencias de aminoácido para las bactepocinas novedosas, y métodos de uso, todos estos son diferentes de las cepas, bactepocinas, y métodos de uso de la técnica relacionada BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar cepas novedosas de Lactobacillus y Enterococcus que produzcan bactepocinas novedosas Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una cepa novedosa de Lactobacillus salivanus PVD32 teniendo las características de identificación de NRRL B-30514 Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una Lactobacillus acidophilus novedosa LWP320 que tenga las características de identificación de NRRL B-30510 Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una cepa Enterococcus faecalis novedosa LWP21 teniendo las características de identificación de NRRL B-30645 Un objeto más de la presente invención es proporcionar una cepa novedosa de Enterococcus durans LWP26 teniendo las características de identificación de NRRL B-30511 Un objeto más de la presente invención es proporcionar bactepocinas novedosas producidas por cepas novedosas de Lactobacillus y Enterococcus Otro objeto de la presente invención es proporcionar una bactepocina novedosa OR7 teniendo una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 1 Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una bactepocina novedosa LWP320 teniendo una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 2 Un objeto más de la presente invención es proporcionar una bactepocina novedosa LWP21 teniendo una secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO 3 Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una bactepocina novedosa LWP26 teniendo una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 4 Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización de al menos una bacteria objetivo en animales, administrando al animal una composición terapéutica incluyendo por lo menos una cepa novedosa de Lactobacillus o Enterococcus que produce una bactepocina novedosa, por lo menos una bactepocma novedosa producida por una cepa novedosa de Lactobacillus o Enterococcus, o una combinación de las cepas novedosas y/o bactepocmas novedosas Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo en animales administrando al animal una composición terapéutica que incluye una cepa novedosa de Lactobacillus teniendo características de NRRL Depósito No.

B-30514 y B-30510; Enterococcus teniendo las características de identificación de NRRL B-30511 y NRRL B-30645; y mezclas de los mismos. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización de al menos una bacteria objetivo en animales administrando al animal una composición terapéutica incluyendo por lo menos una cepa novedosa con las características de identificación de NRRL B-30510, NRRL B-30511, NRRL 30514, NRRL B-30645, y mezclas de los mismos; por lo menos una bacteriocina novedosa que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 1, SEC ID NO 2, SEC ID NO 3, SEC ID NO 4, y mezclas de las mismas; o una combinación de cepas novedosas y bacteriocinas novedosas. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo en animales, administrando al animal una composición terapéutica incluyendo una bacteriocina novedosa que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 1. Un objeto más de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización por lo menos una bacteria objetivo en animales, administrando al animal una composición terapéutica que incluye una bacteriocina novedosa teniendo una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 2. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo en animales, administrando al animal una composición terapéutica que incluye una bacteriocina novedosa que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 3. Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo en animales, administrando al animal una composición terapéutica que incluye una bacteriocina novedosa teniendo una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO 4. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo en un animal, administrando al animal una composición terapéutica que comprende una bacteriocina producida por una cepa novedosa de una bacteria Lactobacillus que tiene las características de identificación de NRRL B-30510 o NRRL B-30514; una cepa novedosa de Enterococcus que tiene las características de identificación de NRRL B-30511 o NRRL B-30645, y mezclas de las mismas. Otros objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción.

Depósito de los Microorganismos Lactobacillus salivarius, designado como NRRL B-30514 (Cepa PVD32), Lactobacillus acidophilus designada NRRL B-30510 (Cepa LWP320; Enterococcus durans designada NRRL B-30511 (Cepa LWP26) se depositaron el 3 de agosto del 2001 y Enterococcus faecalis designada NRRL B-30645 (Cepa LWP21), fue depositada el 1 de abril del 2003. Todas las cepas anteriores han sido depositadas de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest, con la U.S. D.A. Agricultural Research Service Patent Culture Collection (National Center for Agricultural Utilization Research, 1815 N. University Street, Peoría, Illinois 61604).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una fotografía que muestra la detección directa de OR7 después de SDS-PAGE. El gel fue cubierto con Campylobacter jejuni para determinar que banda(s) corresponde a la actividad antimicrobiana y el peso molecular de la banda con actividad. Carril 1 - Escala de MMW de Marcadores de Peso Molecular 6,500-97,000 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH): 97,000, 66,000, 43,000, 30,000, 21,000, 14,400, y 6,500 Da. La banda en el carril 2 de lactocina pura OR7, la banda en el carril 3, lactocina 3-CAP OR7 después de absorción por C. jejuni, que corresponde a la actividad antimicrobiana, la zona de inhibición de crecimiento (ver flecha), tiene una masa de aproximadamente 6,000 Da, la banda en el carril 4-lactocina CAP OR7. Otras bandas no mostraron actividad antimicrobiana. La Figura 2 es una fotografía que muestra la detección directa de bacteriocina LWP320 y LWP26 después de SDS-PAGE. El gel fue cubierto con Campylobacter jejuni para determinar que banda(s) corresponde a la actividad antimicrobiana y el peso molecular asociado con la actividad. Carril 3 - Escala de LMW de Marcadores de Peso Molecular 3,000-43,000 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH): 3,000, 11,400, 18,000, 21,000, y 43,000 Da. La banda en el carril 1 -bacteriocina LWP320, la banda en el carril 2-bacteriocin LWP26, que corresponde a la actividad antimicrobiana, la zona de inhibición de crecimiento, tuvieron una masa de aproximadamente 6,000 y aproximadamente 3,000 Da, respectivamente. Otras bandas no mostraron actividad antimicrobiana. La Figura 3 es una fotografía que muestra la detección directa de enterocina LWP21 después de SDS-PAGE. El gel se cubrió con Campylobacter jejuni para determinar que banda(s) corresponde a la actividad antimicrobiana y peso molecular de la banda activa. Carril 4 - Escala de LMW de Marcadores de Peso Molecular 1060-43,000 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH): 1,060, 2,500, 3,500, 14,400, 20,000, 30,000, y 43,000 Da. La banda en el carril 1 (enterocina LWP21 después de SP-Sepharose), y la banda en el carril 2 (pico 2 después de fenil-sefarosa CL-4B) que corresponde a la actividad antimicrobiana, la zona de inhibición de crecimiento (ver flecha), tuvieron una masa de aproximadamente 6,000 Da. La banda en el carril 3 (pico después de fenil-sefarosa CL-4B), tuvo una masa de aproximadamente 3,000 Da. Otras bandas no mostraron actividad antimicrobiana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La importancia de infecciones entéricas en seres humanos ha sido enormemente bien reconocida y la relación de contaminación de aves de corral e infección en seres humanos está bien documentada. La habilidad de disminuir este peligro de salud a través de intervenciones en plantas de procesamiento de aves de corral también es bien conocida. Durante la producción y procesamiento de pollos tiernos, los materiales fecales que contienen patógenos son transferidos en la carne y persisten en las cocinas de procesamiento de alimentos. Los metabolitos de organismos de competencia pueden contribuir al control de patógenos tales como Campylobacter jejuni y Salmonella. Las cepas antagonísticas novedosas de la presente invención fueron aisladas de superficies de mucosa de intestino ciego y grano de pollos tiernos. Los componentes nativos del antagonista caracterizado son péptidos de bajo peso molecular, bacteriocinas, las cuales tienen un amplio espectro de actividad antagonística. La presente invención proporciona cepas novedosas de Lactobacillus y Enterococcus strains, bacteriocinas novedosas, secuencias de aminoácido de dichas bacteriocinas, composiciones terapéuticas que contienen las bacteriocínas novedosas y/o las cepas que las producen, y métodos para utilizar las composiciones terapéuticas novedosas. El aislado Lactobacillus acidophilus LWP320 es un bastoncillo pleomórfico sin movimiento, Gram-positivo, negativo a catalasa, anaeróbico facultativo (microaerofilo), que tiene crecimiento retrasado en agar MRS a aproximadamente 37°C. Cuando se desarrolla agar MRS, el aislado produce colonias semi-opacas, blanquecinas que tienen un diámetro de aproximadamente 0.5mm a aproximadamente 0.8 mm después de aproximadamente 24 horas de incubación microaerofílíca. En el caldo MRS, la cepa LWP320 crece solamente en el fondo de un tubo de cultivo. La cepa Lactobacillus salivarius PVD32 es un bastoncillo pleomórfico, sin movimiento, negativo a catalasa, Gram-positivo, anaeróbico facultativo (microaerofílo). Las colonias producen colonias convexas lisas, con forma de circular a regular con márgenes agudos que tienen un diámetro de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 3 mm después de la incubación del microaerofílo durante aproximadamente 18-24 horas a aproximadamente 37°C. Las cepas producen ácido láctico y H2O2. La cepa Enterococcus faecalis LWP21 es un coco, negativo a catalasa, Gram-positivo, anaeróbico facultativo (microaerofílo). El crecimiento se retrasa en MRS a 37°C. Cuando se cultiva en agar MRS, la cepa produce colonias semi-opacas, blanquecinas que tienen un diámetro de aproximadamente 0.2 mm después de la incubación de microaerofílo durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 37°C. Después de aproximadamente 48 horas, de incubación del microaerofilo a aproximadamente 37°C, las colonias presentan un diámetro de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 1.2 mm. La cepa se desarrolla en caldo MRS solamente en un volumen de aproximadamente 2/3 en el fondo del tubo de cultivo. La cepa Enterococcus durans LWP26 es un coco negativo a catalasa, Gram-positivo, anaeróbico facultativo (microaerofilo) con crecimiento retrasado en agar MRS a aproximadamente 37°C. Cuando crece en agar MRS, la cepa produce colonias semiopacas, blanquecinas que son opacas después de aproximadamente 24 horas de incubación microaerofílica a aproximadamente 37°C. Después de aproximadamente 48 horas de incubación microaerofílica a aproximadamente 37°C, los tamaños de la colonia tienen un promedio de aproximadamente O.dmm a aproximadamente 1.0 mm. En caldo MRS, la cepa crece en todos los volúmenes del tubo. La clasificación o tamización de especies aisladas de Lactobacillus y Enterococcus para la producción de actividad de bacteriocina se realiza en agar nutriente en cultivos sembrados con diferentes bacterias objetivo de interés. Otras cepas de prueba se cultivaron bajo condiciones aeróbicas a aproximadamente 37°C durante alrededor de 14-24 horas. Yersinia enterocolitica y Y. pseudotuberculosis se cultivaron a aproximadamente 28°C bajo condiciones aeróbicas durante aproximadamente 14-24 horas. Las pruebas para actividad contra Campylobacter jejuní se realizaron en agar de Campylobacter sembrado con C jejum conteniendo aproximadamente 5% de sangre lisada El uso de sangre está también dentro de la experiencia de la técnica e incluye, por ejemplo, de oveja, caballo, etc Se realizaron pruebas para actividad contra Campylobacter jejum bajo condiciones microaeróbicas de aproximadamente 5% O2, aproximadamente 10% CO2, y aproximadamente 85% N2 durante aproximadamente 24-48 horas a aproximadamente 42°C Aproximadamente 0 2 ml de las bacterias antagonísticas suspendidas en salina normal se colocaron en placas de agar de Lactobacillus y se incubaron durante aproximadamente 24 horas Se cortaron bloques de agar de aproximadamente 0 5 cm3 y se transfirieron en agar de brucella o Campylobacter suplementado con sangre hsada, aproximadamente 10 microgramos/ml de pfampicina, aproximadamente 2 4 U/ml de polimixina, y se sembró con aproximadamente 107 células de Campylobacter jejuní Las placas se incubaron a aproximadamente 42°C durante alrededor de 24-48 horas bajo condiciones microaeróbicas La actividad se evaluó midiendo zonas de inhibición de crecimiento Los aislados de Lactobacillus encontrados como antagonísticos se evaluaron para producción de bactepocina Se prepararon preparaciones antimicrobianas crudas (CAPs) a través de precipitación de sulfato de amonio solamente de cultivo de cepas antagonísticas desarrolladas en un medio de privación K2HPO4 6.0 gramos KH2PO4 0.2 gramos (NH4)2SO4 0.2 gramos MgSO4 0.1 gramos glucosa 9.0 gramos histidina 0.08 gramos arginina 0.02 gramos Agregar H2O destilada a 1000 ml, pH de aproximadamente 7.2 a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 18 horas bajo condiciones aeróbicas. Los fluidos del cultivo después se centrifugaron a aproximadamente 12,000 X g durante aproximadamente 10 minutos. Los sobrenadantes resultantes después se sometieron a un pH de aproximadamente 6.2 agregando 1N NaOH y aproximadamente 130 U/ml de catalasa para remover ácidos orgánicos y peróxido de hidrógeno, y factores de inhibición. Se aislaron péptidos antagonísticos del sobrenadante a través de una combinación de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de desalación y filtración de gel para producir una preparación antimicrobiana cruda (CAP). Las muestras de CAP se filtraron a través de filtros 0.22 µ (Millipore, Bedford, MA, USA). Los aislados de Enterococcus encontrados como antagonísticos se evaluaron para la producción de bacteriocina. Se hicieron preparaciones antimicrobianas crudas (CAPs) a través de precipitación de sulfato de amonio solamente a partir de cultivos de cepas antagonísticas desarrolladas en un caldo de MRS: Caldo MRS 15.0 gramos Lactosa 0.05 gramos Se agregó H2O destilada a aproximadamente 1000 ml, pH 7.2 a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 18 horas bajo condiciones aeróbicas. Los fluidos del cultivo después se centrifugaron a aproximadamente 12,000 X g durante alrededor de 10 minutos. Los sobrenadantes resultantes después se sometieron a un pH de aproximadamente 6.2 agregando 1N NaOH y aproximadamente 130 U/ml de catalasa para remover ácidos orgánicos y peróxido de hidrógeno, y factores de inhibición. Se aislaron péptidos antagonísticos del sobrenadante a través de una combinación de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de desalación y filtración de gel para producir una preparación antimicrobiana cruda (CAP). Las muestras de CAP se filtraron a través de filtros 0.22 µ (Millipore, Bedford, MA, USA). Los pesos moleculares de todos los péptidos se determinaron a través de electroforesis SDS-PAGE, se determinaron pls de los péptidos a través de enfoque isoeléctrico. Se determinaron secuencias de aminoácido a través de degradación Edman utilizando, por ejemplo, un secuenciador 491 cLC Automatic Sequencer (Applied Biosystems, Inc.). Para los propósitos de la presente invención, el término "péptido" representa un compuesto de por lo menos dos o más aminoácidos o análogos de aminoácido. Los aminoácidos o análogos de aminoácido pueden estar enlazados a través de enlaces peptídicos. En otra modalidad, los aminoácidos pueden estar enlazados a través de otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc.

