ES2268226T3 - Basterias bifidobacterium longun y preparaciones que las contienen. - Google Patents
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Abstract
Un cultivo biológicamente puro de la cepa Bifidobacterium Longum LMG P-21586
Description
Bacterias Bifidobacterium Longum y
preparaciones que las contienen.
La presente invención se refiere al uso de
microorganismos no patógenos del género Bifidobacterium
Longum con objeto de favorecer la salud gastrointestinal y en
particular para prevenir y/o tratar las indisposiciones del tracto
gastrointestinal, particularmente del intestino.
Se conocen desde hace bastante tiempo muchos
tipos de bacterias utilizados como agentes de fermentación para
conservación de alimentos o preparación de alimentos lácteos como
yogur u otros productos lácteos; estas bacterias se designan bajo
el término genérico de "bacterias de ácido láctico" y
comprenden muchos géneros como Lactococcus, Lactobacillus,
Streptococcus, Bifidobacterium y Pediococcus.
En fecha más reciente, estas bacterias están
siendo objeto de mayor atención debido a que, una vez ingeridas,
han demostrado propiedades notables en el hombre y los animales; en
particular cepas de Lactobacillus o Bifidobacterium,
administradas a veces juntas en combinación, han demostrado eficacia
en la colonización de la mucosa intestinal y en la ayuda a la salud
de las personas, por prevención de la colonización por otros
microorganismos nocivos, como se indica en las patentes U.S.
5.494.664 y 6.241.983 y en las Solicitudes de Patentes Internacional
WO 0033854 y
WO 0110453.
WO 0110453.
Estos microorganismos se denominan también
"probióticos" y un requisito fundamental para su efecto
beneficioso es que los mismos puedan alcanzar la mucosa intestinal
en tal número y con tal vitalidad que sean capaces de persistir y
colonizar el intestino, por lo cual es necesario que resistan
convenientemente al bajo pH del estómago.
La toma de productos probióticos está
recomendada en el caso de indisposiciones intestinales, tales como
estreñimiento o diarrea y después de períodos de tratamiento con
antibióticos, es decir en particular en todas aquellas
circunstancias que conducen a un empobrecimiento de la flora
bacteriana intestinal y también en todas aquellas circunstancias en
las cuales una alimentación pobre en fibras, las condiciones
ambientales, o el estrés disminuyen la vitalidad de la flora
bacteriana intestinal.
El restablecimiento de niveles adecuados de
microorganismos presentes naturalmente en la flora bacteriana
intestinal por utilización de cepas bacterianas bien caracterizadas
y extraídas de la flora de personas sanas es el objetivo de una
dicha administración.
La actividad colonizadora de microorganismos
exógenos en el intestino depende de su concentración, de su
capacidad para colonizar y de las condiciones ambientales que
encuentran los mismos en el intestino, debido a que la
administración de una cantidad mayor, una alta capacidad de
colonización y condiciones ambientales adecuadas contribuyen a su
efecto protector y curativo mediante la colonización de grandes
porciones en el interior del intestino sin efectos secundarios dado
que los mismos son productos de origen natural. En particular, debe
subrayarse que la posible presencia de fibras alimentarias, como por
ejemplo inulina o fructo-oligosacáridos, contribuye
principalmente a la colonización debido a que estos compuestos son
un sustrato para el producto probiótico y por consiguiente aumentan
las posibilidades de colonización. Dichos oligosacáridos han sido
denominados también "prebióticos" debido a su acción sinérgica
con el probiótico.
El documento US 5.494.664 se refiere a un
cultivo biológicamente puro de una cepa seleccionada del grupo
constituido por Bifidobacterium Breve CNCM
I-1226, Bifidobacterium Infantis CNCM
I-1227 y Bifidobacterium Longum CNCM
I-1228.
La publicación Microbial Ecology in Health and
Disease 1999; 11:41-46 da a conocer los efectos de
la administración de yogur de Bifidobacterium Longum BB536
sobre el ambiente intestinal de adultos sanos.
El documento US 6.306.638 da a conocer una cepa
mutante de Bifidobacterium aislada que crece en condiciones
aerobias, es aproximadamente 10 veces más tolerante al ácido
clorhídrico que Bifidobacterium a un pH de aproximadamente
1,5-4,5, y es tolerante a la bilis de buey a
aproximadamente 0,3% (p/v en un medio de cultivo).