Los péptidos pueden estar en cualquier configuración estructural incluyendo configuraciones lineales, ramificadas o cíclicas. Como se utiliza aquí, el término "aminoácidos" se refiere a aminoácidos ya sea naturales o sintéticos, incluyendo isómeros ópticos tanto D como L, y análogos de aminoácido. Los derivados y análogos de péptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácido del péptido que incluye secuencias alteradas en donde los residuos de aminoácido funcionalmente equivalentes son sustituidos por residuos dentro de la secuencia dando como resultado una sustitución de aminoácido conservadora. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoácido de una polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden ser seleccionados de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano, y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Dichas alteraciones no se espera que afecten significativamente el peso molecular aparente según determinado por electroforesis de gel de poliacrilamida o punto isoeléctrico. También se pueden introducir sustituciones de aminoácido no conservadoras para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir Cys a un sitio potencial para puentes de disulfuro con otro Cys. Se puede introducir Pro debido a su estructura particularmente plana. Los péptidos de la presente invención pueden ser químicamente sintetizados. Se pueden preparar péptidos sintéticos utilizando las técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida, o técnicas de condensación de péptido, o cualquier combinación de las mismas, y pueden incluir aminoácidos naturales y/o sintéticos. Los aminoácidos utilizados para síntesis de péptido pueden ser resina de aminoácidos Boc (N"-t-butiloxicarbonil Na-amino protegido) con los protocolos estándares de desprotección, neutralización, acoplamiento y lavado del procedimiento de fase sólida original de Merrifield (J. Am. Chem. Soc, Volume 85, 2149-2154, 1963), o el aminoácidos de base lábil 9-fluorenilmetoxicarbonilo Nu-amino protegido (Fmoc) (Carpino and Han, J. Org. Chem., Volume 37, 3403-3409, 1972). Además, el método de la presente invención puede ser utilizado con otros grupos N°-protectores que son similares a aquellos con experiencia en la técnica. La síntesis de péptido de fase sólida se puede lograr a través de técnicas dentro de la experiencia ordinaria en el campo. (Ver por ejemplo Stewart and Young, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, 111., 1984; Fields and Noble, Int. J. Pept. Protein Res., Volume 35, 161-214, 1990), o utilizando sintetizadores automáticos. De acuerdo con la presente invención, los péptidos y/o las varias cepas bacterianas novedosas pueden ser administradas en un vehículo terapéuticamente aceptable, ya sea tópica, parenteral, transmucosalmente, tal como por ejemplo, oral, nasal, rectal, o transdérmicamente. Los péptidos de la presente invención pueden ser modificados si es necesario para incrementar la habilidad del péptido para cruzar membranas celulares tal como incrementando la naturaleza hidrofóbica del péptido, introduciendo el péptido como un conjugado a un vehículo, tal como un ligando a un receptor específico, etc. La presente invención también proporciona conjugar una molécula objetivo a un péptido de la invención. Las moléculas objetivo para los propósitos de la presente invención representan una molécula que cuando se administra in vivo, se localiza en una ubicación deseada o ubicaciones. En varias modalidades de la presente invención, la molécula objetivo puede ser un péptido o proteína, anticuerpo, lectina, carbohidrato, o esteroide. La molécula objetivo puede ser un ligando peptídico de un receptor sobre la célula objetivo o un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal.