Cultivos biológicamente puros de una cepa de
Bifidobacterium Longum denominada W11, depositada en las
Colecciones Belgas Coordinadas de Microorganismos - BCCM
LMG-Collection que ha registrado la misma bajo el
número de acceso LMG P-21586, su uso como
probióticos con preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario y
las preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que contienen
la misma útiles para favorecer la salud gastrointestinal y prevenir
y tratar las patologías intestinales son el objeto de la presente
invención.
La cepa de Bifidobacterium Longum W11 ha
sido aislada de la flora bacteriana intestinal de un hombre sano y
se ha seleccionado entre muchas otras cepas de Bifidobacterium
Longum aisladas al mismo tiempo debido a que ha demostrado una
capacidad colonizadora en la flora bacteriana intestinal y una
capacidad de adherencia a las células intestinales, características
ambas que, juntas, hacen de la misma un agente probiótico muy
satisfactorio capaz de favorecer la
buena salud del tracto gastrointestinal y restablecer su funcionalidad alterada por gastroenteritis de orígenes diversos.
buena salud del tracto gastrointestinal y restablecer su funcionalidad alterada por gastroenteritis de orígenes diversos.
El cultivo bacteriano objeto de la presente
invención se ha producido primeramente en laboratorio y
posteriormente en preparaciones industriales y está compuesto de
cepas puras que se han desarrollado durante 20 horas a 37ºC en un
medio de cultivo adecuado denominado TPY que contiene como
ingredientes principales caseína-peptona tríptica,
peptona de soja, extracto de levadura y glucosa además de sales de
potasio, calcio, magnesio y cinc.
A partir de este cultivo primario se han
preparado sub-cultivos subsiguientes con la
finalidad de aumentar el número de células de cepas puras hasta
obtener los cultivos madre que se han utilizado como inoculación
para la producción industrial de los cultivos bacterianos del
material probiótico Bifidobacterium Longum W11.
El proceso de producción industrial de dicho
cultivo bacteriano prevé los pasos siguientes:
- 1.
- fermentación a un pH controlado entre 5,5 y 7,5;
- 2.
- separación de la biomasa bacteriana del caldo de cultivo por centrifugación;
- 3.
- liofilización de la biomasa bacteriana, después de adición de crioprotectores adecuados seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales para salvaguardar la vitalidad de las células a lo largo del paso de congelación y liofilización, posiblemente también con adición de un precipitado proteico con la finalidad de aumentar la resistencia de la cepa a la degradación enzimática y a condiciones de pH ácido;
- 4.
- molienda y granulación del cultivo liofilizado.
El producto así preparado contiene un promedio
de aproximadamente 1 x 10^{10} a aproximadamente 1 x 10^{12}
células vivas de Bifidobacterium Longum W11 por cada gramo de
producto final, analizado de acuerdo con métodos microbiológicos de
recuento bacteriano conocidos por las personas expertas en la
técnica, como por ejemplo los consignados en Ison A.P. y Matthew
G.B., Applied Microbial Physiology a Practical Approach,
compiladores Rhodes P.M. y Stanbury P.F. - IRL Press Oxford,
103-130, 1997.
El cultivo bacteriano se ha comprobado en
ensayos de colonización del intestino de ratones con resultados
positivos dado que el recuento de la cantidad de carga bacteriana
del Bifidobacterium Longum LMG P-21586 ha
exhibido un valor mayor que 1 x 10^{6} células vivas por cada
gramo de heces de ratón.
Objeto adicional de la presente invención,
partiendo estrictamente del objeto principal, es el uso del cultivo
biológicamente puro obtenido de las cepas de Bifidobacterium
Longum W11 como material probiótico en preparaciones de tipo
farmacéutico o alimentario útiles para favorecer la salud
gastrointestinal y en la prevención y el tratamiento de las
patologías intestinales tales como diarreas, gastroenteritis de
diverso origen, estreñimiento, colon irritable, enfermedad
diverticular y enfermedades inflamatorias crónicas del intestino. La
eficacia de los cultivos bacterianos que contienen el
Bifidobacterium Longum W11 para favorecer la salud
gastrointestinal puede incrementarse añadiendo a las preparaciones
de tipo farmacéutico o alimentario que las contienen fibras
alimentarias en la forma de oligosacáridos indigeribles, por ejemplo
fructo-oligosacáridos o inulina, que no son
absorbidos ni hidrolizados en el primer tracto del intestino y
refuerzan la actividad y estimulan el metabolismo de las cepas de
Bifidobacterium Longum LMG P-21586 con
desventaja de las bacterias patógenas. Los oligosacáridos preferidos
en la realización de la presente invención son mezclas de
fructo-oligosacáridos constituidas por una unidad
básica consistente en una molécula de glucosa (G), unida a una
cadena de moléculas de fructosa (F) de fórmula general GFn, con n
\leq 4, teniendo un grado de polimerización, es decir un número de
unidades de monosacárido, comprendido entre 2 y 20. Los
fructo-oligosacáridos utilizados como materiales
prebióticos asociados con los dos tipos de materiales prebióticos
objeto de la presente invención tienen un grado de polimerización
entre 2 y 10, preferiblemente entre 3 y 6.