Para facilitar el entrelazamiento, el anticuerpo puede, ser reducido a dos heterodímeros de cadena pesada ligera, o el fragmento F(ab')2 puede ser reducido y entrelazado al péptido a través del sulfidrilo reducido. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar composiciones terapéuticas. Las composiciones pueden ser para administración oral, nasal, pulmonar, inyección, etc. Las composiciones terapéuticas incluyen cantidades efectivas de al menos una bacteriocina de la presente invención y sus derivados y/o al menos una cepa novedosa para al menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo junto con diluyentes, conservadores, solubilizantes, emulsificantes, auxiliares, y/o vehículos aceptables. Los diluyentes pueden incluir reguladores de pH tales como Tris-HCl, acetato, fosfato, por ejemplo; los aditivos pueden incluir detergentes y agentes de solubilización tales como Tween 80, Polisorbato 80, etc., por ejemplo; los antioxidantes incluyen, por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, etc.; los conservadores pueden incluir, por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, etc.; y sustancias proporcionadoras de volumen tales como lactosa, manitol, etc. La composición terapéutica de la presente invención puede ser incorporada en preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como polivinilpirrolidona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. La encapsulación liposómica incluye encapsulación a través de varios polímeros. Una amplia variedad de vehículos poliméricos se puede utilizar para contener y/o suministrar uno o más de los agentes terapéuticos discutidos anteriormente, incluyendo, por ejemplo, composiciones tanto biodegradables como no biodegradables. Ejemplos representativos de composiciones biodegradables incluyen albúmina, colágeno, gelatina, ácido hialurónico, almidón, celulosa (metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, acetato ftalato de celulosa, acetato succinato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), caseína, dextranos, polisacáridos, fibrinogeno, po I i (D, L lactida), poli (D, L-lactida-co-glicolida), poli (g I icol ida) , poli(hidroxibutirato), poli (alquilcarbonato) y poli (ortoésteres), poliésteres, poli (ácido hidroxivalérico), polidioxanona, tereftalato de polietileno, poli (ácido málico), poli(ácido tartrónico), polianhídridos, polifosfacenos, poli(aminoácidos) y sus copolímeros (ver en general, lllum, L., Davids, S. S. (eds.) "Polimers in Controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Reléase 17:1-22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59:173-196, 1990; Holland et al., J. Controlled Reléase 4:155-0180, 1986). Ejemplos representativos de polímeros no degradables incluyen copolímeros de poli(eti leño- acetato de vinilo) ("EVA"), hule de silicón, polímeros acrílicos (ácido poliacrílico, ácido polimetacríMco, polimetilmetacrilato, polialquilcinoacrilato), polietileno, polipropileno, poliamidas (nylon 6,6), poliuretano, poli(éster-uretanos), poli(éter uretanos), poli(éster-urea), poliéteres (pol ?(óx?do de etileno), pol?(óx?do de propileno), Pluronics y pol?(tetramet?len glicol)) , hules de silicona y polímeros de vi n i lo tales como polivinilpirrolidona, pol?(alcohol vinihco), pol?(acetato-ftalato de vinilo) También se pueden preparar polímeros que son ya sea amónicos (por ejemplo, alginato, carragenina, carboximetil celulosa y pol?(ác?do acrílico), o catiónicos (por ejemplo, quitosan, poh-L-hsina, pohetilenimina, y pol?(al?l amina)) (ver en general, Dunn et al , J Applied Polymer Sci 50 353-365, 1993, Cascone et al , J Materials Sci Materials in Medicine 5 770-774, 1994, Shiraishi et al , Biol Pharm Bull 16 (11) 1164-1168, 1993, Thacharodi and Rao, Int'l J Pharm 120 115-118, 1995, Miyazaki et al , lnt'1 J Pharm 118 257-263, 1995) Los vehículos polimépcos pueden ser diseñados en una variedad de formas, con características de liberación deseadas y/o con propiedades deseadas específicas Por ejemplo, los vehículos polimépcos pueden ser diseñados para liberar un agente terapéutico después de exponerse a un evento de activación específico tal como pH (ver, por ejemplo, Heller et al , "Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems", in Pohmers in Medicine lll, Elsevier Science Publishers B V , Amsterdam, 1988, pp 175-188, Kang et al , J Applied Polymer Sci 48 343-354, 1993, Dong et al , J Controlled Reléase 19 171-178, 1992, Dong and Hoffman, J Controlled Reléase 15 141-152, 1991, Kim et al , J Controlled Reléase 28 143-152, 1994, Cornejo-Bravo et al , J Controlled Reléase 33 223-229, 1995, Wu and Lee, Pharm Res 10(10) 1544-1547, 1993, Serres et al , Pharm Res 13 (2) 196-201, 1996, Peppas, "Fundamentáis of pH-and Temperature-Sensitive Dehvery Systems", in Gurny et al (eds ), Pulsatile Drug Dehvery, Wissenschafthche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, pp 41-55, Doelker, "Cellulose Depvatives", 1993, m Peppas and Langer (eds ), Biopolymers I, Sppnger-Verlag, Berlín) Ejemplos representativos de polímeros sensibles a pH incluyen pol?(ác?do acrílico) y sus derivados (incluyendo por ejemplo, homopolímeros tales como pol?(ác?do aminocarboxíhco), pol?(ác?do acrílico), pol?(ác?do metí lacrílico) , copolímeros de dichos homopolímeros, y copolímeros de pol?(ác?do acrílico) y acplmonómeros tales como tales como aquellos discutidos anteriormente Otros polímeros sensibles a pH incluyen pohsacápdos tales como acetato-ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-tpmelilato de celulosa, y quitosan Otros polímeros sensibles a pH adicionales incluyen cualquier mezcla de un polímero sensible a pH y un polímero soluble en agua Asimismo, los vehículos polimépcos pueden ser diseñados para que sean sensibles a la temperatura (ver, por ejemplo, Chen et al , "Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Po acryhc Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery", m Proceed Intern Symp Control Reí Bioact Mater 22 167-168, Controlled Reléase Society, Ine , 1995, Okano, "Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Dehvery", in Proceed Intern Symp Control Reí Bioact Mater 22:111-112, Controlled Reléase Society, Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9(3) :425-433, 1992; Tung, lnt'1 J. Pharm. 107:85-90, 1994; Harsh and Gehrke, J. Controlled Reléase 17:175-186, 1991; Bae et al., Pharm. Res. 8(4):531 -537, 1991; Dinarvand and D'Emanuele, J. Controlled Reléase 36:221-227, 1995; Yu and Grainger, "Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels: Poli N-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamíde Network Synthesis and Physicochemical Characterization", Dept . of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduato Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 820-821; Zhou and Smid, "Physical Hydrogels of Associative Star Polymers," Polymer Research Institute, Dept. of Chemistry, College of Environmental Science and Forestry, Stato Univ. of New York, Syracuse, N. Y., pp. 822-823; Hoffman et al., "Characterizing Pore Sizes and Water "Structure" in Stimuli-Responsive Hydrogels," Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, Wash., p. 828; Yu and Grainger, "Thermo-sensitive Sweiling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels," Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Gradúate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 829-830; Kim et al., Pharm. Res. 9(3):283-290, 1992; Bae et al., Pharm. Res. 8 (5): 624-628, 1991; Kono et al., J. Controlled Reléase 30:69-75, 1994; Yoshida et al., J. Controlled Reléase 32:97-102, 1994; Okano et al., J. Controlled Reléase 36:125-133, 1995; Chun and Kim, J. Controlled Reléase 38:39-47, 1996; D'Emanuele and Dinarvand, lnt'1 J. Pharm. 118:237- 242, 1995; Katono et al., J. Controlled Reléase 16:215-228, 1991; Hoffman, "Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species", in Migliaresi et al. (eds.), Polymers in Medicine lll, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, pp. 161-167; Hoffman, "Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels ¡n Therapeutics and Diagnostics", in Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, Utah, Feb. 24-27, 1987, pp. 297-305; Gutowska et al., J.

Controlled Reléase 22:95-104, 1992; Palasis and Gehrke, J. Controlled Reléase 18:1-12, 1992; Paavola et al., Pharm. Res. 12 (12): 1997-2002, 1995). Ejemplos representativos de polímeros de termogelificación, y su temperatura de gelatina (LCST (grados C)) incluyen homopolímeros tales como poli(N-metil-N-n-propilacrilamida), 19.8; poli(N-n-propilacrilamida), 21.5; poli(N-metil-N-isopropilacrilamida), 22.3; poli(N-n-propilmetacrilamida), 28.0; poli(N-isopropilacrilamida), 30.9; poli(N,n-dietilacrilamida), 32.0; poli (N-isopropilmetacrilamida), 44.0; poli(N-ciclopropilacrilamida), 45.5; poli (N-etilmetiacrilamida), 50.0; poli(N-metil-N-etilacrilamida), 56.0; poli(N-ciclopropilmetacrilamida), 59.0; poli(N-etilacrilamida), 72.0. Además, los polímeros de termogelificación pueden hacerse al preparar copolímeros entre monómeros de los anteriores, o combinando tales homopolímeros con otros polímeros solubles en agua tales como acrilmonómeros (por ejemplo, ácido acrílico y sus derivados tales como ácido metilacrílico, acrilato y sus derivados tales como metacplato de butilo, acplamida, y N-n-butilacplamida) Otros ejemplos representativos de polímeros de termogehficación incluyen derivados de éter de celulosa tales como hidroxipropil celulosa, 41 grados C, metil celulosa, 55 grados C, hidroxipropilmetil celulosa, 66 grados C, y et 11 h id roxieti I celulosa, y Pluronics tales como F-127, 10- 15 grados C, L-122, 19 grados C, L-92, 26 grados C, L-81, 20 grados C, and L-61 , 24 grados C Una amplia variedad de formas puede ser diseñada a través de los vehículos polimépcos de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, dispositivos con forma de bastoncillos, pellas, rebanadas o cápsulas (ver por ejemplo, Goodell et al , Am J Hosp Pharm 43 1454-1461, 1986, Langer et al , "Controlled reléase of macromolecules from polymers", m Biomedical Polymers, Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, Goldberg, E P , Nakagim, A (eds ) Academic Press, pp 113-137, 1980, Rhina et al , J Pharm Sci 69 265-270, 1980, Brown et al , J Pharm Sci 72 1181-1185, 1983, and Bawa et al , J Controlled Reléase 1 259-267, 1985) Los agentes terapéuticos pueden ser enlazados a través de oclusión en las matrices del polímero, unidos mediante enlaces covalentes, o encapsulados en microcápsulas Dentro de ciertas modalidades preferidas de la invención, se proporcionan composiciones terapéuticas en formulaciones no capsulares tales como microesferas (que tienen un tamaño que varía de nanómetros a micrómetros), pastas, hebras de varios tamaños, películas y aspersiones. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición terapéutica y alimento para animales. La composición terapéutica de la presente invención puede ser encapsulada utilizando un vehículo polimérico como se describe anteriormente y después se agrega a un alimento a través de medios conocidos de aplicación al alimento, tales como, por ejemplo, a través de mezclado mecánico, aspersión, etc. La composición terapéutica incluye, por ejemplo, una cantidad de por lo menos una bacteriocina y/o bacteria antagonística efectiva para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo en un animal, tal como, por ejemplo aproximadamente 0.5 gramos de lactocina y/o enterocina/1000 gramos, aproximadamente 1.25 gramos de un vehículo polimérico tal como polivinilpirrolidona/1000 gramos, y aproximadamente 8.6% de un diluyente tal como agua/1000 gramos mezclado con cualquier componente granulado que sea digerible, tal como, por ejemplo, grano de maíz molido; granos molidos tales como, por ejemplo avena, trigo, trigo sarraceno; frutas molidas tales como, por ejemplo, peras, etc. La composición terapéutica después se agrega a cualquier tipo de alimento para animales en cantidades efectivas para al menos reducir los niveles de colonización de al menos una bacteria objetivo tal como, por ejemplo en relaciones de bacteriocina a alimento de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:100. Para los propósitos de la presente invención, ejemplos de alimento para animales incluyen forraje verde, ensilajes, forraje verde seco, raíces, tubérculos, frutas carnosas, granos, semillas, granos cerveceros, pulpa de manzana, levadura de cerveza, residuos de destilación, subproductos de molienda, subproductos de la producción de azúcar, producción de almidón o aceite, y varios desperdicios de alimentos. El producto puede ser agregado al alimento del animal para la crianza del ganado, aves de corral, conejos, cerdos u ovejas, etc. Se puede utilizar mezclado con otros aditivos alimenticios para estos ganados. Los siguientes ejemplos pretenden solamente ilustrar más la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Se aislaron dos cepas antagonísticas novedosas, Lactobacillus salivarius designada NRRL B-30514 (Cepa PVD32) y Lactobacillus acidophilus, designada NRRL B-30510 (Cepa LWP320), que producen bacteriocinas, del intestino ciego y buche de pollos tiernos. El intestino ciego y el buche se vaciaron preliminarmente y se lavaron dos veces con aproximadamente 100 ml de una solución salina estéril 0.85% p/v (salina normal). El material del intestino ciego y buche se suspendió en una solución salina estéril, pH de aproximadamente 7.0. Aproximadamente 0.1 ml de una suspensión diluida 10 veces se colocó en placas directamente sobre agar MRS.

Las placas se incubaron anaeróbicamente a aproximadamente 37°C durante alrededor de 16-18 horas. Por lo menos 10 colonias específicas para Lactobacillus spp. fueron seleccionadas para cada muestra. Se identificaron Lactobaci 11 i utilizando el sistema de microprueba APO 50 CHL (bioMerieux, Francia). Se desarrollaron cepas Lactobacillus salivarius PVD 32 y Lactobacillus acidophilus LWP320 a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24 horas sobre agar MRS. Las dos cepas son bastoncillos sin movimiento, Gram-positivos, anaeróbicas facultativas capaces de desarrollarse a aproximadamente 30°, 37°, y 42°C. La cepa PVD 32 se desarrolla sobre agar MRS produciendo colonias convexas, uniformes, con forma circular a regular, con márgenes agudos que tienen un diámetro de aproximadamente 1-3 mm después de incubación microaerofílica durante aproximadamente 18-24 horas a aproximadamente 37°C. La cepa LWP320 se desarrolla sobre agar MRS produciendo colonias semi-opacas, blanquecinas con un diámetro de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 0.8 mm después de incubación microaerofílica durante aproximadamente 24 horas a 37°C. Se desarrollaron Enterococcus faecalis LWP21 y Enterococcus durans LWP26 a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24 horas sobre agar MRS. Estos son cocos sin movimiento, Gram-positivos, anaeróbicos facultativos, capaces de desarrollo a aproximadamente 30°, 37°, y 42°C. La cepa LWP21 se desarrolla sobre agar MRS produciendo colonias semi-opacas, blanquecinas que son opacas después de incubación microaerofílica durante aproximadamente 24 horas. Después de aproximadamente 48 horas de incubación microaerofílica a aproximadamente 37°C, las colonias presentaron un diámetro de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.0 mm. Los resultados en las galerías API 50CHL y EN-COCCUS utilizando el medio de suspensión API 50 CHL, se presentan a continuación en el Cuadro 1. Los resultados mostrados más abajo en el Cuadro 2 indican que la cepa PVD32 es Lactobacillus salivarius, la cepa LWP320 es Lactobacillus acidophilus, la cepa LWP21 es Enterococcus faecalis, y la cepa LWP26 es Enterococcus durans. Las bacterias objetivo para determinar la actividad antagonística de aislados antagonísticos incluyeron las cepas L4 y B1 de C. jejuni aislada de pollos tiernos en Rusia y Campylobacter jejuni ATCC 11168, varias especies de la familia Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa cepa ATCC 9027, Staphylococcus aureus, y Listeria monocytongenes, se utilizaron como cultivos de prueba para evaluar aislados para actividad antagonística. Los cultivos de C. jejuni se desarrollaron ya sea en agar de brucella o en agar de Campylobacter suplementado con aproximadamente 0.02% de bisulfito de sodio, aproximadamente 0.05% de sulfato ferroso, y aproximadamente 5% de sangre de oveja parcialmente lisada a aproximadamente 37°C durante alrededor de 18-24 horas bajo condiciones microaeróbicas de aproximadamente 5% O2, aproximadamente 10% CO2, y aproximadamente 85% N2. Las otras cepas se cultivaron sobre agar de nutriente a aproximadamente 37°C o aproximadamente 28°C para Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis durante aproximadamente 18-24 horas bajo condiciones aeróbicas. Se evaluó la actividad antagonística de los aislados contra Campylobacter. Aproximadamente 0.2 ml de las suspensiones en salina normal se colocaron en placas sobre agar MRS y se incubaron a aproximadamente 37°C durante alrededor de 24 horas. Se cortaron cubos de agar de aproximadamente 0.5 cm3 y se transfirieron sobre agar de brucella o agar Campylobacter suplementado con aproximadamente 5%-10% de sangre de oveja parcialmente lisada, aproximadamente 10 microgramos/ml de rifampicina, y aproximadamente 2.5 u/ml de polimixina y se inocularon con aproximadamente 107 células de Campylobacter jejuni por placa. Las placas se incubaron a aproximadamente 42°C durante alrededor de 24 horas bajo condiciones microaeróbicas como se describió antes. Se evaluó la actividad antagonística midiendo el tamaño de las zonas de inhibición de C. jejuni. Se evaluó la actividad antagonística de Campylobacter jejuni utilizando 11,790 aislados. De estos, 279 aislados exhibieron antagonismo a C. jejuni.

Cuadro 1. Identificación de resultados en API 50CHL en la prueba EN-COCCUS.

Cuadro 2a. Caracterización de Cepas Lactobacillus (resultados en API 50CHL).