La preparación objeto de la presente invención
puede contener, junto con diversos excipientes tales como
edulcorantes, por ejemplo aspartamo, manitol o sorbitol, sustancias
saborizantes y colorantes, vitaminas, preferiblemente vitaminas de
los grupos E, B1, B2, B6 y B12, que tienen la finalidad de favorecer
adicionalmente la salud por restablecimiento del componente
vitamínico que sufre una disminución acusada durante las patologías
del tracto intestinal.
Objeto de la presente invención son tanto
preparaciones farmacéuticas como productos alimentarios que
contienen cultivos bacterianos de Bifidobacterium Longum
denominado W11 y registrados con el número de acceso LMG
P-21586, opcionalmente en asociación con materiales
prebióticos, preferiblemente fructo-oligosacáridos o
inulina, y/o vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E,
B1, B2, B6 y B12.
Las preparaciones farmacéuticas están hechas
preferiblemente de composiciones administrables por vía oral en
forma de cápsulas, tabletas, sobres, trociscos, suspensiones
líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales líquidos,
viales y algunos otros que contienen una carga bacteriana de células
vivas de Bifidobacterium Longum W11 entre 1 x 10^{7} y 1 x
10^{11} al final del periodo de estabilidad.
Dichas preparaciones farmacéuticas pueden
contener también agentes prebióticos como los
fructo-oligosacáridos o la inulina, preferiblemente
de 0,5 a 5 g de fructo-oligosacárido por cada
dosis, más preferiblemente de 1 a 3 g, y/o vitaminas,
preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12.
Cantidades de material probiótico de 1 x 10^{7} a 1 x 10^{11}
de células vivas de Bifidobacterium Longum pueden
incorporarse también en la fabricación de muchas clases de
productos alimentarios tales como leche, yogur, quesos frescos
tales como ricotta, stracchino y mozzarella (clases de queso
italiano), helados, productos constituidos por leche
fermentada, productos constituidos por cereales fermentados, polvos
lácteos, productos para niños y productos para animales domésticos.
Los ensayos para la comprobación del recuento bacteriano han
demostrado que la cepa de Bifidobacterium Longum objeto de
la presente invención es tan resistente que no sufre una mortalidad
sensible durante los procesos tecnológicos de producción de las
preparaciones farmacéuticas o alimentarias, o a todo lo largo del
período normal de almacenamiento de la misma. De hecho, estas
preparaciones bacterianas se han sometido a ensayos de estabilidad
que han demostrado una resistencia extremadamente satisfactoria de
las dos cepas bacterianas a la temperatura ambiente por lo que su
venta puede continuarse durante no menos de dos años después de su
fabricación.
Los ejemplos consignados más adelante en esta
memoria son útiles para una ilustración adicional de la invención y
no deben considerarse como limitación de la misma.
El "cultivo primario" de la cepa de
Bifidobacterium Longum W11 utilizado como inoculación de las
fermentaciones industriales es exactamente el mismo que el
depositado en las Colecciones Belgas Coordinadas de Microorganismos
- BCCM LMG-Collection - Laboratorium voor
Microbiologie, Universidad de Gante, que al aceptar la cepa expedida
ha ratificado la pureza y la vitalidad de la cepa, y ha registrado
la misma con el número de acceso LMG P-21586.