Aislados y sus propiedades CARBOHIDRATOS PVD32 LWP320 0-control Glicerol Eritriol D-Arabinosa L-Arabinosa Ribosa D-Xilosa L-Xilosa Adonitol - - ?-Met¡l-xilosida - - Galactosa + + D-Glucosa + + D-Fructosa + + D-Manosa + - L-Sorbosa - - Rhamnosa + - Dulcitol - - Inositol - - Manitol + - Sorbitol + -a-metil D-manosida - ? a-metil D-glucosida - ? N-acetil glucosalina + + Amigdalina - + Arbutina - ? Esculina - - Salicina - + Celobiosa - + Maltosa + + Lactosa + + Melibiosa + - Sacarosa + + Trehalosa I nulina Melezitosa D-Rafinosa Amidon Glicógeno Xilitol Gentiobiosa D-Turanosa D-Lixosa D-Tagatosa D-Fucosa L-Fucosa D-Arabitol L-Arabitol Gluconato 2 ceto gluconano 5 ceto gluconano Identificación como Lactobacillus Lactobacillus salivarius acidophilus Cuadro 2b. Caracterización de Cepas Entercoccus utilizando la prueba EN-COCCUS.

Aislados y sus propiedades PRUEBA LWP21 LWP26 L-Arabinosa . . Ribosa + + L-Sorbosa - - Manitol + - Sorbitol + - Lactosa + + Melibiosa - d Sacarosa + - Melezitosa ( + ) - D-Rafinosa - - Arginina + + Identificación como Enterococcus Enterococcus faecalis durans Cuadro 3. Actividad inhibidora de aislados contra cepas de prueba de Campylobacter jejuni.

EJEMPLO 2 Se aislaron dos cepas novedosas antagonística, Enterococcus faecalis 21 (NRRL B-30645), y Enterococcus durans 26 (NRRL B-30511), que producen bacteriocinas, de embarraduras de intestino ciego y buche de pollos tiernos saludables. Los intestinos ciegos y los buches se vaciaron y se lavaron dos veces con una solución saina estéril 0.085% p/v (salina normal) a aproximadamente un pH de 7.0. El material de los intestinos ciegos y buches se suspendió en salina normal estéril a aproximadamente un pH de 7.0. Alrededor de 0.1 ml de una suspensión diluida 10 veces se colocó en una plataforma directamente sobre un medio selectivo de MRS y las placas se incubaron a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24-48 horas. Se identificaron Enterococci utilizando el equipo de microprueba EN-COCCUS. Se utilizó Campylobacter jejuni ATCC 11168 como un cultivo de prueba para aislados evaluados para actividad antagonística como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Se utilizaron otras treinta y tres cepas con cultivos de prueba para evaluar la actividad antagonística del aislado como se describió antes en el Ejemplo 1. La actividad antagonística de los aislados contra Campylobacter también se evaluó como se describió antes en el Ejemplo 1. La actividad antagonística para Campylobacter jejuni se evaluó utilizando 1,200 aislados derivados de aproximadamente 125 pollos tiernos. De estos, 63 aislados exhibieron antagonismo a C. jejuni ATCC 11168. La habilidad para producir bacteriocinas 'durante el cultivo en caldo MRS se estudió para los 12 aislados más activos. (Ver Cuadros 1-3 anteriores).

EJEMPLO 3 Se realizaron preparaciones antimicrobianas crudas mediante sulfato de amonio solamente de cultivos de cepas antagonística de Lactobacillus desarrolladas en un medio de privación K2HPO4 6 0 gramos KH2PO4 0 2 gramos (NH4)2SO4 02 gramos MgSO4 0 1 gramos glucosa 9 0 gramos histidina 0 08 gramos arginina 0 02 gramos Se agregó H2O destilada a 1,000 ml, pH 7 2 durante aproximadamente 18 horas bajo condiciones aeróbicas a aproximadamente 37°C Los fluidos del cultivo se centrifugaron a aproximadamente 12,000 X g, durante aproximadamente 10 minutos Los sobrenadantes resultantes se sometieron a un pH de aproximadamente 6 2 agregando 1N NaOH y aproximadamente 130 U/ml de catalasa se agregaron para remover los ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, y factores de inhibición Se aislaron péptidos antagonísticos del sobrenadante a través de una combinación de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de desalación, y filtración de gel para producir una preparación cruda (CAP) Las muestras de CAP se filtraron a través 0 22 µ (Mi 111 po re , Bedford, MA ) EJEMPLO 4 Se cultivaron aislados de Enterococcus exhibiendo actividad antimicrobiana del Ejemplo 2 anterior, en el caldo MRS (HiMedia;) Caldo MRS 15 gramos Lactosa 0.05 gramos Se agregó H2O destilada a aproximadamente 1000 ml, pH de aproximadamente 7.2 a aproximadamente 37°C durante alrededor de 18 horas bajo condiciones aeróbicas. Los fluidos de cultivo se cosecharon y se centrifugaron a aproximadamente 12,000 X g durante aproximadamente 10 minutos. Los sobrenadantes resultantes se ajustaron a un pH de aproximadamente 6.2 agregando 1N NaOH y se agregaron aproximadamente 130 U/ml de catalasa para remover ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, y factores de inhibición. Se aislaron péptidos antagonísticos del sobrenadante a través de una combinación de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de desalación, y filtración de gel para producir una preparación antimicrobiana cruda (CAP). Las muestras de CAP se filtraron a través de filtros 0.22 µ (Millipore).

EJEMPLO 5 Se determine el espectro de la actividad antimicrobiana de las CAPs utilizando una prueba de mancha. Aproximadamente 1 ml de una preparación antimicrobiana cruda estéril (CAP), obtenida como en los Ejemplos 3 y 4 anteriores, se diluyeron con aproximadamente 1 ml de regulador de pH de fosfato de sodio (pH aproximadamente 7 0) y se esterilizó como se hizo anteriormente en los Ejemplos 3 y 4 Aproximadamente 10 microhtros de cada muestra se colocaron en placas sobre agar de Campylobacter suplementado con sangre o agar de Nutriente previamente sembrado con células de bacterias objetivo Las placas conteniendo los cultivos de C jejuní se desarrollaron a aproximadamente 42°C bajo condiciones microaeróbicas, se cultivaron aeróbicamente Y enterocolitica y Y pseudotuberculosis a aproximadamente 28°C, y se incubaron otras cepas bacterianas en forma aeróbica a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24 o 48 horas La identificación se basó en áreas de inhibición producidas por las bacterias objetivo La actividad de CAP se expresó en unidades arbitrarias (AU) por un mililitro de la preparación en donde apareció una zona visible de inhibición del crecimiento de cultivo (Henderson et al , Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 295, 5-12, 1992, incorporada aqui por referencia) Todos los experimentos se condujeron por duplicado Los Cuadros 4 y 5 que se presentan más adelante muestran actividad antagonística de las preparaciones antimicrobianas crudas preparadas para Lactobacillus en el Ejemplo 3, y Enterococcus en el Ejemplo 4 Dos aislados de la especie Lactobacillus inhibieron el crecimiento de Campylobacter jejuní (Cuadro 3) Los aislados se identificaron utilizando la prueba de API 50CHL (bioMepeux, Francia) y fueron Lactobacillus salivapus -PVD32 (NRRL B-30514) y Lactobacillus acidophilus LWP320 (NRRL B-30510). Como se ve en el Cuadro 4, todas estas cepas producen lactocína con un amplio espectro de actividad antibacteriana. Inhiben el crecimiento de microorganismos tanto Gram-positivos como Gram-negativos.

Lactocina OR-7 es más activo contra C. jejuni. Dos aislados de la especie Enterococcus inhibieron el crecimiento de C. jejuni (Cuadro 3). Los aislados fueron identificados utilizando la prueba de ENCOCCUS como Enterococcus faecalis (LWP21 aislado) (NRRL B-30645) y Enterococcus durans (LWP26 aislado) (NRRL B-30511). Amplias cepas producen enterocinas con un amplio espectro de actividad suprimiendo microorganismos tanto Gram-positivos como Gram-negativos. La enterocina 21, producida por E. faecalis es única ya que inhibe el crecimiento de las 33 cepas de prueba incluyendo Proteus vulgaris y Morganella morganii, las cuales son especialmente resistentes a bacteriocinas de diferentes orígenes.

Cuadro 4. Actividad de lactocina y lactococcin producida por Lactobacillus spp. y Lactococcus spp. en prueba de mancha (AU/ml). Cuadro 5. Actividad de enterocinas producidas a partir de Enterococcus faecalis 21 y Enterococcus durans 26.