Para obtener este "cultivo primario" dicha
cepa se ha dejado crecer en un medio de cultivo denominado TPY que
tiene la composición siguiente cuando se refiere a un litro:
- Peptona tríptica de caseína | 10 g |
- Peptona de soja | 5 g |
- Extracto de levadura | 5 g |
- Glucosa | 10 g |
- K_{2}HPO_{4} anhidro | 2 g |
- MgCl_{2}\cdot6H_{2}O | 0,5 g |
- ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 0,25 g |
- CaCl_{2}\cdot2H_{2}O | 0,15 g |
- Tween 80 | 1 ml |
- Hidrocloruro de cisteína | 0,5 g |
- Agua bidestilada | cs hasta 1000 ml. |
El crecimiento se ha llevado a cabo a 37ºC
durante 20 horas y después de ello el cultivo se ha distribuido,
con la adición de crioprotectores adecuados seleccionados de
proteidos, carbohidratos y sales minerales, en viales que se han
congelado y guardado en nitrógeno líquido a -196ºC.
Partiendo del "cultivo primario", con un
porcentaje de inoculación de 3%, se han preparado 3
sub-cultivos con la finalidad de aumentar el número
de células de la cepa bacteriana.
El último sub-cultivo de
aproximadamente 10 litros, denominado "cultivo madre", se ha
utilizado para inocular el reactor del "cultivo intermedio"
que tiene una capacidad de aproximadamente 300 litros.
El proceso subsiguiente de la fabricación
industrial del cultivo biológicamente puro de Bifidobacterium
Longum W11 comprende los pasos siguientes:
- 1.
- fermentación a un pH controlado entre 6,5 y 7,0;
- 2.
- separación de la biomasa bacteriana del caldo de cultivo;
- 3.
- protección de la biomasa bacteriana por medio de una solución de crioprotectores seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales con la finalidad salvaguardar la vitalidad de las células durante los pasos subsiguientes de congelación y liofilización, y posiblemente también por inclusión en un precipitado proteico con la finalidad de proporcionar también a la cepa resistencia a la degradación enzimática y a condiciones de pH ácido;
- 4.
- liofilización;
- 5.
- molienda y granulación del cultivo liofilizado;
- 6.
- mezcla del cultivo liofilizado;
- 7.
- envasado.
El producto obtenido contiene aproximadamente 8
\div 10 x 10^{10} células vitales por cada gramo.
Los ensayos se han llevado a cabo en 4 grupos de
2 ratones, habiendo recibido cada ratón dos dosis, la segunda 16
horas después de la primera, de una solución de glucosa que contenía
Bifidobacterium Longum LMG P-21586 a una
concentración igual a 1,6 x 10^{9} CFU (unidades formadoras de
colonias)/60 \mul.
La capacidad de la cepa en cuanto a la
colonización del intestino de estos ratones se ha comprobado por
cálculo de la cantidad de Bifidobacterium Longum presente en
las heces: la primera toma de muestras se ha realizado antes de
iniciar las alimentaciones, mientras que las tomas de muestras
subsiguientes se han realizado respectivamente 2, 4, 8, 24, y 48
horas después de la segunda administración. La cantidad de la cepa
de Bifidobacterium Longum encontrada en las heces ha estado
situada en la región de 10^{6} CFU/g, demostrando así que se ha
producido colonización. En particular, se ha encontrado que el
Bifidobacterium Longum resulta ser el componente principal
de la flora bacteriana con respecto a todas las cepas de
bifidobacterias encontradas en las heces.
Se consigna como ejemplo la preparación de
bolsas, cada una de las cuales pesa 3 g para disolución en agua o
leche y que contienen 250 mg de cultivo bacteriano biológicamente
puro correspondiente a aproximadamente 2 x 10^{10} células vivas
de Bifidobacterium Longum W11, 2500 mg de
fructo-oligosacáridos y vitaminas de los grupos B1,
B2, B6 y B12.
En particular, se ha utilizado como
fructo-oligosacárido el producto disponible
comercialmente denominado
Actilight® 950P compuesto de una mezcla de fructo-oligosacáridos formados por una cadena de moléculas de fructosa unidas a una molécula de glucosa de fórmula general GFn con n \leq 4 y con un grado de polimerización entre 2 y 10.
Actilight® 950P compuesto de una mezcla de fructo-oligosacáridos formados por una cadena de moléculas de fructosa unidas a una molécula de glucosa de fórmula general GFn con n \leq 4 y con un grado de polimerización entre 2 y 10.