EJEMPLO 6 Se electroforearon CAPs y bacteríocinas a través de SDS-PAGE utilizando aproximadamente 15% de gel de agarosa en peso y aproximadamente 1% SDS (9 X 12 cm) en regulador de pH de Tri-glicina. Después de la electroforesis a aproximadamente 100mA durante aproximadamente 4 horas, los geles se fijaron con una solución conteniendo alrededor de 15% de etanol y alrededor de 1% de ácido acético. Los geles después se lavaron con agua destilada durante aproximadamente 4 horas. Para determinar los pesos moleculares de fracciones de proteína, el gel se tino con una solución conteniendo alrededor de 0.15% de Azul Brillante Coomassi R-250 (Sigma, E.U.A.), aproximadamente 40% de etanol, y aproximadamente 7% de ácido acético. Los geles se lavaron secuencialmente con salina regulada en su pH con fosfato (PBS) durante aproximadamente 1.5 horas y agua desionizada durante aproximadamente 3 horas. Los geles lavados se probaron contra tres bacterias objetivo, C. jejuni ATCC 11168, E. coli 0157:H7 904, y S. enteritidis 237 a través del método de Bhunia et al. (Journal of Industrial Microbiology, Volume 2, 319-322, 1987; incorporada aquí por referencia). Los geles se colocaron en cajas de Petri, se cubrieron con aproximadamente 5% de agar de Campylobacter semisólido de sangre de oveja lisada (aproximadamente 0.75%) o agar semisólido (0.7%), y se sembraron con células de las cepas de prueba. Las placas conteniendo C. jejuni se incubaron a aproximadamente 42°C durante aproximadamente 48 horas bajo condiciones microaeróbicas, E. coli 0157:H7 y S. enteritidis a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24 horas. La determinación se baso en la visualización de zonas del crecimiento inhibido de las cepas de prueba en presencia de bacteriocinas. La actividad de las bacteriocinas purificadas se evaluó (Cuadro 6 para la especie Lactobacillus y Cuadro 7 para la especie Enterococcus). Se colocaron especimenes de CAPs y bacteriocinas sobre geles IEF (pH de aproximadamente 3.1-10.0) (Novex, San Diego, CA). Los geles se corrieron a aproximadamente 100V durante aproximadamente 1 hora, 200V durante aproximadamente 2 horas, y 500V durante aproximadamente 30 minutos en XCM II™ Mini-Cell (Novex). Los geles se lavaron con agua destilada durante aproximadamente 30 segundos sin fijación seguido por tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250 (Sigma, E.U.A.) para determinar puntos isoeléctricos (pi) de las bacteriocinas y su habilidad para inhibir el crecimiento de las cepas de prueba según presentadas más adelante en el Cuadro 6 para lactocinas y Cuadro 7 para enterocinas. Como se ve en la Figura 1, la CAP OR7 de L. salivarius PVD 32 contiene tres fracciones de proteína de aproximadamente 6 kDa, aproximadamente 16 kDa, y aproximadamente 40 kDa. Para medir su actividad, las tiras electroforéticas teñidas conteniendo los péptidos se colocaron sobre el agar de Campylobacter semisólido inoculado con células de C. jejuni ATCC 11168, S. enteritidis, y E. coli 0157:H7. La fracción de aproximadamente 6 kDa se encontró ser activa contra las tres cepas de prueba. El isoelectroenfoque identificó una fracción de pl = aproximadamente 9.0, que mostró actividad contra las tres cepas de prueba. Como se ve en la Figura 2, la lactocina pura LWP320 de L. acidophilus LWP320 y la enterocina pura LWP26 de E. durans LWP26 contienen fracciones de proteína de aproximadamente 6 kDa y aproximadamente 3 kDa, respectivamente. Para medir su actividad, las tiras electroforéticas teñidas comprendiendo los péptidos se colocaron sobre el agar de Campylobacter semisólido inoculado con células de C. jejuni ATCC 11168, S. enteritidis, y E. coli 0157:H7. las fracciones de aproximadamente 6 kDa y aproximadamente 3kDa se encontraron como activas contra las tres cepas de prueba. El isoelectroenfoque identificó fracciones de pl = aproximadamente 8.5 y aproximadamente 7.8 respectivamente, lo cual mostró actividad contra las tres cepas de prueba. Como se ve en la Figura 3, la enterocina aislada LWP21 de E. faecalis LWP21 comprende dos fracciones de proteína de aproximadamente 3.0 kDa (pico 1) y aproximadamente 6.0 kDa (pico 2). Para determinar la actividad antimicrobiana, las bandas electroforéticas sobre agar de Campylobacter semisólido inoculado con C. jejuni ATTC 11168, S. enteritidis, y E. coli 0157:H7. La fracción de aproximadamente 6.0 kDa fue activa contra las tres cepas. No se observó ninguna actividad antibacteriana para la fracción de aproximadamente 3.0 kDa. Para la enterocina aislada el LWP26, el isoelectroenfoque identificó una sola fracción de proteína de pl de aproximadamente 7.8 la cual fue antagonística a las tres cepas probadas (Cuadro 7). La actividad más alta fue asociada con fracciones de enterocina LWP21 pico 1 + pico 2 en la prueba de mancha, mientras que la actividad más baja se mostró con SDS-PAGE e IEF.

Cuadro 6. Actividad antimicrobiana de CAPs de lactocinas determina mediante prueba de mancha, SDS-PAGE, y IEF.

CAP Cepa de Actividad de Actividad de Actividad de prueba inhibición en inhibición en inhibición en prueba de SDS-PAGE IEF mancha (kDa) (pl) (AU/ml) OR-7 C. jejuni 3200 M.W. = 6.0 9.0 lactocina ATCC 11168 S. 800 M.W. = 6.0 9.0 enteritidis 204 E. coli 3200 M.W. = 6.2 9.0 0157:H7 904 LWP320 C. jejuni 1600 M.W. = 6.2 8.5 lactocina ATCC 11168 S. 800 M.W. = 6.2 8.5 enteritidis 204 E. coli 800 M.W. = 6.2 8.5 0157:7 904 Cuadro 7. Caracterización de fracciones activas de enterocinas LWP21 y LWP26 con base en los resultados de SDS-PAGE e isoelectroenfoque.

EJEMPLO 7 Las bacteriocinas obtenidas como una preparación antimicrobiana cruda, como se describe anteriormente en el Ejemplo 2, se purificaron mediante filtración de gel y cromatografía de intercambio de ion. Las preparaciones antimicrobianas crudas (CAPs) de lactocina OR7 y lactocina LWP320 se sometieron a una columna Superóse 12HR 16/50 (Pharmacia, 1.6 X 50 cm) equilibrada con aproximadamente 75 ml de regulador de pH de fosfato de sodio, pH de aproximadamente 5.9. Las preparaciones se eluyeron con el mismo regulador de pH a una velocidad de flujo de aproximadamente 8 ml/min. Se probaron las actividades de las fracciones eluidas contra Campylobacter jejuni ATCC 11168. La concentración de las proteínas se midió utilizando el método descrito por Lowry et al., (Journal of Biological Chemistry, Volume 193, 1951). Las fracciones que inhiben el crecimiento de C. jejuni además se purificaron a través de cromatografía de intercambio de catión utilizando una columna CM-Sepharose (Pharmacia, 2.5 X 20 cm). La columna CM- Sepharose se equilibró con regulador de pH C (50 mM de regulador de pH de citrato-fosfato, pH aproximadamente 5.0) a una velocidad de flujo de aproximadamente 8 ml/min. Las bacteriocinas se eluyeron con aproximadamente 8 mM de regulador de pH C en presencia de NaCI a concentraciones de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.8% a una velocidad de flujo de aproximadamente 8 ml/min. Se determinaron la actividad antimicrobiana y concentraciones de proteína para cada fracción. Las fracciones purificadas fueron designadas como lactocinas OR7 y LWP320. Las OR7 y LWP320 purificadas se evaluaron utilizando SDS-PAGE e isoelectroenfoque como se describió anteriormente en el ejemplo 4. La fracción más activa (OR7) fue un péptido con un peso molecular de aproximadamente 6 kDa y un pl de aproximadamente 9.0 (Figura 1 y Cuadro 6) y la fracción activa LWP320 fue un péptido con un peso molecular de aproximadamente 6 kDa, pl de aproximadamente 8.5 (Figura 3 y Cuadro 6). Se purificaron bacterocinas de Enterococcus a partir de CAPs utilizando un procedimiento de dos pasos: cromatografía de intercambio de ion y cromatografía hidrofóbica. Las fracciones de CAP activas obtenidas en el Ejemplo 4 se inyectaron en una Columna de Flujo Rápido SP-Sepharose (V-30 ml) equilibrada con regulador de pH C (20 mM de fosfato de sodio, pH aproximadamente 7.8) a una velocidad de flujo de aproximadamente 18 ml/minuto. La columna se lavó con cuatro volúmenes de regulador de pH C y las fracciones se eluyeron con aproximadamente 100 ml de 0.5 M NaCI en regulador de pH C. La actividad de fracción de determinó utilizando la prueba de mancha como se describe anteriormente en el Ejemplo 5 utilizando C. jejuni ATCC 11168. Las fracciones capaces de inhibir el crecimiento de C. jejuni se inyectaron en una columna de Fenil-Sepharose CL-4B equilibrada con regulador de pH D (0.06 M regulador de pH de borato, pH aproximadamente 8.5) conteniendo 0.2 M de NaCl. La columna se lavó con cuatro volúmenes de regulador de pH D. Las fracciones se eluyeron con aproximadamente 4 ml del regulador de pH D conteniendo aproximadamente 70% de etanol (vol/vol). El antagonismo de cada fracción se midió utilizando la prueba de mancha. Se obtuvieron preparaciones puras a través de métodos de recromatografía de intercambio de catión sobre SP-Sepharose, así como sobre Fenil-Sepharose CL-4B. La concentración de proteínas se determine utilizando el método de Lowry (supra). Las fracciones aisladas se designaron como enterocinas LWP21 y LWP26. Las fracciones aisladas LWP21 y LWP26 se evaluaron utilizando SDS-PAGE e isoelectroenfocando como se describe anteriormente en el Ejemplo 4. La fracción más activa 2 para LWP21 fue un péptido con una peso molecular de aproximadamente 6 kDa y un pl de aproximadamente 8.4 (Figura 2 y Cuadro 7) y la fracción no activa 1 para LWP21 fue un péptido con un peso molecular de aproximadamente 3 kDa, pl de aproximadamente 5.6 (Figura 2 y Cuadro 7). La fracción más activa para LWP26 fue un péptido con un peso molecular de aproximadamente 3 kDa y una pl de aproximadamente 7.8 (Figura 3 y Cuadro 7). Las secuencias de aminoácido de bacteriocínas purificadas se determinaron a través de degradación de Edman utilizando un secuenciador automático 491 cLC (Applied Biosystems, USA). Las bacteriocinas fueron hidrolizadas en aproximadamente 6M HCl bajo un vacío de aproximadamente 110°C durante alrededor de 72 horas. Se determinaron los pesos moleculares a través de espectrometría de masas utilizando Voyager-DERP (Perkin-Elmer, USA). El sistema MALDI-TOF, un tiempo de ionización de desabsorción de láser ayudado por matriz de sistema de vuelo, se utilizó junto con la matriz ácido 2-ciano-hidroxicinámico. Las secuencias de aminoácido para las cuatro bacteriocinas son: OR7: KTYYGTNGVHCTKNSLWGKVRLKNMKYDQNTTYMGRLQDILLGWATGA FGKTFH SEC ID NO 1 LWP320: ARKYGNGVCGSKWINNGGFQVIGNNAAANLTNWGEAFASATKSGCSAT TCIINAMA SEC ID NO 2 LWP21 (FRACCIÓN 1): FN I RGGYNFGKSVRHWDAIGNMAGI I KL SEC ID NO 3 LWP21 (FRACCIÓN 2): VFHAYSARGVRNNYKCAGVPDAIGCAVRGIFIHGYSLQWMQVKWGWLF K SEC ID NO 4 LWP26: TKTTRGNGVNKECWETYKAGTVDILWASWSK SEC ID NO 5 El peso molecular calculado del péptido OR7 fue de aproximadamente 6,000 Da. El análisis mediante MALDI-TOF reveló el siguiente peso molecular para OR7: 5,123 Da. El peso molecular calculado del péptido LWP320 fue de aproximadamente 6,000 Da. El análisis mediante MALDI-TOF reveló el siguiente peso molecular para LWP320: 5,858 Da. El peso molecular calculado del péptido LWP21 (Fracción 1) fue de aproximadamente 3,000 Da. El análisis mediante MALDI-TOF reveló el siguiente peso molecular para LWP21 (Fracción 1): 2,786 Da. El peso molecular calculado del péptido LWP21 péptido (Fracción 2) fue de aproximadamente 6,000 Da. El análisis mediante MALDI-TOF reveló el siguiente peso molecular para LWP21 (Fracción 2): 4,986 Da. El peso molecular calculado del péptido LWP26 fue de aproximadamente 3,000 Da. El análisis mediante MALDI-TOF reveló el siguiente peso molecular para LWP26: 3,231 Da.