La composición
cuali-cuantitativa detallada de las bolsas es como
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Componente | mg |
Bifidobacterium Longum W11 | 250 |
Actilight® 950P | 2500 |
Vitamina B1 | 1,4 |
Vitamina B2 | 1,6 |
Vitamina B6 | 2 |
Vitamina B12 | 0,001 |
Aroma de mandarina | 20 |
Aspartamo | 20 |
Gel de sílice | 10 |
Sorbitol | 195 |
Se lleva a cabo un primer paso de mezcladura de
las vitaminas con una parte alícuota de Actilight® 950P, seguido
por tamizado sobre un tamiz que tiene 0,5 mm de apertura de malla.
Esta primera mezcla se añade a una segunda parte alícuota de
Actilight® 950P y se lleva a cabo un segundo paso de mezcladura. Por
último, el cultivo bacteriano de Bifidobacterium Longum W11,
la parte alícuota restante de Actilight® 950P y los otros
componentes de la formulación se añaden con mezcladura adicional
seguida por un tamizado final sobre un tamiz de 0,8 mm.
El producto se distribuye luego en bolsas de
aluminio que pesan 3 g. El proceso tecnológico de preparación de
las bolsas no causa deterioro alguno a la vitalidad de la cepa.
Los ensayos de estabilidad se han llevado a cabo
sobre las bolsas midiendo la carga bacteriana en el tiempo 0 y
respectivamente después de 1, 2 y 3 meses de almacenamiento a 22ºC
para fijar así el tiempo de semi-vida. El análisis
de los datos después de 1, 2 y 3 meses ha demostrado que la
mortalidad es muy baja en estos periodos de tiempo, de tal modo que
al cabo de 2 años el número de células vivas para cada dosis no es
inferior a 5 x 10^{9} células en la formulación anterior de
dichas bolsas. Dicho resultado demuestra que esta preparación es
perfectamente adecuada para los objetivos que la presente invención
pretende alcanzar.
Se han preparado cápsulas blandas de gel con la
composición cuali-cuantitativa siguiente:
Componente | mg |
Bifidobacterium Longum W11 | 125 |
Mono- y diglicéridos de los ácidos grasos | 14 |
Aceite de soja | 261,372 |
Lecitina de soja | 5 |
Tocoferoles naturales (E) | 16,418 |
Mononitrato de tiamina (B1) | 2,072 |
Hidrocloruro de piridoxina (B6) | 2,918 |
Riboflavina (B2) | 1,920 |
Cianocobalamina 0,1% (B12) | 1,300 |
Gelatina alimentaria | 116 |
Glicerol | 71 |
Dióxido de titanio | 4,140 |
Óxido de hierro amarillo | 0,200 |
Produciendo una suspensión homogénea del cultivo
bacteriano de Bifidobacterium Longum W11, las vitaminas, la
lecitina de soja y los mono- y diglicéridos de los ácidos grasos en
lecitina de soja, distribuyendo dicha suspensión en cápsulas
ovaladas de tamaño 7,5 hechas de gelatina alimentaria, glicerol,
dióxido de titanio y óxido de hierro amarillo y secando luego con
una corriente de aire a una temperatura de aproximadamente 21ºC con
aproximadamente 20% de humedad.
Claims (8)
1. Un cultivo biológicamente puro de la cepa
Bifidobacterium Longum LMG P-21586.
2. Uso del cultivo biológicamente puro de
acuerdo con la reivindicación 1 como material probiótico para la
fabricación de preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario a
fin de favorecer la salud gastrointestinal y prevenir y tratar
patologías intestinales.
3. Preparaciones de tipo farmacéutico o
alimentario que contienen una carga bacteriana entre 1 x 10^{7} y
1 x 10^{11} células vivas procedentes de un cultivo biológicamente
puro constituido por la cepa de Bifidobacterium Longum LMG
P-21586.
4. Preparaciones de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizadas porque contienen un material
prebiótico en forma de oligosacáridos.
5. Preparaciones de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizadas porque los oligosacáridos
son fructo-oligosacáridos con un grado de
polimerización entre 2 y 10 o inulina.
6. Preparaciones de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 5, caracterizadas porque contienen
vitaminas.
7. Preparaciones de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizadas porque las vitaminas son las
vitaminas E, B1, B2, B6 y B12.
8. Preparaciones de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 7, caracterizadas porque se
seleccionan de cápsulas, tabletas, sobres, trociscos, suspensiones
líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales líquidos,
viales, leche, yogur, queso fresco, helados, productos hechos de
cereales fermentados, polvos lácteos, productos para niños y
productos para animales domésticos.
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