Cuadro 8. Purificación bioquímica de lactocina OR7.

Cuadro 9. Purificación bioquímica de Enterocina LWP21 EJEMPLO 8 Se determinó la influencia de enzimas, temperatura y pH en la actividad de bacteriocina. Se transfirieron aproximadamente 10 µl de una de las siguientes enzimas en tubos conteniendo alrededor de 20 ml de bacteriocinas: beta-quimiotripsina, aproximadamente 100 mg/ml, proteinasa K -aproximadamente 200mg/ml, papaína aproximadamente 60 mg/ml, lisozima -aproximadamente 75 mg/ml, y lipasa -aproximadamente 100 mg/ml (todos de Sigma-Aldrich Corp., St. Louis MO). Después de un período de incubación de aproximadamente tres horas a alrededor de 37°C, la mezcla de bacteriocina y enzima fue analizada para actividad antimicrobiana utilizando la prueba de mancha como en el Ejemplo 5. Las bacteriocinas no tratadas sirvieron como controles positivos. Para estudiar la termoestabilidad de las bacteriocjnas, una muestra de aproximadamente 2 mg/ml se hizo hervir en un baño de agua durante aproximadamente 15 minutos, se enfrío y se analizó en términos de su actividad antimicrobiana utilizando la prueba de mancha. Se utilizaron aproximadamente 2 mg/ml de bacteriocina para evaluar el efecto del pH. Aproximadamente 2 mililitros de soluciones estériles, aproximadamente 10mM de NaOH o aproximadamente 10 mM de HCl se agregaron a las muestras para probar el pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 10. Las muestras se incubaron a alrededor de 37°C durante aproximadamente 2 horas y 24 horas, y a aproximadamente 90°C durante aproximadamente 20 minutos. Las muestras se sometieron a un pH de aproximadamente 7.2 a través de la adición de aproximadamente 4 mM de regulador de pH de fosfato estéril y se analizaron para su actividad antimicrobiana utilizando la prueba de mancha como se describió anteriormente en el Ejemplo 5. Las bacteriocinas perdieron su actividad antimicrobiana después de ser tratadas con beta-quimiotripsina, proteinasa K, y papaína, pero la retuvieron cuando se trataron con lisozima, lipasa, o se calentaron a aproximadamente 90°C (Cuadros 10 y 11). Fueron estables a diferentes valores de pH variando de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 9.0, pero se hicieron inactivas a aproximadamente un pH de 10 (Cuadros 12 y 13). Las enterocinas perdieron su actividad a un pH de aproximadamente 9.1 y aproximadamente 10.

Cuadro 10. Efecto de Enzimas y Temperatura en la actividad antimicrobiana de OR7. * actividad contra C. jejuni ATCC 11168 en prueba de mancha ( + ) presencia de actividad (-) pérdida de actividad después de tratamiento Cuadro 11. Efecto de Enzimas y Temperatura en la actividad antimicrobiana de Enterocina LWP21 y Enterocina LWP26. * actividad contra C. jejuni ATCC 11168 en prueba de mancha ( + ) presencia de actividad después de tratamiento (-) pérdida de actividad después de tratamiento Cuadro 12. Efecto del pH sobre la actividad de lactocina OR7. *actividad contra C. jejuni ATCC 11168 en prueba de mancha ( + ) presencia de actividad después de tratamiento (-) pérdida de actividad después de tratamiento Cuadro 13. Efecto del pH sobre la actividad de enterocina LWP21 y LWP26 'actividad contra C. jejuni ATCC 11168 en prueba de mancha ( + ) presencia de actividad después de tratamiento (-) pérdida de actividad después de tratamiento EJEMPLO 9 Se purificó la bacteriocina OR7 como se describió en el Ejemplo 5. Se agregó bacteriocina purificada OR7 a una concentración de aproximadamente 250 mg por kilogramo del alimento comercial para aves en polivinilpirrolidona como se conoce en la técnica Se formó aproximadamente 100 gramos de una composición terapéutica con granos de maíz molidos conteniendo aproximadamente 0 5 gramos de bactepocma OR7, aproximadamente 1 25 gramos de polivinilpirrohdona, y aproximadamente 8 6% de agua Se agregaron alrededor de 100 gramos de esta composición a aproximadamente 2 kilogramos del alimento para aves Se colocaron pollos de 1 día, seis días y 18 días de edad en grupos en unidades de aislamiento separadas equipadas con ahmentadores, agua y con un suministro de aire filtrado El alimento y el agua se suministraron ad libitum Para los pollos de 1 día de edad (Cuadro 14) Grupo uno los pollos sirvieron como el grupo de control que recibieron acceso libre a dieta sin bactepocina agregada Estos pollos fueron reforzados en el día uno de vida con las cepas L4 y B1 de C jejuní, como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 Las cepas se administraron a través de cebaduras orales a una concentración de aproximadamente 2 X 105 en un volumen de 0 2 ml Cinco de los pollos fueron sacrificados aproximadamente 7 días después del refuerzo y los cinco restantes se sacrificaron aproximadamente 10 días después del ataque Grupo dos los pollos fueron reforzados en el día 1 de vida con C jejuní cepas L4 y B1 como se describió anteriormente para el Grupo uno A los pollos se les dio acceso libre a dieta conteniendo aproximadamente 250 mg de bactepocina OR7 por kilogramo de alimento durante tres días, comenzando a partir del día 4 de vida Los pollos del Grupo dos fueron sacrificados aproximadamente siete días después del ataque con C jejuní Grupo tres los pollos fueron atacados y alimentados como los pollos del Grupo dos y se sacrificaron 10 días después del ataque. Los resultados se muestran en el Cuadro 15.

Cuadro 14. Efectos terapéuticos de bacteriocina OR-7 para infección por C. jejuni experimentalmente inducida en pollos tiernos.

*Dieta terapéutica preparada con base en alimento comercial destinado para pollos con una edad de 1-10 días.

Para pollos de 6 días de edad, los grupos de control recibieron acceso libre a dieta sin agregar bacteriocina. Estos pollos fueron atacados en el día 2 del experimento con aproximadamente 10s CFU (en aproximadamente un volumen de 0.2 ml) de las cepas L-4, y B-1 de C. jejuni, como se describió en el Ejemplo 1. Se administró C. jejuni a través de cebaduras orales. Los pollos fueron sacrificados a los 9 días, 11 días, y 14 días después del ataque. Los pollos del experimento, teniendo dos grupos, se les dio acceso libre a dieta con bacteriocina OR7 encapsulada en polivinilpirrolidona comenzando a partir del día 6 de vida. Estos pollos fueron atacados en el día 2 del experimento como se hizo anteriormente para los pollos de control.

Los pollos se sacrificaron en los días 9, 11, y 14 de vida. Los resultados se muestran en el Cuadro 15 a continuación.

Cuadro 15. Tratamiento de infección asociada con C. jejuni experimental en pollos con 6 días de edad con bacteriocina OR7 agregada al alimento. *-dosis neta administrada a pollos durante un período de 3 días = aproximadamente 26.4 mg; 5 días = aproximadamente 50.6 mg; 8 días = aproximadamente 80.5 mg.

Para pollos con una edad de 18 días, los pollos de control recibieron acceso libre a dieta sin bacteriocina agregada. Estos pollos fueron atacados como se hizo anteriormente en el día 15 del experimento a través de cebaduras orales con una dosis de 107 CFU C jejuní cepas L-4 y B-1 en aproximadamente un volumen de 0 2 ml Los pollos fueron sacrificados en el día 24 del experimento A los pollos que recibieron dieta convencional incluyendo bactepocina OR7 como se describe anteriormente, se les dio acceso libre al alimento conteniendo aproximadamente 025 g de bactepocina OR7 por kg de alimento durante aproximadamente cinco días comenzando aproximadamente en el día 19 de vida La dosis terapéutica neta es de aproximadamente 109 mg por pollo Los pollos se sacrificaron aproximadamente en el día 24 e vida Los resultados se muestran en el Cuadro 16 a continuación Cuadro 16 Tratamiento de infección asociada con C jejuní experimental en pollos con 18 días de edad con bactepocina OR7 agregada al alimento Los pollos fueron atacados en el día 1 de vida y a los pollos de control se les dio libre acceso a alimento y agua sin bacteriocina agregada. Los pollos fueron atacados con aproximadamente 1 O6 CFU de una mezcla de las cepas L4 y B1 de C. jejuni a través de cebaduras orales el 1er día de vida. Los pollos de control se sacrificaron en el día 17 de vida. En el grupo I experimental, los pollos con 1 día de edad fueron atacados como pollos de control, proporcionando acceso libre al alimento con aproximadamente 0.250 gramos de bacteriocina OR7 por kilogramo de alimento, empezando en el día 14 de vida y se sacrificaron aproximadamente en el día 17 de vida; y los pollos del grupo II fueron atacados como pollos de control en el día 1 de vida y se les proporcionó libre acceso a alimento conteniendo aproximadamente 0.500 gramos de bacteriocina OR7 por kilogramo de alimentación en el día 14 de vida; y se sacrificaron en el día 17 de vida. Los resultados se muestran en el Cuadro 17 a continuación.

Cuadro 17. Tratamiento de infección asociada con C. jejuni experimental en pollos con bacteriocina OR7 agregada al alimento.

La descripción detallada anterior es para el propósito de ilustración. Estos detalles son solamente para ese propósito y aquellos expertos en la técnica pueden hacer variaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una bacteriocina aislada producida por una cepa bacteriana productora de ácido láctico que tiene las características de identificación de una cepa seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30514, NRRL B-30510, NRRL B-30511, y NRRL B-30645. 2. La bacteriocina de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 1. 3. La bacteriocina de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 2. 4. La bacteriocina de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 3. 5. La bacteriocina de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 4. 6. Un Lactobacillus spp. aislado que tiene las características de identificación de una cepa de Lactobacillus seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30514 y NRRL B-30510. 7. Un Lactobacillus spp. aislado que tiene las características de identificación de NRRL B-30510. 8. Un Lactobacillus salivarius aislado que tiene las características de identificación de NRRL B-30514. 9. Una cepa Enterococcus aislada que tiene las características de identificación de una cepa de Enterococcus seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30645 y NRRL B-30511. 10. Un Enterococcus faecalis aislado que tiene las características de identificación de NRRL B-30645. 11. Un Enterococcus durans que tiene las características de identificación de NRRL B-30511. 12. Una composición terapéutica que comprende: (a) por lo menos una bacteriocina aislada producida por una cepa bacteriana productora de ácido láctico que tiene las características de identificación de una cepa seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30514, NRRL B-30510, NRRL B-30645, NRRL B-30511, y mezclas de los mismos en una cantidad efectiva para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo; y (b) un vehículo terapéutico adecuado. 13. Una composición terapéutica que comprende: (a) una bacteriocina aislada producida por una cepa Lactobacillus salivarius que tiene las características de identificación de NRRL B-30514 en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo, y (b) un vehículo terapéutico adecuado. 14. La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 1, SEC ID NO 2, SEC ID NO 3, SEC ID NO 4 o mezclas de los mismos. 15. La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 1. 16. La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 2. 17. La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 3. 18. La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido de SEC ID NO 4. 19. Una composición terapéutica que comprende: (a) por lo menos una bacteriocina aislada producida por un Lactobacillus spp. que tiene las características de identificación de NRRL B-30510 en cantidades para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo; y (b) un vehículo terapéuticamente aceptable. 20. Una composición terapéutica que comprende: (a) por lo menos una bacteriocina aislada producida por un Enterococcus durans, que tiene las características de identificación de NRRL B-30511 en cantidades para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria; y (b) un vehículo terapéuticamente aceptable. 21. Una composición terapéutica que comprende: (a) por lo menos una bacteriocina aislada producida por un Enterococcus faecalis que tiene las características de identificación de NRRL B-30645 en cantidades para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria; y (b) un vehículo terapéuticamente aceptable. 22. Una alimentación terapéutica para animales, que comprende: (a) por lo menos una bacteriocina aislada producida por una cepa bacteriana productora de ácido láctico que tiene las características de identificación de una cepa seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30514, NRRL B-30510, NRRL B-30511, NRRL B-30645, y mezclas de los mismos, en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo, (b) un vehículo terapéutico, y (c) un alimento para animal. 23. El alimento terapéutico de acuerdo con la reivindicación 22, en donde por lo menos una bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO 1, SEC ID NO 2, SEC ID NO 3, SEC ID NO 4, y mezclas de los mismos. 24. Un alimento terapéutico para animales, que comprende: (a) una bacteriocina producida por una cepa Lactobacillus que tiene las características de identificación de una cepa Lactobacillus seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30510, NRRL B-30514, y mezclas de los mismos; en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo, (b) un vehículo terapéutico, y (c) un alimento para animales 25 El alimento terapéutico de acuerdo con la reivindicación 24, en donde dicha bactepocina tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2 26 Un alimento terapéutico para animales que comprende (a) por lo menos una bactepocma aislada producida por una cepa Enterococcus que tiene las características de identificación de una cepa Enterococcus seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30511, NRRL B-30645, y mezclas de los mismos, en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo, (b) un vehículo terapéutico, y, (c) un alimento para animal 27 El alimento terapéutico de acuerdo con la reivindicación 26, en donde dicha bactepocma tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO 3 y SEC ID NO 4 28 Un método para por lo menos reducir el nivel de colonización por al menos una bacteria objetivo en un animal, que comprende administrar a un animal una composición terapéutica que comprende por lo menos una bactepocina producida por una cepa bacteriana productora de ácido láctico que tiene las características de identificación de una cepa seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30514, NRRL B-30510, NRRL B-30511, NRRL B-30645, y mezclas de las mismas en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo y un vehículo terapéutico. 29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO 1, SEC ID NO 2, SEC ID NO 3, SEC ID NO 4, y mezclas de las mismas. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido SEC ID NO 1. 31. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido SEC ID NO 2. 32. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido SEC ID NO 3. 33. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha bacteriocina tiene una secuencia de aminoácido SEC ID NO 4. 34. Un método para por lo menos reducir el nivel de colonización por al menos una bacteria objetivo en un animal que comprende: administrar a un animal una composición terapéutica que comprende: (a) por lo menos una bacteriocina producida por una cepa bacteriana productora de ácido láctico que tiene las características de identificación de una cepa seleccionada del grupo que consiste de NRRL 33-30514, NRRL B-30510, NRRL B-30511, NRRL B-30645, y mezclas de la misma en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo, (b) por lo menos una cepa bacteriana productora de ácido láctico que tiene las características de identificación de una cepa seleccionada del grupo que consiste de NRRL B-30514, NRRL B-30510, NRRL B-30511, NRRL B-30645, y mezclas de los mismos en cantidades efectivas para por lo menos reducir los niveles de colonización por al menos una bacteria objetivo; y (c) un vehículo terapéutico.